Name: Zrozumienie wczesnej organogenezy przy użyciu uproszczonego protokołu hybrydyzacji in situ u Xenopus (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2015-01-12T12:00:00.000+00:00
Duration: 14 min 50 s
Description: Poznaj uproszczoną metodę hybrydyzacji in situ w całych zarodkach Xenopus laevis do wizualizacji ekspresji genów. Protokół umożliwia szybkie lokalizowanie RNA z użyciem mniejszej liczby odczynników.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Autorzy chcieliby podziękować CIHR za wsparcie stypendialne Steve'a Deimlinga oraz Departamentowi Pediatrii Uniwersytetu Zachodniego Ontario za wsparcie Steve'a Deimlinga, Ramiego Halabiego i Stephanie Grover. Prace te były wspierane przez R2654A11 grantowy NSERC oraz suplement NSERC Discovery Accelerator Supplement

<ol><li>Ninomiya, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cadherin-dependent+differential+cell+adhesion+in+Xenopus+causes+cell+sorting+in+vitro+but+not+in+the+embryo%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cell+Sci%22%5BJournal%5D)">Cadherin-dependent differential cell adhesion in Xenopus causes cell sorting in vitro but not in the embryo.</a> J Cell Sci. 125, 1877-1883 (2012).</li>
<li>Movassagh, M., Philpott, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cardiac+differentiation+in+Xenopus+requires+the+cyclin-dependent+kinase+inhibitor%2C+p27Xic1%5BTitle%5D)+AND+%22Cardiovasc+Res%22%5BJournal%5D)">Cardiac differentiation in Xenopus requires the cyclin-dependent kinase inhibitor, p27Xic1.</a> Cardiovasc Res. 79, 436-447 (2008).</li>
<li>Zhao, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+expression+of+alphaA-+and+betaB1-crystallin+during+normal+development+and+regeneration%2C+and+proteomic+analysis+for+the+regenerating+lens+in+Xenopus+laevis%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Vis%22%5BJournal%5D)">The expression of alphaA- and betaB1-crystallin during normal development and regeneration, and proteomic analysis for the regenerating lens in Xenopus laevis.</a> Mol Vis. 17, 768-778 (2011).</li>
<li>Harland, R. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+situ+hybridization%3A+an+improved+whole-mount+method+for+Xenopus+embryos%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">In situ hybridization: an improved whole-mount method for Xenopus embryos.</a> Methods Cell Biol. 36, 685-695 (1991).</li>
<li>Kirilenko, P., Weierud, F. K., Zorn, A. M., Woodland, H. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+efficiency+of+Xenopus+primordial+germ+cell+migration+depends+on+the+germplasm+mRNA+encoding+the+PDZ+domain+protein+Grip2%5BTitle%5D)+AND+%22Differentiation%22%5BJournal%5D)">The efficiency of Xenopus primordial germ cell migration depends on the germplasm mRNA encoding the PDZ domain protein Grip2.</a> Differentiation. 76, 392-403 (2008).</li>
<li>Deimling, S. J., Drysdale, T. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fgf+is+required+to+regulate+anterior-posterior+patterning+in+the+Xenopus+lateral+plate+mesoderm%5BTitle%5D)+AND+%22Mech+Dev%22%5BJournal%5D)">Fgf is required to regulate anterior-posterior patterning in the Xenopus lateral plate mesoderm.</a> Mech Dev. , (2011).</li>
<li>Fletcher, R. B., Harland, R. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+role+of+FGF+signaling+in+the+establishment+and+maintenance+of+mesodermal+gene+expression+in+Xenopus%5BTitle%5D)+AND+%22Dev+Dyn%22%5BJournal%5D)">The role of FGF signaling in the establishment and maintenance of mesodermal gene expression in Xenopus.</a> Dev Dyn. 237, 1243-1254 (2008).</li>
<li>Sive, H. L., Grainger, R. M., Harland, R. M. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aSive%2C+HL+%22Early+development+of+Xenopus+laevis+%3A+a+laboratory+manual%22">Early development of Xenopus laevis : a laboratory manual</a>. , Cold Spring Harbor Laboratory Press. (2000).</li>
<li>Park, E. C., Hayata, T., Cho, K. W., Han, J. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Xenopus+cDNA+microarray+identification+of+genes+with+endodermal+organ+expression%5BTitle%5D)+AND+%22Dev+Dyn%22%5BJournal%5D)">Xenopus cDNA microarray identification of genes with endodermal organ expression.</a> Dev Dyn. 236, 1633-1649 (2007).</li>
<li>Horb, M. E., Slack, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Endoderm+specification+and+differentiation+in+Xenopus+embryos%5BTitle%5D)+AND+%22Dev+Biol%22%5BJournal%5D)">Endoderm specification and differentiation in Xenopus embryos.</a> Dev Biol. 236, 330-343 (2001).</li>
<li>Nieuwkoop, P. D., Faber, J. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aNieuwkoop%2C+PD+%22Normal+table+of+Xenopus+laevis+%28Daudin%29+%3A+a+systematical+and+chronological+survey+of+the+development+from+the+fertilized+egg+till+the+end+of+metamorphosis%22">Normal table of Xenopus laevis (Daudin) : a systematical and chronological survey of the development from the fertilized egg till the end of metamorphosis</a>. , Garland Pub. (1994).</li>
<li>Gebhardt, D. O., Nieuwkoop, P. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Influence+of+Lithium+on+the+Competence+of+the+Ectoderm+in+Ambystoma+Mexicanum%5BTitle%5D)+AND+%22J+Embryol+Exp+Morphol%22%5BJournal%5D)">The Influence of Lithium on the Competence of the Ectoderm in Ambystoma Mexicanum.</a> J Embryol Exp Morphol. 12, 317-331 (1964).</li>
<li>Nieuwkoop, P. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pattern+formation+in+artificially+activated+ectoderm+%28Rana+pipiens+and+Ambystoma+punctatum%29%5BTitle%5D)+AND+%22Dev+Biol%22%5BJournal%5D)">Pattern formation in artificially activated ectoderm (Rana pipiens and Ambystoma punctatum).</a> Dev Biol. 6, 255-279 (1963).</li>
<li>Sato, S. M., Sargent, T. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Molecular+approach+to+dorsoanterior+development+in+Xenopus+laevis%5BTitle%5D)+AND+%22Dev+Biol%22%5BJournal%5D)">Molecular approach to dorsoanterior development in Xenopus laevis.</a> Dev Biol. 137, 135-141 (1990).</li>
<li>Smith, S. J., Kotecha, S., Towers, N., Latinkic, B. V., Mohun, T. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((XPOX2-peroxidase+expression+and+the+XLURP-1+promoter+reveal+the+site+of+embryonic+myeloid+cell+development+in+Xenopus%5BTitle%5D)+AND+%22Mech+Dev%22%5BJournal%5D)">XPOX2-peroxidase expression and the XLURP-1 promoter reveal the site of embryonic myeloid cell development in Xenopus.</a> Mech Dev. 117, 173-186 (2002).</li>
<li>Drysdale, T. A., Tonissen, K. F., Patterson, K. D., Crawford, M. J., Krieg, P. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cardiac+troponin+I+is+a+heart-specific+marker+in+the+Xenopus+embryo%3A+expression+during+abnormal+heart+morphogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Dev+Biol%22%5BJournal%5D)">Cardiac troponin I is a heart-specific marker in the Xenopus embryo: expression during abnormal heart morphogenesis.</a> Dev Biol. 165, 432-441 (1994).</li>
<li>Carroll, T., Wallingford, J., Seufert, D., Vize, P. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Molecular+regulation+of+pronephric+development%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Top+Dev+Biol%22%5BJournal%5D)">Molecular regulation of pronephric development.</a> Curr Top Dev Biol. 44, 67-100 (1999).</li>
<li>Tonissen, K. F., Drysdale, T. A., Lints, T. J., Harvey, R. P., Krieg, P. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((XNkx-2.5%2C+a+Xenopus+gene+related+to+Nkx-2.5+and+tinman%3A+evidence+for+a+conserved+role+in+cardiac+development%5BTitle%5D)+AND+%22Dev+Biol%22%5BJournal%5D)">XNkx-2.5, a Xenopus gene related to Nkx-2.5 and tinman: evidence for a conserved role in cardiac development.</a> Dev Biol. 162, 325-328 (1994).</li>
<li>Davidson, L. A., Ezin, A. M., Keller, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Embryonic+wound+healing+by+apical+contraction+and+ingression+in+Xenopus+laevis%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Motil+Cytoskeleton%22%5BJournal%5D)">Embryonic wound healing by apical contraction and ingression in Xenopus laevis.</a> Cell Motil Cytoskeleton. 53, 163-176 (2002).</li>
<li>Hurtado, R., Mikawa, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Enhanced+sensitivity+and+stability+in+two-color+in+situ+hybridization+by+means+of+a+novel+chromagenic+substrate+combination%5BTitle%5D)+AND+%22Dev+Dyn%22%5BJournal%5D)">Enhanced sensitivity and stability in two-color in situ hybridization by means of a novel chromagenic substrate combination.</a> Dev Dyn. 235, 2811-2816 (2006).</li>
</ol>

Autorzy nie mają konkurencyjnych interesów finansowych do ujawnienia.

Możliwość wykorzystania hybrydyzacji in situ do wizualizacji wzorca ekspresji określonych genów pozostaje najczęściej stosowaną metodą identyfikacji określonych narządów lub typów komórek w zarodku Xenopus . Wynika to z kilku zalet oferowanych przez tę technikę. Ekspresja genu może zidentyfikować określone struktury na długo przed jakimikolwiek histologicznymi oznakami różnicowania, takimi jak w przypadku ekspresji nkx2,5 w komórkach progenitorowych serca, przed wyraźnym rozgraniczeniem tych ko...

Wzorzec ekspresji określonego genu jest ważną informacją w określaniu potencjalnej roli tego genu w rozwoju określonego narządu lub typu komórki. Mówiąc najprościej, jeśli nie zostanie wyrażona we właściwym czasie i miejscu, jest mało prawdopodobne, aby odegrała kluczową rolę. W Xenopus, podobnie jak w większości wczesnych zarodków, najczęściej stosowanym testem do wykrywania ekspresji genu jest hybrydyzacja in situ z całego wierzchowca przy użyciu znakowanych antysensownych sond RNA. Stosowanie barwienia przeciwciałami do oceny ekspresji genu w Xenopus staje się coraz bardziej powszechne, ponieważ naukowcy odkrywają przeciwciała, zwykle wywoływane przeciwko białkom ssaków, które reagują krzyżowo na homolog Xenopus lub generują własne 1-3. Jednak zdecydowana większość badań nad organogenezą Xenopus nadal wykorzystuje antysensowne sondy RNA. W przypadku stosowania przeciwciał każde pojedyncze przeciwciało często wymaga optymalizacji pod kątem pierwotnego stężenia przeciwciał lub protokołów wiązania. W przeciwieństwie do tego, protokół hybrydyzacji in situ jest zasadniczo niezmienny dla różnych sond. Podstawowa koncepcja jest stosunkowo prosta, a doskonały standardowy protokół został dobrze ugruntowany 4. Nasz protokół jest uproszczoną wersją oryginalnego protokołu 4, który nadal zapewnia doskonałe wykrywanie wzorców ekspresji genów we wczesnym zarodku. Zarodki są utrwalane, a następnie przygotowywane do hybrydyzacji poprzez zmianę roztworów i temperatur tak, aby pozwoliło to na wysokie rygorystyczne wiązanie znakowanej antysensownej sondy RNA z docelowym mRNA. Niezwiązana sonda jest wypłukiwana, a następnie zarodki są przygotowywane do wiązania przeciwciała przeciwko etykiecie na sondach RNA. Nadmiar przeciwciał jest następnie wypłukiwany, a enzymatyczna reakcja barwna jest stosowana do zlokalizowania miejsca, w którym sonda RNA jest związana w zarodku. Obecnie istnieje wiele linii transgenicznych Xenopus, które napędzają ekspresję białek fluorescencyjnych w określonych tkankach i są one dostępne w centrach magazynowych Xenopus, takich jak National Xenopus Resource w Woods Hole. Chociaż jest to bardzo przydatne w wielu eksperymentach, które wymagają zbadania organogenezy w żywych embrionach, opcja ta wymaga oddzielnego pomieszczenia dla linii transgenicznych. 
Hybrydyzacja in situ może wyraźnie określić, gdzie uformują się określone narządy lub typy komórek we wczesnym zarodku (Rysunek 1). Technika ta jest niezwykle czuła, biorąc pod uwagę, że można wykryć ekspresję genów w niewielkiej liczbie komórek w jednym zarodku 5. Jednak hybrydyzacja in situ z wykorzystaniem intensywności barwienia kolorymetrycznego nie jest uważana za kwantyfikalną, ponieważ reakcja koloru nie jest liniowa. Pomimo trudności w ilościowym określeniu intensywności barwienia, zmiany w ekspresji są często dość zauważalne; Zwłaszcza, gdy hybrydyzacja in situ wykazuje wymierne wzrosty lub spadki wielkości domen ekspresji 6,7. 
Wyraźne zalety hybrydyzacji in situ z całym wierzchowcem sprawiają, że jest to kluczowy test w badaniach nad wczesnym rozwojem. Jest to jednak proces czasochłonny, który wymaga wielu kroków w ciągu kilku dni. Protokół ten jest uproszczoną wersją standardowego protokołu, która eliminuje kilka kroków bez obniżania jakości wyniku in situ. Uproszczenie eliminuje również źródła zmienności, ułatwiając rozwiązywanie problemów, jeśli hybrydyzacja in situ nie jest optymalna. W szczególności wyeliminowaliśmy stosowanie leczenia zarodka proteinazą K i RNAzy, dwoma etapami, które mogą zależeć od jakości odczynnika, a także mogą zmniejszać intensywność sygnału, jeśli są przesadzone. Protokół zapewnia również pewien stopień oszczędności kosztów dzięki wyeliminowaniu użycia kilku odczynników. Wreszcie, protokół ten zawiera również kilka prostych wskazówek dotyczących lepszego przechwytywania obrazów wyników hybrydyzacji in situ. Chociaż protokół ten jest zoptymalizowany pod kątem pracy na zarodkach Xenopus, jest prawdopodobne, że przynajmniej niektóre z uproszczeń będą miały zastosowanie do prac nad hybrydyzacją in situ w innych systemach zarodkowych.

<table><tbody><tr><td>Wytrząsarki do probówek Labguake</td><td>VWR</td><td>17-08-2011</td><td></td></tr><tr><td>Fiolki</td><td>VWR VWR</td><td>10-07-2012</td><td></td></tr><tr><td>L-cysteina</td><td>BioShop</td><td>CYS342.500</td><td></td></tr><tr><td>Zestaw trifosforanu rybonukleozydu, 100mM</td><td>Roche</td><td>11277057001</td><td></td></tr><tr><td>Digoxigenin-11-UTP</td><td>Roche</td><td>11209256910</td><td></td></tr><tr><td>inhibator Rnazy (Rnase OUT)</td><td>Invitrogen&nbsp;</td><td>10777-019</td><td></td></tr><tr><td>T7 Polimeraza RNA</td><td>Fermentas</td><td>EPO111</td><td></td></tr><tr><td>T3 Polimeraza RNA</td><td>Fermentas</td><td>EPO101</td><td></td></tr><tr><td>SP6 Polimeraza RNA</td><td>Fermentas</td><td>EPO131</td><td></td></tr><tr><td>Dnaza 1</td><td>Invitrogen&nbsp;</td><td>18047-019</td><td></td></tr><tr><td>Surowica owcza</td><td>&nbsp; Żubr</td><td>31150</td><td></td></tr><tr><td>Odczynnik blokujący</td><td>Roche</td><td>11096176001</td><td></td></tr><tr><td>BM fioletowy Ap Substrate</td><td>Roche</td><td>11442094001</td><td></td></tr><tr><td>Anty-Digoxigenin-Ap Fragmenty Feb</td><td>Roche</td><td>11093274910</td><td></td></tr><tr><td>Metanol</td><td>VWR</td><td>CAMX0485-7</td><td></td></tr><tr><td>NaCl</td><td>BioShop</td><td>SOD002.10</td><td></td></tr><tr><td>SDS</td><td>EM&nbsp;</td><td>7910</td><td></td></tr><tr><td>EDTA</td><td>BioShop</td><td>EDT001.500</td><td></td></tr><tr><td>Tris</td><td>BioShop</td><td>TRS003.5</td><td></td></tr><tr><td>Tween-20</td><td>EM&nbsp;</td><td>9480</td><td></td></tr><tr><td>MgSO4</td><td>Sigma</td><td>M-2643</td><td></td></tr><tr><td>Mopy</td><td>BioShop</td><td>MOP001.250</td><td></td></tr><tr><td>EGTA</td><td>Sigma</td><td>E-3889-25G</td><td></td></tr><tr><td>Paraformaldehyd</td><td>BioShop</td><td>PAR070.500&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Formamid</td><td>&nbsp; Firma VWR&nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp;</td><td>CAFX0420-4&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>RNA</td><td>Roche</td><td>10109223001</td><td></td></tr><tr><td>Kwas maleinowy</td><td>&nbsp; Firma VWR&nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp;</td><td>CAMX0100-3</td><td></td></tr><tr><td>Cytrynian tri-sodowy</td><td>BioShop</td><td>CIT001</td><td></td></tr><tr><td>Nadtlenek wodoru (30% roztwór)</td><td>EM&nbsp;</td><td>HX0635-2</td><td></td></tr><tr><td>BSA</td><td>BioShop</td><td>ALB001.100</td><td></td></tr><tr><td>PVP-40</td><td>ICN</td><td>195451</td><td></td></tr><tr><td>Ficoll 400</td><td>GE Healthcare</td><td>17-0300-10</td><td></td></tr><tr><td>Alkohol benzylowy</td><td>Sigma</td><td>B-1042</td><td></td></tr><tr><td>Benzoesan benzylu</td><td>Sigma</td><td>B-6630</td><td></td></tr><tr><td>UltraPure Agaroza&nbsp;</td><td>Invitrogen&nbsp;</td><td>Średnica 16500-500</td><td></td></tr></tbody></table> TGL

zrozumienie wczesnej organogenezy przy użyciu uproszczonego protokołu hybrydyzacji in situ u xenopus

Understanding Early Organogenesis Using a Simplified In Situ Hybridization Protocol in Xenopus

Organogeneza to nauka o tym, jak narządy są określane, a następnie nabywają swój specyficzny kształt i funkcje podczas rozwoju. Zarodek Xenopuslaevis jest bardzo przydatny do badania organogenezy, ponieważ jego duży rozmiar sprawia, że doskonale nadaje się do identyfikacji narządów na najwcześniejszych etapach organogenezy. W tej chwili podstawową metodą stosowaną do identyfikacji określonego narządu lub zawiązka jest hybrydyzacja in situ z całymi sondami RNA antysensownymi specyficznymi dla genu, który ulega ekspresji w narządzie będącym przedmiotem zainteresowania. Ponadto stosunkowo łatwo jest manipulować genami lub szlakami sygnałowymi w Xenopus, a hybrydyzacja in situ pozwala następnie na zbadanie zmian w obecności lub morfologii narządu docelowego. Hybrydyzacja całego montażu in situ to wielodniowy protokół składający się z wielu etapów. Tutaj zapewniamy uproszczony protokół ze zmniejszoną liczbą kroków i użytych odczynników, który dobrze sprawdza się w rutynowych testach. Roboty hybrydyzacyjne in situ znacznie ułatwiły ten proces, a my szczegółowo opisujemy, jak i kiedy wykorzystujemy tę technologię w tym procesie. Po zakończeniu hybrydyzacji in situ uchwycenie najlepszego obrazu wyniku może być frustrujące. Doradzamy, jak zoptymalizować obrazowanie wyników hybrydyzacji in situ. Chociaż protokół opisuje ocenę organogenezy u Xenopus laevis, ten sam podstawowy protokół prawie na pewno można dostosować do Xenopus tropicalis i innych systemów modelowych.

Wykorzystanie sond specyficznych dla tkanek może dostarczyć niezwykle cennych informacji na temat stanu rozwoju konkretnych narządów. W poniższych przykładach stadium embrionu określono na podstawie tabeli stadiów Nieuwkoopa i Fabera 11. Stosując sondy dla genów ekspresowanych po różnicowaniu, na przykład dla troponiny I serca w stadiach 28-30 (Ryc. 1C), można ocenić obecność lub wielkość zróżnicowanego narządu na każdym etapie po różnicowaniu. Przed laty embriolodzy potrafili przepro...

Zarodek Xenopus laevis nadal jest wyjątkowo przydatny w badaniach nad wczesnym rozwojem, ze względu na jego duży rozmiar i łatwość manipulacji. Przewidziano uproszczony protokół hybrydyzacji całego montażu in situ, który można wykorzystać do identyfikacji określonych narządów w tym modelowym systemie.

Zrozumienie wczesnej organogenezy przy użyciu uproszczonego protokołu hybrydyzacji in situ u Xenopus

Organogenesis is the study of how organs are specified and then acquire their specific shape and functions during development.  The Xenopuslaevis embryo ...

Ogólnym celem następnego eksperymentu jest wykazanie miejsca ekspresji konkretnego genu w obrębie nienaruszonego zarodka. Osiąga się to poprzez unieruchomienie RNA do lokalizacji w miejscu jego występowania w zarodku w drugim kroku. Sonda RNA antysensowna, specyficzna dla badanego genu, jest hybrydyzowana z docelowym RNA w obrębie zarodka.Sonda ta zawiera epitop, zazwyczaj digoksigeninę, który może następnie zostać wykryty. Następnie przeciwciało sprzężone z fosfatazą alkaliczną ulega hybrydyzacji z epitopem na sondzie RNA, po czym stosuje się barwnik kolorymetryczny. Aby zwizualizować lokalizację RNA wewnątrz zarodka, uzyskuje się wyniki precyzyjnie wskazujące miejsce ekspresji badanego genu na podstawie reakcji barwnej oraz znajomości anatomii zarodka.Główną zaletą protokołu naszego instytutu w porównaniu z istniejącymi procedurami jest to, że jest on szybszy i wymaga zużycia mniejszej ilości odczynników, bez widocznej utraty jakości. Metoda ta pozwala odpowiedzieć na kluczowe pytania z zakresu embriologii, takie jak sposób specyfikacji i wzorowania tkanek. Choć metoda ta umożliwia wgląd w rozwój opus, może być ona również stosowana w przypadku wielu innych małych embrionów, takich jak embriony ryb zebrafish oraz wczesne embriony myszy.Rozpoczęliśmy opracowywanie tych metod, ponieważ pierwotne procedury były bardzo czasochłonne, zatem zaczęliśmy eksperymentować z pomijaniem etapów Ed w celu zwiększenia wydajności procedury bez pogorszenia jakości. Fixacja zarodków jest przeprowadzana etapami. Najpierw należy przygotować szklane fiolki, które będą wykorzystywane we wszystkich krokach, w tym do końcowego przechowywania zarodków, aby umożliwić ich monitorowanie podczas wszystkich etapów procesu.Należy użyć przezroczystych fiolek z dobrą uszczelką teflonową w zakrętce; za pomocą niezmywalnego markeru należy opisać fiolki, podając odpowiednie informacje eksperymentalne. Etykietę należy pokryć przezroczystą taśmą, aby zapobiec jej zatarciu w trakcie procedury. Ze względu na zastosowanie alkoholi i innych rozpuszczalników, należy przygotować roztwór utrwalający MFA zgodnie z opisem w tekście protokołu.Napełnij każdą oznakowaną szklaną fiolkę od trzema do czterech mililitrów roztworu MFA. Przechowuj 100% metanol w temperaturze -20°C. Przygotuj szklaną pipetę ciętą i użyj jej do przeniesienia embrionów do szklanych fiolek zawierających roztwór Memphis do fiksacji.Przenieść zarodki, ograniczając do minimum ilość przenoszonego medium do zarodków. Umieścić nie więcej niż 20 do 30 zarodków w jednej probówce. Pozostawić zarodki w roztworze Memphis na dwie godziny w temperaturze pokojowej na rotatorze.Po zakończeniu fiksacji paraformaldehydem należy zastąpić roztwór Memphis około czterema mililitrami 100%metanolu w temperaturze -20 °C w celu przechowywania embrionów. Przed przygotowaniem reakcji syntezy sondy należy pozwolić mieszaninie wody z DNA i NTP oraz buforowi polimerazy ogrzać się do temperatury pokojowej. Jednym z najważniejszych kroków dla sukcesu tej procedury jest prawidłowe przygotowanie reakcji syntezy sondy.Przygotuj reakcję syntezy sond w temperaturze pokojowej. Do probówki do mikrocentryfugi o pojemności 1,5 ml dodaj kolejno następujące składniki: DNA matrycowe w wodzie, dostosowane tak, aby całkowita objętość reakcji wynosiła 20 µL, mieszaninę NTP, inhibitor RNA, bufor polimerazy RNA oraz polimerazę RNA. Inkubuj reakcję transkrypcji przez dwie godziny w temperaturze 37 °C.Inkubacje nieco dłuższe niż dwie godziny nie wywierają negatywnego wpływu, jednak nie powodują również znaczącego wzrostu wydajności; w przypadku inkubacji przez jedną godzinę wydajność ulegnie zmniejszeniu, choć nadal będzie ona wystarczająca do przygotowania dobrej sondy. Po zakończeniu reakcji transkrypcji należy pobrać jeden mikrolitr mieszaniny reakcyjnej w celu sprawdzenia na 1% żelu agarozy w buforze TAE, a pozostałą część mieszaniny reakcyjnej zachować.Dodać 80 µL 1% SDS w buforze TE, 10 µL pięcio molowego octanu amonu oraz 220 µL zimnego etanolu. Energicznie wymieszać na wortexie i odstawić na lód do czasu uzyskania wyników kontroli jakości RNA. Po dodaniu wody i standardowego barwnika do ładowania do 1 µL RNA pobranego przed wytrącaniem, przeprowadzić elektroforezę RNA na 1% żelu agarozy w buforze TAE zawierającym bromek etydyny.Wizualizuj RNA znakowane bromkiem etydium na żelu za pomocą transluminatora UV, aby sprawdzić jakość sondy. Powinien być widoczny pojedynczy prążek bez rozmycia powyżej lub poniżej niego. Po zweryfikowaniu jakości RNA, wytrąć pozostałe RNA, które pozostawiono na lodzie, wirując w mikrocentry fudze z maksymalną prędkością przez 10 do 15 minut.Usunąć supernatant za pomocą długiej pipety szklanej i pozwolić RNA krótko wyschnąć. Następnie sondę resuspenderować w buforze do hybrydyzacji RNA i przechowywać w 15-mililitrowej polistyrenowej probówce z nakrętką w temperaturze -20°C. Aby rozpocząć tę procedurę, wyjąć zarodki przechowywane w metanolu w temperaturze -20°C i pozwolić im ogrzać się do temperatury pokojowej.Cała procedura jest przeprowadzana w szklanych fiolkach. Jeśli różne embriony z jednej grupy mają być badane za pomocą różnych sond, należy przechowywać je w jednej fiolce aż do momentu bezpośrednio poprzedzającego dodanie sond. Aby zmniejszyć zmienność oraz nakład pracy w pierwszym dniu przygotowań do dodania sondy, należy przeprowadzić rehydratację embrionów w serii metanolu zgodnie z opisem w tej tabeli; do usuwania i dodawania każdego roztworu należy używać szklanych pipet, robiąc to ostrożnie, ponieważ embriony mogą zostać łatwo uszkodzone na tym etapie.Podczas przenoszenia cieczy należy sprawdzić wnętrze zakrętek, aby upewnić się, że nie utknęły w nich embriony. Po każdej wymianie delikatnie zamieszać embriony, aby upewnić się, że nie przywierają one do ścianek naczynia ani do siebie nawzajem. Następnie należy delikatnie kołysać embrionami, montując probówki na rotatorze; przed użyciem bufor do hybrydyzacji RNA oraz sonda muszą zostać wstępnie podgrzane do 65 °C.Hybrydyzować embriony w roztworze sondy przez noc, z wytrząsaniem w temperaturze 65°C, a następnie kontynuować proces następnego dnia. Usunąć roztwór sondy i przelać go do polistyrenowej probówki z nakrętką o pojemności 15 ml, opisując ją datą oraz liczbą cykli wykorzystania sondy. Roztwór sondy przechowywać w temperaturze -20°C.Po usunięciu sondy należy przygotować embriony do barwienia przeciwciałami przeciwko sondzie, wykonując serię płukań zgodnie z opisem, a następnie zmienić temperaturę w razie potrzeby, przenosząc mutator z przymocowanymi fiolkami z embrionami bezpośrednio do inkubatorów do hybrydyzacji ustawionych na odpowiednią temperaturę. W czasie inkubacji embrionów w roztworze blokującym należy przygotować odpowiednią objętość roztworu blokującego z dodatkiem przeciwciała anty-D dig, aby przeciwciało zostało zablokowane przed dodaniem go do embrionów. Następnego dnia inkubować embriony w roztworze przeciwciał przez noc w temperaturze 4°C przy jednoczesnym kołysaniu.Usunąć roztwór przeciwciał i przemyć za pomocą mab, roztworu zawierającego kwas maleinowy i chlorek sodu. Przeprowadzić co najmniej 3 przemycia po 10 minut w temperaturze pokojowej podczas kołysania. Ostatni roztwór do płukania zastąpić substratem dla fosfatazy alkalicznej.Reakcję barwienia należy przeprowadzić w temperaturze pokojowej przy ciągłym kołysaniu przez noc, a następnie w kolejnym dniu. Przerwać reakcję barwienia i przygotować embriony do przechowywania oraz obrazowania, wymieniając ciecze zgodnie z opisem w poniższej tabeli. Po rehydratacji embrionów utrwalić barwnik za pomocą MFA przez 30 minut.Po utrwaleniu wyjąć MFA i przemyć embriony 25% metanolem. Jeśli wymagane jest usunięcie endogennego pigmentu, należy usunąć 25% metanol i dodać roztwór wybielający. Należy uważnie obserwować proces wybielania, ponieważ przebiega on stosunkowo szybko, a stopień wybielenia można różnicować w zależności od pożądanego efektu.W celu długotrwałego przechowywania odwodnić zarodki w serii stężeń metanolu aż do 100% metanolu; w przypadku przechowywania krótkoterminowego i późniejszego obrazowania, po wybieleniu przenieść zarodki do PBS. Nieoczyszczone zarodki najlepiej obserwować i obrazować na 1% podłożu z aros. Aby przygotować roztwór aros, dodać aros do wody i zagotować, aż substancja całkowicie się rozpuści. Po ostygnięciu roztworu aros do 50 °C, wlać go do szalki Petriego, tworząc warstwę o grubości około dwóch milimetrów.Gdy szalka aros jest gotowa, należy umieścić w niej nieoczyszczone embriony i przystąpić do obrazowania. Aros zapewnia niebieskoszare tło, które dobrze kontrastuje z embrionem oraz niebieskim kolorem reakcji barwienia. Pomaga on również rozproszyć rozpraszające cienie i odblaski, które odciągają uwagę od embrionu podczas obrazowania go z różnych stron, na przykład od strony brzusznej.Za pomocą precyzyjnej pęsety wykonaj nacięcia w pierścieniu, aby dopasować go do zarodka. Umieść zarodki w tych kanałach w celu ich orientacji. Zachowaj ostrożność podczas manipulowania zarodkami, ponieważ są one podatne na uszkodzenia.Użyj światłowodowego źródła światła, aby oświetlić zarodek pod niewielkim kątem, tworząc cienie na zarodku, które nadadzą obrazowi głębi i pomogą w rozróżnieniu struktur powierzchniowych, ponieważ odbarwianie może usunąć pigment stanowiący przydatne punkty orientacyjne. Stosuj cieniowanie w przypadku zarodków silnie odbarwionych. Zarodki przejrzyste są wykorzystywane do obrazowania barwień znajdujących się głęboko wewnątrz zarodka, takich jak w obrębie sznura, płuc lub obszarów mózgu.W niniejszym protokole zastosowano różne stopnie odbarwiania w celu wizualizacji barwienia w zarodku. Jeśli barwienie jest intensywne, łagodniejsze odbarwienie, pozostawiające część pigmentacji, umożliwia lepsze określenie stadium rozwoju i orientację zarodka. Jednakże, jeśli barwienie znajduje się w obszarze o wysokim stopniu pigmentacji, takim jak nerka, lepsze rezultaty daje silniejsze odbarwianie.Modyfikacja podstawy ARO może pomóc w orientacji embrionu. Na przykład poprzez wycięcie w ARO wąskiego kanału, embrion w stadium kijanka leżący na boku może być oglądany od strony brzusznej z wystarczającą stabilnością, aby uzyskać wysokiej jakości obraz. Ten embrion został umieszczony w małym otworze, który ustabilizował jego pozycję stroną brzuszną do góry, umożliwiając pełną obserwację wzorca ekspresji badanego genu.Organy wewnętrzne można obserwować zarówno w nieprześwietlonych, jak i prześwietlonych embrionach; w nieprześwietlonym, nieprzezroczystym embrionie barwionym na PAX2 można zobaczyć m.in. sznurowisko i rurkę neuralną w stadium 34. Jednak szczegóły nie są wyraźne. Po prześwietleniu embrionu granice obszarów ekspresji, w tym sznurowiska, stają się ostrzejsze.Zakres przejrzystości jest widoczny dzięki możliwości dostrzeżenia obu oczu w tym embrionie. Jednak powszechnym problemem w przypadku przejaśnionych embrionów jest gromadzenie się części barwnika w jamach wewnętrznych. Po obejrzeniu tego filmu powinni Państwo mieć dobre wyobrażenie o tym, jak szybko przeprowadzić hybrydyzację in situ w preparatach całych z wykorzystaniem mniejszej ilości odczynników oraz jak uzyskać wysokiej jakości obrazy.

understanding-early-organogenesis-using-simplified-situ-hybridization

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

Biologia rozwojowa

Rozumienie wczesnej organogenesy przy użyciu uproszczonego protokołu in situ hybrydyzacji u Xenopus

Xenopus embrionalne nabłonki stanowią idealny system modelowy do badania zachowań komórkowych, takich jak rozwój polaryzacji i zmiana kształtu podczas morfogenezy nabłonkowej. Tradycyjna histologia utrwalonych próbek jest coraz częściej uzupełniana przez konfokalne obrazowanie żywych komórek. W niniejszej pracy prezentujemy metody izolacji tkanek żaby oraz wizualizacji żywych komórek nabłonkowych i ich cytoszkieletu z wykorzystaniem konfokalnej mikroskopii żywych komórek.

Obrazowanie żywych komórek i analiza ilościowa embrionalnych komórek nabłonkowych u Xenopus laevis

Zewnętrzna warstwa ektodermy embrionalnej Xenopus stała się atrakcyjnym modelem do badań polaryzacji komórkowej. Opisano analizę, w której ocenia się subkomórkową dystrybucję białek fluorescencyjnych w komórkach ektodermy. Niniejszy protokół pomoże w odpowiedzi na pytania dotyczące przestrzennej kontroli sygnalizacji.

Polaryzowana translokacja białek fluorescencyjnych w ektodermie Xenopus w odpowiedzi na sygnalizację Wnt

Danio pręgowany, mała tropikalna ryba, stała się popularnym modelem do badania funkcji genów podczas rozwoju i choroby kręgowców. Czasową i przestrzenną ekspresję genów docelowych można określić za pomocą hybrydyzacji in situ. Nasz ulepszony protokół pozwala na wykrywanie mało obfitych transkryptów z niskim niespecyficznym sygnałem tła.

Hybrydyzacja in situ w pełnej rozdzielczości w zarodkach danio pręgowanego w celu zbadania ekspresji i funkcji genów

Technika przeszczepiania tkanki twarzy "Extreme Anterior Domain" pomiędzy embrionami Xenopus laevis została opracowana. Tkanka może być przenoszona z jednego tła ekspresji genów do drugiego, co pozwala na badanie lokalnych wymagań dotyczących rozwoju twarzoczaszki i sygnalizowania interakcji między regionami twarzy.

Przeszczepy twarzy w zarodkach Xenopus laevis

Zięba zebry (Taeniopygiaguttata) jest cennym organizmem modelowym; jednak wczesne etapy rozwoju zeberki nie zostały dokładnie zbadane. Protokół opisuje, w jaki sposób przeprowadzać preparację wczesnych zarodków do zastosowań rozwojowych i molekularnych.

Sekcja i dalsza analiza zarodków zięby zeberki we wczesnych stadiach rozwoju

W embrionach Xenopus, komórki z dachu blastocoelu są pluripotencjalne i mogą być zaprogramowane do generowania różnych tkanek. W tym miejscu opisujemy protokoły stosowania eksplantatów dachowych z blastocoelu jako systemu testowego do badania kluczowych cech in vivo i in vitro wczesnego rozwoju neuronalnego.

Podobne do komórek macierzystych eksplantaty embrionalne Xenopus do badania wczesnych cech rozwojowych neuronów in vitro i in vivo

Ten artykuł przedstawia wygodną i szybką metodę wizualizacji różnych populacji komórek nerwowych w ośrodkowym układzie nerwowym zarodków Xenopus za pomocą barwienia immunofluorescencyjnego na skrawkach.

Ocena pierwotnej neurogenezy w zarodkach Xenopus za pomocą barwienia immunologicznego

Prezentujemy dwuczęściowy protokół, który łączy fluorescencyjne obrazowanie wapnia z hybrydyzacją in situ, pozwalając eksperymentatorowi skorelować wzorce aktywności wapnia z profilami ekspresji genów na poziomie pojedynczej komórki.

Fluorescencyjne obrazowanie wapnia i późniejsza hybrydyzacja in situ w celu charakterystyki prekursorów neuronalnych u Xenopus laevis

Opisujemy prosty protokół tworzenia organoidów nabłonkowych śluzowo-rzęskowych z głębokich komórek ektodermy wyizolowanych z zarodków Xenopus laevis. Multipotencjalne komórki progenitorowe regenerują prekursory nabłonkowych komórek kubkowych i umożliwiają śledzenie na żywo inicjacji i progresji przemian komórkowych na powierzchni organoidów.

Organoidy nabłonkowe śluzowo-rzęskowe z komórek embrionalnych Xendopus: generacja, hodowla i obrazowanie na żywo w wysokiej rozdzielczości

Dostarczamy szczegółowe metody metabolicznego oznaczania i oczyszczania początkujących transkryptów do analizy transkryptomu u wczesnych zarodków Xenopus z wykorzystaniem 5-etynylo-urydyny (5-EU).

Znakowanie metaboliczne nowo powstającego transkryptomu w wczesnej embriogenezie Xenopus

Opisujemy metodę fizycznego zwężania do tworzenia mini embrionów z zarodków Xenopus laevis o jednokomórkowej liczbie komórek.

Manipulacja fizyczna w celu generowania mini embrionów Xenopusa

Poznaj uproszczoną metodę hybrydyzacji in situ w całych zarodkach Xenopus laevis do wizualizacji ekspresji genów. Protokół umożliwia szybkie lokalizowanie RNA z użyciem mniejszej liczby odczynników.

Zrozumienie wczesnej organogenezy przy użyciu uproszczonego protokołu hybrydyzacji in situ u Xenopus

Przeglądaj więcej filmów