Dwufotonowe obrazowanie in vivo kolców dendrytycznych w korze myszy przy użyciu preparatu z rozrzedzoną czaszką

Ogólnym celem tej procedury jest umożliwienie obrazowania przezczaszkowego, fluorescencyjnie znakowanych struktur synaptycznych w żywej korze myszy za pomocą mikroskopii fotonowej. Pierwszym krokiem po znieczuleniu myszy jest wykonanie preparatu z rozcieńczonej czaszki. Następnie głowa myszy jest unieruchamiana za pomocą specjalnie wykonanej płytki mocującej.

Następnie przez przerzedzoną czaszkę pobierane są stosy obrazów za pomocą mikroskopii dwufotonowej. Ostatecznie przeprowadzka i obrazowanie. Wcześniej zobrazowany obszar pozwolił prześledzić dynamikę kolców dendrytycznych w różnych okresach czasu w różnych warunkach.

Aby przygotować się do operacji, znieczulij mysz ketaminą i ksylazyną i wykonaj uszczypnięcie palca u nogi, aby zapewnić pełne znieczulenie. Następnie umieść mysz na poduszce grzewczej i użyj żyletki, aby ogolić głowę. Przetrzyj skórę naprzemiennie wacikami nasączonymi alkoholem, aby wysterylizować ogolony obszar i usunąć wszelkie resztki ścinków włosów.

Delikatnie nałóż również maść do oczu na oba oczy. Następnie wykonaj proste nacięcie wzdłuż linii środkowej skóry głowy i przesuń skórę na boki w kierunku krawędzi czaszki. Następnie usuń tkankę łączną przyczepioną do czaszki, aby rozpocząć przygotowanie rozrzedzonej czaszki.

Najpierw zidentyfikuj żądany obszar obrazowania na podstawie jego względnego położenia względem linii środkowej i bgma. Następnie zwilż czaszkę solą fizjologiczną, aby obserwować układ krwionośny, aby uniknąć ścieńczenia czaszki w obszarze z dużymi naczyniami krwionośnymi, ponieważ blokują one przenikanie światła i rozmywają struktury obrazu. Po wybraniu obszaru o średnicy od 0,5 do jednego milimetra użyj szybkoobrotowego mikrowiertła, aby rozrzedzić okrągły obszar czaszki.

Przesuwaj wiertło równolegle do powierzchni czaszki, zamiast przytrzymywać je przy czaszce i dociskać, aby zapobiec uszkodzeniom spowodowanym przegrzaniem. Unikaj długotrwałego kontaktu wiertła z wiertłem do czaszki, dopóki nie zostanie usunięta zarówno zewnętrzna zwarta warstwa kości, jak i środkowa warstwa kości gąbczastej. Następnie użyj ostrza mikrochirurgicznego trzymanego pod kątem około 45 stopni, aby rozrzedzić wewnętrzną, zwartą warstwę kości w środku przerzedzonego obszaru wiertła.

Zeskrobać czaszkę bez naciskania na czaszkę, aż do uzyskania równomiernie rozrzedzonego obszaru o średnicy od 200 do 300 mikrometrów i grubości około 20 do 30 mikrometrów. Gdy czaszka jest wystarczająco rozrzedzona, ostrożnie usuń resztki kości. Następnym krokiem jest przymocowanie płyty czołowej, która jest wykonana z żyletek z ostrymi krawędziami pokrytymi taśmami.

Zacznij od umieszczenia małej kropli kleju cyjanoakrylowego na każdej krawędzi środkowego otworu płyty głowicy. Następnie wyśrodkowanie płyty głowicy na przerzedzonym obszarze. Przyciśnij go mocno do czaszki.

Teraz delikatnie pociągnij skórę od boków czaszki do krawędzi środkowego otworu płyty głowy. Przytrzymaj płytę głowicy na miejscu przez jedną do dwóch minut. Następnie odczekaj kolejne osiem do dziewięciu minut, aż płyta głowy będzie dobrze przymocowana do czaszki.

Po 10 minutach umieść płytę głowicy na dwóch bocznych blokach płyty mocującej. Następnie dokręć na krawędziach płyty głowicy, aby unieruchomić mysz na płycie mocującej. Spójrz na głowę myszy przez mikroskop preparacyjny, delikatnie wyściełając grzbiet myszy, aby upewnić się, że głowa jest prawidłowo unieruchomiona.

Następnie płucz naświetlił czaszkę solą fizjologiczną, aby usunąć niespolimeryzowany klej w celu przeniesienia wcześniej zobrazowanego obszaru. W kolejnych sesjach obrazowania należy wykonać zdjęcie układu naczyniowego przerzedzonego obszaru odsłoniętej czaszki, który jest oznaczony jako mapa pierwsza. Następnie umieść mysz pod mikroskopem obrazowym i zlokalizuj przerzedzony obszar pod obiektywem powietrznym 10x.

Korzystając z fluorescencji epi, przesuń najcieńszy obszar do środka widoku. Teraz dodaj kroplę soli fizjologicznej na szczyt czaszki i przełącz się na cel 60 x. Wybierz obszar, w którym poszczególne kolce dendrytyczne są wyraźnie widoczne wzdłuż dendrytów.

Zidentyfikuj i oznacz odpowiedni region na mapie pierwszej, porównując układ naczyniowy między widokiem fluorescencyjnym epi a zdjęciem układu naczyniowego. Następnie dostosuj dwie długości fal lasera fotonowego zgodnie z czwórkami fluorowymi. Następnie za pomocą obiektywu 60 x nabierz stosów obrazów z dwumikrometrowymi krokami wzdłuż osi Z, pokrywając obszar o wymiarach około 200 mikrometrów na 200 mikrometrów.

Jest ona oznaczona jako mapa druga i służy do przemieszczania segmentu dendrytycznego obrazu podczas kolejnych sesji obrazowania. Teraz zdobądź dziewięć stosów obrazów na drugiej mapie, korzystając z trzykrotnego zoomu cyfrowego. Każdy stos obrazów obejmuje przybliżony obszar 70 mikrometrów na 70 mikrometrów z krokami co 0,7 mikrometra wzdłuż osi Z.

Po wykonaniu badania obrazowego delikatnie oderwij płytkę głowy od czaszki. Następnie za pomocą ostrza mikrochirurgicznego usuń pozostały klej z czaszki. Następnie kilkakrotnie przepłucz czaszkę i skórę solą fizjologiczną i zszyj skórę głowy sterylnymi szwami chirurgicznymi.

Podczas rekonwalescencji należy trzymać zwierzę na poduszce grzewczej w osobnej klatce i podawać podskórnie buprenorfinę przeciwbólową w przypadku bólu pooperacyjnego. Po pełnym wyzdrowieniu zwróć zwierzę do domowego miernika Aby ponownie zobrazować dendryty innego dnia, znieczul zwierzę i odsłoń czaszkę. Tak jak poprzednio, powtórz unieruchomienie głowy, montując płytę głowicy i mocując ją do płyty mocującej.

Następnie zlokalizuj poprzednio sfotografowany obszar, porównując wzorzec unaczynienia w celu odwzorowania jednego i wzór gałęzi dendrytycznych w celu zmapowania drugiego. Jeśli ponowne obrazowanie zostanie wykonane w ciągu tygodnia, cienką warstwę nowo wyrosłej kości można usunąć za pomocą ostrza mikrochirurgicznego. Jeśli ponowne obrazowanie zostanie wykonane po upływie więcej niż tygodnia, najpierw użyj mikrowiertła, a następnie ostrza mikrochirurgicznego, aby rozrzedzić czaszkę.

Teraz dostosuj położenie i orientację pod dwoma mikroskopami fotonowymi, aby uzyskać stosy obrazów, które pasują do poprzednio wykonanych stosów obrazów. Po uzyskaniu obrazów pozwól myszy dojść do siebie i wróć do klatki, tak jak poprzednio, a obraz wzoru naczyniowego otaczającego cienki obszar czaszki oznaczony jako mapa pierwsza służy do odniesienia się do wszystkich kolejnych sesji obrazowania. ramka wskazuje obszar, w którym uzyskano dwa obrazy fotonowe in vivo.

Ten obraz gałęzi dendrytycznych w korze ruchowej miesięcznej myszy jest oznaczony jako mapa druga. Białe pole pokazuje segment dendrytyczny wybrany do obrazowania. Z biegiem czasu wykonano obrazowanie dwóch fotonów tego samego segmentu dendrytycznego w dniu zero, dniu drugim, czwartym i ósmym.

Nowo powstałe kolce. Oznacza to, że kolce, które nie były obecne w poprzedniej sesji obrazowania, są pokazane przez kolce grotów strzał, które zostały wyeliminowane między sesjami obrazowania, są pokazane przez strzałki. Filip Podia są oznaczone gwiazdami po opanowaniu.

Tę technikę można wykonać w ciągu jednej do dwóch godzin, jeśli jest wykonywana prawidłowo.