Zrozumienie wczesnej organogenezy przy użyciu uproszczonego protokołu hybrydyzacji in situ u Xenopus

Ogólnym celem następnego eksperymentu jest wykazanie miejsca ekspresji konkretnego genu w obrębie nienaruszonego zarodka. Osiąga się to poprzez unieruchomienie RNA do lokalizacji w miejscu jego występowania w zarodku w drugim kroku. Sonda RNA antysensowna, specyficzna dla badanego genu, jest hybrydyzowana z docelowym RNA w obrębie zarodka.

Sonda ta zawiera epitop, zazwyczaj digoksigeninę, który może następnie zostać wykryty. Następnie przeciwciało sprzężone z fosfatazą alkaliczną ulega hybrydyzacji z epitopem na sondzie RNA, po czym stosuje się barwnik kolorymetryczny. Aby zwizualizować lokalizację RNA wewnątrz zarodka, uzyskuje się wyniki precyzyjnie wskazujące miejsce ekspresji badanego genu na podstawie reakcji barwnej oraz znajomości anatomii zarodka.

Główną zaletą protokołu naszego instytutu w porównaniu z istniejącymi procedurami jest to, że jest on szybszy i wymaga zużycia mniejszej ilości odczynników, bez widocznej utraty jakości. Metoda ta pozwala odpowiedzieć na kluczowe pytania z zakresu embriologii, takie jak sposób specyfikacji i wzorowania tkanek. Choć metoda ta umożliwia wgląd w rozwój opus, może być ona również stosowana w przypadku wielu innych małych embrionów, takich jak embriony ryb zebrafish oraz wczesne embriony myszy.

Rozpoczęliśmy opracowywanie tych metod, ponieważ pierwotne procedury były bardzo czasochłonne, zatem zaczęliśmy eksperymentować z pomijaniem etapów Ed w celu zwiększenia wydajności procedury bez pogorszenia jakości. Fixacja zarodków jest przeprowadzana etapami. Najpierw należy przygotować szklane fiolki, które będą wykorzystywane we wszystkich krokach, w tym do końcowego przechowywania zarodków, aby umożliwić ich monitorowanie podczas wszystkich etapów procesu.

Należy użyć przezroczystych fiolek z dobrą uszczelką teflonową w zakrętce; za pomocą niezmywalnego markeru należy opisać fiolki, podając odpowiednie informacje eksperymentalne. Etykietę należy pokryć przezroczystą taśmą, aby zapobiec jej zatarciu w trakcie procedury. Ze względu na zastosowanie alkoholi i innych rozpuszczalników, należy przygotować roztwór utrwalający MFA zgodnie z opisem w tekście protokołu.

Napełnij każdą oznakowaną szklaną fiolkę od trzema do czterech mililitrów roztworu MFA. Przechowuj 100% metanol w temperaturze -20°C. Przygotuj szklaną pipetę ciętą i użyj jej do przeniesienia embrionów do szklanych fiolek zawierających roztwór Memphis do fiksacji.

Przenieść zarodki, ograniczając do minimum ilość przenoszonego medium do zarodków. Umieścić nie więcej niż 20 do 30 zarodków w jednej probówce. Pozostawić zarodki w roztworze Memphis na dwie godziny w temperaturze pokojowej na rotatorze.

Po zakończeniu fiksacji paraformaldehydem należy zastąpić roztwór Memphis około czterema mililitrami 100%metanolu w temperaturze -20 °C w celu przechowywania embrionów. Przed przygotowaniem reakcji syntezy sondy należy pozwolić mieszaninie wody z DNA i NTP oraz buforowi polimerazy ogrzać się do temperatury pokojowej. Jednym z najważniejszych kroków dla sukcesu tej procedury jest prawidłowe przygotowanie reakcji syntezy sondy.

Przygotuj reakcję syntezy sond w temperaturze pokojowej. Do probówki do mikrocentryfugi o pojemności 1,5 ml dodaj kolejno następujące składniki: DNA matrycowe w wodzie, dostosowane tak, aby całkowita objętość reakcji wynosiła 20 µL, mieszaninę NTP, inhibitor RNA, bufor polimerazy RNA oraz polimerazę RNA. Inkubuj reakcję transkrypcji przez dwie godziny w temperaturze 37 °C.

Inkubacje nieco dłuższe niż dwie godziny nie wywierają negatywnego wpływu, jednak nie powodują również znaczącego wzrostu wydajności; w przypadku inkubacji przez jedną godzinę wydajność ulegnie zmniejszeniu, choć nadal będzie ona wystarczająca do przygotowania dobrej sondy. Po zakończeniu reakcji transkrypcji należy pobrać jeden mikrolitr mieszaniny reakcyjnej w celu sprawdzenia na 1% żelu agarozy w buforze TAE, a pozostałą część mieszaniny reakcyjnej zachować.

Dodać 80 µL 1% SDS w buforze TE, 10 µL pięcio molowego octanu amonu oraz 220 µL zimnego etanolu. Energicznie wymieszać na wortexie i odstawić na lód do czasu uzyskania wyników kontroli jakości RNA. Po dodaniu wody i standardowego barwnika do ładowania do 1 µL RNA pobranego przed wytrącaniem, przeprowadzić elektroforezę RNA na 1% żelu agarozy w buforze TAE zawierającym bromek etydyny.

Wizualizuj RNA znakowane bromkiem etydium na żelu za pomocą transluminatora UV, aby sprawdzić jakość sondy. Powinien być widoczny pojedynczy prążek bez rozmycia powyżej lub poniżej niego. Po zweryfikowaniu jakości RNA, wytrąć pozostałe RNA, które pozostawiono na lodzie, wirując w mikrocentry fudze z maksymalną prędkością przez 10 do 15 minut.

Usunąć supernatant za pomocą długiej pipety szklanej i pozwolić RNA krótko wyschnąć. Następnie sondę resuspenderować w buforze do hybrydyzacji RNA i przechowywać w 15-mililitrowej polistyrenowej probówce z nakrętką w temperaturze -20°C. Aby rozpocząć tę procedurę, wyjąć zarodki przechowywane w metanolu w temperaturze -20°C i pozwolić im ogrzać się do temperatury pokojowej.

Cała procedura jest przeprowadzana w szklanych fiolkach. Jeśli różne embriony z jednej grupy mają być badane za pomocą różnych sond, należy przechowywać je w jednej fiolce aż do momentu bezpośrednio poprzedzającego dodanie sond. Aby zmniejszyć zmienność oraz nakład pracy w pierwszym dniu przygotowań do dodania sondy, należy przeprowadzić rehydratację embrionów w serii metanolu zgodnie z opisem w tej tabeli; do usuwania i dodawania każdego roztworu należy używać szklanych pipet, robiąc to ostrożnie, ponieważ embriony mogą zostać łatwo uszkodzone na tym etapie.

Podczas przenoszenia cieczy należy sprawdzić wnętrze zakrętek, aby upewnić się, że nie utknęły w nich embriony. Po każdej wymianie delikatnie zamieszać embriony, aby upewnić się, że nie przywierają one do ścianek naczynia ani do siebie nawzajem. Następnie należy delikatnie kołysać embrionami, montując probówki na rotatorze; przed użyciem bufor do hybrydyzacji RNA oraz sonda muszą zostać wstępnie podgrzane do 65 °C.

Hybrydyzować embriony w roztworze sondy przez noc, z wytrząsaniem w temperaturze 65°C, a następnie kontynuować proces następnego dnia. Usunąć roztwór sondy i przelać go do polistyrenowej probówki z nakrętką o pojemności 15 ml, opisując ją datą oraz liczbą cykli wykorzystania sondy. Roztwór sondy przechowywać w temperaturze -20°C.

Po usunięciu sondy należy przygotować embriony do barwienia przeciwciałami przeciwko sondzie, wykonując serię płukań zgodnie z opisem, a następnie zmienić temperaturę w razie potrzeby, przenosząc mutator z przymocowanymi fiolkami z embrionami bezpośrednio do inkubatorów do hybrydyzacji ustawionych na odpowiednią temperaturę. W czasie inkubacji embrionów w roztworze blokującym należy przygotować odpowiednią objętość roztworu blokującego z dodatkiem przeciwciała anty-D dig, aby przeciwciało zostało zablokowane przed dodaniem go do embrionów. Następnego dnia inkubować embriony w roztworze przeciwciał przez noc w temperaturze 4°C przy jednoczesnym kołysaniu.

Usunąć roztwór przeciwciał i przemyć za pomocą mab, roztworu zawierającego kwas maleinowy i chlorek sodu. Przeprowadzić co najmniej 3 przemycia po 10 minut w temperaturze pokojowej podczas kołysania. Ostatni roztwór do płukania zastąpić substratem dla fosfatazy alkalicznej.

Reakcję barwienia należy przeprowadzić w temperaturze pokojowej przy ciągłym kołysaniu przez noc, a następnie w kolejnym dniu. Przerwać reakcję barwienia i przygotować embriony do przechowywania oraz obrazowania, wymieniając ciecze zgodnie z opisem w poniższej tabeli. Po rehydratacji embrionów utrwalić barwnik za pomocą MFA przez 30 minut.

Po utrwaleniu wyjąć MFA i przemyć embriony 25% metanolem. Jeśli wymagane jest usunięcie endogennego pigmentu, należy usunąć 25% metanol i dodać roztwór wybielający. Należy uważnie obserwować proces wybielania, ponieważ przebiega on stosunkowo szybko, a stopień wybielenia można różnicować w zależności od pożądanego efektu.

W celu długotrwałego przechowywania odwodnić zarodki w serii stężeń metanolu aż do 100% metanolu; w przypadku przechowywania krótkoterminowego i późniejszego obrazowania, po wybieleniu przenieść zarodki do PBS. Nieoczyszczone zarodki najlepiej obserwować i obrazować na 1% podłożu z aros. Aby przygotować roztwór aros, dodać aros do wody i zagotować, aż substancja całkowicie się rozpuści. Po ostygnięciu roztworu aros do 50 °C, wlać go do szalki Petriego, tworząc warstwę o grubości około dwóch milimetrów.

Gdy szalka aros jest gotowa, należy umieścić w niej nieoczyszczone embriony i przystąpić do obrazowania. Aros zapewnia niebieskoszare tło, które dobrze kontrastuje z embrionem oraz niebieskim kolorem reakcji barwienia. Pomaga on również rozproszyć rozpraszające cienie i odblaski, które odciągają uwagę od embrionu podczas obrazowania go z różnych stron, na przykład od strony brzusznej.

Za pomocą precyzyjnej pęsety wykonaj nacięcia w pierścieniu, aby dopasować go do zarodka. Umieść zarodki w tych kanałach w celu ich orientacji. Zachowaj ostrożność podczas manipulowania zarodkami, ponieważ są one podatne na uszkodzenia.

Użyj światłowodowego źródła światła, aby oświetlić zarodek pod niewielkim kątem, tworząc cienie na zarodku, które nadadzą obrazowi głębi i pomogą w rozróżnieniu struktur powierzchniowych, ponieważ odbarwianie może usunąć pigment stanowiący przydatne punkty orientacyjne. Stosuj cieniowanie w przypadku zarodków silnie odbarwionych. Zarodki przejrzyste są wykorzystywane do obrazowania barwień znajdujących się głęboko wewnątrz zarodka, takich jak w obrębie sznura, płuc lub obszarów mózgu.

W niniejszym protokole zastosowano różne stopnie odbarwiania w celu wizualizacji barwienia w zarodku. Jeśli barwienie jest intensywne, łagodniejsze odbarwienie, pozostawiające część pigmentacji, umożliwia lepsze określenie stadium rozwoju i orientację zarodka. Jednakże, jeśli barwienie znajduje się w obszarze o wysokim stopniu pigmentacji, takim jak nerka, lepsze rezultaty daje silniejsze odbarwianie.

Modyfikacja podstawy ARO może pomóc w orientacji embrionu. Na przykład poprzez wycięcie w ARO wąskiego kanału, embrion w stadium kijanka leżący na boku może być oglądany od strony brzusznej z wystarczającą stabilnością, aby uzyskać wysokiej jakości obraz. Ten embrion został umieszczony w małym otworze, który ustabilizował jego pozycję stroną brzuszną do góry, umożliwiając pełną obserwację wzorca ekspresji badanego genu.

Organy wewnętrzne można obserwować zarówno w nieprześwietlonych, jak i prześwietlonych embrionach; w nieprześwietlonym, nieprzezroczystym embrionie barwionym na PAX2 można zobaczyć m.in. sznurowisko i rurkę neuralną w stadium 34. Jednak szczegóły nie są wyraźne. Po prześwietleniu embrionu granice obszarów ekspresji, w tym sznurowiska, stają się ostrzejsze.

Zakres przejrzystości jest widoczny dzięki możliwości dostrzeżenia obu oczu w tym embrionie. Jednak powszechnym problemem w przypadku przejaśnionych embrionów jest gromadzenie się części barwnika w jamach wewnętrznych. Po obejrzeniu tego filmu powinni Państwo mieć dobre wyobrażenie o tym, jak szybko przeprowadzić hybrydyzację in situ w preparatach całych z wykorzystaniem mniejszej ilości odczynników oraz jak uzyskać wysokiej jakości obrazy.