Name: Wspomagane sonikacją barwienie immunofluorescencyjne tkanek drobnoustrojowych i larwalnych drobnoustrojowych i larwalnych Drosophila in situ (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-08-14T14:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 10 s
Description: Poznaj protokół barwienia immunofluorescencyjnego tkanek Drosophila melanogaster wspomagany sonikacją. Metoda umożliwia wizualizację białek bez konieczności mikroskopijnej dyssekcji.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Jesteśmy wdzięczni Ruth Lehman i Dorthei Godt, które uprzejmie dostarczyły przeciwciała Vasa i Traffic Jam. Chcielibyśmy podziękować Bloomington Stock Center na Uniwersytecie Indiana za utrzymanie dostarczonych zapasów oraz Developmental Studies Hybridoma Bank opracowany pod auspicjami NICHD i utrzymywany przez Uniwersytet Iowa. Dziękujemy wszystkim członkom laboratorium Wawersik za rady i wsparcie. Praca ta została sfinansowana z Monroe Scholars Program Grant (dla AF i LB) oraz grantu NSF IOS0823151 (dla MW).

1. Przygotowanie klatki na zbiórkę
<ol>
	<li>Znieczulenie młodych, płodnych much za pomocą CO2 . Przenieś znieczulone muchy do klatki. Aby uzyskać optymalny plon, użyj 100-120 dorosłych much w wieku od 2 do 7 dni w stosunku 4:1 samic do samców. Pozwól muchom na odpowiedni okres aklimatyzacji, ~ 24 godziny przed pobraniem próbki do utrwalenia. Jeśli klatka została założona z dziewiczymi samicami krytymi samcami, należy zastosować 36-48-godzinny okres aklimatyzacji.</li>
	<li>Na otwartym końcu klatki umieść wstępnie przygotowany talerz agarowy z sokiem jabłkowym z kroplą pasty drożdżowej wielkości dziesięciocentówki pośrodku nad otworem klatki. Następnie zabezpiecz taśmą. Uszczelnij połączenie między płytką agarową z sokiem jabłkowym a klatką za pomocą Parafilm.</li>
	<li>Umieść klatkę w dodatkowym pojemniku z płytką agarową z sokiem jabłkowym jako podstawą i pozwól muchom rozmnażać się w określonej temperaturze przez odpowiedni okres czasu, jak określono w doświadczeniu. 
	Uwaga: Czasy pobierania próbek będą się różnić. Na przykład, podczas pobierania zarodków w późnym stadium rozwoju/wczesnych larw L1 (17–24 godziny), należy pozwolić muszkom na złożenie jaj na płytkach agarowych z sokiem jabłkowym przez 7 godzin w temperaturze 25 °C, a następnie poddać próbce starzenie się przez 17 godzin w temperaturze 25 °C. Podobnie w przypadku zbioru larw pierwszego stadium rozwojowego w średnim okresie (36–48 godzin) należy pozwolić muchom na składanie jaj przez 12 godzin w temperaturze 25 °C przed leżakowaniem próbki przez 36 godzin w temperaturze 25 °C.</li>
	<li>Po upływie tego czasu postukaj klatką o stół, aby muchy spadły z talerza z sokiem jabłkowym bez znieczulenia. Szybko wymień zużyty talerz na świeży zawierający kroplę pasty drożdżowej. Zabezpiecz świeżą płytkę taśmą i parafolią i przechowuj klatkę z płytą agarową z sokiem jabłkowym jako podstawą.</li>
	<li>Ostrożnie usuń kroplę drożdży z używanej płytki metalową szpatułką. Przykryj pokrywką talerz z zużytym sokiem jabłkowym i pozwól złożonym zarodkom dożakować do starzenia się, jeśli jest to konieczne eksperymentalnie. 
	Uwaga: Podczas starzenia próbek płytki mogą być przechowywane w temperaturze 25 °C, chyba że doświadczalnie wymagane są wyższe temperatury. Przykłady starzenia zarodków do pobrania opisano powyżej (patrz uwaga do kroku 1.3). Usuwanie pasty drożdżowej przed starzeniem próbki jest wykonywane, aby zapobiec wpełzaniu larw do drożdży i rozbijaniu agaru pod spodem. Pozostały sok jabłkowy, agar i pozostałości pasty drożdżowej dostarczają składników odżywczych dla wzrostu larw. Podczas gdy zarodki złożone bezpośrednio w paście drożdżowej są tracone w wyniku usunięcia pasty drożdżowej, utrata ta jest lepsza niż pozostałości drożdży i agaru w próbce, co może zmniejszyć wydajność barwienia. W przypadku nieusuwania pasty drożdżowej, drożdże można upłynnić za pomocą buforu fosforanowego Triton X-100 (PBTx), zmieszać pędzlem, a następnie usunąć z próbki za pomocą sitka do komórek przed utrwaleniem.</li>
</ol>
2. Fiksacja
<ol>
	<li>Gdy zarodki ułożone na płytce agarowej z sokiem jabłkowym osiągną wiek dojrzały, użyj małego pędzla zwilżonego roztworem buforu fosforanowego Triton X-100 (PBTx), aby ostrożnie usunąć próbkę z płytki. 
	Uwaga: Starsze larwy są ruchome i mogą pełzać po wewnętrznej stronie pokrywy. Próbkę tę można pobrać w podobny sposób, usuwając ją pędzlem.</li>
	<li>Przetrzyj pędzel z próbką o skierowany do wewnątrz grzbiet sitka do komórek. Następnie spłucz ścianki sitka i pędzel butelką ze spryskiwaczem zawierającą roztwór PBTx. Umieść pokrywę szalki Petriego pod sitkiem, aby uchwycić roztwór PBTx.</li>
	<li>Po przeniesieniu całej próbki do sitka wlej do sitka tyle PBTx, aby podnieść próbkę z siatki. Następnie podnieś sitko i wlej zawartość szalki Petriego do pojemnika na odpady płynne.</li>
	<li>Powtórzyć krok 2.3 trzy razy, aby usunąć odpadki drożdży i much, które mogły zostać przeniesione wraz z próbką.</li>
	<li>Wlej wystarczającą ilość 50% roztworu wybielacza (NaOCl)/wody (ddH2O) do sitka, aby podnieść larwy z siatki. Pozostaw larwy w roztworze na 5 minut. Następnie podnieś sitko i wylej zawartość szalki Petriego do pojemnika na odpady płynne. 
	Uwaga: Wybielacz jest wymagany tylko w próbkach embrionalnych w wieku od 0 do 22 godzin w celu usunięcia błony kosmówkowej. Stosowanie wybielacza do starszych próbek można pominąć, ale jego włączenie nie jest szkodliwe. Jeśli pożądane jest pominięcie, zastąp wybielacz na tym etapie PBTx. Rozcieńczony wybielacz należy zużyć w ciągu 24 godzin od przygotowania roztworu.</li>
	<li>Przemyć próbkę w sitku za pomocą PBTx, wlewając do sitka tyle PBTx, aby podnieść próbkę z siatki. Pozostawić próbkę w roztworze na 3 minuty. Następnie podnieś sitko i wlej zawartość szalki Petriego do pojemnika na odpady płynne.</li>
	<li>Powtórz krok 2.6 pięć razy.</li>
	<li>Osuszyć dno sitka do komórek, a następnie przenieść próbkę do fiolki scyntylacyjnej zawierającej 1,75 ml roztworu PEMS za pomocą pędzla.</li>
	<li>Pracując w wentylowanym dygestorium, dodaj 250 μl 37% formaldehydu i 8 ml odczynnika heptanu do fiolki scyntylacyjnej. 
	Uwaga: Formaldehyd i heptan są niebezpieczne. Ze względów bezpieczeństwa należy kontynuować pracę pod wentylowanym wyciągiem i nosić odpowiednie rękawice do czynności 2.9 – 3.3.</li>
	<li>Pozostawić fiolkę do wstrząsania z prędkością 200 obr./min lub podobną umiarkowaną prędkością przez 20 minut.</li>
	<li>Dodać 10 ml metanolu do fiolki scyntylacyjnej bez usuwania poprzedniej fazy wodnej i pozostawić fiolkę do energicznego wstrząsania z prędkością 500 obr./min przez 1 min. 
	Uwaga: Metanol jest niebezpieczny. Kontynuuj pracę w wentylowanym dygestorium i noś odpowiednie rękawice.</li>
	<li>Wyjąć fiolkę z shakera i natychmiast wlać zawartość do sitka komórkowego nad pojemnikiem na odpady płynne w kapturze. Dodać dodatkową ilość metanolu do fiolki i w razie potrzeby przepuścić przez sitko do komórek, aby upewnić się, że cała próbka została usunięta. 
	Uwaga: Sitka do komórek mogą powoli spływać. Aby temu zaradzić, należy przyłożyć tkankę laboratoryjną do dna sitka komórkowego, aby szybciej przeciągnąć roztwór przez sitko. Metanol, formaldehyd i heptan powinny być przechowywane w odpowiednich pojemnikach na odpady do czasu właściwej utylizacji zgodnie z wytycznymi instytucjonalnymi.</li>
	<li>Osuszyć dno sitka komórkowego za pomocą chusteczki laboratoryjnej, a następnie za pomocą pędzla przenieść próbkę pobraną z sitka do probówki mikrowirówkowej o pojemności 1,5 ml zawierającej 0,5 ml metanolu. 
	Uwaga: Jeśli używanych jest wiele fiolek scyntylacyjnych, należy wykonywać kroki 2.12 i 2.13 po jednej fiolce na raz, aby zapobiec wysychaniu próbki na sitkach do komórek.</li>
	<li>Po dodaniu próbki do probówki mikrowirówki usuń metanol za pomocą pipety. Upewnij się, że próbka osiadła na dnie probówki.</li>
	<li>Przepłukać próbkę w probówce do mikrowirówki, dodając do probówki około 0,5 ml metanolu. Poczekaj, aż próbka się uspokoi, a następnie usuń metanol za pomocą pipety.</li>
	<li>Powtórz krok 15 trzy razy.</li>
	<li>Dodaj 0,5 ml metanolu do probówki, a następnie przechowuj w zamrażarce w temperaturze -20 °C do późniejszego wykorzystania.</li>
</ol>
3. Rehydratacja i przygotowanie próbki do barwienia immunologicznego
<ol>
	<li>Usunąć metanol z probówki mikrowirówki za pomocą pipety, pozostawiając próbkę w probówce. Odpady metanolu należy przechowywać w odpowiednim pojemniku na odpady do czasu ich prawidłowej utylizacji. 
	Uwaga: Aby zwiększyć skuteczność sonikacji, należy użyć nie więcej niż 3 mm próbki osadzonej na dnie probówki do mikrowirówki o pojemności 1,5 ml. Nadmiar próbki można przenieść do oddzielnej probówki za pomocą pipety przed rozpoczęciem powyższego etapu hydratacji. Aby zapobiec zatkaniu końcówki pipety za pomocą czystej żyletki, można przeciąć końcówkę pipety.</li>
	<li>Dodaj 1,0 ml 50% roztworu metanolu/buforu fosforanowego (PBTw) do probówki i miażdż przez 3 minuty.</li>
	<li>Usunąć roztwór metanolu do odpowiedniego pojemnika na odpady i dwukrotnie spłukać 1,0 μl PBTw. Po każdym płukaniu należy odczekać, aż próbka osiada, a następnie pobrać PBTw za pomocą pipety.</li>
	<li>Dodać 1,0 ml mieszanki albuminy bydlęcej i buforu fosforanowego (BBTw) do fiolki i rozdrabniać. Po 3 minutach na kołysce poczekaj, aż próbka się uspokoi i wyjmij BBTw za pomocą pipety.</li>
	<li>Powtórz krok 3.4 dwa razy, uważając, aby usunąć jak najwięcej BBTw bez utraty próbki po ostatnim praniu.</li>
	<li>Dodać 0,5 ml BBTw do probówki i umieścić probówkę na lodzie.</li>
</ol>
4. Sonikacja próbki
<ol>
	<li>Ustaw sonikator na maksymalną amplitudę 10% i wyznacz czas pracy 2 sekundy stałej sonikacji. 
	Uwaga: Ustawienia te są specyficzne dla sonikatora wskazanego w Tabeli Materiałów i Sprzętu i mogą wymagać optymalizacji dla różnych sonikatorów.</li>
	<li>Przed sonikacją próbki należy oczyścić sondę sonikatora, umieszczając końcówkę sondy w stożkowej probówce o pojemności 50 ml wypełnionej wodą dejonizowaną i uruchomić sonikator w celu wyczyszczenia sondy. Sucha sonda sonicyjna z tkanką laboratoryjną po uruchomieniu.</li>
	<li>Zanurz sondę w probówce mikrowirówki zawierającej próbkę tak, aby znajdowała się około 3 do 4 mm nad próbką i rozpocznij sonikację.</li>
	<li>Wyjmij probówkę do mikrowirówki i umieść ją na lodzie na co najmniej 30 sekund, aby rozproszyć ciepło z sonikacji i pozwolić, aby próbka osiadła na dnie probówki do mikrowirówki.</li>
	<li>W razie potrzeby powtórzyć kroki 4.3 i 4.4 w zależności od wieku przetwarzanej próbki. 
	Uwaga: Aby uzyskać optymalną objętość próbki sonikacji, zarodki młodsze niż 17 godzin nie wymagają sonikacji, ale te między 17 a 24 godzinami (stadium 17/wczesny L1) wymagają dwóch sonikacji. Larwy w wieku od 24 do 36 lat (wczesne/środkowe L1), 36 - 48 (średnie/późne L1), 48 - 60 (wczesne/średnie-L2), 60 - 72 (średnie/późne-L2), 72 - 84 (wczesne/średnie-L3), 84 - 96 - 96 (wczesne/średnie-L3) wymagają odpowiednio 5, 9, 11, 13, 15, 18 i 22 sonikacji. Zobacz dyskusję w celu dalszego opracowania na temat czasów sonikacji.</li>
	<li>Dwukrotnie spłukać 1,0 ml BBTw. Po każdym płukaniu odczekać, aż próbka się uspokoi, a następnie pobrać BBTw za pomocą pipety.</li>
	<li>Dodać 1,0 ml BBTw do fiolki i rozdrobnić. Po 3 minutach na kołysce poczekaj, aż próbka się uspokoi i wyjmij BBTw za pomocą pipety.</li>
	<li>Powtórz krok 4.7 dwa razy.</li>
</ol>
5. Barwienie immunologiczne
<ol>
	<li>Zablokować próbkę, dodając 5% normalnej surowicy rozcieńczonej w BBTw do probówki mikrowirówkowej. Usuń blok po kołysaniu przez 1 godz. 
	Uwaga: Należy użyć normalnej surowicy z gatunku, w którym wytwarzane są przeciwciała drugorzędowe.</li>
	<li>Rozcieńczyć przeciwciała pierwszorzędowe do odpowiedniego stężenia roboczego w 5% normalnym roztworze surowicy/BBTw.</li>
	<li>Próbkę skały w pierwszorzędowym roztworze przeciwciała O/N w temperaturze 4 °C lub przez co najmniej 3 godziny w temperaturze pokojowej (około 22 °C. 
	Uwaga: Czas inkubacji przeciwciał i temperatury mogą się różnić. Inkubacja O/N w temperaturze 4 °C lub 3 godziny w temperaturze pokojowej jest zazwyczaj wystarczająca. Jednak dwudniowy okres inkubacji może poprawić jakość barwienia, szczególnie w przypadku starszych próbek lub gdy stosowane są przeciwciała pierwotne o niskim powinowactwie. Dłuższe inkubacje przeprowadza się zazwyczaj w temperaturze 4 °C. Podobne względy należy wziąć pod uwagę przy stosowaniu przeciwciał drugorzędowych (patrz ppkt 5.10).</li>
	<li>Pozwól, aby próbka osiadła na dnie probówki do mikrofuge. Pobrać przeciwciała pierwotne za pomocą pipety. W razie potrzeby zachowaj przeciwciała do ponownego użycia.</li>
	<li>Dwukrotnie spłukać 1,0 ml BBTw. Po każdym płukaniu odczekać, aż próbka się osadzi, a następnie pobrać BBTw za pomocą pipety.</li>
	<li>Dodać 1,0 ml BBTw do fiolki i rozdrobnić. Po 3 minutach na wahaczu pozostawić próbkę do osiadania i usunąć BBTw za pomocą pipety.</li>
	<li>Powtórz krok 5.6 pięć razy.</li>
	<li>Zablokować próbkę, dodając 5% normalnego roztworu surowicy/BBTw do probówki mikrowirówkowej. Usuń blok po kołysaniu przez 30 minut do 1 godz. 
	Uwaga: Ten dodatkowy etap blokowania nie jest wymagany, ale może poprawić jakość barwienia dla określonych przeciwciał.</li>
	<li>Rozcieńczyć przeciwciała drugorzędowe do odpowiedniego stężenia roboczego w 5% normalnym roztworze surowicy/BBTw.</li>
	<li>Owiń probówkę mikrowirówki folią aluminiową, aby zmniejszyć blaknięcie spowodowane ekspozycją na światło. Próbkę skalną w roztworze przeciwciał drugorzędowych przez 12–48 godzin w temperaturze 4 °C lub przez co najmniej 3 godziny w temperaturze pokojowej (około 22 °C).</li>
	<li>Pozwól, aby próbka osiadła na dnie probówki do mikrofuge. Pobrać przeciwciała wtórne za pomocą pipety.</li>
	<li>Dwukrotnie przepłukać 1,0 ml PBTw. Po każdym płukaniu odczekać, aż próbka się uspokoi, a następnie pobrać PBTw za pomocą pipety.</li>
	<li>Dodać 1,0 ml PBTw do fiolki i rozdrobnić. Po 5 minutach na wahaczu poczekaj, aż próbka się uspokoi i usuń PBTw za pomocą pipety.</li>
	<li>Powtórz krok 5.13 trzy razy.</li>
	<li>OPCJONALNIE: Dodać DAPI rozcieńczony w stosunku 1:1 000 w PBTw. Próbkę skały zawinąć w folię aluminiową na 3 minuty, a następnie usunąć roztwór DAPI za pomocą pipety. Przepłukać pięć razy 1,0 ml PBTw, pozwalając próbce osiąść przed usunięciem PBTw za pomocą pipety.</li>
	<li>Dodać 80 - 100 μl roztworu 1,4-diazabicyklo[2.2.2]oktanu (DABCO) do probówki do mikrowirówki i przechowywać w temperaturze -20 °C. 
	Uwaga: Można zastąpić inny środek zapobiegający blaknięciu na bazie glicerolu.</li>
</ol>
6. Analiza
<ol>
	<li>Przed zamontowaniem próbki na szkiełkach należy dodać dodatkowe 5 - 10 μl roztworu zapobiegającego blaknięciu DABCO/p-fenylenodiaminy (PPD) do probówki mikrowirówkowej. 
	Uwaga: Próbkę można dodawać do slajdów bez sekcji. Objętość próbki dodanej do szkiełka zmienia się w zależności od rozmiaru szkiełka nakrywkowego. Podczas pipetowania próbki na szkiełko można odciąć końcówkę pipety za pomocą żyletki, aby zapobiec ścinaniu próbki. Często przydatne jest ułożenie próbki w rzędach w celu łatwej analizy. Dodanie PPD jako dodatkowego środka zapobiegającego blaknięciu może nie być wymagane, ale może zapobiec fotowybielaniu, jeśli próbki są przechowywane przez długi czas.</li>
	<li>Delikatnie umieść szkiełko pokrywy szklanej na próbce. Następnie zabezpiecz szkiełko nakrywkowe za pomocą lakieru do paznokci.</li>
	<li>Widok zamontowanej próbki za pomocą mikroskopii fluorescencyjnej.</li>
</ol>

<ol><li>Moore, L. A., Broihier, H. T., Van Doren, M., Lunsford, L. B., Lehmann, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+of+genes+controlling+germ+cell+migration+and+embryonic+gonad+formation+in+Drosophila%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Identification of genes controlling germ cell migration and embryonic gonad formation in Drosophila.</a> Development. 125, 667-678 (1998).</li>
<li>Rothwell, W. F., Sullivan, W. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aRothwell%2C+WF+%22Drosophila+Protocols%22">Drosophila Protocols</a>. , Cold Spring Harbor Laboratory Press. 141-157 (2000).</li>
<li>Jenkins, A. B., McCaffery, J. M., Van Doren, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Drosophila+E-cadherin+is+essential+for+proper+germ+cell-soma+interaction+during+gonad+morphogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Drosophila E-cadherin is essential for proper germ cell-soma interaction during gonad morphogenesis.</a> Development. 130, 4417-4426 (2003).</li>
<li>Ashburner, M., Golic, K., Hawley, R. S. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aAshburner%2C+M+%22Drosophila%3A+A+Laboratory+Handbook%22">Drosophila: A Laboratory Handbook</a>. , Cold Spring Harbor Laboratory Press. Ch. 6 122-205 (2005).</li>
<li>Blair, S. S. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aBlair%2C+SS+%22Drosophila+Protocols%22">Drosophila Protocols</a>. Sullivan, W., Ashburner, M., Hawley, R. S. , Cold Spring Harbor Laboratory Press. Ch. 10 159-173 (2000).</li>
<li>Patel, N. Drosophila melanogaster: Practical Uses in Cell and Molecular Biology. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aPatel%2C+N+%22Methods+in+Cell+Biology%22">Methods in Cell Biology</a>. Goldstei, L. S. B., Fryberg, E. A. , Academic Press. Vol. 44 445-487 (1994).</li>
<li>Maimon, I., Gilboa, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dissection+and+staining+of+Drosophila+larval+ovaries%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Dissection and staining of Drosophila larval ovaries.</a> J Vis Exp. , (2011).</li>
<li>Le Bras, S., Van Doren, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Development+of+the+male+germline+stem+cell+niche+in+Drosophila%5BTitle%5D)+AND+%22Dev+Biol%22%5BJournal%5D)">Development of the male germline stem cell niche in Drosophila.</a> Dev Biol. 294, 92-103 (2006).</li>
<li>Sheng, X. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Jak-STAT+regulation+of+male+germline+stem+cell+establishment+during+Drosophila+embryogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Dev+Biol%22%5BJournal%5D)">Jak-STAT regulation of male germline stem cell establishment during Drosophila embryogenesis.</a> Dev Biol. 334, 335-344 (2009).</li>
<li>Sinden, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Jak-STAT+regulation+of+cyst+stem+cell+development+in+the+Drosophila+testis%5BTitle%5D)+AND+%22Dev+Biol%22%5BJournal%5D)">Jak-STAT regulation of cyst stem cell development in the Drosophila testis.</a> Dev Biol. 372, 5-16 (2012).</li>
<li>DeFalco, T., Camara, N., Le Bras, S., Van Doren, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nonautonomous+sex+determination+controls+sexually+dimorphic+development+of+the+Drosophila+gonad%5BTitle%5D)+AND+%22Dev+Cell%22%5BJournal%5D)">Nonautonomous sex determination controls sexually dimorphic development of the Drosophila gonad.</a> Dev Cell. 14, 275-286 (2008).</li>
<li>Jemc, J. C., Milutinovich, A. B., Weyers, J. J., Takeda, Y., Van Doren, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((raw+Functions+through+JNK+signaling+and+cadherin-based+adhesion+to+regulate+Drosophila+gonad+morphogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Dev+Biol%22%5BJournal%5D)">raw Functions through JNK signaling and cadherin-based adhesion to regulate Drosophila gonad morphogenesis.</a> Dev Biol. 367, 114-125 (2012).</li>
<li>Fuller, M. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aFuller%2C+M+%22The+Development+of+Drosophila+melanogaster%22">The Development of Drosophila melanogaster</a>. Bat, M., Martinez Arias, A. , Cold Spring Harbor Press. Vol. I 71-147 (1993).</li>
<li>Cuevas, M., Matunis, E. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+stem+cell+niche%3A+Lessons+from+Drosophila+testis%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">The stem cell niche: Lessons from Drosophila testis.</a> Development. 138, 2861-2869 (2011).</li>
<li>Williamson, A., Lehmann, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Germ+cell+development+in+Drosophila%5BTitle%5D)+AND+%22Annu+Rev+Cell+Dev+Biol%22%5BJournal%5D)">Germ cell development in Drosophila.</a> Annu Rev Cell Dev Biol. 12, 365-391 (1996).</li>
<li>Jemc, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Somatic+gonadal+cells%3A+the+supporting+cast+for+the+germline%5BTitle%5D)+AND+%22Genesis%22%5BJournal%5D)">Somatic gonadal cells: the supporting cast for the germline.</a> Genesis. 49, 753-775 (2011).</li>
<li>Spradling, A. C. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aSpradling%2C+AC+%22The+Development+of+Drosophila+melanogaster%22">The Development of Drosophila melanogaster</a>. Bat, M., Martinez Arias, A. , Cold Spring Harbor Press. Vol. I 1-70 (1993).</li>
<li>Eliazer, S., Buszczak, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Finding+a+niche%3A+studies+from+the+Drosophila+ovary%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cell+Res+Ther%22%5BJournal%5D)">Finding a niche: studies from the Drosophila ovary.</a> Stem Cell Res Ther. 2, 45(2011).</li>
<li>Sahut-Barnola, I., Godt, D., Laski, F. A., Couderc, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Drosophila+ovary+morphogenesis%3A+Analysis+of+terminal+filament+formation+and+identification+of+a+gene+required+for+this+process%5BTitle%5D)+AND+%22Developmental+Biology%22%5BJournal%5D)">Drosophila ovary morphogenesis: Analysis of terminal filament formation and identification of a gene required for this process.</a> Developmental Biology. 170, 127-135 (1995).</li>
<li>Godt, D., Laski, F. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mechanisms+of+cell+rearrangement+and+cell+recruitment+in+Drosophila+ovary+morphogenesis+and+the+requirement+of+bric+a+brac%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Mechanisms of cell rearrangement and cell recruitment in Drosophila ovary morphogenesis and the requirement of bric a brac.</a> Development. 121, 173-187 (1995).</li>
<li>Gancz, D., Lengil, T., Gilboa, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Coordinated+regulation+of+niche+and+stem+cell+precursors+by+hormonal+signaling%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Biol%22%5BJournal%5D)">Coordinated regulation of niche and stem cell precursors by hormonal signaling.</a> PLoS Biol. 9, e1001202(2011).</li>
<li>Matsuoka, S., Hiromi, Y., Asaoka, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Egfr+signaling+controls+the+size+of+the+stem+cell+precursor+pool+in+the+Drosophila+ovary%5BTitle%5D)+AND+%22Mech+Dev%22%5BJournal%5D)">Egfr signaling controls the size of the stem cell precursor pool in the Drosophila ovary.</a> Mech Dev. 130, 241-253 (2013).</li>
<li>Song, X., Zhu, C. H., Doan, C., Xie, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Germline+stem+cells+anchored+by+adherens+junctions+in+the+Drosophila+ovary+niches%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Germline stem cells anchored by adherens junctions in the Drosophila ovary niches.</a> Science. 296, 1855-1857 (2002).</li>
<li>Homem, C. C., Knoblich, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Drosophila.+neuroblasts%3A+a+model+for+stem+cell+biology%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Drosophila. neuroblasts: a model for stem cell biology.</a> Development. 139, 4297-4310 (2012).</li>
<li>Urbach, R., Technau, G. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neuroblast+formation+and+patterning+during+early+brain+development+in+Drosophila%5BTitle%5D)+AND+%22BioEssays%22%5BJournal%5D)">Neuroblast formation and patterning during early brain development in Drosophila.</a> BioEssays. 26, 739-751 (2004).</li>
<li>Bello, B., Reichert, H., Hirth, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+brain+tumor+gene+negatively+regulates+neural+progenitor+cell+proliferation+in+the+larval+central+brain+of+Drosophila%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">The brain tumor gene negatively regulates neural progenitor cell proliferation in the larval central brain of Drosophila.</a> Development. 133, 2639-2648 (2006).</li>
<li>Lee, C. Y., Wilkinson, B. D., Siegrist, S. E., Wharton, R. P., Doe, C. Q. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Brat+is+a+Miranda+cargo+protein+that+promotes+neuronal+differentiation+and+inhibits+neuroblast+self-renewal%5BTitle%5D)+AND+%22Dev+Cell%22%5BJournal%5D)">Brat is a Miranda cargo protein that promotes neuronal differentiation and inhibits neuroblast self-renewal.</a> Dev Cell. 10, 441-449 (2006).</li>
<li>Betschinger, J., Mechtler, K., Knoblich, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Asymmetric+segregation+of+the+tumor+suppressor+brat+regulates+self-renewal+in+Drosophila+neural+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Asymmetric segregation of the tumor suppressor brat regulates self-renewal in Drosophila neural stem cells.</a> Cell. 124, 1241-1253 (2006).</li>
<li>Pereanu, W., Shy, D., Hartenstein, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Morphogenesis+and+proliferation+of+the+larval+brain+glia+in+Drosophila%5BTitle%5D)+AND+%22Dev+Biol%22%5BJournal%5D)">Morphogenesis and proliferation of the larval brain glia in Drosophila.</a> Dev Biol. 283, 191-203 (2005).</li>
<li>Moraru, M. M., Egger, B., Bao, D. B., Sprecher, S. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Analysis+of+cell+identity%2C+morphology%2C+apoptosis+and+mitotic+activity+in+a+primary+neural+cell+culture+system+in+Drosophila%5BTitle%5D)+AND+%22Neural+Dev%22%5BJournal%5D)">Analysis of cell identity, morphology, apoptosis and mitotic activity in a primary neural cell culture system in Drosophila.</a> Neural Dev. 7, 14(2012).</li>
</ol>

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Protokół ten zapewnia metodę skutecznego barwienia immunologicznego docelowych tkanek embrionalnych i larwalnych Drosophila in situ, eliminując w ten sposób potrzebę sekcji. Zgodnie z wcześniejszymi protokołami barwienia wczesnych zarodków1,2,3, błona kosmówkowa jest usuwana przy użyciu 50% wybielacza (NaOCl). Próbki utrwala się w formaldehydzie i metanolu. Ponieważ naskórek larwy powoduje, że starsza próbka unosi się na wodzie, cała próbka jest następnie przepuszczana przez sitko komórkowe, ...

Zarodki i larwy Drosophila stanowią doskonały model do badania procesów rozwojowych w wielu narządach i tkankach. Obrazowanie pojedynczych komórek jest często konieczne w tych badaniach w celu ustalenia złożonych środowisk, w których rozwijają się komórki. Wizualizację komórek w tkankach można osiągnąć za pomocą barwienia immunologicznego. Istnieją dobrze opisane protokoły barwienia immunologicznego dla embrionalnych tkanek Drosophila <17 godzin po złożeniu jaj (AEL)1-3. Jednak pod koniec embriogenezy tworzy się ochronny naskórek, uniemożliwiając skuteczne przenikanie przeciwciał. W związku z tym te protokoły barwienia immunologicznego są nieskuteczne w analizie tkanek w późnych stadiach rozwoju zarodków i w kolejnych stadiach rozwoju larwalnego (1. stadium (L1), 2. stadium (L2) i 3. stadium (L3)). Ta nieefektywność stanowi barierę dla naszego zrozumienia dynamicznych procesów, które zachodzą podczas tego wydłużonego okresu rozwojowego 4. Sekcja tkanek jest szeroko stosowaną techniką obchodzenia tej bariery 5-7. Jednak sekcja może okazać się nieefektywna. Ekstrakcja może być utrudniona ze względu na trudności w zlokalizowaniu lub wyizolowaniu tkanek zarodkowych i larwalnych. Ponadto fizyczne usunięcie tkanek docelowych może spowodować uszkodzenie poprzez ich rozerwanie lub niemożność wydobycia ich w całości.
Sonikacja to metoda, która wykorzystuje fale dźwiękowe do zakłócania oddziaływań międzycząsteczkowych. Stosuje się go w celu zakłócenia integralności naskórka larwalnego Drosophila w celu immunobarwienia rozwijających się komórek nerwowych typu 6. Protokół ten został dostosowany do barwienia immunologicznego gonad embrionalnych i larwalnych w późnym stadium, które mogą mieć nawet 50 μm średnicy 8-10. Dzięki takim badaniom scharakteryzowano proces tworzenia się niszy męskich komórek macierzystych linii rozrodczej (GSC) w późnym stadium rozwoju zarodków Drosophila 8-10, a mechanizmy regulujące rozwój i różnicowanie komórek macierzystych w późnym stadium zarodków i larw 9-12. W ten sposób sonikacja stanowi skuteczną alternatywę dla rozwarstwienia tkanek, które może być trudne ze względu na rozmiar tkanki. Ponadto umożliwia barwienie immunologiczne tkanek Drosophila in situ, pozostawiając komórki w kontekście całego organizmu i zachowując morfologię in situ. W tym miejscu opisujemy krok po kroku protokół fluorescencyjnego barwienia immunologicznego tkanek w późnym stadium zarodkowym przez wczesne/środkowe L3 in situ. Analiza gonad Drosophila i tkanki nerwowej jest pokazana w reprezentatywnych wynikach w celu wykazania skuteczności tego protokołu. Co więcej, ten protokół barwienia immunologicznego może być dostosowany do analizy innych tkanek Drosophila, a także tkanek innych organizmów z zewnętrznym naskórkiem.

<table><tbody><tr><td colspan="4">Tabela 1: Odczynniki i</td></tr><tr><td>Bufor fosforanowy Triton X-100 (PBTx)</td><td></td><td></td><td>Dla 5 L: 500 ml PBS 10X, 4,45 L ddH2O, 50 ml Triton 10%. Sklep w RT.</td></tr><tr><td>Bufor fosforanowy sól fizjologiczna 10X (PBS 10X)</td><td></td><td></td><td>Dla 1 l w dH2O: 80 g NaCl, 2 g KCl, 14,4 g Na2HPO4, 2,4 g KH2PO4. Dodaj składniki i wypełnij do odpowiedniej objętości. Przechowywać w temperaturze 4 stopni Celsjusza.</td></tr><tr><td>Triton 10%</td><td></td><td></td><td>Na 50 ml: 5 ml Tritonu, 5 ml PBS 10X, 45 ml ddH2O. Skała do wymieszania. Sklep w RT.</td></tr><tr><td>PEMS</td><td></td><td></td><td>0,1 m Rury (pH 6,9), 2,0 mM MgSO4, 1,0 mM EGTA. Sklep w RT.</td></tr><tr><td>Rury</td><td></td><td></td><td>Na 400 ml 0,25 M roztworu (pH 6,9): 30,24 g Rury dH20 NaOH. Rozpuść rury w 300 ml dH2O, a następnie dostosuj do pH 6,9 za pomocą NaOH. Doprowadzić całkowitą objętość do 400 ml za pomocą dH2O i autoklawu. Sklep w RT.</td></tr><tr><td>Formaldehyd</td><td></td><td></td><td>37% wagowo formaldehydu w metanolu. Przechowywać w RT. Mieszaninę odpadów formaldehydu, heptanu i metanolu należy przechowywać w szczelnie zamkniętym pojemniku w dygestoriach przed utylizacją zgodnie z wytycznymi instytucjonalnymi.</td></tr><tr><td>Heptan</td><td></td><td>CAS 142-82-5</td><td>n-heptan. Przechowywać w RT. Mieszaninę odpadów formaldehydu, heptanu i metanolu należy przechowywać w szczelnie zamkniętym pojemniku w dygestoriach przed utylizacją zgodnie z wytycznymi instytucjonalnymi.</td></tr><tr><td>Metanol</td><td></td><td>CAS 67-56-1</td><td>Przechowywać w RT. Przechowywać mieszaninę odpadów formaldehydu, heptanu i metanolu w szczelnie zamkniętym pojemniku w dygestorium przed utylizacją zgodnie z wytycznymi instytucjonalnymi.</td></tr><tr><td>Bufor fosforanowy Tween (PBTw)</td><td></td><td></td><td>Do przygotowania 1 l: 100 ml PBS 10X, 890 ml ddH2O, 10 ml Tween 10%. Filtr sterylizować po dodaniu wszystkich składników. Przechowywać w temperaturze 4 stopni Celsjusza.</td></tr><tr><td>Tween 10%</td><td></td><td></td><td>Na 50 ml: 5 ml Tween, 5 ml PBS 10X, 40 ml ddH2O. Skała do wymieszania. Sklep w RT.</td></tr><tr><td>Bufor albuminowo-fosforanowy surowicy bydlęcej Tween (BBTw)</td><td></td><td></td><td>Aby przygotować 1 l: 100 ml PBS 10X, 890 ml ddH2O, 10 ml Tween 10%, 1 g albuminy surowicy bydlęcej (BSA). Dodaj BSA, a następnie wysterylizuj za pomocą 0,2 &mu; m Jednostka filtra próżniowego. Przechowywać w temperaturze 4 stopni Celsjusza.</td></tr><tr><td>Normalna surowica kozia (NGS)</td><td>ackson ImmunoResearch Laboratories</td><td>005-000-121</td><td>Aby zrobić 10 ml: Normalna surowica kozia 10 ml ddH2O. Dodaj ddH2O do fiolki NGS i wysterylizuj za pomocą 0,2 &mu; m filtr syrninge. Przechowuj podwielokrotności w temperaturze -20 &deg;C.</td></tr><tr><td>1,4-diazabicyklo[2.2.2]oktan (DABCO)CAS</td><td></td><td>: 281-57-9</td><td>Aby przygotować 100 ml: 25 ml ddH2O, 1 ml Tris HCl (1M, pH 7,5), 2,5 g stałej DABCO, 3,5 ml 6N HCl, 250 &mu; l 10N NaOH, 70 ml glicerolu. Do zlewki o pojemności 250 ml z mieszadłem dodać ddH2O, Tris HCl i DABCO. Wymieszaj, a następnie dodaj 6N HCl, 10 N NaOH i glicerol. Następnie dodawać kroplami 10N NaOH, aż roztwór osiągnie pH 7,5. Podwielokrotnej. Przechowuj podwielokrotności w temperaturze -20 &deg;C.</td></tr><tr>DABCO + roztwór <td></td><td></td><td>p-fenylenodiaminy (PPD)</td><td>1,765 ml NaHCO3, 0,353 Na2CO3, 0,02 g PPD (CAS: 106-50-3). Rozpuścić PPD w roztworze NaHCO3 i NaCO3. Dodaj 60 &mu; l roztworu PPD do 500 &mu; l z DABCO. Przechowuj podwielokrotności w temperaturze -20 &deg;C.</td></tr><tr>Talerze <td></td><td></td><td>z sokiem jabłkowym</td><td>Aby przygotować ~200 talerzy: 45 g agaru (CAS#9002-18-0), 45 g cukru pudru (kupionego w sklepie), 500 ml soku jabłkowego (kupionego w sklepie), 15 ml Tegosept 10%, 1,5 ml ddH2O. Dodaj agar do ddH2O w kolbie o pojemności 4 litrów, a następnie autoklaw przez 30 min. Wymieszaj sok jabłkowy i cukier na rozgrzanym talerzu. Stopniowo dodawaj mieszaninę soku jabłkowego do autoklawowanego agaru. Wymieszać na rozgrzanej płytce mieszającej, a następnie podzielić 10 ml objętości na szalki Petriego o średnicy 35 mm i odstawić na temperaturę sitową do zestalenia. Przechowywać w temperaturze 4 stopni Celsjusza.</td></tr><tr><td>Tegosept 10%</td><td></td><td></td><td>Aby przygotować 100 ml: 10 g Tegosept, 100 ml etanolu. Przechowuj podwielokrotności w temperaturze -20 &deg;C.</td></tr><tr><td>Pasta drożdżowa</td><td></td><td></td> <td>~ 50 g suchych aktywnych drożdży. Stopniowo dodawać ddH2O do zlewki zawierającej drożdże, mieszając aż do uzyskania konsystencji pasty. Przechowywać w temperaturze 4 stopni Celsjusza.</td></tr><tr><td colspan="4">Tabela 2: Materiały barwiące</td></tr><tr><td>DAPI</td><td>Invitrogen</td><td>D3571</td><td>1:1000, zapas 5 mg/ml.</td></tr><tr><td>Królik anty-Vasa</td><td></td><td></td><td>1:250, prezent od Ruth Lehmann.</td></tr><tr><td>Mysia anty-Fasciclin III</td><td>Developmental Studies Hybridoma Bank (DSHB)</td><td>7G10</td><td>1:10</td></tr><tr><td>Mysie anty-1B1</td><td>Developmental Studies Hybridoma Bank (DSHB)</td><td>1B1</td><td>1:4</td></tr><tr><td>Guniea pig anti-Traffic Jam</td><td></td><td></td><td>1:2500, prezent od Dorthei Godt (Li i wsp., 2003).</td></tr><tr>Badania rozwojowe <td>myszy anty-Prospero</td><td>Bank hybrydoma (DSHB)</td><td>Prospero MR1A</td><td>1:10</td></tr><tr>Badania rozwojowe<td>anty-Elav</td> szczurów <td>Hybridoma Bank (DSHB)</td><td>7EBA10</td><td>1:30</td></tr><tr><td>mysie badania rozwojowe anty-Repo</td><td>Hybridoma Bank (DSHB)</td><td>8D12</td><td>1:10</td></tr><tr><td>Kozioł anty-królik Alexa546</td><td>Invitrogen</td><td>A11010</td><td>1:500</td></tr><tr><td>Kozioł anty-mysz Alexa488</td><td>Invitrogen</td><td>A11029</td><td>1:500</td></tr><tr><td>Koza anty-guniea świnia Alexa633</td><td>Invitrogen</td><td>A21105</td><td>1:500</td></tr><tr><td>Koza anty-szczur Alexa488</td><td>Invitrogen</td><td>A11006</td><td>1:500</td></tr><tr><td colspan="4">Tabela 3: Materiały i sprzęt</td></tr><tr><td>Klatki na muchy</td><td>Ręcznie robione; Genesee Scientific Corporation</td><td>Nie dotyczy; Butelki: 32-130; Gotowa klatka: 59-101</td><td>Wykonana przez cięcie przezroczystych rurek akrylowych (o średnicy 1 3/4 cala) na segmenty o wysokości 4 cali za pomocą złożonej piły ukośnej przy 400 obr./min. Bardzo drobne sitko ze stali nierdzewnej (zostało przymocowane do jednego końca wanny za pomocą kleju akrylowego. Alternatywną metodę wykorzystującą pustą butelkę po pokarmie dla much można znaleźć w Drosophila Protocols ISBN 0-87969-584-4. Klatki można również zakupić w Genesee Scientific Corporation.</td></tr><tr><td>Sonikator: Branson 250 Digital Sonifier</td><td>Branson</td><td>Model: Sonda Branson Digital Sonifier 250</td><td></td></tr><tr><td>Sonicator</td><td>Branson</td><td>Model #: 102C (CE)</td><td>EDP: 101-135-066; S/N: OBU06064658</td></tr><tr><td>Filtr strzykawkowy</td><td>Nalgene</td><td>190-25-20</td><td>0,2 &mu; m celuloza, filtr membranowy octanowy</td></tr><tr><td>System obrazowania: Mikroskop konfokalny z wirującym dyskiem z wielobarwnym źródłem światła, cyfrową kamerą CCD i oprogramowaniem do obrazowania</td><td>Mikroskop: Olympus, Źródło światła: Lumen Dynamics, Kamera: Q-Imaging, Oprogramowanie do obrazowania: Intelligent Imaging Inc.</td><td></td><td>Mikroskop: BX51 wyposażony w wirującą tarczę DSU, Źródło światła: X-Cite 120Q, Kamera: RETIGA-SRV, Oprogramowanie do obrazowania: Slidebook 5.0</td></tr><tr><td>Filtr próżniowy</td><td>Nalgene</td><td>450-0020</td><td>0.2 &mu; M Filtr membranowy z azotanu celulozy</td></tr></tbody></table>

wspomagane sonikacją barwienie immunofluorescencyjne tkanek drobnoustrojowych i larwalnych drobnoustrojowych i larwalnych drosophila in situ

Sonication-facilitated Immunofluorescence Staining of Late-stage Embryonic and Larval Drosophila Tissues In Situ

Badania przeprowadzone na zarodkach i larwach Drosophila melanogaster dostarczają kluczowych informacji na temat procesów rozwojowych, takich jak specyfikacja losu komórki i organogeneza. Barwienie immunologiczne pozwala na wizualizację rozwijających się tkanek i narządów. Jednak ochronny naskórek, który tworzy się pod koniec embriogenezy, zapobiega przenikaniu przeciwciał do późnych zarodków i larw. Podczas gdy sekcja przed barwieniem immunologicznym jest regularnie stosowana do analizy tkanek larwalnych Drosophila, okazuje się nieskuteczna w przypadku niektórych analiz, ponieważ małe tkanki mogą być trudne do zlokalizowania i wyizolowania. Sonikacja stanowi alternatywę dla sekcji w protokołach barwienia immunologicznego larw Drosophila. Pozwala na szybkie, jednoczesne przetwarzanie dużej liczby zarodków i larw w późnym stadium rozwoju oraz utrzymuje morfologię in situ. Po utrwaleniu w formaldehydzie próbka jest poddawana sonikacji. Próbka jest następnie poddawana barwieniu immunologicznemu za pomocą przeciwciał pierwszorzędowych specyficznych dla antygenu i fluorescencyjnie znakowanych przeciwciał drugorzędowych w celu wizualizacji docelowych typów komórek i specyficznych białek za pomocą mikroskopii fluorescencyjnej. Podczas procesu sonikacji kluczowe znaczenie ma właściwe umieszczenie sondy sonizacyjnej nad próbką, a także czas trwania i intensywność sonikacji. W przypadku barwienia wysokiej jakości mogą być wymagane dodatkowe drobne modyfikacje standardowych protokołów barwienia immunologicznego. W przypadku przeciwciał o niskim stosunku sygnału do szumu zwykle konieczne są dłuższe czasy inkubacji. Jako dowód słuszności koncepcji tego protokołu wspomaganego sonikacją, pokazujemy barwienia immunologiczne trzech typów tkanek (jąder, jajników i tkanek nerwowych) na różnych etapach rozwoju.

Aby zademonstrować skuteczność immunobarwienia opartego na sonikacji w analizie tkanek embrionalnych w późnej fazie oraz tkanek larwalnych in situ, embriony i larwy typu dzikiego poddano procesowi immunobarwienia jąder, jajników oraz tkanki nerwowej. Próbki obrazowano za pomocą mikroskopii konfokalnej, a reprezentatywne wyniki przedstawiono na rycinach (Rycina 1 oraz Rycina 2). Wyniki wykazują, że opisany protokół jest skuteczny w wizualizacji cech morfologicznych, a także pojed...

Barwienie immunologiczne jest skuteczną techniką wizualizacji określonych typów komórek i białek w tkankach. Wykorzystując sonikację, opisany tutaj protokół łagodzi potrzebę preparowania tkanek Drosophila melanogaster z zarodków i larw w późnym stadium przed barwieniem immunologicznym. Zapewniamy skuteczną metodologię barwienia immunologicznego całych larw utrwalonych formaldehydem.

Wspomagane sonikacją barwienie immunofluorescencyjne tkanek drobnoustrojowych i larwalnych drobnoustrojowych i larwalnych Drosophila in situ

Studies performed in Drosophila melanogaster embryos and larvae provide crucial insight into developmental processes such as cell fate specification and ...

Ogólnym celem niniejszej procedury jest wizualizacja lub barwienie tkanek w C dwa przy użyciu mikroskopii fluorescencyjnej po sonikacji. Osiąga się to poprzez uprzednie pobranie próbek embrionalnych i larwalnych, a następnie ich utrwalenie przy użyciu formaldehydu, heptanu i metanolu. Drugim krokiem jest sonikacja utrwalonej próbki w celu usunięcia kutykuli, aby umożliwić penetrację przeciwciał.Następnie próbkę poddaje się immunobarwieniu przeciwciałami pierwszorzędowymi oraz fluorescencyjnymi przeciwciałami drugorzędowymi. Ostatnim etapem jest zamknięcie próbki w roztworze Antifade na bazie glicerolu. Ostatecznie do wizualizacji rozwijającej się tkanki, a także ekspresji i lokalizacji białek, wykorzystuje się mikroskopię konfokalną lub epifluorescencyjną.Główną zaletą tej techniki w porównaniu z innymi metodami, takimi jak sekcjonowanie tkanek, jest to, że umożliwia ona wizualizację in vivo wielu rozwijających się tkanek. Zazwyczaj osoby początkujące w tej metodzie napotykają trudności, ponieważ etap sonikacji zależy od szeregu czynników warunkujących maksymalną wydajność, w tym od prawidłowego ustawienia sondy sonikacyjnej. Procedurę zaprezentują Ashley Fiddler i Lauren Bole, dwie utalentowane studentki realizujące badania w moim laboratorium.Aby rozpocząć eksperyment, należy ostrożnie przenieść embriony zebrane na płytce agarowej, używając małego pędzla zwilżonego buforem fosforanowym z Tritonem X 100 lub roztworem PBTX. Następnie pędzel z pobraną próbką należy przetrzeć o wewnętrzną krawędź sitka do hodowli komórkowych. Pod sitkiem należy umieścić pokrywkę od szalki Petriego.Następnie opłucz pędzel oraz ścianki sita komórkowego za pomocą butelki z rozpylaczem zawierającej PBTX. Po przeniesieniu próbki do sita, wlej do niego odpowiednią ilość PBTX, aby unieść próbkę ponad siatkę. Powtórz ten krok trzykrotnie, aby usunąć drożdże i odchody much, a następnie usuń PBTX.Następnie wlej 50% roztwór wybielacza do sita i pozostaw larwy w roztworze na pięć minut. Następnie usuń roztwór. Po tym przemyj próbkę PBTX i pozostaw próbkę w roztworze na trzy minuty.Powtórz ten krok pięć razy, osuszając spód sitka do komórek. Następnie użyj pędzla zwilżonego PBTX, aby przenieść próbkę do fiolki scyntylacyjnej zawierającej 1,75 ml pems. W wyciągu dodaj 250 µl 37% formaldehydu oraz osiem ml odczynnika czystości analitycznej.Do fiolki scyntylacyjnej dodać heptan i wstrząsać fiolką z prędkością 200 RPM przez 20 minut. Następnie, bez usuwania fazy wodnej, dodać do fiolki scyntylacyjnej 10 mililitrów metanolu i energicznie wstrząsać z prędkością 500 RPM. Po wstrząsaniu niezwłocznie przelać zawartość przez sitko do hodowli komórkowych do pojemnika na odpady ciekłe.Dodać dodatkowy metanol do fiolki i przefiltrować zawartość przez sitko do komórek. Aby upewnić się, że cała próbka została usunięta, należy przetrzeć dno sitka do komórek ręcznikiem laboratoryjnym.Następnie za pomocą pędzla przenieś próbkę z sita do probówki mikrocentryfugowej o pojemności 1,5 mililitra zawierającej 0,5 mililitra metanolu. Odczekaj, aż próbka osiądzie. Następnie usuń metanol pipetą i zastąp go nową 0,5 mililitrową porcją metanolu.Powtórz ten krok trzykrotnie, a następnie dodaj do probówki końcowe 0,5 ml metanolu przed przechowywaniem w temperaturze -20 °C. W późniejszym czasie wyjmij przechowywaną próbkę z zamrażarki i usuń metanol za pomocą pipety. Następnie dodaj do probówki 1 ml 50% roztworu buforu fosforanowego z metanolem i Tweenem (PBTW), a następnie wytrząsaj probówkę przez trzy minuty.Następnie przepłucz próbkę dwukrotnie jednym mililitrem PBTW, pozwalając próbce osiąść przed odessaniem PBTW pipetą, dodaj do fiolki 1,0 mililitra albuminy surowicy bydlęcej w buforze fosforanowym z tweenem (BBTW) i mieszaj w wytrząsarce przez trzy minuty. Pozostaw próbkę do osiąknięcia osadu i usuń BBTW za pomocą pipety. Powtórz ten krok dwukrotnie.Należy uważnie usunąć jak największą ilość BBTW, aby nie utracić żadnej części próbki. Następnie do probówki należy dodać 0,5 mililitra BBTW i umieścić ją w lodzie. W dalszej kolejności należy ustawić sonikator na 10% maksymalnej amplitudy i czas pracy wynoszący dwie sekundy przy stałej aktywacji, a następnie wyczyścić sondę sonikatora, umieszczając jej końcówkę w probówce stożkowej o pojemności 50 mililitrów wypełnionej wodą dejonizowaną i uruchomić sonikator.Następnie osusz końcówkę sonikatora za pomocą chusteczki laboratoryjnej. Zanurz końcówkę w probówce, trzy do czterech milimetrów nad próbką, i rozpocznij sonikację. Następnie wyjmij probówkę i umieść ją w lodzie na 30 sekund, aby zapobiec przegrzaniu podczas sonikacji oraz umożliwić opadnięcie próbki na dno probówki.Powtórz ten krok w zależności od wieku próbki po zakończeniu sonikacji. Przepłucz próbkę dwukrotnie jednym mililitrem BBTW. Po każdym płukaniu odstaw próbkę, aby osiadła, przed usunięciem BBTW. Za pomocą pipety dodaj jeden mililitr BBTW do fiolki i umieść ją na wytrząsarce orbitalnej.Po trzech minutach należy odstawić próbkę i usunąć BBTW za pomocą pipety. Następnie powtórzyć tę czynność. Po dwukrotnym wykonaniu tego kroku, do probówki należy dodać 0,5 mililitra 5% serum normalnego rozcieńczonego w BBTW w celu zablokowania próbki, a następnie umieścić próbkę na wytrząsarce orbitalnej na jedną godzinę w temperaturze pokojowej.Następnie należy dodać 0,5 ml roztworu przeciwciała pierwszorzędowego i inkubować próbkę na kołysce przez noc w temperaturze 4 °C, pozwalając próbce opaść na dno probówki. Następnie odessać przeciwciała pierwszorzędowe za pomocą pipety i dwukrotnie przepłukać 1 ml BBTW. Dodać 1 ml BBTW do fiolki, a następnie umieścić ją na kołysce na trzy minuty.Następnie usunąć BBTW za pomocą pipety i powtórzyć tę czynność. Po pięciu powtórzeniach zablokować próbkę za pomocą 5% roztworu BBTW z normalną surowicą i inkubować na wytrząsarce przez 30 minut. Następnie usunąć roztwór.Dodać przeciwciało wtórne rozcieńczone w 5% roztworze serum normalnego BBTW i owinąć probówkę folią aluminiową. Następnie inkubować próbkę przez noc w temperaturze czterech stopni Celsjusza na wytrząsarce. Odessać przeciwciała wtórne pipetą i dwukrotnie przemyć próbkę jednym mililitrem PBTW.Następnie dodaj jeden mililitr PBTW do fiolki i umieść ją na kołysarce na pięć minut. Następnie odstaw próbkę do sedymentacji i usuń PBTW za pomocą pipety. Powtórz tę czynność.Powtórz ten krok trzykrotnie. Do probówki dodaj od 80 do 100 µL roztworu DAB i przechowuj ją w temperaturze -20 °C. Na koniec, aby zamontować preparat, użyj od 5 do 10 µL DAB BCO p lene diamine lub PPD anti fade.Następnie należy poddać próbkę analizie za pomocą mikroskopii fluorescencyjnej. Przedstawione projekcje Z z czterech przekrojów konfokalnych demonstrują skuteczność protokołu w wizualizacji cech morfologicznych, a także pojedynczych komórek w C dwa podczas późnych etapów embrionalnych oraz wczesnych i środkowych etapach L trzy rozwoju Drosophila. Rozwój jąder jest szczególnie odpowiednim systemem do zilustrowania skuteczności protokołu, ponieważ dojrzewanie jąder jest procesem dynamicznym przez cały okres rozwoju larwalnego.Obrazy te przedstawiają komórki linii zarodkowej na czerwono oraz komórki hub i strefy FU na zielono w pojedynczych sekcjach konfokalnych mózgów w połowie trzeciego stadium larwalnego (L3). Immunobarwienie komórek macierzystych zwojowych i niezróżnicowanych neuronów na zielono oraz niedojrzałych i pierwotnych neuronów na czerwono wykazuje silne barwienie z wyraźnymi wzorami ekspresji w płatach mózgu i brzuszny sznur nerwowy; w zależności od orientacji preparatu, obrazowanie umożliwia wizualizację tkanki mózgowej z powierzchni grzbietowej, brzusznej lub w przekroju strzałkowym.Ta technika in situ umożliwia biologom badanie rozwoju organów w morfogenezie tkanek u organizmów, w których ochronna kutykula zapobiega przenikaniu przeciwciał. Po obejrzeniu tego filmu powinni Państwo posiadać wiedzę na temat tego, jak poddać sonikacji i zabarwić immunocytochemicznie próbki przełyka z późnych stadiów embrionalnych i larwalnych w celu wizualizacji rozwijających się tkanek w C two. Należy pamiętać, że praca z formaldehydem, heptanem i metanolem może być niezwykle niebezpieczna i wymaga zachowania środków ostrożności, takich jak praca pod wyciągiem).Podczas wykonywania tej procedury należy zawsze stosować odpowiednie rękawice oraz fartuch laboratoryjny.

sonication-facilitated-immunofluorescence-staining-late-stage

Research

JoVE Journal

Biology

Biologia

Bardziej efektywne barwienie immunofluorescencyjne tkanek embrionalnych i larw Drosophila w późnym etapie rozwoju in situ przy użyciu sonicacji

Mezoskopowa tomografia fluorescencyjna działa poza limitami penetracji charakterystycznymi dla fluorescencyjnej mikroskopii sekcji tkanek. Technika ta opiera się na oświetleniu wieloprojekcyjnym oraz opisie transportu fotonów. Demonstrujemy wizualizację 3D całego organizmu in-vivo podczas morfogenezy wyobraźników skrzydeł wykazujących ekspresję GFP u Drosophila melanogaster.

Mezoskopowa tomografia fluorescencyjna do obrazowania in-vivo rozwijających się Drosophila

Drosophila hemocyty rozprzestrzeniają się po całym rozwijającym się embrionie. Niniejszy protokół demonstruje sposób montowania i obrazowania tych migracji z wykorzystaniem embrionów z hemocytami znakowanymi fluorescencyjnie.

Obrazowanie na żywo migracji hemocytów embrionalnych Drosophila melanogaster

Barwienie przeciwciałami poczwerek Drosophila może usprawnić analizy genetyczne rozwoju odwłoka osobników dorosłych. Przedstawiamy nasz protokół sekcji, utrwalania i barwienia przeciwciałami odwłoka poczwarek Drosophila w określonych stadiach rozwojowych.

Immunohistochemia odwłoka poczwarki Drosophila

Tutaj opisujemy protokół hybrydyzacji in situ (FISH) do określania właściwości ekspresji i lokalizacji RNA wyrażanych podczas embriogenezy u muszki owocowej, Drosophila melanogaster.

Fluorescencyjna hybrydyzacja in situ zarodków Drosophila z całą górą RNA

Przedstawiono protokół barwienia immunologicznego na zarodkach mszyc, w którym omówiono krytyczne warunki zmniejszania barwienia tła i zwiększania przepuszczalności tkanek. Warunki te zostały specjalnie opracowane do skutecznego wykrywania ekspresji białek w tkankach embrionalnych mszyc.

Identyfikacja warunków krytycznych dla barwienia immunologicznego w zarodkach mszyc grochowych: zwiększenie przepuszczalności tkanek i zmniejszenie barwienia tła

Obrazowanie morfogenezy zarodków owadów za pomocą mikroskopii fluorescencyjnej opartej na arkuszach świetlnych stało się najnowocześniejszym rozwiązaniem. Protokół ten nakreśla i porównuje trzy techniki montażu odpowiednie dla zarodków Tribolium castaneum, wprowadza dwie nowatorskie, wykonane na zamówienie linie transgeniczne, dobrze nadające się do obrazowania na żywo, omawia podstawowe kontrole jakości i wskazuje obecne ograniczenia eksperymentalne.

Mikroskopia fluorescencyjna oparta na arkuszach świetlnych żywych lub utrwalonych i barwionych zarodków Tribolium castaneum

Opisany protokół hybrydyzacji RNA in situ pozwala na wykrycie RNA w całych zarodkach Drosophila lub wypreparowanych tkankach. Korzystając z 96-dołkowych płytek mikromiareczkowych i wzmocnienia sygnału tyramidu, transkrypty mogą być wykrywane z wysoką rozdzielczością, czułością i przepustowością oraz przy stosunkowo niskich kosztach.

Fluorescencyjna hybrydyzacja in situ o wysokiej rozdzielczości w zarodkach i tkankach Drosophila przy użyciu wzmocnienia sygnału tyramidowego

Tutaj opisujemy protokół wykrywania i lokalizacji białka zarodka Drosophila i RNA od pobrania do wstępnego osadzenia i osadzenia, barwienia immunologicznego i hybrydyzacji mRNA in situ.

Protokół immunohistochemii i dystrybucji RNA in-situ we wczesnym zarodku Drosophila

Tutaj udostępniamy protokół sekcji wymagany do zobrazowania na żywo późnej embrionalnej męskiej gonady Drosophila. Protokół ten pozwoli na obserwację dynamicznych procesów komórkowych w normalnych warunkach lub po manipulacji transgenicznej lub farmakologicznej.

Sekcja i obrazowanie na żywo późnej embrionalnej gonady Drosophila

Ten protokół opisuje spersonalizowane znakowanie fluorescencyjne oparte na przeciwciałach i wstrzykiwanie do wczesnych zarodków Drosophila, aby umożliwić obrazowanie na żywo białek o niskiej obfitości lub modyfikacji potranslacyjnych, które są trudne do wykrycia przy użyciu tradycyjnych metod GFP/mCherry-tag.

Wizualizacja białek o niskiej liczebności i modyfikacji potranslacyjnych w żywych zarodkach Drosophila poprzez wstrzyknięcie przeciwciał fluorescencyjnych

Protokoły te określają, jak scharakteryzować organizację i funkcję zakrywającą złączeń przegrody plisowanej u nabłonka embrionalnego kontrolnego oraz mutacyjnego nabłonka embrionalnego Drosophila.

Eksperymenty immunobarwienia i penetracji barwnika w celu określenia białek styku przegrody w nabłonku embrionalnym Drosophila

Poznaj protokół barwienia immunofluorescencyjnego tkanek Drosophila melanogaster wspomagany sonikacją. Metoda umożliwia wizualizację białek bez konieczności mikroskopijnej dyssekcji.

Wspomagane sonikacją barwienie immunofluorescencyjne tkanek drobnoustrojowych i larwalnych drobnoustrojowych i larwalnych Drosophila in situ (Wideo) | JoVE Journal

Wspomagane sonikacją barwienie immunofluorescencyjne tkanek drobnoustrojowych i larwalnych drobnoustrojowych i larwalnych Drosophila in situ

Przeglądaj więcej filmów