Name: Dwufotonowe obrazowanie in vivo kolców dendrytycznych w korze myszy przy użyciu preparatu z rozrzedzoną czaszką (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-05-12T22:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 53 s
Description: Poznaj metodę dwufotonowej mikroskopii przezczaszkowej do obrazowania kolców dendrytycznych w korze myszy przy użyciu preparatu z rozrzedzoną czaszką. Technika ta umożliwia śledzenie dynamiki struktur synaptycznych in vivo.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Dziękujemy Jamesowi Pernie za ilustrację graficzną. Praca ta została wsparta grantami z Narodowego Instytutu Zdrowia Psychicznego dla Y.Z.

Zgoda musi być uzyskana z instytucji macierzystych przed rozpoczęciem badania chirurgicznego i obrazowego. Eksperymenty opisane w tym manuskrypcie zostały przeprowadzone zgodnie z wytycznymi i przepisami Uniwersytetu Kalifornijskiego, Santa Cruz Institutional Animal Care and Use Committee.
1. Chirurgia
<ol>
	<li>Przed zabiegiem należy autoklawować wszystkie narzędzia chirurgiczne i dokładnie wysterylizować miejsce pracy 70% alkoholem.</li>
	<li>Znieczulić mysz przez dootrzewnowe (IP) wstrzyknięcie roztworu znieczulającego KX (200 mg/kg ketaminy i 20 mg/kg ksylazyny) w zależności od masy ciała myszy. Uwaga: Dawka KX może być dostosowana w zależności od szczepu, wieku i stanu zdrowia myszy. Zalecana jest również konsultacja weterynaryjna w celu ustalenia optymalnej dawki.</li>
	<li>Okresowo wykonuj test szczypania palców u stóp, naciskając palce myszy i sprawdzając reakcję odruchową, aby monitorować stan znieczulenia. Upewnij się, że mysz jest w pełni znieczulona przed rozpoczęciem zabiegu. Uwaga: Podczas przedłużających się sesji obrazowania należy okresowo sprawdzać stan znieczulenia myszy, w razie potrzeby podawać dodatkowe KX.</li>
	<li>Umieść mysz na poduszce grzewczej, aby utrzymać temperaturę ciała podczas zabiegu.</li>
	<li>Ogol głowę myszy za pomocą żyletki, aby odsłonić skórę głowy.</li>
	<li>Wysterylizuj ogolony obszar, przecierając skórę naprzemiennymi wacikami nasączonymi alkoholem i betadyną. Usuń wszelkie resztki ścinków włosów.</li>
	<li>Delikatnie nałóż maść do oczu, aby nawilżyć oba oczy, zapobiegając w ten sposób trwałym uszkodzeniom spowodowanym odwodnieniem podczas eksperymentu.</li>
	<li>Wykonaj proste nacięcie wzdłuż linii środkowej skóry głowy i przesuń skórę na boki w kierunku krawędzi czaszki.</li>
	<li>Usuń tkankę łączną przyczepioną do czaszki.</li>
</ol>
2. Przygotowanie cienkiej czaszki
<ol>
	<li>Zidentyfikuj obszar obrazowania na podstawie współrzędnych stereotaktycznych. Uwaga: Staraj się unikać dużych naczyń krwionośnych, które blokują przenikanie światła i rozmywają obrazowane struktury. Unaczynienie najlepiej obserwuje, gdy czaszka jest wilgotna sterylnym roztworem soli fizjologicznej.</li>
	<li>Użyj szybkoobrotowego mikrowiertła, aby rozrzedzić okrągły obszar czaszki (średnica 0,5-1,0 mm). Przesuń wiertło równolegle do powierzchni czaszki, zamiast trzymać je przy czaszce i dociskać. Wiercić, aż zarówno zewnętrzna, zwarta warstwa kości, jak i środkowa warstwa kości gąbczastej zostaną usunięte. Uwaga: Aby zapobiec uszkodzeniom spowodowanym przegrzaniem, unikaj długotrwałego kontaktu wiertła z czaszką.</li>
	<li>Kontynuuj rozrzedzanie wewnętrznej, zwartej warstwy kości za pomocą ostrza mikrochirurgicznego w środku obszaru przerzedzonego wiertłem. Trzymaj ostrze mikrochirurgiczne pod kątem około 45°, aby zeskrobać czaszkę bez naciskania na czaszkę, aż do uzyskania równomiernie przerzedzonego małego obszaru (średnica 200-300 μm) o grubości około 20-30 μm. Ze względu na autofluorescencję czaszki, grubość można zmierzyć, skanując odległość między górną i dolną powierzchnią czaszki pod mikroskopem dwufotonowym. Uwaga: chociaż grubość czaszki mniejsza niż 20 μm zapewnia dobrą jakość obrazowania, nie jest zalecana, ponieważ utrudnia proces przerzedzania w kolejnych sesjach ponownego obrazowania. Aby uniknąć nadmiernego przerzedzenia, grubość czaszki musi być okresowo sprawdzana podczas operacji (patrz Dyskusja).</li>
</ol>
3. Unieruchomienie
<ol>
	<li>Ostrożnie usuń resztki kości.</li>
	<li>Umieść niewielką kroplę kleju cyjanoakrylowego na każdej krawędzi środkowego otworu sterylnej płyty głowicy, która została autoklawizowana (patrz rysunek 1). Przyciśnij mocno płytkę głowy do czaszki, tak aby cieńszy obszar znajdował się pośrodku otworu. Uwaga: Jeśli klej przypadkowo zanieczyści rozcieńczony obszar, usuń go ostrożnie za pomocą ostrza mikrochirurgicznego.</li>
	<li>Delikatnie pociągnij skórę od boków czaszki do krawędzi środkowego otworu płyty głowy.</li>
	<li>Odczekaj około 10 minut, aż płyta głowy będzie dobrze przymocowana do czaszki.</li>
	<li>Umieść płytę głowicy na dwóch bocznych blokach płyty mocującej, a następnie dokręć na krawędziach płyty głównej, aby unieruchomić mysz na płycie mocującej (patrz rysunek 1). Uwaga: Przed dokręceniem upewnij się, że między płytą głowicy a blokami nie ma skóry ani wąsów. Dobry unieruchomiony preparat nie powinien wykazywać zauważalnych ruchów czaszki pod mikroskopem preparacyjnym, gdy grzbiet zwierzęcia jest delikatnie poklepywany.</li>
	<li>Opłucz odsłoniętą czaszkę solą fizjologiczną, aby usunąć niespolimeryzowany klej. Uwaga: Ważne jest, aby usunąć pozostały klej, ponieważ niespolimeryzowany klej rozmywa obrazy i uszkadza obiektywy mikroskopu.</li>
</ol>
4. Obrazowanie
<ol>
	<li>Zrób zdjęcie układu naczyniowego odsłoniętej czaszki z przerzedzonym obszarem jak na mapie 1, która służy do przemieszczenia obrazowanego obszaru w kolejnych sesjach obrazowania (patrz ryc. 2).</li>
	<li>Umieść mysz pod mikroskopem obrazowym. Zlokalizuj przerzedzony obszar pod obiektywem powietrznym 10X za pomocą epifluorescencji i przesuń najcieńszy obszar do środka view.</li>
	<li>Dodaj kroplę soli fizjologicznej na czubek czaszki i przełącz się na obiektyw 60X, który został spłukany sterylną wodą. Wybierz obszar, w którym poszczególne kolce dendrytyczne są wyraźnie widoczne wzdłuż dendrytów. Zidentyfikuj i oznacz odpowiedni region na mapie 1, porównując układ naczyniowy między widokiem epifluorescencyjnym a zdjęciem układu naczyniowego.</li>
	<li>Dostosuj długość fali lasera dwufotonowego do fluoroforów. Na przykład 920 nm dla YFP; 890 nm dla GFP; 1 000 nm dla DsRed i tdTomato24.</li>
	<li>Rejestruj stosy obrazów z krokiem co 2 μm wzdłuż osi Z za pomocą obiektywu 60X. Ten stos obrazów obejmuje obszar o wymiarach około 200 μm x 200 μm (512 x 512 pikseli) i jest używany jako mapa 2 do przemieszczania się podczas kolejnych sesji obrazowania (patrz rysunek 2).</li>
	<li>Zdobądź dziewięć stosów obrazów na mapie 2 za pomocą 3-krotnego zoomu cyfrowego. Każdy stos obrazów obejmuje przybliżony obszar 70 μm x 70 μm (512 x 512 pikseli), z krokiem 0,7 μm wzdłuż osi z. Uwaga: Intensywność lasera powinna być mniejsza niż 40 mW podczas pomiaru na próbkach, aby zminimalizować fototoksyczność.</li>
</ol>
5. Odzyskiwanie
<ol>
	<li>Po wykonaniu badania obrazowego delikatnie oderwij płytkę głowy od czaszki.</li>
	<li>Dokładnie oczyść czaszkę i skórę, aby usunąć cały pozostały klej. Uwaga: Wszelkie pozostałe kleje na skórze spowodują podrażnienia i spowolnią gojenie się skóry, podczas gdy pozostały klej na czaszce spowoduje erozję czaszki i angiogenezę w nowo wyrosłej warstwie kości, co utrudni późniejsze przemieszczenie i ponowne obrazowanie.</li>
	<li>Kilkakrotnie opłucz czaszkę i skórę solą fizjologiczną.</li>
	<li>Zszyj skórę głowy sterylnym szwem chirurgicznym.</li>
	<li>Trzymaj zwierzę na poduszce grzewczej w osobnej klatce. Buprenorfinę przeciwbólową (0,1 mg/kg) podawać podskórnie w celu złagodzenia bólu pooperacyjnego. Po pełnym wyzdrowieniu zwierzę należy zwrócić do klatki domowej. Uważnie obserwuj zwierzę (sprawdzaj co najmniej raz dziennie), aż nacięcie zostanie zagojone i szwy zostaną usunięte. W razie potrzeby należy podać kolejne wstrzyknięcia leku przeciwbólowego buprenorfiny.</li>
</ol>
6. Ponowne obrazowanie
<ol>
	<li>Powtórz kroki 1.1-1.8.</li>
	<li>Powtórz kroki 3.1-3.6</li>
	<li>Zlokalizuj poprzednio zobrazowany obszar, porównując wzorzec unaczynienia z mapą 1 i wzór gałęzi dendrytycznych z mapą 2.</li>
	<li>Jeśli ponowne obrazowanie zostanie wykonane w ciągu 1 tygodnia, powtórz krok 2.3, aby usunąć cienką warstwę nowo wyrosłej kości na wierzchu przerzedzonego obszaru za pomocą ostrza mikrochirurgicznego. Jeśli ponowne obrazowanie zostanie wykonane po upływie ponad 1 tygodnia, powtórz kroki 2.2 i 2.3. Uwaga: Nowo wyhodowana warstwa kości składa się z mniej zagęszczonej struktury w porównaniu z oryginalną zwartą warstwą kości, co prowadzi do obniżenia jakości obrazu. Dlatego, aby uzyskać tę samą jakość, konieczne jest nieco większe przerzedzenie czaszki niż podczas poprzedniej sesji obrazowania.</li>
	<li>Dostosuj położenie i orientację, aby uzyskać stosy obrazów, które pasują do poprzednio wykonanych stosów obrazów pod mikroskopem dwufotonowym.</li>
	<li>Uzyskaj obrazy jak w kroku 4.6.</li>
	<li>Powtórz kroki 5.1-5.5 po obrazowaniu.</li>
</ol>

<ol><li>Holtmaat, A., Svoboda, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Experience-dependent+structural+synaptic+plasticity+in+the+mammalian+brain%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+reviews.+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Experience-dependent structural synaptic plasticity in the mammalian brain.</a> Nature reviews. Neuroscience. 10, 647-658 (2009).</li>
<li>Fu, M., Zuo, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Experience-dependent+structural+plasticity+in+the+cortex%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+in+neurosciences%22%5BJournal%5D)">Experience-dependent structural plasticity in the cortex.</a> Trends in neurosciences. 34, 177-187 (2011).</li>
<li>Yu, X., Zuo, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Spine+plasticity+in+the+motor+cortex%5BTitle%5D)+AND+%22Current+opinion+in+neurobiology%22%5BJournal%5D)">Spine plasticity in the motor cortex.</a> Current opinion in neurobiology. 21, 169-174 (2011).</li>
<li>Harms, K. J., Dunaevsky, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dendritic+spine+plasticity%3A+looking+beyond+development%5BTitle%5D)+AND+%22Brain+research%22%5BJournal%5D)">Dendritic spine plasticity: looking beyond development.</a> Brain research. 1184, 65-71 (2007).</li>
<li>Segal, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dendritic+spines+and+long-term+plasticity%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+reviews.+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Dendritic spines and long-term plasticity.</a> Nature reviews. Neuroscience. 6, 277-284 (2005).</li>
<li>Tada, T., Sheng, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Molecular+mechanisms+of+dendritic+spine+morphogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Current+opinion+in+neurobiology%22%5BJournal%5D)">Molecular mechanisms of dendritic spine morphogenesis.</a> Current opinion in neurobiology. 16, 95-101 (2006).</li>
<li>Alvarez, V. A., Sabatini, B. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Anatomical+and+physiological+plasticity+of+dendritic+spines%5BTitle%5D)+AND+%22Annual+review+of+neuroscience%22%5BJournal%5D)">Anatomical and physiological plasticity of dendritic spines.</a> Annual review of neuroscience. 30, 79-97 (2007).</li>
<li>Denk, W., Strickler, J. H., Webb, W. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Two-photon+laser+scanning+fluorescence+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Two-photon laser scanning fluorescence microscopy.</a> Science. 248, 73-76 (1990).</li>
<li>Yang, G., Pan, F., Parkhurst, C. N., Grutzendler, J., Gan, W. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Thinned-skull+cranial+window+technique+for+long-term+imaging+of+the+cortex+in+live+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+protocols%22%5BJournal%5D)">Thinned-skull cranial window technique for long-term imaging of the cortex in live mice.</a> Nature protocols. 5, 201-208 (2010).</li>
<li>Holtmaat, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Long-term%2C+high-resolution+imaging+in+the+mouse+neocortex+through+a+chronic+cranial+window%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+protocols%22%5BJournal%5D)">Long-term, high-resolution imaging in the mouse neocortex through a chronic cranial window.</a> Nature protocols. 4, 1128-1144 (2009).</li>
<li>Drew, P. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chronic+optical+access+through+a+polished+and+reinforced+thinned+skull%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+methods%22%5BJournal%5D)">Chronic optical access through a polished and reinforced thinned skull.</a> Nature methods. 7, 981-984 (2010).</li>
<li>Szu, J. I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Thinned-skull+cortical+window+technique+for+in+vivo+optical+coherence+tomography+imaging%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Thinned-skull cortical window technique for in vivo optical coherence tomography imaging.</a> J Vis Exp. , (2012).</li>
<li>Mostany, R., Portera-Cailliau, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+craniotomy+surgery+procedure+for+chronic+brain+imaging%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">A craniotomy surgery procedure for chronic brain imaging.</a> J Vis Exp. , (2008).</li>
<li>Xu, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rapid+formation+and+selective+stabilization+of+synapses+for+enduring+motor+memories%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Rapid formation and selective stabilization of synapses for enduring motor memories.</a> Nature. 462, 915-919 (2009).</li>
<li>Fu, M., Yu, X., Lu, J., Zuo, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Repetitive+motor+learning+induces+coordinated+formation+of+clustered+dendritic+spines+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Repetitive motor learning induces coordinated formation of clustered dendritic spines in vivo.</a> Nature. 483, 92-95 (2012).</li>
<li>Davalos, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((ATP+mediates+rapid+microglial+response+to+local+brain+injury+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+neuroscience%22%5BJournal%5D)">ATP mediates rapid microglial response to local brain injury in vivo.</a> Nature neuroscience. 8, 752-758 (2005).</li>
<li>Tsai, J., Grutzendler, J., Duff, K., Gan, W. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fibrillar+amyloid+deposition+leads+to+local+synaptic+abnormalities+and+breakage+of+neuronal+branches%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+neuroscience%22%5BJournal%5D)">Fibrillar amyloid deposition leads to local synaptic abnormalities and breakage of neuronal branches.</a> Nature neuroscience. 7, 1181-1183 (2004).</li>
<li>Pan, F., Aldridge, G. M., Greenough, W. T., Gan, W. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dendritic+spine+instability+and+insensitivity+to+modulation+by+sensory+experience+in+a+mouse+model+of+fragile+X+syndrome%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Dendritic spine instability and insensitivity to modulation by sensory experience in a mouse model of fragile X syndrome.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 107, 17768-17773 (2010).</li>
<li>Liu, Z., Condello, C., Schain, A., Harb, R., Grutzendler, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CX3CR1+in+microglia+regulates+brain+amyloid+deposition+through+selective+protofibrillar+amyloid-beta+phagocytosis%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci%22%5BJournal%5D)">CX3CR1 in microglia regulates brain amyloid deposition through selective protofibrillar amyloid-beta phagocytosis.</a> J Neurosci. 30, 17091-17101 (2010).</li>
<li>Tremblay, M. E., Zettel, M. L., Ison, J. R., Allen, P. D., Majewska, A. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effects+of+aging+and+sensory+loss+on+glial+cells+in+mouse+visual+and+auditory+cortices%5BTitle%5D)+AND+%22Glia%22%5BJournal%5D)">Effects of aging and sensory loss on glial cells in mouse visual and auditory cortices.</a> Glia. 60, 541-558 (2012).</li>
<li>Lam, C. K., Yoo, T., Hiner, B., Liu, Z., Grutzendler, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Embolus+extravasation+is+an+alternative+mechanism+for+cerebral+microvascular+recanalization%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Embolus extravasation is an alternative mechanism for cerebral microvascular recanalization.</a> Nature. 465, 478-482 (2010).</li>
<li>Kelly, E. A., Majewska, A. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chronic+imaging+of+mouse+visual+cortex+using+a+thinned-skull+preparation%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Chronic imaging of mouse visual cortex using a thinned-skull preparation.</a> J Vis Exp. , (2010).</li>
<li>Marker, D. F., Tremblay, M. E., Lu, S. M., Majewska, A. K., Gelbard, H. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+thin-skull+window+technique+for+chronic+two-photon+in+vivo+imaging+of+murine+microglia+in+models+of+neuroinflammation%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">A thin-skull window technique for chronic two-photon in vivo imaging of murine microglia in models of neuroinflammation.</a> J Vis Exp. , (2010).</li>
<li>Svoboda, K., Yasuda, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Principles+of+two-photon+excitation+microscopy+and+its+applications+to+neuroscience%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Principles of two-photon excitation microscopy and its applications to neuroscience.</a> Neuron. 50, 823-839 (2006).</li>
<li>Feng, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Imaging+neuronal+subsets+in+transgenic+mice+expressing+multiple+spectral+variants+of+GFP%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Imaging neuronal subsets in transgenic mice expressing multiple spectral variants of GFP.</a> Neuron. 28, 41-51 (2000).</li>
<li>Shih, A. Y., Mateo, C., Drew, P. J., Tsai, P. S., Kleinfeld, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+polished+and+reinforced+thinned-skull+window+for+long-term+imaging+of+the+mouse+brain%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">A polished and reinforced thinned-skull window for long-term imaging of the mouse brain.</a> J Vis Exp. , (2012).</li>
<li>Zhang, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Imaging+glioma+initiation+in+vivo+through+a+polished+and+reinforced+thin-skull+cranial+window%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Imaging glioma initiation in vivo through a polished and reinforced thin-skull cranial window.</a> J Vis Exp. , (2012).</li>
<li>Pacary, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Visualization+and+genetic+manipulation+of+dendrites+and+spines+in+the+mouse+cerebral+cortex+and+hippocampus+using+in+utero+electroporation%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Visualization and genetic manipulation of dendrites and spines in the mouse cerebral cortex and hippocampus using in utero electroporation.</a> J Vis Exp. , (2012).</li>
<li>Saito, T., Nakatsuji, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Efficient+gene+transfer+into+the+embryonic+mouse+brain+using+in+vivo+electroporation%5BTitle%5D)+AND+%22Developmental+biology%22%5BJournal%5D)">Efficient gene transfer into the embryonic mouse brain using in vivo electroporation.</a> Developmental biology. 240, 237-246 (2001).</li>
<li>Lowery, R. L., Majewska, A. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Intracranial+injection+of+adeno-associated+viral+vectors%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Intracranial injection of adeno-associated viral vectors.</a> J Vis Exp. , (2010).</li>
<li>Taniguchi, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+resource+of+Cre+driver+lines+for+genetic+targeting+of+GABAergic+neurons+in+cerebral+cortex%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">A resource of Cre driver lines for genetic targeting of GABAergic neurons in cerebral cortex.</a> Neuron. 71, 995-1013 (2011).</li>
<li>Zariwala, H. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+Cre-dependent+GCaMP3+reporter+mouse+for+neuronal+imaging+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci%22%5BJournal%5D)">A Cre-dependent GCaMP3 reporter mouse for neuronal imaging in vivo.</a> J Neurosci. 32, 3131-3141 (2012).</li>
<li>Kuhlman, S. J., Huang, Z. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High-resolution+labeling+and+functional+manipulation+of+specific+neuron+types+in+mouse+brain+by+Cre-activated+viral+gene+expression%5BTitle%5D)+AND+%22PloS+one%22%5BJournal%5D)">High-resolution labeling and functional manipulation of specific neuron types in mouse brain by Cre-activated viral gene expression.</a> PloS one. 3, (2008).</li>
</ol>

Autorzy oświadczają, że nie mają konkurencyjnych interesów finansowych.

Aby uzyskać skuteczny preparat na rozrzedzoną czaszkę, kluczowe jest kilka kroków w tym protokole. 1) Grubość czaszki. Kość czaszki ma strukturę warstwową, z dwiema warstwami zwartej kości o dużej gęstości i środkową warstwą kości gąbczastej o niskiej gęstości. Podczas gdy szybkoobrotowe mikrowiertło nadaje się do usuwania zewnętrznych warstw kości zwartej i kości gąbczastej, ostrze mikrochirurgiczne jest idealne do rozrzedzania wewnętrznej warstwy kości zwięzłej. Ponieważ grubość i sztywność czaszki wzrasta podczas rozw...

Kora mózgowa ssaków uczestniczy w wielu funkcjach mózgu, od percepcji sensorycznej i kontroli ruchu po abstrakcyjne przetwarzanie informacji i poznanie. Różne funkcje korowe opierają się na różnych obwodach neuronalnych, które składają się z różnych typów neuronów komunikujących się i wymieniających informacje w poszczególnych synapsach. Struktura i funkcja synaps są konsekwentnie modyfikowane w odpowiedzi na doświadczenia i patologie. W dojrzałym mózgu plastyczność synaptyczna przybiera formę zarówno zmian siły, jak i dodawania/usuwania synaps, odgrywając ważną rolę w tworzeniu i utrzymywaniu funkcjonalnych obwodów neuronalnych. Kolce dendrytyczne są postsynaptycznymi składnikami większości synaps pobudzających w mózgu ssaków. Uważa się, że ciągły obrót i zmiany morfologiczne kolców służą jako dobry wskaźnik modyfikacji połączeń synaptycznych1-7.
Dwufotonowa laserowa mikroskopia skaningowa oferuje głęboką penetrację przez gęste, nieprzezroczyste preparaty i niską fototoksyczność, co czyni ją odpowiednią do obrazowania na żywo w nienaruszonym mózgu8. W połączeniu ze znakowaniem fluorescencyjnym, obrazowanie dwufotonowe stanowi potężne narzędzie do zaglądania do żywego mózgu i śledzenia reorganizacji strukturalnej w poszczególnych synapsach z wysoką rozdzielczością przestrzenną i czasową. Do przygotowania myszy do obrazowania na żywo9-13 zastosowano różne metody. W tym miejscu opisujemy przygotowanie rozrzedzonej czaszki do obrazowania dwufotonowego in vivo w celu zbadania plastyczności strukturalnej postsynaptycznych kolców dendrytycznych w korze myszy. Korzystając z tego podejścia, nasze ostatnie badania przedstawiły dynamiczny obraz dendrytycznych zmian kręgosłupa w odpowiedzi na uczenie się umiejętności motorycznych Wraz z rosnącą dostępnością zwierząt transgenicznych z fluorescencyjnie znakowanymi podzbiorami neuronów i szybkim rozwojem technik znakowania in vivo, podobne procedury opisane tutaj można również zastosować do badania innych typów komórek i regionów kory mózgowej, w połączeniu z innymi manipulacjami, a także stosowany w modelach chorób16-23.

<table><tbody><tr><td>Ketamine</td><td>Bioniche Pharma</td><td>67457-034-10</td><td>Zmieszany z ksylazyną do znieczulenia</td></tr><tr><td>Ksylazyna</td><td>Lloyd laboratories</td><td>139-236</td><td>Zmieszany z ketaminą do znieczulenia</td></tr><tr><td>Saline</td><td>Hospira</td><td>0409-7983-09</td><td>0,9% NaCl do wstrzykiwań i obrazowania</td></tr><tr><td>Żyletki</td><td>Mikroskopia elektronowa nauki</td><td>72000</td><td>Dwukrawędziowe żyletki ze stali nierdzewnej</td></tr><tr><td>Płatki nasączone alkoholem</td><td>Fisher Scientific</td><td>06-669-62</td><td>Sterylne waciki nasączone alkoholem</td></tr><tr><td>Maść do oczu</td><td>Henry Schein</td><td>102-9470</td><td>Maść okulistyczna z wazeliną sterylny smar do oczu</td></tr><tr><td>Szybkoobrotowa mikrowiertło</td><td>Fine Science Tools</td><td>18000-17</td><td>Szybkoobrotowe mikrowiertło nadaje się do rozrzedzania zewnętrznej warstwy zwartej kości i celowania w mały obszar</td></tr><tr><td>Stalowe</td> <td>zadziory Micro drillFine Science Tools</td><td>19007-14</td> Ostrze mikrochirurgiczne o <td>średnicy 1,4 mm</td></tr><tr><td></td><td>Surgistar</td><td>6961</td><td>Ostrze mikrochirurgiczne nadaje się do rozrzedzania wewnętrznej warstwy zwartej kości i środkowej warstwy kości gąbczastej</td></tr><tr><td>Klej cyjanoakrylowy</td><td>Fisher Scientific</td><td>NC9062131</td><td>Przymocuj płytkę głowy do czaszki</td></tr><tr><td>Szew</td><td>Havard Apparatus</td><td>510461</td><td>Niewchłanialny, sterylny szew jedwabny, 6-0 monofilament</td></tr><tr><td>Mikroskop preparacyjny</td><td>Olympus</td><td></td><td>SZ61</td></tr><tr><td>Kamera CCD</td><td>Infinity</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Mikroskop dwufotonowy</td><td>Prairie Technologies</td><td></td><td>Ultima IV</td></tr><tr><td>10X obiektyw</td><td>Olympus</td><td></td><td>NA 0.30, powietrzny</td></tr><tr><td>60X obiektyw</td><td>Olympus</td><td></td><td>NA 1.1, przepuszczający podczerwień, zanurzenie w wodzie</td></tr><tr><td>Ti-szafirowy laser</td><td>Widma-Fizyka</td><td></td><td>Mai Tai HP</td></tr></tbody></table>

dwufotonowe obrazowanie in vivo kolców dendrytycznych w korze myszy przy użyciu preparatu z rozrzedzoną czaszką

Two-Photon in vivo Imaging of Dendritic Spines in the Mouse Cortex Using a Thinned-skull Preparation

W korze mózgowej ssaków neurony tworzą niezwykle skomplikowane sieci i wymieniają informacje w synapsach. Zmiany w sile synaptycznej, a także dodawanie/usuwanie synaps, zachodzą w sposób zależny od doświadczenia, zapewniając strukturalną podstawę plastyczności neuronalnej. Jako postsynaptyczne składniki najbardziej pobudzających synaps w korze mózgowej, kolce dendrytyczne są uważane za dobry wskaźnik zastępczy synaps. Korzystając z genetyki myszy i technik znakowania fluorescencyjnego, poszczególne neurony i ich struktury synaptyczne mogą być znakowane w nienaruszonym mózgu. Tutaj przedstawiamy protokół obrazowania przezczaszkowego przy użyciu dwufotonowej laserowej mikroskopii skaningowej, aby śledzić fluorescencyjnie znakowane postsynaptyczne kolce dendrytyczne w czasie in vivo. Protokół ten wykorzystuje preparat z rozrzedzoną czaszką, który utrzymuje czaszkę w stanie nienaruszonym i pozwala uniknąć skutków zapalnych spowodowanych odsłonięciem opon mózgowych i kory. Dzięki temu obrazy można uzyskać natychmiast po wykonaniu zabiegu. Procedura eksperymentalna może być wykonywana powtarzalnie w różnych odstępach czasu, od godzin do lat. Zastosowanie tego preparatu można również rozszerzyć o badanie różnych obszarów i warstw kory mózgowej, a także innych typów komórek, w warunkach fizjologicznych i patologicznych.

U myszy linii YFP-H25 żółte białko fluorescencyjne wykazuje ekspresję w podzbiorze neuronów piramidalnych warstwy V, które kierują swoje dendryty apikalne do powierzchownych warstw kory. Dzięki preparacji z utonczoną czaszką fluorescencyjnie znakowane segmenty dendrytów mogą być wielokrotnie obrazowane za pomocą mikroskopu dwufotonowego w różnych odstępach czasu, od godzin do miesięcy. Przedstawiamy tutaj przykład czterokrotnego obrazowania tych samych dendrytów w ciągu 8 dni w korze ruchowej miesięcznego mysz...

Obrazowanie poklatkowe u żywego zwierzęcia dostarcza cennych informacji na temat reorganizacji strukturalnej w nienaruszonym mózgu. Tutaj wprowadzamy preparat z rozcieńczoną czaszką, który umożliwia przezczaszkowe obrazowanie znakowanych fluorescencyjnie struktur synaptycznych w żywej korze myszy za pomocą mikroskopii dwufotonowej.

Dwufotonowe obrazowanie in vivo kolców dendrytycznych w korze myszy przy użyciu preparatu z rozrzedzoną czaszką

In the mammalian cortex, neurons form extremely complicated networks and exchange information at synapses. Changes in synaptic strength, as well as ...

Ogólnym celem tej procedury jest umożliwienie obrazowania przezczaszkowego fluorescencyjnie znakowanych struktur synaptycznych w korze mózgowej żywej myszy za pomocą mikroskopii dwufotonowej. Pierwszym krokiem po znieczuleniu myszy jest przygotowanie preparatu z pocienioną czaszką. Następnie głowa myszy zostaje unieruchomiona za pomocą specjalnie wykonanej płytki mocującej.Następnie, przy użyciu mikroskopii dwufotonowej, wykonuje się serie obrazów poprzezcieńszą czaszkę. Ostatecznie, ponowne zlokalizowanie i obrazowanie wcześniej zobrazowanego obszaru pozwoliło na śledzenie dynamiki kolców dendrytycznych w różnych przedziałach czasowych i w różnych warunkach.W celu przygotowania do operacji, podaj myszy znieczulenie z ketaminy i ksylazyny, a następnie wykonaj test uszczypnięcia palca, aby upewnić się, że znieczulenie jest całkowite. Następnie umieść mysz na podgrzewaczu i za pomocą żyletki ogól głowę. Przetrzyj skórę naprzemiennie gazikami nasączonymi alkoholem, aby wysterylizować ogoloną okolicę i usunąć pozostałe resztki włosów.Następnie delikatnie nałóż maść do oczu do obu oczu. Potem wykonaj proste cięcie wzdłuż linii środkowej skóry głowy i odsunij skórę bocznie w kierunku kra

two-photon-vivo-imaging-dendritic-spines-mouse-cortex-using-thinned

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Neuronauka

Dwufotonowe in vivo Obrazowanie kolców dendrytycznych w korze mózgu myszy z użyciem preparatu z przerzedzonymi czaszkami

W tym filmie i materiałach uzupełniających przedstawiamy protokół przewlekłego obrazowania in vivo nienaruszonego mózgu z wykorzystaniem preparacji z cienkiej czaszki.

Przewlekłe obrazowanie kory wzrokowej myszy z wykorzystaniem preparatu z pocienioną czaszką

Przedstawiamy metodę tworzenia okna obrazującego w czaszce myszy, które obejmuje obszar o wielkości kilku milimetrów i pozostaje stabilne przez wiele miesięcy bez wywoływania stanu zapalnego mózgu. Metoda ta jest odpowiednia do podłużnych badań przepływu krwi, dynamiki komórkowej oraz struktury komórkowej i naczyniowej z wykorzystaniem mikroskopii dwufotonowej.

Polerowane i wzmocnione okno z cienkiej czaszki do długoterminowego obrazowania mózgu myszy

Łącząc zastosowanie polerowanego i wzmocnionego cienkiego okna czaszkowego (PoRTS) z wstrzykiwaniem komórek glejaka wielopostaciowego (GBM), możemy w sposób podłużny obserwować inicjację i wzrost glejaka z wstrzykniętych komórek GBM w mózgu żywej myszy.

Obrazowanie inicjacji glejaka in vivo poprzez wypolerowane i wzmocnione cienkie okno czaszkowe

Źródło: Pekarek, B. T., et. al., Obrazowanie i kwantyfikacja nienaruszonych dendrytów neuronalnych za pomocą oczyszczania tkanek CLARITY. J. Vis. Exp. (2021)W tym filmie pokazujemy przygotowanie, obrazowanie i analizę oczyszczonego mózgu myszy w celu zbadania dendrytycznych altan dendrytycznych, morfologii kręgosłupa i rozmieszczenia neuronów przy użyciu mikroskopii konfokalnej i technik rekonstrukcji 3D.

Obrazowanie mikroskopem konfokalnym nienaruszonych altan dendrytycznych i morfologii kręgosłupa w oczyszczonym mózgu myszy

Ten artykuł opisuje działający protokół obrazowania kolców dendrytycznych z neuronów hipokampa in vitro za pomocą Mikroskopii Iluminacji Strukturalnej (SIM). Mikroskopia superrozdzielcza wykorzystująca SIM zapewnia rozdzielczość obrazu znacznie wykraczającą poza granicę dyfrakcji światła we wszystkich trzech wymiarach przestrzennych, umożliwiając obrazowanie pojedynczych kolców dendrytycznych z większą szczegółowością.

Obrazowanie kolców dendrytycznych pierwotnych neuronów hipokampa szczura za pomocą mikroskopii oświetlenia strukturalnego

Ten film pokazuje procedurę kraniotomii, która umożliwia przewlekłe obrazowanie neuronów w korze zaśledziony myszy za pomocą mikroskopii dwufotonowej in vivo w linii transgenicznej Thy1-GFP. Podejście to łączy się z wstrzyknięciem do grzbietowego hipokampa wirusa związanego z ekspresją mCherry. Techniki te pozwalają na długoterminowe monitorowanie plastyczności strukturalnej zależnej od doświadczenia w RSC.

Jednoczesne dwufotonowe obrazowanie in vivo wejść synaptycznych i celów postsynaptycznych w korze zaśledzinowej myszy

Ta metoda opisuje chroniczne przygotowanie, które umożliwia optyczny dostęp do hipokampa żywych myszy. Preparat ten może być stosowany do wykonywania podłużnego obrazowania optycznego plastyczności strukturalnej neuronów i plastyczności komórkowej wywołanej aktywnością przez okres kilku tygodni.

Podłużne obrazowanie dwufotonowe grzbietowego hipokampa CA1 u żywych myszy

Seryjna skaningowa mikroskopia elektronowa (SBEM) jest stosowana do obrazowania i analizy kolców dendrytycznych w mysim hipokampie.

Seryjna skaningowa mikroskopia elektronowa typu block-face (SBEM) do badania kolców dendrytycznych

Tutaj opisujemy protokół łączący wstrzyknięcie wirusa związanego z adenowirusem z implantacją okna czaszkowego w celu jednoczesnego obrazowania dynamiki mikrogleju i aktywności neuronalnej u obudzonych myszy.

Jednoczesne obrazowanie dynamiki mikrogleju i aktywności neuronalnej u obudzonych myszy

Protokół ten zawiera szczegółowy opis krok po kroku podejścia dla przewlekłego modelu myszy z przewlekłym oknem czaszki oraz mikronaczyniowym zatorem naczyniowym, zoptymalizowanego do mikroskopii in vivo dwufotonowej z użyciem fluorescencyjnych mikrosfer polistyrenowych.

Model mikronaczyniowej embolii myszy do mikroskopii in vivo dwufotonowej z wykorzystaniem fluorescencyjnych mikrosfer polistyrenowych

Poznaj metodę dwufotonowej mikroskopii przezczaszkowej do obrazowania kolców dendrytycznych w korze myszy przy użyciu preparatu z rozrzedzoną czaszką. Technika ta umożliwia śledzenie dynamiki struktur synaptycznych in vivo.

Dwufotonowe obrazowanie in vivo kolców dendrytycznych w korze myszy przy użyciu preparatu z rozrzedzoną czaszką

Przeglądaj więcej filmów