Półautomatyczne obrazowanie specyficznej tkankowo fluorescencji w zarodkach danio pręgowanego

Ogólnym celem tej procedury jest automatyczne wykrycie komórek reagujących na estrogen w żywych larwach danio pręgowanego. Osiąga się to poprzez najpierw wyhodowanie pięciu dorosłych ryb X-E-R-E-G-F-P w celu wygenerowania estrogenowych zarodków reporterowych danio pręgowanego. Następnie zarodki umieszcza się w indywidualnych dołkach na 96-dołkowej płytce.

Następnie estrogeny są dodawane do płytki zarodków. Na koniec płytka jest skanowana pod kątem fluorescencji za pomocą mikroskopu fluorescencyjnego epi ze zmotoryzowanym stolikiem. Ostatecznie mikroskopia fluorescencyjna służy do wykazania specyficznej dla tkanek aktywności receptorów estrogenowych.

Tak więc główną zaletą stosowania tej techniki w porównaniu z innymi tradycyjnymi technikami, takimi jak badania przesiewowe o wysokiej przepustowości lub wysokiej zawartości, jest to, że specyficzną dla tkanek fluorescencję larw danio pręgowanego można obrazować za pomocą standardowego mikroskopu fluorescencyjnego epi. Wyposażony w zmotoryzowany stolik, nie jest wymagany specjalistyczny czytnik płytek. Uwaga: chemikalia z BPA i estradiolem są niebezpieczne i mogą mieć szkodliwy wpływ na płód ludzki.

Z substancjami zaburzającymi funkcjonowanie układu hormonalnego należy obchodzić się ostrożnie i zawsze używać odpowiedniego sprzętu ochrony osobistej. W tej demonstracji danio pręgowany zostanie wystawiony na działanie estrogenów 17 beta estradiolu, bisfenolu A i geniny w różnych dawkach, począwszy od 48 godzin po zapłodnieniu po wyhodowaniu danio pręgowanego oraz zebraniu i wyrównaniu jaj. Zgodnie z tekstem w dniu zabiegu, rozcieńczyć rozcieńczać podstawowe roztwory chemiczne, jeden do 1000 w jednym mililitrze E trzy B plus energicznie wirować PTU.

Jako sterowanie pojazdem. Użyć rozcieńczenia DMSO od 1 do 1000 w E, trzech, B i PTU, używając transferu z tworzywa sztucznego o dużym otworze. Pipetą przenieś trzy zarodki na studzienkę do płytki 96-dołkowej, przygotowując trzy dołki na warunek.

Należy unikać umieszczania zarodków w dołkach zewnętrznych, aby zapobiec parowaniu pożywki podczas długotrwałego leczenia. Pracując szybko, aby uniknąć wysuszenia zarodków, usuń pożywkę z każdej studzienki i dodaj 200 mikrolitrów dobrze wymieszanego roztworu zabiegowego. Potwierdź wzrokowo, że wszystkie zarodki są zanurzone w roztworze i nie przyklejają się do boku studzienki.

Inkubuj zarodki w temperaturze 28,5 stopni Celsjusza przez 72 godziny. Po zapłodnieniu znieczulij zarodki, dodając 10 mikrolitrów czterech miligramów na mililitr trica. Aby każdy z nich dobrze umieścił płytkę 96-dołkową na zmotoryzowanym stoliku i za pomocą oprogramowania Zeiss Zen Blue 2011.

Skalibruj stolik, wybierając opcję nośnika próbki i wybierając multi well 96. Następnie wybierz kalibrację przed postępowaniem zgodnie ze wskazówkami krokowymi, używając obiektywu 10x i ustawienia jasnego pola lub BF, zidentyfikuj zarodek kontroli pozytywnej i ustaw odpowiednie ustawienia ekspozycji dla kanałów BF i GFP, upewniając się, że sygnał fluorescencji nie nasyca aparatu. Skoncentruj się na pojedynczym zarodku i zaprogramuj mikroskop tak, aby uzyskał łącznie trzy sekcje Z, które zawierają jeden obraz 50 mikrometrów powyżej i jeden 50 mikrometrów poniżej aktualnej płaszczyzny ogniskowej.

Następnie, aby ustawić parametry oprogramowania w celu uzyskania obrazu kafelkowego przy użyciu kanałów GFP i BF. Na karcie pobierania wybierz pozycję konfiguracja zaawansowana, wybierz regiony kafelków, a następnie kafelki. Wybierz okrąg.

Opcja studni wybierz nośnik i współczynnik wypełnienia 90%, aby uchwycić wiele obrazów wybranych studzienek, tak aby 90% powierzchni każdej studni było widoczne na obrazie kompozytowym. W obszarze opcje wybierz żądany stopień nakładania się, na przykład od pięciu do 10%co pozwala na gładki szew między obrazami. Następnie rozpocznij obrazowanie, aby ręcznie uchwycić obrazy za pomocą obiektywu 20x i ustawienia BF, zidentyfikuj zarodek kontroli pozytywnej.

Ustaw ustawienia BF i GFP jak poprzednio i rób zdjęcia. Ten rysunek przedstawia złożone obrazy z poszczególnych dołków płytki 96-dołkowej. Każdy obraz składa się z 59 pojedynczych obrazów, które nakładają się na siebie w 5%.

Zwróć uwagę, że żywe danio pręgowane są rozmieszczone losowo w każdej studzience. Mimo to jesteśmy w stanie odróżnić fluorescencję w sercu od fluorescencji w wątrobie. Obrazy w jasnym polu są przydatne jako punkty odniesienia do oceny orientacji danio pręgowanego i wizualizacji nieprawidłowości morfologicznych.

Pokazane tutaj obrazy zostały wykonane za pomocą obiektywu o dużej odległości roboczej 20 razy w celu bardziej szczegółowej analizy i zostały wykonane bezpośrednio po pokazanym przed chwilą automatycznym skanowaniu bez zdejmowania płytki ze stolika mikroskopu. Za pomocą obiektywu 20x fluorescencja w sercu może być precyzyjnie zlokalizowana w zastawkach komorowych przedsionków wskazywanych przez strzałki i zastawkach aortalnych, jak wskazuje grot strzałki. Po opanowaniu tej techniki można rejestrować obrazy z 3 96 płyt ściennych dziennie.

Nie zapominaj, że praca ze związkami zaburzającymi gospodarkę hormonalną może być niebezpieczna, dlatego zawsze podejmuj odpowiednie środki ostrożności, takie jak noszenie odpowiedniego sprzętu ochrony osobistej podczas wykonywania tej procedury.