Monitorowanie funkcjonalności i morfologii układu krwionośnego rekrutowanego przez czynniki wydzielane przez szybko rosnące komórki nowotworowe
23 listopada 2014
Opisujemy test czopa matrigelowego, aby zilustrować potencjał angiogenny puli czynników wydzielanych przez komórki nowotworowe za pomocą dwóch uzupełniających się metod obrazowania, ultradźwięków i endomikroskopii. Matrigel, żel naśladujący macierz zewnątrzkomórkową (ECM), jest wykorzystywany do wprowadzenia gospodarza (myszy) z czynnikami angiogennymi wydzielanymi do kondycjonowanego podłoża (CM).
Ogólnym celem poniższego eksperymentu jest wykorzystanie ultradźwięków i mikroskopii endodoncyjnej do zilustrowania potencjału angiogennego puli czynników wydzielanych przez komórki nowotworowe. Osiąga się to poprzez pierwsze wszczepienie zatyczki w celu wytworzenia środowiska podobnego do guza u myszy przy braku komórek nowotworowych. Następnie oceniana jest gęstość naczyń krwionośnych i procent funkcjonalnych naczyń krwionośnych w czopie.
W ostatnim kroku wizualizowana jest morfologia naczyń krwionośnych. Ostatecznie równowaga między czynnikami pro i antyangiogennymi wydzielanymi przez komórki oraz ich wpływem na angiogenezę może być oceniona w, żywotnie i w różnych punktach czasowych za pomocą dwóch uzupełniających się metod obrazowania. Główną zaletą tej techniki w porównaniu z istniejącymi metodami, takimi jak konwencjonalny test czopa matrigelowego, jest to, że umożliwia analizę puli czynników wydzielanych przez komórki przy jednoczesnym wykorzystaniu uzupełniających się metod obrazowania przyżyciowego.
Demonstrując tę procedurę, poprowadziła doktorantów F Andra z mojego laboratorium Aby użyć ultradźwięków do oceny unaczynienia matrycy zewnątrzkomórkowej lub unaczynienia korka żelowego ECM naśladującego zacznij od umieszczenia na lodzie jednej 1,5-mililitrowej probówki einor zawierającej 80 mikrolitrów świeżo przygotowanej kondycjonowanej pożywki. Najtrudniejszą częścią zabiegu jest wstrzyknięcie żelu bez pęcherzyków za pomocą lodowatych końcówek. Delikatne mieszanie i powolne wstrzykiwanie zapewni optymalne podawanie żelu.
Następnie za pomocą lodowatych końcówek o pojemności 1000 mikrolitrów wymieszaj 600 mikrolitrów lodu w czterech stopniach Celsjusza przez noc. Rozmrożony żel naśladujący ECM w podłożu, uważając, aby nie tworzyć pęcherzyków. Po potwierdzeniu sedacji przez uszczypnięcie palca u nogi, ogol brzuch każdej myszy i użyj lodowatej strzykawki o pojemności jednego mililitra wyposażonej w igłę o rozmiarze 27, aby powoli podskórnie.
Wstrzyknąć zawartość jednej probówki EEND DPH na zwierzę. Po podaniu całej objętości należy przytrzymać igłę na miejscu przez kilka minut, aż do zestalenia. Trzy tygodnie później ponownie ogol okolice brzucha myszy, usuwając dodatkowe włosy kremem do depilacji, a następnie unieruchom myszy w pozycji leżącej na stoliku mikromanipulatora.
Następnie napełnij strzykawkę o pojemności jednego mililitra wyposażoną w igłę o rozmiarze 30 z solą fizjologiczną. Następnie umieść igłę w żyle ogonowej. Mocno zamocować igłę i poluzować strzykawkę.
Teraz umieść przetwornik na środku żądanego obszaru skanowania i kliknij 3D, aby zainicjować stopień motoryczny 3D. Kliknij opcję 3D. Ponownie wprowadź odległość skanowania i rozmiar kroku, a następnie naciśnij skanuj.
Upewnij się, że cała wtyczka została zeskanowana w wyświetlonych danych obrazu 3D. Jeśli nie, wyreguluj przetwornik tak, aby cała wtyczka była widoczna i ponownie zeskanuj obszar, jak pokazano poniżej. Następnie wybierz kontrast i dostosuj kompensację wzmocnienia czasowego lub elementy sterujące tgc, aby przyciemnić obraz, użyj miksera do fiolek, aby aktywować mikropęcherzyki na 45 sekund.
Następnie wymieszaj 50 mikrolitrów mikropęcherzyków z 50 mikrolitrami soli fizjologicznej w jednomililitrowej strzykawce. Zastrzykawkę z solą fizjologiczną zawierającą strzykawkę zawierającą aktywowane mikropęcherzyki i wstrzyknąć rozcieńczone mikropęcherzyki do żyły ogonowej każdej myszy. Poczekaj kilka sekund, aż bąbelki osiągną stan ustalony, a następnie kliknij 3D i wybierz skanowanie, aby uzyskać 3D.
Obrazy o zwiększonym kontraście. Kliknij opcję Widziałem sklep, aby zapisać dane obrazu, a następnie wybierz opcję 3D i zniszcz 3D. Aby zniszczyć mikropęcherzyki, ponownie kliknij 3D i wybierz skanowanie, aby uzyskać pętlę ceny po zniszczeniu.
Następnie ponownie kliknij opcję Widziałem sklep. Następnie w ustawieniach referencji kliknij przycisk utwórz odniesienie, a następnie wybierz opcję Zarządzanie badaniem. Aby otworzyć pętlę ceny przed zniszczeniem.
Teraz kliknij process cena, aby wygenerować zieloną nakładkę kontrastową. Następnie wybierz opcję Załaduj do 3D w oprogramowaniu do obrazowania ultrasonograficznego. Następnie kliknij ustawienia trybu, kliknij głośność i wybierz równoległy.
Następnie podziel serię konturów na segmenty, aby utworzyć objętość 3D tkanki docelowej i kliknij przycisk Zakończ, aby zakończyć segmentację. Aby użyć światłowodowej konfokalnej mikroskopii endodonalnej do oceny morfologii naczyń ECM naśladującego zatyczkę żelową, wstrzyknij 200 mikrolitrów po 10 miligramów na mililitr, dopasowując dekstran oznaczony literą C do żyły ogonowej każdego zwierzęcia doświadczalnego. Następnie wykonaj małe nacięcie w odległości około jednego centymetra od zatyczki i delikatnie umieść sondę mikroskopową endo na górze zatyczki, zachowując zatyczkę w stanie nienaruszonym.
Gdy sonda znajdzie się na miejscu, użyj pedału nożnego, aby nacisnąć start lasera. Gdy fluorescencja pojawi się na ekranie, naciśnij przycisk Select za pomocą pedału nożnego, aby uzyskać krótkie filmy o długości do 32 między filmami, umyj końcówkę sondy w probówce zawierającej wodę. Po zakończeniu filmowania wyczyść końcówkę bawełnianym wacikiem, aby przeanalizować średnią średnicę naczynia.
Następnie kliknij wykryj mikro naczynia, aby otworzyć okno modułu wykrywania naczyń i kliknij preferencje. Upewnij się, że średnia średnica naczynia w interesującej nas statystyce. Paski histogramu okna i wyświetlacza w trybie wyświetlania są oznaczone.
Kliknij przycisk Wykryj, aby wyświetlić wybrane pomiary. Aby przeanalizować natężenie sygnału fluorescencyjnego w obszarach przyległych do naczyń krwionośnych, wybierz utwórz okrąg ROI i utwórz okrąg w obszarze zainteresowania. Na koniec wybierz oblicz histogram w obszarze ROI, aby obliczyć wartości związane z zakreślonym regionem.
W tym przypadku rozległa rekrutacja funkcjonalnych naczyń krwionośnych w obrębie czopów kondycjonowanych medium U 87 mg ujawnia się za pomocą obrazowania ultrasonograficznego wzmocnionego kontrastem mikropęcherzyków. I odwrotnie, w czopach zawierających kondycjonowane podłoże z uśpionych komórek wytwarzających nowotwór, przepływ krwi jest prawie niewykrywalny. Morfologia tych nowo powstałych naczyń krwionośnych jest dodatkowo podkreślona przez włóknistą konfokalną mikroskopię endodonową naczyń po podaniu dekstranu fit, jak pokazano na tych reprezentatywnych obrazach, zauważ, jak naczynia krwionośne w czopach załadowanych pożywką kondycjonowaną U 87 mg wykazują typową nieszczelną, zakończoną morfologię powiększonych naczyń.
Powiększone i silnie splątane naczynia krwionośne wykazują również nieciągły i powolny przepływ, a wyciek krwi jest obserwowany w okolicy, a także świadczy o tym silny sygnał fluorescencyjny widoczny na zewnątrz naczyń krwionośnych. Po opanowaniu technikę tę można wykonać w ciągu kilku godzin w kilku punktach czasowych, aby zoptymalizować kinetykę angiogenezy.
Wyświetl pełny transkrypt i uzyskaj dostęp do tysięcy filmów naukowych
Przegląd
To badanie opisuje metodę ocen czynników angiogennych wydzielanych przez komórki rakowe za pomocą ultradźwięków i endomikroskopii, za pomocą wszczepienia matrigel. Metoda ta pozwala na ocenę gęstości i morfologii naczyń krwionośnych w środowisku przypominającym nowotwór, stworzone w myszach.
Kluczowe elementy badania
Obszar nauki
- Neuronauki
- Onkologia
- Angiogeneza
Tło
- Angiogeneza jest kluczowa dla wzrostu i przerzutów nowotworów.
- Zrozumienie równowagi czynników pro- i przeciwangiogennych jest istotne.
- Tradycyjne metody mogą nieskutecznie analizować wydzielane czynniki.
- Komplementarne techniki obrazowania poprawiają ocenę angiogenezy.
Cel badania
- Zobrazowanie potencjału angiogennego czynników wydzielanych przez komórki nowotworowe.
- Wykorzystanie metody wszczepienia matrigel w modelu mysim.
- Ocena gęstości i funkcjonalności naczyń krwionośnych.
Stosowane metody
- Wszczepienie wszczepu matrigel w myszy, aby symulować środowisko nowotworowe.
- Ocena gęstości naczyń krwionośnych i funkcjonalnych naczyń krwionośnych.
- Wizualizacja morfologii naczyń krwionośnych za pomocą modalności obrazowania.
- Ocena czynników angiogennych w czasie.
Główne wyniki
- Udane wygenerowanie środowiska przypominającego nowotwór u myszy.
- Osiągnięto ilościową ocenę gęstości naczyń krwionośnych.
- Wykonano wizualizacje morfologii naczyń krwionośnych.
- Uzyskano wgląd w równowagę czynników angiogennych.
Wnioski
- Metoda wszczepienia matrigel skutecznie ocenia potencjał angiogenny.
- Komplementarne modalności obrazowania zapewniają szczegółowe wglądy.
- Ta metoda poprawia rozumienie biologii raka.
Często zadawane pytania
Executive Industry Relevance
This method enables biopharma R&D to evaluate the angiogenic potential of complex factor pools secreted by tumor cells in a physiologically relevant in vivo environment. By combining quantitative ultrasound imaging with high-resolution endomicroscopy, it provides mechanistic insights into vascular functionality and morphology, supporting target validation and de-risking of angiogenesis-modulating therapeutics. The assay facilitates early-stage assessment of pro- and anti-angiogenic factor balance, informing portfolio decisions and reducing late-stage biological risk in oncology drug development.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Interrogates therapeutic hypotheses by assessing the net angiogenic output of secreted factor pools from cancer cells.
- Operational Value: Enables functional target validation through real-time measurement of blood vessel density and perfusion in a tumor-mimetic matrix.
- Predictive Value: Supports mechanistic de-risking by correlating factor secretion profiles with vascular phenotypes, aiding in target prioritization.
Screening & Assay Development
- Assay Readiness: Prepares standardized, reproducible biological systems for screening angiogenic or anti-angiogenic compounds using conditioned media as input.
- Quantitative Outputs: Generates measurable endpoints including blood vessel density, percent functional vessels, and mean vessel diameter for compound screening campaigns.
- Scalability & Reuse: Supports longitudinal monitoring at multiple time points, enabling kinetic analysis and platform reuse across factor libraries or genetic perturbations.
Translational & Preclinical Research
- Disease Relevance: Models the angiogenic microenvironment of fast-growing glioblastoma, providing a translational bridge to preclinical efficacy studies.
- Biomarker Alignment: Enables correlation of vascular morphology (e.g., leaky, enlarged vessels) with functional readouts, supporting translational biomarker discovery.
- Risk-Adjusted Advancement: Facilitates go/no-go decisions by quantifying angiogenic response over time, reducing uncertainty in preclinical progression.
Pipeline & Workflow Integration
The assay integrates into the discovery continuum from early target validation through lead optimization to preclinical validation, offering a functional readout that complements biochemical and phenotypic screening.
- Discovery Biology: Supports hypothesis testing by revealing the angiogenic potential of complex factor mixtures, clarifying pathway-level effects in angiogenesis regulation.
- Screening: Delivers standardized, quantitative vascular readouts (vessel density, functionality) that enable reliable comparison of test conditions across wells or time points.
- Analytics: Provides multimodal data—ultrasound-derived perfusion metrics and endomicroscopy-based morphometric analysis—to inform comparative analytics and structure-activity relationships.
- Translational Research: Connects in vitro factor secretion to in vivo vascular outcomes, supporting continuity from discovery through preclinical validation using disease-relevant vascular phenotypes.
- Enterprise Reuse: Establishes a reusable platform for evaluating angiogenic or anti-angiogenic activity of factor pools, antibodies, or small molecules across oncology projects.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Enhances predictive confidence by linking secreted factor profiles to functional vascular outcomes, reducing mechanistic ambiguity in angiogenesis modulation.
- Operational Value: Standardizes assessment through reproducible plug formation, standardized imaging protocols, and quantifiable endpoints across operators and sites.
- Strategic Value: Improves capital efficiency by enabling early de-risking of angiogenesis-targeting candidates, minimizing investment in biologically inactive approaches.
- Portfolio Impact: Informs risk-adjusted prioritization by providing direct evidence of angiogenic activity, supporting differentiation between pro- and anti-angiogenic mechanisms.
Implementation Considerations
- Requires expertise in vivo imaging techniques, including ultrasound contrast agent handling and fibered confocal endomicroscopy operation.
- Depends on access to high-frequency ultrasound systems with 3D motorized stages and microbubble contrast agents, plus endomicroscopy platforms with fluorescent dextran labeling capability.
- Necessitates cross-team standardization of plug preparation, imaging parameters, and image analysis workflows to ensure reproducibility across studies.
- Involves adaptation considerations when applying the model to different cell lines, tumor types, or stromal co-cultures to maintain physiological relevance.
- Limited by the endpoint nature of the assay, requiring sacrifice of animals at each time point, which constrains longitudinal sampling in individual subjects.
Biopharma FAQs
Chapters in this video
0:05
Title
1:29
Extracellular Matrix (ECM)–mimic Gel Plug Inoculation into Mice
2:43
Evacuation of ECM–mimic Gel Plug Vascularization Using Ultrasound
5:31
Evacuation of ECM–mimic Gel Plug Vasculature Morphology Using Fibered Confocal Endomicroscopy
7:23
Results: Representative ECM–mimic Gel Plug Imaging
8:40
Conclusion
