Name: Półautomatyczne obrazowanie specyficznej tkankowo fluorescencji w zarodkach danio pręgowanego (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-05-17T17:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 6 s
Description: Poznaj półautomatyczne obrazowanie fluorescencji tkankowo-specyficznej w zarodkach Danio rerio. Ta metoda umożliwia wykrywanie komórek odpowiadających na estrogeny przy użyciu standardowego mikroskopu fluorescencyjnego z automatyczną platformą.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Dziękujemy Susan Farmer i personelowi ośrodka badawczego UAB za opiekę nad danio pręgowanym. Dofinansowanie ze środków start-upu z Zakładu Farmakologii i Toksykologii.

UWAGA: Ten protokół został zatwierdzony przez University of Alabama at Birmingham Institutional Animal Care and Use Committee.
1. Hodowla danio pręgowanego i kolekcje jaj
<ol>
	<li>Trzy dni przed rozpoczęciem ekspozycji chemicznej zmontuj zbiorniki hodowlane z przegrodami, aby oddzielić samce i samice. Napełnij każdy zbiornik do połowy wodą z systemu akwakultury. Za pomocą sieci przenieś ryby Tg(5xERE:GFP)c262/c262 do zbiorników hodowlanych, umieszczając 2 samce i 3 samice w każdym zbiorniku oddzielone przegrodą. Umieść pokrywkę na każdym zbiorniku i oznacz etykietę z datą i szczepami, które mają zostać skrzyżowane.</li>
	<li>Następnego ranka usuń wszystkie bariery i przegrody uchylne, aby utworzyć płytki obszar na jednym końcu zbiornika hodowlanego. Pozwól danio pręgowanemu na kojarzenie się, zbierając zarodki w 10-minutowych odstępach, aby zapewnić precyzyjną ocenę etapu rozwoju. Oczyść jajka, przepłukując je przez sitko do herbaty na pożywce E3B i delikatnie wypłucz zarodki na szalki Petriego. Przywróć dorosłe ryby do stałych zbiorników.</li>
	<li>Za pomocą mikroskopu preparacyjnego posortuj, policz i usuń wszelkie niezapłodnione, nieprawidłowe lub uszkodzone zarodki. Umieścić zarodki na szalkach Petriego na pożywce E3B i w temperaturze 28,5 °C w cyklu 14:10 światło: ciemność. Gęstość zarodków może wpływać na rozwój. Umieścić nie więcej niż 100 zarodków w szalce o wymiarach 100 x 35 mm i nie więcej niż 50 zarodków w szalce o wymiarach 60 x 15 mm.</li>
	<li>Przez 24 hpf zastąp pożywkę E3B zawierającą 200 μM 1-fenylo2-tiomocznika (PTU). PTU zapobiega tworzeniu się pigmentu i utrzymuje przezroczystość zarodków i larw danio pręgowanego, co poprawia klarowność obrazu. UWAGA: skoncentrowane zapasy PTU są niebezpieczne; nosić rękawice podczas wytwarzania roztworu E3B + PTU.</li>
	<li>Po 1 dniu od zapłodnienia (dpf) ręcznie usuń kosmówkę z każdego zarodka za pomocą cienkich kleszczy. Wydaje się, że kosmówka nie wpływa na przenikanie estrogenów, jednak usunięcie zwiększa klarowność obrazu. Nie ma potrzeby usuwania kosmówki z podłoża. UWAGA: Jako alternatywę dla ręcznej dechorionacji, partie zarodków mogą być chemicznie dechorionowane przy użyciu 1 mg/ml pronazy, jak opisano wcześniej11.</li>
</ol>
2. Chemiczna obróbka embrionów
<ol>
	<li>Dzień przed zabiegiem należy przygotować roztwory podstawowe każdej substancji chemicznej o 1000-krotnym stężeniu w DMSO (lub odpowiednim rozpuszczalniku). Na przykład, aby wystawić zarodki na działanie 10 μM bisfenolu A (BPA), przygotuj 10 mM roztwór podstawowy BPA w 100% DMSO. Zapewnia to równomierne stężenie DMSO w każdym zabiegu i pozwala na nietoksyczne rozcieńczenie DMSO w stosunku 1:1,000, które służy jako kontrola nośnika. Przechowywać roztwory podstawowe w temperaturze -20 °C. W przypadku tego protokołu zarodki zostaną wystawione na działanie 1 μM i 10 μM BPA, 18,5 nM i 1,85 μM genisteiny, 367 nM estradiolu (kontrola pozytywna) i nośnika (0,1% DMSO, kontrola ujemna). 
	UWAGA: Chemikalia, takie jak BPA i estradiol, są niebezpieczne i mogą mieć szkodliwy wpływ na płód ludzki. Z substancjami zaburzającymi funkcjonowanie układu hormonalnego należy obchodzić się ostrożnie i zawsze używać odpowiedniego sprzętu ochrony osobistej.</li>
	<li>W dniu zabiegu rozmrozić przygotowane podstawowe roztwory chemiczne. Rozcieńczyć w stosunku 1:1 000 przez pipetowanie 1 ml E3B + PTU do probówki mikrowirówkowej o pojemności 1,5 ml i dodanie 1 μl podstawowego roztworu chemicznego. Wiruj energicznie. Rozcieńczyć DMSO 1:1,000 do E3B + PTU jako sterowanie pojazdem. Użyj 1 ml E3B + PTU w probówce mikrowirówkowej o pojemności 1,5 ml jako kontrolę bez poddanej obróbki.</li>
	<li>Za pomocą plastikowej pipety transferowej o dużym otworze przenieś zarodki z szalek Petriego do każdego dołka na 96-dołkowej płytce, 3 zarodki na dołek, 3 dołki na warunek. Aby zapobiec parowaniu podczas długotrwałego leczenia, należy pominąć zarodki z zewnętrznych rzędów i kolumn płytki (rzędy A i E, kolumny 1 i 12). Studzienki zewnętrzne można wypełnić 300 μl E3B + PTU. Odpowiednio oznacz pokrywę talerza.</li>
	<li>Usuń pożywkę z każdej studzienki za pomocą plastikowej pipety transferowej z cienką końcówką. Pracuj szybko, aby uniknąć wysuszenia zarodków.</li>
	<li>Dodać 200 μl roztworu do uzdatniania do odpowiedniego dołka. Umieść pokrywkę pod płytką jako prowadnicę, aby zapewnić dodanie zabiegów do odpowiednich studzienek. Zmieszać każdą probówkę przed pipetowaniem, aby rozprowadzić substancję chemiczną w roztworze. Potwierdź wzrokowo, że każdy zarodek znajduje się w roztworze leczniczym. Jeśli zarodki znajdują się z boku studzienki, użyj czystej pipety transferowej, aby umyć je do studzienki z roztworem leczniczym.</li>
	<li>Umieścić płytkę w inkubatorze w temperaturze 28,5 °C. Zarodki zostaną przeanalizowane pod kątem fluorescencji w temperaturze 72 hpf.</li>
</ol>
3. Automatyczne obrazowanie zarodków na 96-dołkowych płytkach
<ol>
	<li>Znieczulić zarodki, dodając 10 μl 4 mg/ml trikainy do każdej studzienki. 
	UWAGA: Znieczulić zarodki przed obrazowaniem. Przy 24-96 hpf danio pręgowany wykazuje spontaniczny ruch i reakcję zaskoczenia na zmieniające się źródło światła podczas przechwytywania obrazu. Znieczulenie zarodków ogranicza ruch podczas obrazowania.</li>
	<li>Umieść 96-dołkową płytkę w zmotoryzowanym stage i skalibruj stage. Korzystając z oprogramowania Zeiss Zen Blue 2011 do automatyzacji i kontroli mikroskopii, wybierz opcję nośnika próbki i wybierz multiwell 96. Wybierz opcję Kalibruj. Postępuj zgodnie z instrukcjami krok po kroku, aby skalibrować stage. 
	UWAGA: Nie odznaczaj przycisku kafelków po tym kroku. Jeśli przycisk płytek nie jest zaznaczony, ustawienia kalibracji mogą zostać utracone, a płytka 96-dołkowa będzie musiała zostać ponownie skalibrowana.</li>
	<li>Korzystając z obiektywu 10x i ustawienia jasnego pola (BF), zidentyfikuj zarodek kontroli pozytywnej i ustaw ustawienia ekspozycji odpowiednio dla kanałów BF i GFP, upewniając się, że sygnał fluorescencji nie nasyca aparatu. Skoncentruj się na pojedynczym zarodku i zaprogramuj mikroskop tak, aby uzyskał łącznie 3 przekroje Z, jeden obraz 50 μm powyżej i jeden 50 μm poniżej aktualnej płaszczyzny ogniskowej. 
	UWAGA: Ponieważ różne tkanki zajmują różne płaszczyzny ogniskowe, zapewni to, że dla każdego danio pręgowanego obrazy zostaną wykonane z ostrością serca i wątroby.</li>
	<li>Ustaw parametry oprogramowania, aby uzyskać obraz kafelkowy przy użyciu kanałów GFP i BF. Na karcie pobierania wybierz pozycję konfiguracja zaawansowana. Wybierz regiony kafelków, a następnie kafelki. Wybierz opcję studni okrągłej. 
	UWAGA: Kafelkowanie służy do tworzenia złożonego obrazu każdej studni. Pojedyncze pole widzenia rejestruje tylko niewielką część każdej studni. Funkcja kafelkowania może automatycznie uchwycić wiele sąsiednich pól widzenia z każdej studni, tworząc złożony obraz całej studni. Dzięki temu możliwe jest automatyczne przechwycenie 96 obrazów kompozytowych na płytkę, przy czym każdy obraz kompozytowy zawiera kilkadziesiąt pojedynczych obrazów z jednego dołka.</li>
	<li>Wybierz nośnik i współczynnik wypełnienia 90%. Wybranie współczynnika wypełnienia 90% spowoduje uchwycenie wielu obrazów wybranych studzienek, tak że 90% obszaru każdej studzienki będzie widoczne na obrazie kompozytowym. 
	UWAGA: Po wybraniu współczynnika wypełnienia zostanie wyświetlony wykres przedstawiający obszar, który ma zostać zobrazowany. Wybierz wartość procentową, która będzie obejmować obszar studni odpowiedni dla eksperymentu.</li>
	<li>W obszarze Opcje wybierz żądany stopień nakładania się. 
	UWAGA: Podczas zszywania płytek w celu uzyskania jednego reprezentatywnego obrazu, nakładanie się 5-10% pozwala na gładki szew między obrazami. Jeśli jednak zszywanie obrazów nie jest konieczne, użycie nakładania 0% skróci czas obrazowania. Przy użyciu 90% współczynnika wypełnienia i 5% nakładania się, złożony obraz pojedynczego dołka składa się z 59 pojedynczych obrazów.</li>
	<li>Rozpocznij obrazowanie. Mikroskop automatycznie uzyska obrazy.</li>
	<li>Ręcznie sprawdź złożone obrazy każdej studzienki pod kątem fluorescencji specyficznej dla tkanki (ryc. 1).</li>
	<li>UWAGA: Najlepiej jest rozpocząć od kontroli pozytywnej, aby potwierdzić, że narażenie na działanie substancji chemicznej zadziałało przed obserwacją eksperymentalnych studzienek uzdatniających.</li>
</ol>
4. Ręczne przechwytywanie obrazu zarodków na płytce 96-dołkowej
UWAGA: Aby potwierdzić wyniki, użyj obiektywu o 20-krotnej dużej odległości roboczej, aby uzyskać bardziej szczegółowe obrazy ręcznie (Rysunek 2).
<ol>
	<li>Korzystając z obiektywu 20x i ustawienia jasnego pola (BF), zidentyfikuj zarodek kontroli pozytywnej i odpowiednio ustaw ustawienia ekspozycji dla kanałów BF i GFP, upewniając się, że sygnał fluorescencji nie nasyca aparatu.</li>
	<li>Identyfikuj poszczególne zarodki i ręcznie rejestruj obrazy. 
	UWAGA: Po wybraniu ustawień ekspozycji dla zarodka kontroli pozytywnej nie należy ich zmieniać. Pozwala to na porównanie intensywności fluorescencji, ponieważ każdy obraz jest rejestrowany w jednolitych warunkach.</li>
</ol>

<ol><li>Molina, G., Watkins, S., Tsang, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Generation+of+FGF+reporter+transgenic+zebrafish+and+their+utility+in+chemical+screens%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Developmental+Biology%22%5BJournal%5D)">Generation of FGF reporter transgenic zebrafish and their utility in chemical screens.</a> BMC Developmental Biology. 7, 62(2007).</li>
<li>Perz-Edwards, A., Hardison, N. L., Linney, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Retinoic+acid-mediated+gene+expression+in+transgenic+reporter+zebrafish%5BTitle%5D)+AND+%22Developmental+Biology%22%5BJournal%5D)">Retinoic acid-mediated gene expression in transgenic reporter zebrafish.</a> Developmental Biology. , 89-101 (2001).</li>
<li>Gorelick, D. A., Halpern, M. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Visualization+of+Estrogen+Receptor+Transcriptional+Activation+in+Zebrafish%5BTitle%5D)+AND+%22Endocrinology%22%5BJournal%5D)">Visualization of Estrogen Receptor Transcriptional Activation in Zebrafish.</a> Endocrinology. 152, 2690-2703 (2011).</li>
<li>Tsang, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Zebrafish%3A+A+tool+for+chemical+screens%5BTitle%5D)+AND+%22Birth+Defects+Research+Part+C%3A+Embryo+Today%3A+Reviews%22%5BJournal%5D)">Zebrafish: A tool for chemical screens.</a> Birth Defects Research Part C: Embryo Today: Reviews. 90, 185-192 (2010).</li>
<li>Peravali, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Automated+feature+detection+and+imaging+for+high-resolution+screening+of+zebrafish+embryos%5BTitle%5D)+AND+%22Biotechniques%22%5BJournal%5D)">Automated feature detection and imaging for high-resolution screening of zebrafish embryos.</a> Biotechniques. 50, 319-324 (2011).</li>
<li>Walker, S. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Automated+reporter+quantification+in+vivo%3A+high-throughput+screening+method+for+reporter-based+assays+in+zebrafish%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Automated reporter quantification in vivo: high-throughput screening method for reporter-based assays in zebrafish.</a> PLoS One. 7, (2012).</li>
<li>Vogt, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Automated+image-based+phenotypic+analysis+in+zebrafish+embryos%5BTitle%5D)+AND+%22Developmental+Dynamics%22%5BJournal%5D)">Automated image-based phenotypic analysis in zebrafish embryos.</a> Developmental Dynamics. 238, 656-663 (2009).</li>
<li>Vogt, A., Codore, H., Day, B. W., Hukriede, N. A., Tsang, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Development+of+automated+imaging+and+analysis+for+zebrafish+chemical+screens%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Vis.+Exp%22%5BJournal%5D)">Development of automated imaging and analysis for zebrafish chemical screens.</a> J. Vis. Exp. , (2010).</li>
<li>Gruber, C. J., Gruber, D. M., Gruber, I. M., Wieser, F., Huber, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Anatomy+of+the+estrogen+response+element%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+in+Endocrinology+and+Metabolism%22%5BJournal%5D)">Anatomy of the estrogen response element.</a> Trends in Endocrinology and Metabolism. 15, 73-78 (2004).</li>
<li>Rovira, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chemical+screen+identifies+FDA-approved+drugs+and+target+pathways+that+induce+precocious+pancreatic+endocrine+differentiation%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+USA%22%5BJournal%5D)">Chemical screen identifies FDA-approved drugs and target pathways that induce precocious pancreatic endocrine differentiation.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences USA. 108, 19264-19269 (2011).</li>
<li>Westerfield, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Zebrafish+Book%3A+A+guide+for+the+laboratory+use+of+zebrafish+%28Danio+rerio%29%5BTitle%5D)+AND+%22%22%5BJournal%5D)">The Zebrafish Book: A guide for the laboratory use of zebrafish (Danio rerio).</a> , 4th edn, University of Oregon Press. (2000).</li>
</ol>

Autorzy nie mają konkurencyjnych interesów finansowych.

Protokół ten opisuje prostą metodę automatycznego obrazowania specyficznej dla tkanek fluorescencji w zarodkach danio pręgowanego. Protokół został opracowany przy użyciu obserwatora Zeiss Axio. Z1 z oprogramowaniem Zen Blue 2011, jednak technikę tę można dostosować przy użyciu dowolnego mikroskopu odwróconego z zmotoryzowanym stolikiem i oprogramowaniem sterującym mikroskopem, które może wykonywać kafelkowanie w celu tworzenia złożonych obrazów. Wyposażenie mikroskopu odwróconego w stolik z napędem może stanowić praktycz...

Transgeniczne danio pręgowane, które pozwalają na bezpośrednią wizualizację aktywności w szlakach sygnałowych, takich jak czynniki wzrostu fibroblastów1, kwas retinowy2 iestrogeny3, w żywych zarodkach. Takie narzędzia umożliwiają badania przesiewowe w kierunku substancji chemicznych, które zaburzają szlaki sygnałowe (oznaczane jako zmiana intensywności fluorescencji) lub substancji chemicznych, które modulują sygnalizację w sposób specyficzny dla tkanki (zmiana lokalizacji fluorescencji)4. Zautomatyzowane przechwytywanie obrazów znacznie zwiększa przepustowość badań przesiewowych substancji chemicznych5,6. Ekrany, które automatycznie badają fluorescencję u żywego danio pręgowanego, często opierają się na drogim, specjalistycznym sprzęcie. Tak zwane badania przesiewowe o wysokiej zawartości zapewniają korzyści w postaci obrazowania ilościowego o wysokiej rozdzielczości, ale kosztem użycia specjalistycznych czytników płytek wyposażonych w mikroskopię konfokalną7,8. Celem tej metody jest automatyczne oznaczenie specyficznej tkankowo fluorescencji w zarodkach danio pręgowanego na 96-dołkowej płytce przy użyciu standardowego mikroskopu epifluorescencyjnego. Fluorescencja specyficzna dla tkanek może być rozróżniana przy użyciu tej techniki i może być rozsądnym podejściem dla laboratoriów, które nie mają dostępu do specjalistycznych czytników płytek lub sprzętu do badań przesiewowych o wysokiej zawartości.
W tym protokole używamy automatycznego obrazowania do wykrywania specyficznych tkankowo agonistów receptora estrogenowego (ER) u żywych ryb danio pręgowanego po 3 dniach od zapłodnienia (dpf). Linia transgeniczna Tg(5xERE:GFP)c262/c262 zawiera 5 tandemowych sekwencji DNA elementu odpowiedzi estrogenowej (ERE) przed białkiem zielonej fluorescencji (GFP)3. W przypadku braku liganda ER są zwykle nieaktywne. Wiązanie ligandów wyzwala zmianę konformacyjną, umożliwiając receptorom wiązanie DNA ERE i regulację transkrypcji9. 5xERE: GFP ryba może być używana do przesiewania bibliotek chemicznych dla modulatorów ER i może być używana do badania próbek wody środowiskowej pod kątem zanieczyszczeń estrogenowych.

<table><tbody><tr><td>Pipety transferowe z tworzywa sztucznego; szeroki otwór</td><td>Fisher</td><td>13-711-23</td><td></td></tr><tr><td>Pipety transferowe z tworzywa sztucznego; cienka końcówka</td><td>Fisher</td><td>13-711-26</td><td></td></tr><tr><td>96-dołkowe, okrągłe, płytki z płaskim dnem</td><td>Fisher</td><td>21-377-203</td><td></td></tr><tr><td>Płytki 100 x 35 mm</td><td>Fisher</td><td>08-757-100D</td><td></td></tr><tr><td>Płytki 35 x 60 mm</td><td>Fisher</td><td>08-757-100B</td><td></td></tr><tr><td>Kleszcze Dumont #5 Fine</td><td>Science Tools</td><td>11254-20</td><td>wymiary końcówki 0,05 x 0,01 mm, do ręcznego usuwania kosmówki z zarodków</td></tr><tr><td>Metanosulfonian trikainy</td><td>Sigma Aldrich</td><td>A5040-25G</td><td>patrz Książka danio pręgowanego po przepis (http://zfin.org/zf_info/zfbook/chapt10.html#wptohtml63)&nbsp;</td></tr><tr><td>1-fenylo 2-tiomocznik (PTU)</td><td>Sigma Aldrich</td><td>P7629-10G</td><td>Przygotuj 20 mM zapasu (100x) i użyj w 200 &mu; M w E3B&nbsp;</td></tr><tr><td>Zeiss Axio Observer Z1</td><td>Carl Zeiss</td><td></td><td>Protocol wymaga odwróconego mikroskopu fluorescencyjnego z zmotoryzowanym stolikiem</td></tr><tr><td>20-krotny obiektyw o dużej odległości roboczej</td><td>Carl Zeiss</td><td></td><td>Używamy obiektywu o zasięgu roboczym 0,4 NA i 8,4 mm</td></tr><tr><td>Aparat cyfrowy Axiocam HRm</td> Oprogramowanie sterujące mikroskopem <td>Carl Zeiss</td><td></td><td></td></tr><tr><td>ZenBlue 2011</td><td>Carl Zeiss</td><td></td><td>Protokół wymaga oprogramowania do automatyzacji i sterowania mikroskopią, aby umożliwić przechwytywanie obrazów kafelkowych za pomocą zmotoryzowanego stolika</td></tr><tr><td>Methylene Blue</td><td>Sigma Aldrich</td><td>MB-1; 25 gramów</td><td>daje 2% roztwór w wodzie RO do użycia w E3B (poniżej)</td></tr><tr><td>E3B</td><td></td><td></td><td>60X E3 ROZWIĄZANIE: NaCl&nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; - 17,2 grama KCl&nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; - 0,76 grama CaCl2-2H2O&nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; - 2,9 grama MgSO4-7H2O&nbsp; - 4,9 grama lub MgSO4 - 2,39 grama Rozpuścić w 1 litrze wody Milli-Q; przechowywać w sterylnej butelce o pojemności 1 litra. 1X E3B ROZTWÓR DLA DANIO PRĘGOWANEGO: 60X E3&nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; 150 ml 2% błękitu metylenowego&nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; 100 &mu; l&nbsp; Doprowadzić do 9 litrów za pomocą wody Milli-Q &nbsp;</td></tr></tbody></table>

półautomatyczne obrazowanie specyficznej tkankowo fluorescencji w zarodkach danio pręgowanego

Semi-automated Imaging of Tissue-specific Fluorescence in Zebrafish Embryos

Zarodki danio pręgowanego są potężnym narzędziem do badań przesiewowych małych cząsteczek na dużą skalę. Transgeniczne danio pręgowane, które wyrażają fluorescencyjne białka reporterowe, są często wykorzystywane do identyfikacji substancji chemicznych modulujących ekspresję genów. Badania chemiczne, które badają fluorescencję u żywych danio pręgowanych, często opierają się na drogim, specjalistycznym sprzęcie do badań przesiewowych o wysokiej zawartości. Opisujemy procedurę z użyciem standardowego mikroskopu epifluorescencyjnego ze zmotoryzowanym stolikiem do automatycznego obrazowania zarodków danio pręgowanego i wykrywania fluorescencji specyficznej dla tkanki. Korzystając z transgenicznych danio pręgowanego, które zgłaszają aktywność receptora estrogenowego poprzez ekspresję GFP, opracowaliśmy półautomatyczną procedurę badania przesiewowego pod kątem ligandów receptora estrogenowego, które aktywują reportera w sposób specyficzny dla tkanki. W tym filmie opisujemy procedury układania zarodków danio pręgowanego w ciągu 24-48 godzin po zapłodnieniu (hpf) na 96-dołkowej płytce i dodawania małych cząsteczek wiążących receptory estrogenowe. Przy 72-96 hpf obrazy każdej studzienki z całej płytki są automatycznie zbierane i ręcznie sprawdzane pod kątem fluorescencji specyficznej dla tkanki. Protokół ten wykazuje zdolność do wykrywania estrogenów, które aktywują receptory w zastawkach serca, ale nie w wątrobie.

Rysunek 1 przedstawia obrazy kompozytowe z poszczególnych studzienek płytki 96-dołkowej. Każdy obraz kompozytowy składa się z 59 pojedynczych obrazów z 5% zakładką. Należy zauważyć, że żywe danio pręgowane są zorientowane w każdej studzience losowo, a mimo to jesteśmy w stanie odróżnić fluorescencję w sercu od fluorescencji w wątrobie. Obrazy w świetle przechodzącym są przydatne jako referencje do oceny orientacji ryb oraz wizualizacji nieprawidłowości morfologicznych (Rysunki 1A i 1C). ...

Opisany tutaj jest protokół półautomatycznego obrazowania specyficznej tkankowo fluorescencji w zarodkach danio pręgowanego.

Półautomatyczne obrazowanie specyficznej tkankowo fluorescencji w zarodkach danio pręgowanego

Zebrafish embryos are a powerful tool for large-scale screening of small molecules. Transgenic zebrafish that express fluorescent reporter proteins are ...

Ogólnym celem niniejszej procedury jest automatyczna detekcja komórek reagujących na estrogen w żywych larwach danio pręgowanego. Jest to realizowane poprzez rozród pięciu dorosłych ryb X-E-R-E-G-F-P w celu uzyskania embrionów danio pręgowanego z reporterem estrogenu. Następnie embriony umieszcza się w poszczególnych studzienkach płytki 96-dołkowej.Następnie do płytki z embrionami dodaje się estrogeny. Na koniec płytkę skanuje się pod kątem fluorescencji, używając mikroskopu epifluorescencyjnego z zmotoryzowanym stolikiem. Ostatecznie mikroskopia fluorescencyjna służy do wykazania tkankowo specyficznej aktywności receptorów estrogenowych.Główną zaletą stosowania tej techniki w porównaniu z innymi tradycyjnymi metodami, takimi jak przesiewy wysokoprzepustowe (high throughput) lub wysokotreściowe (high content screening), jest fakt, że fluorescencję specyficzną dla tkanek w larwach danio pręgowanego można obrazować przy użyciu standardowego mikroskopu epi-fluorescencyjnego. Dzięki wyposażeniu w zmotoryzowany stolik, nie jest wymagany specjalistyczny czytnik płytek. Uwaga: substancje chemiczne zawierające BPA i estradiol są niebezpieczne i mogą mieć szkodliwy wpływ na ludzki płód.Z substancjami zaburzającymi gospodarkę hormonalną należy obchodzić się ostrożnie, zawsze stosując odpowiednie środki ochrony indywidualnej. W niniejszej demonstracji rybki danio zostaną poddane działaniu estrogenów: 17 beta estradiolu, bisfenolu A oraz geniny w różnych dawkach, rozpoczynając 48 godzin po zapłodnieniu, po rozrodzie rybek danio oraz zebraniu i wyrównaniu liczby jaj. Zgodnie z tekstem w dniu traktowania, rozmrożone roztwory zapasowe substancji chemicznych należy rozcieńczyć w stosunku 1:1000 w 1 mL medium E3 B+PTU i energicznie wymieszać w wirówce vortex.Jako kontrolę nośnika. Należy zastosować rozcieńczenie DMSO w E3B i PTU w stosunku 1:1000, używając plastikowej pipety transferowej o dużej średnicy. Przenieść po trzy embriony na dołek do płytki 96-dołkowej, przygotowując trzy dołki na każdą próbę.Należy unikać umieszczania embrionów w zewnętrznych studzienkach, aby zapobiec odparowywaniu pożywki podczas przedłużonej inkubacji. Pracując sprawnie, aby zapobiec wysychaniu embrionów, należy usunąć pożywkę z każdej studzienki i dodać 200 µL dobrze wymieszanego roztworu traktującego. Należy wizualnie potwierdzić, że wszystkie embriony są zanurzone w roztworze i nie przylegają do ścianek studzienki.Inkubować zarodki w temperaturze 28.5 °C przez 72 godziny po zapłodnieniu. Znieczulić zarodki, dodając do każdego dołka płytki 96-dołkowej 10 µL roztworu trica o stężeniu 4 mg/mL. Umieścić płytkę na stoliku zmotoryzowanym i korzystać z oprogramowania Zeiss Zen Blue 2011.Skalibruj stół przedmiotowy, wybierając opcję nośnika próbek i wybierając wielodołkową płytkę 96. Następnie wybierz opcję kalibracji i postępuj zgodnie z instrukcjami krok po kroku; używając obiektywu 10x oraz ustawienia pola jasnego (BF), zidentyfikuj embrion z kontroli pozytywnej i odpowiednio ustaw parametry ekspozycji dla kanałów BF i GFP, upewniając się, że sygnał fluorescencji nie powoduje nasycenia kamery. Ustaw ostrość na pojedynczym embrionie i zaprogramuj mikroskop tak, aby pozyskał łącznie trzy sekcje Z, obejmujące jeden obraz 50 µm powyżej i jeden 50 µm poniżej aktualnej płaszczyzny ogniskowej.Następnie należy ustawić parametry oprogramowania w celu pozyskania obrazu mozaikowego (tiled image) przy użyciu kanałów GFP i BF. W zakładce akwizycji (acquisition) wybierz zaawansowaną konfigurację (advanced setup), zaznacz regiony mozaiki (tile regions), a następnie kafelki (tiles). Wybierz kształt koła.W opcjach wybierz nośnik (carrier) oraz współczynnik wypełnienia 90%, aby uchwycić wiele obrazów wybranych studni, w taki sposób, aby 90% obszaru każdej studni było widoczne na obrazie złożonym. W opcjach wybierz pożądaną ilość zakładki, na przykład od 5 do 10%, co pozwoli na uzyskanie gładkiego przejścia między obrazami. Następnie rozpocznij obrazowanie, aby ręcznie wykonać zdjęcia przy użyciu obiektywu 20x i ustawienia BF, a następnie zidentyfikuj embrion z kontroli pozytywnej.Ustaw parametry BF i GFP tak jak poprzednio i wykonaj zdjęcia. Rysunek ten przedstawia obrazy złożone z poszczególnych studzienek płytki 96-dołkowej. Każdy obraz składa się z 59 pojedynczych zdjęć z 5% zakładką obrazu.Należy zauważyć, że żywe rybki danio są zorientowane w sposób losowy w każdej studzience. Niemniej jednak jesteśmy w stanie odróżnić fluorescencję w sercu od fluorescencji w wątrobie. Obrazy w świetle przechodzącym są przydatne jako referencje do oceny orientacji rybek danio oraz wizualizacji nieprawidłowości morfologicznych.Obrazy przedstawione tutaj zostały zarejestrowane przy użyciu obiektywu 20x z dużą odległością roboczą w celu przeprowadzenia bardziej szczegółowej analizy; wykonano je bezpośrednio po pokazanym przed chwilą automatycznym skanowaniu, bez zdejmowania płytki ze stolika mikroskopu. Przy użyciu obiektywu 20x fluorescencję w sercu można precyzyjnie zlokalizować w obrębie zastawek przedsionkowo-komorowych wskazanych strzałkami oraz zastawek aorty wskazanych grotem strzałki. Po opanowaniu tej techniki możliwe jest zarejestrowanie obrazów z 3 płytek 96-dołkowych dziennie.Należy pamiętać, że praca z związkami zaburzającymi gospodarkę hormonalną może być niebezpieczna, dlatego podczas wykonywania tej procedury należy zawsze zachować odpowiednie środki ostrożności, takie jak stosowanie właściwych środków ochrony indywidualnej.

semi-automated-imaging-tissue-specific-fluorescence-zebrafish

Research

JoVE Journal

Biology

Biologia

Półautomatyczne obrazowanie fluorescencji specyficznej dla tkanki w zarodkach danio rzecznego

Opisano metodę fotoaktywacji pojedynczych komórek zawierających „uwięzione” (caged) białko fluorescencyjne z wykorzystaniem absorpcji dwufotonowej z femtosekundowego oscylatora laserowego Ti:Szafir. W celu mapowania losu fotoaktywowanej komórki zastosowano immunohistochemię. Technikę tę można zastosować do każdego typu komórek.

Mapowanie losów pojedynczych komórek u danio przeznaczonego (zebrafish)

Źródło: Zhang, X., et al. Model zarodka danio pręgowanego do wizualizacji in vivo i analizy przyżyciowej zakażenia Staphylococcus aureus związanego z biomateriałem. J. Vis. Exp. (2019 rok)Film przedstawia obrazowanie fluorescencyjne zarodków danio pręgowanego, którym wstrzyknięto Staphylococcus aureus, umożliwiając ilościowe określenie progresji infekcji i rozmieszczenia bakterii w celu oceny wpływu mikrosfer biomateriału na interakcje gospodarz-patogen in vivo.

 Obrazowanie fluorescencyjne infekcji bakteryjnej związanej z biomateriałem w zarodkach danio pręgowanego

Rozwój danio pręgowanego można obserwować przez wiele dni za pomocą mikroskopii z lekkim arkuszem, gdy zarodki są umieszczane w optycznie przezroczystych rurkach polimerowych z agarozą o niskim stężeniu.

Wielowarstwowe mocowanie do długotrwałej mikroskopii świetlnej danio pręgowanego

Obrazowanie dynamicznego zachowania organelli i innych struktur subkomórkowych in vivo może rzucić światło na ich funkcję w warunkach fizjologicznych i chorobowych. W tym artykule przedstawiono metody genetycznego znakowania dwóch organelli, centrosomów i mitochondriów oraz obrazowania ich dynamiki w żywych zarodkach danio pręgowanego za pomocą mikroskopii szerokokątnej i konfokalnej.

Obrazowanie struktur subkomórkowych w żywym zarodku danio pręgowanego

Mitoza jest niezbędna dla każdego żywego organizmu, a defekty często prowadzą do raka i zaburzeń rozwojowych. Korzystając z tego protokołu obrazowania i danio pręgowanego jako systemu modelowego, naukowcy mogą wizualizować mitozę w żywym organizmie kręgowców i mnogość defektów, które powstają, gdy procesy mitotyczne są wadliwe.

Obserwacja podziału i dynamiki mitotycznej w żywym zarodku danio pręgowanego

Rozwój rzęsek jest niezbędny do prawidłowego organogenezy. Protokół ten opisuje zoptymalizowaną metodę oznaczania i wizualizacji komórek rzęskowych danio pręgowanego.

Wizualizacja wielorzęskowych komórek u danio pręgowanego za pomocą połączonego protokołu fluorescencyjnej hybrydyzacji in situ i immunofluorescencji całej góry

Mikroiniekcja zarodków i larw danio pręgowanego jest kluczową, ale wymagającą techniką stosowaną w wielu modelach danio pręgowanego. W tym miejscu przedstawiamy szereg narzędzi w mikroskali, które pomagają w stabilizacji i orientacji danio pręgowanego zarówno do mikroiniekcji, jak i obrazowania.

Urządzenia mikrostrukturalne do zoptymalizowanej mikroiniekcji i obrazowania larw danio pręgowanego

Ten protokół demonstruje sekwencyjną immunofluorescencję i immunohistochemię na kriosekcjach z wczesnych stadiów zarodków danio pręgowanego, umożliwiając precyzyjne analizy kolokalizacji w określonych populacjach komórek.

Sekwencyjna immunofluorescencja i immunohistochemia na kriowyciętych zarodkach danio pręgowanego

Ten protokół opisuje podejście do etykietowania in toto i wielowymiarowego obrazowania wczesnego rozwoju oczu danio pręgowanego. Opisujemy znakowanie, osadzanie i obrazowanie czterowymiarowe (4D) za pomocą laserowej skaningowej mikroskopii konfokalnej oraz rozważania dotyczące optymalizacji pozyskiwania zestawów danych do analizy mechanizmów morfogenezy panewki wzrokowej.

4-wymiarowe obrazowanie morfogenezy kubka wzrokowego danio pręgowanego

Ten protokół wykorzystuje obrazowanie za pomocą arkusza świetlnego do badania funkcji skurczu serca u larw danio pręgowanego i uzyskania wglądu w mechanikę serca poprzez śledzenie komórek i interaktywną analizę.

Obrazowanie 4D Light-sheet skurczu serca danio pręgowanego

Opisano strategię przygotowania próbki do obrazowania wczesnych zarodków danio pręgowanego w nienaruszonym kosmówce za pomocą mikroskopu z arkuszami świetlnymi. Analizuje różne orientacje, jakie zarodki nabywają w kosmówce na 70% etapie epibolii i pąków, a także szczegółowo opisuje strategie obrazowania w celu uzyskania rozdzielczości w skali komórkowej w całym zarodku przy użyciu systemu arkuszy świetlnych.

Obrazowanie w mikroskopii świetlnej i strategie montażu wczesnych zarodków danio pręgowanego

Poznaj półautomatyczne obrazowanie fluorescencji tkankowo-specyficznej w zarodkach Danio rerio. Ta metoda umożliwia wykrywanie komórek odpowiadających na estrogeny przy użyciu standardowego mikroskopu fluorescencyjnego z automatyczną platformą.

Półautomatyczne obrazowanie specyficznej tkankowo fluorescencji w zarodkach danio pręgowanego

Przeglądaj więcej filmów