Wspomagane sonikacją barwienie immunofluorescencyjne tkanek drobnoustrojowych i larwalnych drobnoustrojowych i larwalnych Drosophila in situ
14 sierpnia 2014
Barwienie immunologiczne jest skuteczną techniką wizualizacji określonych typów komórek i białek w tkankach. Wykorzystując sonikację, opisany tutaj protokół łagodzi potrzebę preparowania tkanek Drosophila melanogaster z zarodków i larw w późnym stadium przed barwieniem immunologicznym. Zapewniamy skuteczną metodologię barwienia immunologicznego całych larw utrwalonych formaldehydem.
Ogólnym celem tej procedury jest wizualizacja lub nasycenie tkanek w C dwa za pomocą mikroskopii fluorescencyjnej po sonikacji. Osiąga się to poprzez pobranie próbek embrionalnych i larwalnych, a następnie utrwalenie ich za pomocą formaldehydu, heptanu i metanolu. Drugim krokiem jest sonikacja utrwalonej próbki w celu usunięcia naskórka, aby umożliwić penetrację przeciwciał.
Następnie próbka jest barwiona immunologicznie z pierwszorzędowymi i fluorescencyjnymi przeciwciałami drugorzędowymi. Ostatnim krokiem jest zamontowanie próbki w roztworze Antify na bazie glicerolu. Ostatecznie mikroskopia konfokalna lub epifluorescencyjna służy do wizualizacji rozwijającej się tkanki, a także ekspresji i lokalizacji białek.
Główną zaletą tej techniki w porównaniu z innymi metodami, takimi jak sekcja tkanek, jest to, że pozwala na wizualizację różnych rozwijających się tkanek. Ogólnie rzecz biorąc, osoby nowe w tej metodzie będą miały trudności, ponieważ etap sonikacji zależy od wielu czynników, aby osiągnąć maksymalną wydajność, w tym od prawidłowego ustawienia sondy sonica. Procedurę zademonstrują Ashley Fiddler i Lauren Bole, dwie utalentowane badaczki z mojego laboratorium.
Aby rozpocząć eksperyment, należy ostrożnie usunąć zarodki zebrane na płytce agarowej za pomocą małego pędzelka połączonego z buforem fosforanowym Triton X 100 lub roztworem PBTX. Następnie przetrzyj pędzel z próbką o grzbiet sitka do komórek. Umieść pokrywę szalki Petriego pod sitkiem do komórek.
Następnie opłucz pędzel i ścianki sitka komórkowego butelką ze spryskiwaczem zawierającą PBTX. Po przeniesieniu próbki do sitka wlej do sitka tyle PBTX, aby podnieść próbkę z siatki. Powtórz ten krok trzy razy, aby usunąć drożdże i odpady much, usuń PBTX.
Następnie wlej 50% roztwór wybielacza do sitka i pozwól larwom siedzieć w roztworze przez pięć minut. Następnie usuń roztwór. Następnie przemyj próbkę PBTX i pozostaw próbkę w roztworze na trzy minuty.
Powtórz ten krok pięć razy, osusz dno sitka do komórek. Następnie za pomocą pędzla połączonego z PBTX przenieś próbkę do fiolki scyntylacyjnej zawierającej 1,75 mililitra pems. W dygestorium dodaj 250 mikrolitrów 37% formaldehydu i osiem mililitrów odczynnika.
Heptan do fiolki scyntylacyjnej i wstrząsać fiolką z prędkością 200 obr./min przez 20 minut. Następnie dodać 10 mililitrów metanolu do fiolki scyntylacyjnej bez usuwania fazy wodnej i energicznie wstrząsnąć z prędkością 500 obr./min. Po wstrząśnięciu natychmiast wlej zawartość do sitka komórkowego nad pojemnikiem na odpady płynne.
Dodać więcej metanolu do fiolki i przepuścić zawartość przez sitko do komórek. Aby upewnić się, że cała próbka została usunięta. Wypróbuj dno sitka komórkowego z tkanką laboratoryjną.
Następnie za pomocą pędzla przenieś próbkę z sitka do 1,5 mililitrowej mikroprobówki wirówkowej zawierającej 0,5 mililitra metanolu. Poczekaj, aż próbka się uspokoi. Następnie usuń metanol za pomocą pipety i zastąp go świeżą 0,5 mililitrową porcją metanolu.
Powtórz ten krok trzy razy i dodaj ostatnie 0,5 mililitra metanolu do probówki przed przechowywaniem jej w temperaturze minus 20 stopni Celsjusza. Na później należy pobrać przechowywaną próbkę z zamrażarki i usunąć metanol za pomocą pipety. Następnie dodaj jeden mililitr 50% roztworu buforu fosforanowego metanolu lub PBTW do probówki i kołysz probówką przez trzy minuty.
Następnie dwukrotnie przepłucz próbkę jednym mililitrem PBTW, pozwalając próbce osiąść przed pobraniem PBTW za pomocą pipety, dodaj 1,0 mililitra buforowanej albuminą fosforanu surowicy bydlęcej lub BBTW do fiolki i kołysz nią przez trzy minuty. Pozostawić próbkę do osiadania i usunąć BBTW za pomocą pipety. Powtórz ten krok dwa razy.
Należy zachować ostrożność, aby usunąć jak największą ilość BBTW, nie tracąc przy tym żadnej części próbki. Następnie dodaj 0,5 mililitra BBTW do probówki i umieść ją na lodzie. Następnie ustaw sonikat na 10% maksymalnej amplitudy i czas pracy wynoszący dwie sekundy ze stałą acją, wyczyść sondę atora, umieszczając końcówkę sondy w stożkowej rurce o pojemności 50 mililitrów wypełnionej wodą dejonizowaną i uruchom sonicate.
Następnie osuszyć sondę sonikacyjną chusteczką laboratoryjną. Zanurz sondę w probówce, trzy do czterech milimetrów nad próbką i rozpocznij sonikację. Następnie wyjmij probówkę i umieść ją na lodzie na 30 sekund, aby zapobiec przegrzaniu w wyniku sonikacji i umożliwić próbce osadzenie się na dnie probówki.
Powtórz ten krok zgodnie z wymaganiami wieku próbki po zakończeniu sonikacji. Przepłukać próbkę dwa razy jednym mililitrem BBTW. Po każdym płukaniu pozwól próbce osiąść przed wysuszeniem BBTW Za pomocą pipety dodaj jeden mililitr BBTW do fiolki i umieść ją na kołysce.
Po trzech minutach odczekać, aż próbka się uspokoi i usunąć BBTW za pomocą pipety. Następnie powtórz to. Wykonaj dwa kroki, zablokuj próbkę 0,5 mililitra 5% normalnej surowicy rozcieńczonej w BBTW do probówki i umieść próbkę na rockerze na godzinę w temperaturze pokojowej.
Następnie dodaj 0,5 mililitra roztworu przeciwciała pierwszorzędowego i kołysz próbkę przez noc w temperaturze czterech stopni Celsjusza, pozwól próbce osiąść na dnie probówki. Następnie odciągnąć przeciwciała pierwszorzędowe za pomocą pipety i spłukać dwukrotnie jednym mililitrem BBTW. Dodaj jeden mililitr BBTW do fiolki, a następnie umieść ją na kołysce na trzy minuty.
Następnie wyjmij BBTW za pomocą pipety i powtórz tę czynność. Wykonaj pięciokrotny krok, zablokuj próbkę 5% normalnym roztworem BBTW w surowicy i kołysz nią przez 30 minut. Następnie usuń roztwór.
Dodać przeciwciało wtórne rozcieńczone w 5% normalnym roztworze BBTW surowicy i zawinąć probówkę w folię aluminiową. Następnie wstrząsnij próbką przez noc w temperaturze czterech stopni Celsjusza. Pobrać przeciwciała drugorzędowe za pomocą pipety i dwukrotnie przepłukać próbkę jednym mililitrem PBTW.
Następnie dodaj jeden mililitr PBTW do fiolki i umieść ją na kołysku na pięć minut. Następnie pozwól próbce się osiąść i usuń PBTW za pomocą pipety. Powtórz to.
Zrób to trzy razy. Dodaj 80 do 100 mikrolitrów roztworu co DAB do probówki i przechowuj ją w temperaturze minus 20 stopni Celsjusza. Na koniec, aby zamontować próbkę, użyj od pięciu do 10 mikrolitrów dabu BCO p lene diaminy lub PPD anti blade.
Następnie obejrzyj go za pomocą mikroskopii fluorescencyjnej. Te projekcje Z czterech warstw konfokalnych pokazują skuteczność protokołu w wizualizacji cech morfologicznych, a także pojedynczych komórek w C dwa podczas późnego embrionalnego do wczesnego i środkowego L trzech etapów rozwoju drosophila. Rozwój jąder jest szczególnie dobrym systemem do zilustrowania skuteczności protokołu, ponieważ dojrzewanie jąder jest dynamiczne przez cały okres rozwoju larw.
Obrazy te uwydatniają komórki rozrodcze w komórkach czerwonych i centralnych oraz strefy FU w zielonych pojedynczych sekcjach konfokalnych środkowego L trzymózgowia. Barwienie immunologiczne komórek macierzystych zwojów, niezróżnicowanych neuronów w neuronach zielonych i niedojrzałych oraz pierwotnych. Na czerwono pokazują silne zabarwienie z wyraźnymi wzorcami ekspresji w płatach mózgu i brzusznym rdzeniu nerwowym, w zależności od orientacji montażu, obrazowanie pozwala na wizualizację tkanki mózgowej od powierzchni grzbietowej, brzusznej lub w przekroju strzałkowym.
Ta technika in situ pozwala biologom badać rozwój narządów w morfogenezie tkanek w organizmach, w których ochronny naskórek uniemożliwia przenikanie przeciwciał. Po obejrzeniu tego filmu powinieneś dobrze zrozumieć, jak sonizować i immunobarwić próbki przełyku w późnym stadium zarodkowym i larwalnym, aby uwidocznić rozwijające się tkanki w C dwa. Nie zapominaj, że praca z formaldehydem, heptanem i metanolem może być bardzo niebezpieczna i wymaga środków ostrożności, takich jak praca pod wyciągiem.
Podczas wykonywania tej procedury należy zawsze przestrzegać noszenia odpowiednich rękawic i fartucha laboratoryjnego.
Wyświetl pełny transkrypt i uzyskaj dostęp do tysięcy filmów naukowych
Przegląd
Niniejszy artykuł przedstawia protokół immunobarwienia tkanek Drosophila melanogaster z wykorzystaniem sonikacji. Metoda ta umożliwia wizualizację specyficznych typów komórek i białek bez konieczności przeprowadzania sekcji, co zwiększa wydajność badań nad rozwijającymi się tkankami.
Kluczowe elementy badania
Dziedzina nauki
- Neuronauka
- Biologia komórki
- Biologia rozwoju
Wstęp
- Immunobarwienie jest kluczowe dla wizualizacji białek w tkankach.
- Tradycyjne metody często wymagają sekcji, co może być czasochłonne.
- Sonikacja może ułatwić penetrację przeciwciał poprzez usunięcie kutykuli.
- Mikroskopia fluorescencyjna jest wykorzystywana do obserwacji lokalizacji białek.
Cel badania
- Aby zapewnić wydajny protokół immunobarwienia dla larw w całości.
- Aby zwizualizować ekspresję białek w tkankach Drosophila.
- Aby poprawić dostępność penetracji przeciwciał w próbkach utrwalonych.
Zastosowane Metody
- Pozyskiwanie próbek embrionalnych i larwalnych.
- Fiksacja przy użyciu formaldehydu, heptanu i metanolu.
- Sonikacja w celu usunięcia kutykuli.
- Immunobarwienie z użyciem przeciwciał pierwszorzędowych i fluorescencyjnych przeciwciał wtórnych.
Główne wyniki
- Skuteczna wizualizacja rozwijających się tkanek przy użyciu mikroskopii fluorescencyjnej.
- Efektywna penetracja przeciwciał uzyskana dzięki sonikacji.
- Wyraźna lokalizacja białek w próbkach.
- Protokół zwiększa wydajność procedur immunobarwienia.
Wnioski
- Opisana metoda upraszcza proces immunobarwienia.
- Sonikacja jest cenną techniką przygotowywania tkanek Drosophila.
- Protokół ten może zostać szeroko zastosowany w podobnych badaniach z zakresu biologii rozwoju.
Najczęściej zadawane pytania
Znaczenie dla przemysłu
Ta metoda immunofluorescencji wspomagana sonikacją rozwiązuje kluczowy problem w badaniach nad biologią rozwoju: nieprzepuszczalność kutykuli w późnych stadiach embrionalnych i larwalnych Drosophila, która utrudnia penetrację przeciwciał. Dzięki umożliwieniu barwienia immunocytochemicznego całych preparatów bez konieczności sekcji, protokół ten zwiększa wydajność i zachowuje morfologię tkanek, wspierając wiarygodną walidację celów w badaniach genetycznych i fenotypowych. Podejście to zwiększa pewność prognostyczną we wczesnej fazie odkryć, dostarczając ilościowych, rozdzielczych przestrzennie danych o ekspresji białek, które są kluczowe dla mechanistycznego ograniczania ryzyka w hipotezach terapeutycznych.
Strategiczne zastosowania w badaniach i rozwoju biofarmaceutycznym
Wczesne odkrywanie i walidacja celu
- Wartość naukowa: Umożliwia weryfikację hipotez terapeutycznych poprzez wizualizację lokalizacji białek w nienaruszonych tkankach, co zmniejsza niejednoznaczność mechanistyczną.
- Wartość operacyjna: Wspiera wysokoprzepustowe przetwarzanie dużej liczby próbek, zwiększając wydajność procesów walidacji celów.
- Wartość strategiczna: Ułatwia screening fenotypowy, umożliwiając jednoczesną analizę wielu typów tkanek (np. jąder, jajników, tkanek nerwowych) na różnych etapach rozwoju.
Przesiewanie i opracowywanie testów
- Wartość naukowa: Generuje ilościowe odczyty fluorescencji, które umożliwiają zestandaryzowaną ocenę poziomów ekspresji antygenów.
- Wartość operacyjna: Zachowuje architekturę tkanki in situ, zapewniając powtarzalność testu i ograniczając zmienność wynikającą z artefaktów preparatyki.
- Wartość strategiczna: Przygotowuje zwalidowane systemy biologiczne do późniejszego przesiewu związków poprzez potwierdzenie zaangażowania celu oraz wzorców ekspresji.
Badania translacyjne i przedkliniczne
- Wartość naukowa: Zapewnia rozdzielczość komórkową istotną dla badania chorób w modelach Drosophila, wspierając translacyjne odkrywanie biomarkerów dla szlaków neurorozwojowych i rozrodczych.
- Wartość operacyjna: Umożliwia zachowanie ciągłości od etapu odkryć po walidację przedkliniczną dzięki utrzymaniu spójnych protokołów przygotowania tkanek i barwienia.
- Wartość strategiczna: Wspiera decyzje o dalszym rozwoju projektu w oparciu o analizę ryzyka poprzez dostarczanie wiarygodnych danych dotyczących lokalizacji białek z rozdzielczością przestrzenną.
Integracja potoku i przepływu pracy
Metoda ta integruje się z kontinuum procesów badawczych, od wczesnej walidacji celu po identyfikację związku wiodącego, szczególnie w sytuacjach, gdy przesiewy fenotypowe wymagają analizy nienaruszonej tkanki i ilościowego określenia lokalizacji białek.
- Biologia odkrywcza: Wspiera testowanie hipotez i wyjaśnianie szlaków sygnałowych poprzez umożliwienie wizualizacji specyficznych typów komórek i ekspresji białek w rozwijających się tkankach.
- Przesiewanie: Zapewnia gotowość do analiz dzięki zestandaryzowanemu, powtarzalnemu barwieniu immunocytochemicznemu z ilościowymi wynikami fluorescencji odpowiednimi do oceny związków.
- Analityka: Generuje mierzalne odczyty (intensywność fluorescencji, wzorce lokalizacji), które pozwalają zespołom porównywać warunki eksperymentalne i oceniać modulację celu.
- Badania translacyjne: Zapewnia ciągłość przedkliniczną poprzez dostarczenie danych na poziomie tkanki, zgodnych z fenotypami rozwojowymi istotnymi dla ludzkich modeli chorób.
- Wykorzystanie przedsiębiorstwa: Ustanawia możliwość wielokrotnego wykorzystania przygotowania próbek, którą można zastosować w wielu projektach z zakresu biologii rozwoju i przesiewania genetycznego.
Wpływ operacyjny i przedsiębiorczy
- Wartość naukowa: Zwiększa pewność prognostyczną poprzez redukcję wyników fałszywie ujemnych wynikających ze słabej penetracji przeciwciał oraz poprawę dokładności walidacji celu.
- Wartość operacyjna: Poprawia standaryzację i skalowalność dzięki usprawnionemu protokołowi bez konieczności sekcji, kompatybilnemu z przetwarzaniem dużych ilości próbek.
- Wartość strategiczna: Usprawnia podejmowanie decyzji o kontynuacji lub przerwaniu badań (go/no-go) poprzez dostarczanie wiarygodnych informacji mechanistycznych, co redukuje ryzyko biologiczne na późnych etapach rozwoju celu.
- Wpływ na portfolio: Umożliwia priorytetyzację celów z uwzględnieniem ryzyka w oparciu o zwalidowane wzorce ekspresji oraz istotność funkcjonalną w systemach istotnych dla danej choroby.
Wskazówki dotyczące wdrożenia
- Wymaga doświadczenia w optymalizacji parametrów sonikacji (pozycja sondy, amplituda, czas trwania), aby uniknąć uszkodzenia próbki przy jednoczesnym zapewnieniu usunięcia kutykuli.
- Zależne od dostępu do sprzętu do sonikacji z precyzyjną kontrolą amplitudy i czasu, a także od standardowych odczynników do immunofluorescencji i mikroskopii fluorescencyjnej.
- Wymaga międzyzespołowej standaryzacji protokołów sonikacji i barwienia w celu zapewnienia powtarzalności wyników pomiędzy różnymi użytkownikami i laboratoriami.
- Wiąże się z koniecznością dostosowania metody do różnych typów tkanek i stadiów rozwojowych Drosophila, ponieważ efektywność sonikacji może różnić się w zależności od wieku próbki i grubości kutykuli.
- Obejmuje ograniczenia praktyczne, takie jak konieczność optymalizacji czasu inkubacji przeciwciał dla celów o niskiej liczności oraz ostrożne obchodzenie się z niebezpiecznymi odczynnikami (formaldehyd, heptan, metanol).
