Name: Ocena specyficznego dla gatunku wkładu w rozwój twarzoczaszki za pomocą chimer kaczki przepiórczej (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-05-31T14:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 38 s
Description: Poznaj metodę tworzenia chimer kaczko-przepiórczych do badania roli komórek grzebienia nerwowego w rozwoju twarzoczaszki. Technika ta pozwala analizować gatunkowo-specyficzne wzorce morfogenezy czaszki.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Ta praca została sfinansowana przez grant F32 (DE021929) Narodowego Instytutu Badań Stomatologicznych i Twarzoczaszkowych (NIDCR) dla J.L.F. oraz grant NIDCR R01 DE016402 dla R.A.S.

1. Przygotuj igły wolframowe
<ol>
	<li>Przetnij pręt wolframowy na pół za pomocą nożyc do drutu, aby pręt się nie zginał.</li>
	<li>Przeciągnij pręt przez stożkowy koniec pipety Pasteura ze szkła borokrzemianowego o grubości 5 3/4 cala.</li>
	<li>Pozostawiając około 3/4 cala pręta wystającego ze szkła, przyklej pręt do końcówki pipety za pomocą małej kulki "kleju topliwego" (HMA), który jest klejem w sztyfcie używanym w pistolecie do klejenia. HMA należy szybko stopić w płomieniu alkoholowym, uważając, aby nie spalić kleju i nie wytworzyć czarnego dymu.</li>
	<li>Za pomocą kleszczy zegnij końcówkę pręta wolframowego (około 1/4 cala od górnego końca), aż do osiągnięcia kąta 45°.</li>
	<li>Trzymając pipetę Pasteura, umieść około 1/8 cala końcówki pręta wolframowego w płomieniu palnika propanowego. Trzymaj końcówkę stabilnie i dokładnie prostopadle do płomienia.</li>
	<li>Wyciągnij igłę z płomienia w momencie, gdy z igły odleci maleńka pomarańczowa plamka wolframu.</li>
</ol>
2. Przygotuj pipety Spemann
<ol>
	<li>Za pomocą palnika Bunsena podgrzej wąską końcówkę pipety Pasteura, aż szklanka znajdująca się tuż za stożkiem zacznie się topić. Zdejmij z ognia i pociągnij końcówkę, aż pipeta się uszczelni. Upewnij się, że pozostała część stożkowej części, która ma średnicę zewnętrzną około 0.7-1.0 mm. Oderwij uszczelniony koniec około 4 cm od stożka.</li>
	<li>Przymocuj około 2 stopy (60 cm) gumowej rurki do szerokiego (otwartego) końca pipety. Przedmuchaj drugi koniec gumowej rurki, aby upewnić się, że powietrze nie może przejść przez stożkową część pipety Pasteura.</li>
	<li>Używając butli z propanem z dołączoną palnikiem ołówkowym, podgrzej owalny obszar po jednej stronie pipety, tuż poniżej początku stożka. Wdmuchuj powietrze bardzo delikatnie i stale przez gumową rurkę z niewielkim naciskiem (w przybliżeniu ciśnienie potrzebne do wypowiedzenia początku litery "P" na poziomie rozmowy). Gdy szkło stanie się miękkie z jednej strony i zacznie wyginać się na zewnątrz, szybko zdejmij pipetę z płomienia i mocno i równomiernie przedmuchaj gumową rurkę. Spowoduje to, że rozgrzana część szklanki utworzy bąbelek w kształcie kiełbasy, który może pęknąć, co jest w porządku. Jeśli bańka jest za mała, spróbuj ponownie stopić i wydmuchać szklankę. Ostatnie otwarte okienko w szybie powinno mieć około 0,25 cala (6,35 mm) szerokości i 0,5 cala (12,7 mm) długości.</li>
	<li>Kierując zwężającą się końcówkę do góry, zeskrob bańkę do szklanego pojemnika na odpady, delikatnie przedmuchując rurkę, aby zapobiec przedostawaniu się odłamków szkła do pipety.</li>
	<li>Za pomocą płomienia propanu wypal pozostałe krawędzie bańki i wypoleruj ogniem boki otwartego okna. Uważaj, aby nie stopić trzonu pipety.</li>
	<li>Za pomocą ołówka diamentowego naciąć stożkowy koniec pipety w odległości około 1,25 cala (30 mm) od okienka i odłamać końcówkę kleszczami, tak aby otwór pipety został czysto przycięty (wyrzuć pipety z połamanymi lub nierównymi końcówkami).</li>
	<li>Za pomocą kleszczy i krawędzi płomienia z palnika alkoholowego zegnij wąską część pipety o 0,375 cala (9,5 mm) od końcówki pod kątem około 60°, tak aby wygięta część znajdowała się w płaszczyźnie pionowej, gdy otwór okienka znajduje się w pozycji 1:00 dla osób praworęcznych i 11:00 dla osób leworęcznych. Ten krok najlepiej wykonać w obudowie bez przeciągów.</li>
	<li>Wypoleruj końcówkę ogniowo za pomocą płomienia alkoholowego pod mikroskopem preparacyjnym. Pamiętaj, aby nie zamykać końcówki, ale raczej utrzymuj otwór okrągły i gładki bez żadnych zwężeń.</li>
	<li>Wytnij kawałek gumowej rurki o średnicy 1 cala (25 mm), spryskaj kawałek rurki 70% etanolem i nasuń rurkę na trzon pipety, aż otwór okienka zostanie całkowicie zakryty. Pełni ona funkcję "membrany" pipety Spemann.</li>
	<li>Umieść gruszkę o pojemności 2 ml z gumy lateksowej na otwartym dnie pipety. Bańka utrzymuje podciśnienie w pipecie Spemanna.</li>
	<li>Aby ćwiczyć korzystanie z pipety Spemanna, przenieś pod mikroskopem kulki chromatograficzne o średnicy około 100-200 μm z zaznaczonego miejsca na jednej szalce Petriego do zaznaczonego miejsca w innym.</li>
	<li>Aby wyczyścić pipetę Spemann, wyjmij gumową gruszkę i umieść pipetę przechyloną w dół w wysokiej zlewce wyłożonej bawełną lub gazą na dnie i wypełnionej wodą destylowaną i detergentem do szkła.</li>
</ol>
3. Sterylizuj i inkubuj jaja
<ol>
	<li>Przetrzyj jajka 70% etanolem i umieść jajka na plastikowych tackach na jajka.</li>
	<li>Jaja należy umieścić w podgrzewanym inkubatorze w temperaturze 37,5 °C i 85-87%.</li>
	<li>Wysiaduj jaja, aż osiągną HH9,5, około 26 godzin dla przepiórek i 48 godzin dla kaczki.</li>
</ol>
4. Jaja okienne
<ol>
	<li>Usuń mały kawałek zewnętrznej skorupy z wierzchu jajka za pomocą kleszczy, uważając, aby nie przebić wewnętrznej błony skorupy.</li>
	<li>Za pomocą strzykawki z igłą o wymiarach 18 G na 1 cal należy zrobić otwór w najwęższym końcu jajka i pobrać około 1-2 ml białka.</li>
	<li>Umieść przezroczystą taśmę na otworze i ślad nakłucia w skorupie.</li>
	<li>Wytnij "okno" wzdłuż górnej powierzchni jajka (przez przezroczystą taśmę) za pomocą zakrzywionych nożyczek.</li>
</ol>
5. Wizualizacja zarodków i przygotowanie do operacji
<ol>
	<li>Za pomocą szklanej pałeczki delikatnie przetrzyj zarodek niewielką ilością Neutral Red (0,02 g/ml w BSS Hanka).</li>
	<li>Przetnij błonę witeliny i przeciągnij ją po zarodku za pomocą zaostrzonej płomieniem igły wolframowej.</li>
	<li>Ponownie zamknij jajko, umieszczając przezroczystą taśmę na oknie.</li>
</ol>
6. Oddziel tkankę dawcy od zarodka dawcy
<ol>
	<li>Usuń taśmę z okienka na komórce jajowej zarodka dawcy.</li>
	<li>Aby przeciąć fałd nerwowy z sąsiedniej ektodermy zarodka dawcy, wykonaj szczeliny po obu stronach cewy nerwowej za pomocą naostrzonej płomieniem igły wolframowej (wyprodukowanej zgodnie z powyższym opisem).</li>
	<li>Następnie przeciąć cewę nerwową na pożądanym przednim i tylnym poziomie przeszczepu i oddzielić przeszczep od reszty cewy nerwowej.</li>
	<li>Usunąć fałd nerwowy z zarodka dawcy za pomocą pipety Spemann lub innej mikropipety.</li>
	<li>Następnie usuń taśmę z okienka na komórce jajowej gospodarza i za pomocą pipety Spemann umieść fałd nerwowy dawcy obok zarodka gospodarza w sąsiedztwie obszaru cewy nerwowej, która zostanie przeszczepiona.</li>
</ol>
7. Oddziel tkankę gospodarza i przeszczep tkankę dawcy
<ol>
	<li>Oddziel fałd nerwowy od cewy nerwowej zarodka gospodarza, tak jak w przypadku dawcy. Należy pamiętać o usunięciu przeszczepu o takiej samej wielkości jak tkanka dawcy. </li>
	<li>Delikatnie odepchnij tę tkankę gospodarza daleko od zarodka.</li>
	<li>Następnie igłą wolframową lub zaokrągloną końcówką mikropipety delikatnie przesuń fałd nerwowy dawcy do cewy nerwowej gospodarza, utrzymując prawidłową orientację przednio-tylną i grzbietowo-brzuszną. Upewnij się, że przeszczep jest schowany po bokach, ale pamiętaj, aby nie szturchnąć ani nie uszkodzić leżących pod spodem tkanek. Aby pomóc w śledzeniu pierwotnej orientacji, zwróć uwagę na asymetrię w tkance dawcy lub barwienie różnicowe od neutralnej czerwieni. Dokumentujemy również fotograficznie zarodek dawcy wraz z towarzyszącą mu wyciętą tkanką, a także chimerę bezpośrednio po operacji.</li>
	<li>Do komórki jajowej należy dodać sterylną sól fizjologiczną, jeśli zarodek gospodarza wykazuje oznaki wysuszenia.</li>
	<li>Teraz ostrożnie ponownie zamknij i oznacz jajo, a następnie delikatnie umieść je w inkubatorze o wysokiej wilgotności (70-80%), gdzie chimeryczny zarodek może rozwinąć się do pożądanego etapu analizy.</li>
</ol>
8. Kolekcja Chimer
<ol>
	<li>Pamiętaj, aby zebrać chimeryczne zarodki w świeżo przygotowanym zimnym utrwalaczu Serry i natychmiast umieścić je na kołysce w temperaturze 4 °C w celu utrwalenia O/N. Pozwoli to na bardziej czułe wykrywanie komórek przepiórczych za pomocą przeciwciała anty-przepiórczego.</li>
	<li>W przypadku analiz ekspresji genów za pomocą RT-qPCR, zarodki należy zamrozić bezpośrednio w ciekłym azocie przed ekstrakcją RNA.</li>
</ol>

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Grzebień nerwowy to przejściowa populacja komórek embrionalnych, która intensywnie migruje w całym zarodku i różnicuje się w różne typy komórek, w tym chondrocyty i osteoblasty, które przyczyniają się do szkieletu twarzoczaszki. Przeszczepienie grzebienia nerwowego w układzie chimerycznym przepiórki i kaczki w znacznym stopniu przyczyniło się do naszego zrozumienia interakcji tkankowych i szlaków sygnałowych, które regulują rozwój szkieletu twarzoczaszki. Jednak biorąc pod uwagę ogromny potencjał grzebienia nerwowego do generowania komórek mięśni gładkich, adipocytów, melanocytów, komórek Schwanna i neuronów, system chimery przepiórki i kaczki ma ogromny potencjał dla przyszłych zastosowań, szczególnie w połączeniu z szybkim postępem biologii komórek macierzystych i medycyny regeneracyjnej. Ponieważ zarówno przepiórka, jak i kaczka są gatunkami hodowanymi komercyjnie, w różnych gospodarstwach dostępna jest łatwa dostawa stosunkowo niedrogich zapłodnionych jaj. W związku z tym technika ta powinna być dostępna dla badaczy działających w szerokim zakresie budżetów i przestrzeni obiektu.
Chociaż ta technika jest bardzo potężna, pozostaje kilka ograniczeń. Podobnie jak w przypadku innych technik chirurgicznych, jakość i żywotność chimer przepiórek zależy od umiejętności chirurgicznych badacza, a zatem będzie więcej różnic między- i wewnątrzosobniczych między eksperymentami w porównaniu z innymi modelami, takimi jak te wykorzystujące genetykę myszy. Co więcej, istnieją również różnice w tempie rozwoju i etapach rozwoju poszczególnych zarodków, co przyczynia się do odtwarzalności i powodzenia każdego przeszczepu. Ptasie zarodki są również bardzo podatne na odwodnienie, dlatego kluczowe kroki podczas operacji obejmują utrzymywanie niskiego poziomu światła, czas spędzony pod mikroskopem do minimum, zamykanie jaj taśmą w jak największym stopniu oraz wysoką wilgotność w inkubatorze pooperacyjnym, aby uniknąć wysuszenia.
Jeśli chodzi o żywotność chimer, zwykle przeżywa od 50 do 75%, chociaż odsetek ten może się zmniejszać wraz z wiekiem etapu pobierania. Podczas typowej 4-6 godzinnej sesji chirurgicznej doświadczony chirurg może wygenerować 10-15 chimer. Sukces przeszczepów zależy również w dużej mierze od jakości narzędzi. Dobre narzędzia prowadzą do bardziej spójnych, powtarzalnych wyników. Użycie palnika propanowego do produkcji igieł wolframowych pozwala na wykonanie niezwykle ostrych igieł. Rodzaj użytej pochodni ma duże znaczenie, ponieważ kontroluje wielkość płomienia. Można również zastosować ostrzenie elektrolityczne, ale takie podejście nawet nie zbliża się do produkcji igieł tak ostrych. Użyj prętów wolframowych zamiast nawiniętego drutu, aby igły można było wyprostować.
Mikropipeta firmy Spemannow, choć czasochłonna i trudna do wykonania, jest idealnym narzędziem do transferu tkanek. Pipetę można dostosować do różnych rozmiarów otworów i można jej używać wielokrotnie. Kluczowym czynnikiem przy użyciu mikropipety Spemann jest posiadanie pewnej ilości płynu w pipecie przed dotknięciem końcówki do powierzchni zarodka. Część płynu zawsze wypływa na zewnątrz, gdy dojdzie do kontaktu z łąkotką nad zarodkiem. Naciśnięcie na membranę pozwala na bardzo precyzyjne wyrzucenie płynu i tkanki przeszczepu, podczas gdy lekkie puszczenie na membranie delikatnie zasysa tkankę przeszczepu dawcy do pipety. Utrzymanie niewielkiego dodatniego ciśnienia na membranie utrzymuje tkankę przeszczepu dawcy na końcówce pipety podczas transferu, A niewielki dodatkowy nacisk na przeponę pozwala na celowe umieszczenie tkanki przeszczepu dawcy w gospodarzu.
W celu ochrony pipety Spemann podczas przechowywania i sterylizacji, wyjmij gruszkę z szerokiego końca i ostrożnie włóż stożkową końcówkę do bańki. Umieść pipetę Spemann w szklanej probówce, przykryj górną część folią aluminiową i autoklaw przed zabiegiem. Po tym, jak wiele pipet jest gotowych do ponownej sterylizacji do zabiegu chirurgicznego, odwróć pipety, podgrzej je prawie do wrzenia w tym samym roztworze wody destylowanej i detergentu do szkła, a następnie kilkakrotnie spłucz wodą destylowaną. Pipety do autoklawowania w ich indywidualnych probówkach. Gumowa rurka tworząca membranę i gumowa bańka powinny być wymieniane po kilku sterylizacjach lub gdy staną się ciemne i sztywne.
Wiele elementów tego protokołu wiąże się z niebezpiecznym sprzętem. Na przykład procedura wytwarzania mikropipet Spemann obejmuje trzy rodzaje płomieni, a także podgrzewanie, ciągnięcie, przedmuchiwanie, gięcie, cięcie i polerowanie szkła. Dlatego noszenie odpowiednich środków ochrony osobistej (PPE), które zwiększają bezpieczeństwo, takich jak gogle i fartuch laboratoryjny, ma kluczowe znaczenie. Ponadto, ponieważ wiele osób cierpi na alergie na jajka lub może się z nimi rozwinąć, zawsze używaj rękawiczek podczas obchodzenia się z jajkami. Mając na uwadze te środki ostrożności, system chimeryczny kaczki przepiórczej jest bezpieczną, wydajną i stosunkowo dostępną metodą, która ma wiele przyszłych zastosowań.

Szkielet twarzy rozwija się w wyniku wzrostu i fuzji wielu procesów twarzy, które składają się z grzebienia nerwowego i mezenchymii mezenchymów otoczonych warstwami nabłonka ektodermalnym i endodermalnym1-11. Zdarzenia morfogenetyczne w każdym procesie są regulowane przez odrębne interakcje sygnalizacyjne między mezenchymą a otaczającym nabłonkiem12-16. Zmiany w tych oddziaływaniach sygnalizacyjnych i/lub ich efektorach przyczyniają się do fenotypów choroby i mogą być również istotne dla ewolucji szkieletu twarzoczaszki 17,18. W związku z tym wyjaśnienie czasu i charakteru interakcji tkankowych ma ogromny potencjał, aby poszerzyć naszą wiedzę na temat biologii rozwojowej i ewolucyjnej twarzoczaszki.
Wykorzystanie chimerycznych embrionów do badania interakcji tkankowych ma długą historię w biologii rozwojowej. Podejście to zostało zapoczątkowane przez Hansa Spemanna i jego laboratorium, którzy odkryli embrionalne "organizatory" poprzez przeszczepianie tkanek między zarodkami różnych gatunków. Spemann był mistrzem technik mikrochirurgicznych, którego umiejętności manualne zostały uzupełnione przez opracowanie specjalistycznych narzędzi, w szczególności pipety Spemann. Viktor Hamburger był doktorantem w laboratorium Hansa Spemanna we Freiburgu w latach dwudziestych XX wieku, kiedy to przeprowadzono pierwsze eksperymenty transplantacyjne, które doprowadziły do Nagrody Nobla dla Spemanna. Kiedy Hamburger przeniósł się na Uniwersytet Waszyngtoński w St. Louis w 1935 roku, szczegółowo opisał proces tworzenia mikropipety Spemann w swoim Podręczniku embriologii eksperymentalnej19. Drew Noden był doktorantem w laboratorium Hamburgera na Uniwersytecie Waszyngtońskim do 1972 roku. Po przeniesieniu się na University of Massachusetts w Amherst, a następnie na Cornell University, Noden kontynuował produkcję i używanie mikropipet Spemann do swoich przeszczepów chirurgicznych z udziałem chimerów przepiórek i piskląt. Podczas studiów magisterskich jeden z autorów (Rich Schneider) szkolił się z Drew Nodenem na Uniwersytecie Cornella w latach 1995-1998. Poniższy protokół tworzenia mikropipety Spemann opiera się na opisach napisanych przez Hamburgera i Nodena i zawiera późniejsze modyfikacje dokonane przez Schneidera.
Wykorzystanie chimer piskląt przepiórczych do badania rozwoju twarzoczaszki, a zwłaszcza do zrozumienia wkładu komórek grzebienia nerwowego, zostało zapoczątkowane przez Nodena i Le Douarina na początku lat siedemdziesiątych, recenzowane w Le Douarin et al20. Podejście to zostało szeroko przyjęte w wielu badaniach i przez wielu innych badaczy 1,4,5,21-38. Równoważne tempo wzrostu i morfologii przepiórek i piskląt sprawia, że przeszczepy w ich obrębie są idealne do badania losu komórek i śledzenia linii. Jednak ze względu na podobieństwa między przepiórką a pisklęciem, zmiany morfologiczne wywołane przez komórki dawcy są trudne do rozszyfrowania. W przeciwieństwie do tego, inne systemy chimeryczne ptaków obejmowały kaczkę domową jako sposób badania mechanizmów, które sprawiają, że zarodki różnią się anatomicznie39-50. Mówiąc dokładniej, system chimeryczny przepiórka-kaczka oferuje wiele korzyści w rozpoznawaniu wpływu dawcy na gospodarza i odwrotnie. Po pierwsze, zarodki przepiórek i kaczek różnią się wielkością i kształtem ciała, co zapewnia bezpośredni sposób na zbadanie specyficznych dla dawcy lub gospodarza mechanizmów tworzenia wzorców poprzez oznaczanie różnych domen ekspresji genów (ryc. 1 A i B). Po drugie, zarodki przepiórek i kaczek mają znacznie różne tempo dojrzewania, przy czym przepiórki wykluwają się w ciągu 17 dni, a kaczki w ciągu 28 dni. Przeszczepiony grzebień nerwowy zachowuje swoje wewnętrzne tempo dojrzewania w środowisku gospodarza, a zatem możliwa jest identyfikacja czasowych zmian w ekspresji genów, interakcjach tkankowych, histogenezie i morfogenezie51-57. Wreszcie, przeciwciało jądrowe przeciw przepiórkom (Q¢PN) pozwala na trwałe odróżnienie od siebie wkładów komórkowych dawcy i gospodarza poprzez rozpoznanie białka, które jest wszechobecne w komórkach przepiórczych, ale nieobecne w komórkach kaczki.

<table><tbody><tr><td>1x PBS</td><td>TEK</td><td>TEKZR114</td><td></td></tr><tr><td>Hank' s BSS bez czerwieni fenolowej</td><td>Invitrogen</td><td>14025-092</td><td></td></tr><tr><td>Neutral Red</td><td>Sigma Aldrich</td><td>N4638-5G</td><td>0,22 &micro; m Igły</td></tr><tr><td>18 G</td> z filtrem <td></td> Strzykawka <td>BD</td> 305195 <td></td></tr><tr><td>5 ml</td><td>Kleszcze</td><td></td> Dumont 309646 <td></td></tr><tr><td>nr 5</td><td>Narzędzia do nauki</td> pięknej <td>11252-20</td><td></td></tr><tr><td>Nożyczki proste</td><td>Narzędzia do nauki</td><td>14028-10</td><td></td></tr><tr><td>Nożyczki zakrzywione</td><td>Narzędzia do nauki o naprawach</td><td>14029-10</td><td></td></tr><tr><td>Pipeta</td><td></td> <td>Spemann</td><td>Ręcznie robiony w laboratorium</td></tr><tr><td>Uchwyt</td><td></td><td></td> na jajka <td>Szklana popielniczka i modelina</td></tr><tr><td>Palnik alkoholowy</td><td>Fisher</td><td>04-245-1</td><td></td></tr><tr><td>Przezroczysta taśma</td><td>3M Scotch</td><td>600</td><td></td></tr><tr><td>Szklany pręt do mieszania</td><td>Fisher</td><td>11-380C</td><td>Końcówka jest zwężona i zaokrąglona za pomocą płomienia</td></tr><tr><td>Drut wolframowy (0,004 x 3 cale)</td><td>A-M Systems</td><td>7190</td><td>Końcówka jest naostrzona płomieniem w palniku propanowym</td></tr><tr><td>Palnik</td><td>Bunsun Fisher Scientific</td><td>S49117</td><td></td></tr><tr><td>Pipeta Pasteura</td><td>Fisherbrand</td><td>22-183-632</td><td>9-calowa (229 mm)</td></tr> <tr><td>rurka gumowa</td><td>Fisher Scientific</td><td>14-178C</td><td>bursztynowa, cienkościenna kauczuk naturalny; grubość ścianki: 0,0625 cala / 1,6 mm; OD OD: 0,375 cala / 9,5 mm; ID: Butla z propanem 0,25 cala / 6,4 mm</td></tr><tr><td></td><td>BernzOmatic</td><td>UL2317</td><td>TX-9 z latarką typu "A" z przykręcaną mosiężną latarką "płomienia ołówka"</td></tr><tr><td>Ołówek diamentowy Fisher</td><td>Scientific</td><td>22-268912</td><td></td></tr><tr><td>Żarówki gumowe</td><td>Fisherbrand</td><td>S32325</td><td></td></tr></tbody></table>

ocena specyficznego dla gatunku wkładu w rozwój twarzoczaszki za pomocą chimer kaczki przepiórczej

Assessing Species-specific Contributions To Craniofacial Development Using Quail-duck Chimeras

Generowanie chimerycznych embrionów to szeroko rozpowszechnione i skuteczne podejście do badania losów komórek, interakcji tkankowych i specyficznego dla gatunku wkładu w rozwój histologiczny i morfologiczny zarodków kręgowców. W szczególności wykorzystanie zarodków chimerycznych ustaliło znaczenie grzebienia nerwowego w kierowaniu specyficzną dla gatunku morfologią kompleksu twarzoczaszki. Opisana tu metoda wykorzystuje dwa gatunki ptaków, kaczkę i przepiórkę, o niezwykle różnej morfologii twarzoczaszki. Metoda ta znacznie ułatwia badanie molekularnej i komórkowej regulacji specyficznego dla gatunku wzorca w kompleksie twarzoczaszki. Eksperymenty na chimerycznych zarodkach przepiórek i kaczek ujawniły już interakcje tkankowe za pośrednictwem grzebienia nerwowego i autonomiczne zachowania komórkowe, które regulują specyficzny dla gatunku wzór w szkielecie twarzoczaszki, mięśniach i powłokach. Ogromna różnorodność pochodnych grzebieni nerwowych sugeruje znaczny potencjał przyszłych zastosowań systemu chimerycznego przepiórka-kaczka do zrozumienia rozwoju, chorób i ewolucji kręgowców.

Przed przystąpieniem do dalszych analiz należy ocenić wydajność przeszczepu. W przypadku analiz histologicznych, morfologicznych lub analizy ekspresji genów w próbkach tkanek, komórki przepiórnika należy wykryć metodą immunohistochemii z użyciem przeciwciała Q¢PN, zgodnie z opisem36. W przypadku analiz RNA, wkład specyficzny dla gatunku w badanych tkankach można obliczyć, stosując strategię opartą na PCR58. Po potwierdzeniu skuteczności przeszczepu w chimerach można ocenić dalsze wskaźniki morfologiczne lub molekularne. Interakcje między donatorskimi komórkami grzebienia nerwowego a otaczającymi je tkankami gospodarza, które leżą u podstaw prawidłowej histogenezy i morfogenezy kompleksu kraniofacjalnego, były wcześniej szeroko badane. W szczególności mezenchyma grzebienia nerwowego kieruje specyficzną dla gatunku morfologią twarzy7,13,51,59, wzorem upierzenia52, wzorem rozmieszczenia mięśni56 oraz chrząstkami53,57 poprzez regulację ekspresji genów gospodarza. Na przykład mezenchyma grzebienia nerwowego determinuje czas formowania się kości w żuchwie poprzez czasową regulację ekspresji Bmp455.
W ostatnim czasie badania koncentrowały się na oddziaływaniach tkankowych występujących we wczesnej fazie rozwoju kraniofacjalnego. W związku z tym eksperymenty z wykorzystaniem chimer przepiórczo-kaczkowych wykazały, że embriony gospodarza wpływają na migrację grzebienia neuronalnego poprzez wyznaczanie granic morfologicznych. Oznacza to, że w chimerycznych embrionach kaczki komórki grzebienia neuronalnego donora (przepiórki) migrują do łuku żuchwowego kaczki-gospodarza w sposób charakterystyczny dla kaczki (Rycina 1D). Mimo tego wpływu gospodarza na wielkość populacji grzebienia neuronalnego, grzebień neuronalny donora nadal generuje szkielet żuchwy o wielkości i kształcie charakterystycznym dla przepiórki (Rycina 1E).
<img alt="Badanie transplantacji grzebienia neuronalnego przepiórki i kaczki; porównanie czaszek dorosłych, stadia rozwoju embrionalnego." fo:content-width="6in" fo:src="/files/ftp_upload/51534/51534fig1highres.jpg" src="/files/ftp_upload/51534/51534fig1.jpg" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="Rysunek 1"> 
Rysunek 1. Chimeryczny system przepiórka-kaczka. (A) Czaszki przepiórki i (B) kaczki wykazują znaczne różnice w wielkości i kształcie, w związku z czym idealnie nadają się do wykorzystania w systemie chimerycznym do badania rozwoju kraniofacialnego (zmodyfikowano z Tokita et al.56). (C) Schemat doświadczalny generowania jednostronnych chimer embrionów quck z embrionów przepiórki i kaczki na odpowiadającym sobie stadium HH9.5. Fałd neuronalny jest usuwany z jednej strony embrionów przepiórki i transplantowany do embrionów kaczki po usunięciu równoważnego fragmentu fałdu neuronalnego. (D) Komórki donora przepiórki (zielone) można śledzić w chimerach przy użyciu przeciwciała anty-przepiórczego (Q¢PN), co pokazano w widoku brzuszno w embrionie chimerycznym w stadium HH12. (F) W żuchwach quck w stadium HH38 chrząstka Meckla pochodząca od donora przepiórki jest krótsza i prostsza niż chrząstka Meckla pochodząca od gospodarza kaczki po stronie przeciwległej, która jest większa i zakrzywiona. Przedruk z Tokita et al., Dev. Bio. 306, 377 (2007) za zgodą wydawnictwa Elsevier.

Ten artykuł opisuje metodę generowania embrionów chimerycznych, które są przeznaczone do testowania specyficznego dla gatunku wkładu grzebienia nerwowego i/lub innych tkanek w rozwój twarzoczaszki.

Ocena specyficznego dla gatunku wkładu w rozwój twarzoczaszki za pomocą chimer kaczki przepiórczej

The generation of chimeric embryos is a widespread and powerful approach to study cell fates, tissue interactions, and species-specific contributions to ...

Ogólnym celem niniejszej procedury jest wykorzystanie chimer przewodu przepiórczego jako narzędzia do badania mechanizmów, dzięki którym komórki grzebienia neuralnego generują gatunkowo specyficzne wzorce podczas rozwoju twarzoczaszki. Jest to realizowane poprzez najpierw wypreparowanie i usunięcie paska fałdu neuralnego z regionu środkowego i przedniego tylnego mózgu zarodka przepiórki w stadium 9.5. Drugi etap polega na przeniesieniu donora fałdu neuralnego przepiórki do zarodka kaczki będącego gospodarzem.Trzeci krok polega na wypreparowaniu i usunięciu odpowiadającego obszaru z zarodka kaczki w stadium 9.5, pełniacego rolę gospodarza. Ostatnim etapem jest umieszczenie zwoju fałdu nerwowego w środkowym i przednim regionie tylnego mózgowia kaczki. Ostatecznie, otrzymane zarodki chimeryczne pozwalają na precyzyjne określenie zmian w ekspresji genów pośredniczonych przez grzebień neuronalny za pomocą hybrydyzacji in situ, a także na ujawnienie zmian morfologicznych poprzez analizy histologiczne.Pomysł na tę metodę pojawił mi się po raz pierwszy podczas obserwacji brązowych pelikanów latających nad Ocean Beach w San Francisco. Zdałem sobie sprawę, że komórki grzebienia neuronalnego muszą być źródłem specyficznych dla gatunku wzorców, ponieważ to z nich powstają kości i chrząstki szkieletu ich długiego dzioba. Choć nie udało mi się zdobyć jaj brązowego pelikana, zdołałem znaleźć jaja białej kaczki pekińskiej.Biorąc pod uwagę, że San Francisco posiada największą dzielnicę Chinatown poza Azją, wykorzystując różnice w tempie dojrzewania i morfologii między przepiórkami a kaczkami, metoda ta może pomóc nam odpowiedzieć na kluczowe pytania w biologii rozwoju, takie jak zrozumienie pochodzenia wzorców specyficznych dla gatunku. Zabieg chirurgiczny zostanie przeprowadzony przez dr Jennifer Fish, stypendystkę podoktorską w moim laboratorium, a pomagać jej będzie Kate Ovitz, studentka studiów doktoranckich. Używając palnika Bunsena, należy podgrzać wąski koniec pipety Pasteura, aż szkło wzdłuż zwężenia zacznie się topić. Następnie należy wyjąć ją z płomienia i pociągnąć końcówkę, aż pipeta zostanie zamknięta.Należy upewnić się, że fragment zwężającej się części posiada średnicę zewnętrzną od 0,7 do 1 mm. Następnie należy odłamać zamknięty koniec w odległości około 4 cm od zwężenia. W kolejnym kroku do otwartego końca pipety należy przymocować około 60 cm gumowej rurki, a na drugim końcu zamocować gruszkę.Podczas delikatnego dmuchania w rurkę, przez połączenie lub drugi koniec pipety nie powinno przedostawać się powietrze. Używając palnika propanowego lub pochodni, należy podgrzać owalny obszar po jednej stronie pipety, tuż poniżej początku zwężenia. W momencie, gdy szkło zacznie wyginać się na zewnątrz, należy odsunąć pipetę od płomienia i delikatnie dmuchnąć przez gumowy przewód.Spowoduje to utworzenie się w podgrzanej części szkła pęcherza w kształcie parówki. Zbyt duże ciśnienie spowoduje pęknięcie pęcherza szklanego, czego należy unikać. Powstałe okno w pipecie powinno mieć około jednego centymetra szerokości oraz od półtora do dwóch centymetrów długości.Teraz skieruj zwężony koniec do góry i wydrap bańkę do szklanego pojemnika na odpady, delikatnie dmuchając przez rurkę, aby zapobiec przedostaniu się odłamków szkła do pipety. Następnie, używając płomienia z propaganu, ostrożnie wypal pozostałe krawędzie bańki i wypoleruj ogniowo boki otwartego okna. Następnie trzymaj pisak z diamentową końcówką w pozycji pionowej i użyj go, aby naciąć zwężony koniec pipety w odległości jednego centymetra od początku zwężenia.Za pomocą pincety ostrożnie przełam pipetę wzdłuż nacięcia. Aby usunąć końcówkę, sprawdź pod mikroskopem stereotypowym, czy przełom jest czysty i nieposzarpany. Trzymaj pipetę tak jak ołówka, umieszczając palec wskazujący nad otwartym otworem w odległości około 9,5 mm od końcówki.Zmiękczyć szkło pipety, trzymając ją w pobliżu krawędzi płomienia palnika alkoholowego. Za pomocą pincety wywrzeć nacisk na końcówkę, aby pod mikroskopem stereoskopowym zgiąć wąski koniec pipety pod kątem 60 stopni. Szybko i ostrożnie wypolerować końcówkę w płomieniu palnika alkoholowego.Gotowy otwór powinien być zaokrąglony i drożny. Należy pamiętać, że końcówka ulegnie zwężeniu i stanie się niezdatna do użytku, jeśli będzie zbyt długo wystawiona na działanie płomienia. Następnie należy zwilżyć 2,5 centymetra długości gumowej rurki 70% ethanol.Nasunąć go na trzpień pipety od dołu w górę, aby zakryć otwarte okienko. Następnie na otwarty koniec pipety nałożyć lateksową gruszkę o pojemności 2 ml. Aby utrzymać wewnętrzne ciśnienie powietrza, należy najpierw przygotować jajo gospodarza.Przetnij membranę Vitale za pomocą igły wolframowej zaostrzonej w płomieniu, a następnie naciągnij membranę na embrion. Następnie ponownie uszczelnij jajo za pomocą taśmy, tak jak zrobiono to w przypadku jaja dawcy. Usuń taśmę z okna w jajku dawcy, aby wyciąć fałd nerwowy z embrionu dawcy.Za pomocą igły wolframowej zaostrzonej w płomieniu wykonaj nacięcia po obu stronach rurki neuralnej. Następnie przetnij rurkę neuralną na pożądanym poziomie przednim i tylnym przeszczepu i oddziel go od pozostałej części rurki neuralnej. Zwróć uwagę na szczegóły anatomiczne, takie jak kształt przedni i tylny przeszczepu, aby tkanka donora została odpowiednio zorientowana.Podczas wprowadzania do gospodarza należy upewnić się, że igła wolframowa jest niezwykle ostra. Należy wykonywać szybkie i zdecydowane ruchy, aby usunąć tkankę całkowicie i w jednym kawałku. Fałd neuronalny należy pobrać z zarodka dawcy za pomocą pipety typu shaman. Należy pobrać jak najmniej cieczy, aby tkanka nie odpłynęła podczas przenoszenia.Następnie usuń taśmę z okna w jajie biorcy i za pomocą pipety Shaman umieść fałd neuralny dawcy obok embrionu biorcy, w sąsiedztwie regionu cewy nerwowej, w którym zostanie przeprowadzony przeszczep. Teraz oddziel fałd neuralny od cewy nerwowej embrionu biorcy, analogicznie do czynności wykonanych z tkanką dawcy. Należy zadbać o to, aby usunięty fragment przeszczepu był tej samej wielkości co tkanka dawcy.Delikatnie odsunąć tkankę biorcy z dala od zarodka. Następnie, używając tępej igły wolframowej lub zaokrąglonej końcówki mikropipety, delikatnie wprowadzić fałd neuronowy dawcy do cewy nerwowej biorcy, zachowując odpowiednią orientację przednio-tylną oraz grzbietowo-brzuszną. Należy upewnić się, że przeszczep jest dobrze dopasowany wzdłuż boków, unikając jednocześnie nakłucia lub uszkodzenia leżących poniżej tkanek.Sterylną sól fizjologiczną należy ostrożnie i delikatnie nanieść na embrion gospodarza. W przypadku wystąpienia oznak wysychania, należy teraz starannie zapieczętować i opisać jajo, a następnie delikatnie umieścić je z powrotem w inkubatorze o wysokiej wilgotności, w którym embrion chimeryczny może rozwijać się do pożądanego stadium do analizy.Do analizy należy zebrać embriony chimeryczne do świeżo przygotowanego, zimnego utrwalacza Sarah's. Następnie należy je bezzwłocznie umieścić na wytrząsarce w temperaturze 4 °C w celu utrwalenia przez noc. Pozwoli to na bardziej czułą detekcję komórek przepiórczych z użyciem przeciwciała anty-przepiórczego.Kolejnym ważnym krokiem w analizach ekspresji genów metodą ilościowej PCR w czasie rzeczywistym jest zamrożenie embrionów w ciekłym azocie przed ekstrakcją RNA. Węgorze i kaczki wykazują znaczne różnice w wielkości i kształcie, a zatem ich embriony są idealnie predysponowane do tworzenia systemu chimerycznego w celu badania rozwoju kraniofacjalnego.W szczególności system ten jest użyteczny do badania roli komórek grzebienia neuronalnego. Podczas formowania szkieletu twarzy w chimerze zarodka przepiórki i kaczki, komórki grzebienia neuronalnego dawcy (przepiórki) migrują do łuku żuchwowego gospodarza (kaczki). W obrazie z widoku brzusznego, komórki dawcy przepiórki zaznaczone na zielono, ułożone w sposób charakterystyczny dla kaczki, są widoczne dzięki zastosowaniu przeciwciała przeciwko przepiórce.W chimerycznym embrionie w stadium 12 donatorska grzebień neuronalny generuje szkielet żuchwy, który pod względem wielkości i kształtu przypomina szkielet przepiórki. Po opanowaniu techniki każdy przeszczep można wykonać w ciągu około pięciu minut. Przedłużanie tego procesu ponad ten czas naraża embrion na wysuszenie i obniża przeżywalność.Podczas wykonywania tej procedury ważne jest, aby zwracać uwagę na postawę ciała, rozluźnić ramiona i zachować prawidłowe ułożenie dłoni. Należy również wypracować rutynę i rozmieszczać narzędzia chirurgiczne oraz odczynniki zawsze w tym samym miejscu, aby móc utrzymywać wzrok w mikroskopie i poruszać dłońmi w sposób zautomatyzowany.

assessing-species-specific-contributions-to-craniofacial-development

Research

JoVE Journal

Biology

Biologia

Ocena wkładu specyficznego dla gatunku w rozwój twarzoczaszki przy użyciu chimer kurcz-kaczki

W niniejszym artykule opisano technikę transplantacji tkanek, która została opracowana w celu zbadania właściwości sygnalizacyjnych i wzorowania powierzchniowego ektodermy głownej podczas rozwoju kraniofacjalnego.

Ocena właściwości sygnalizacyjnych nabłonków ektodermalnych podczas rozwoju kraniofacjalnego

Opisano podejście do analizy migracji i ostatecznego losu ptasich komórek grzebienia neuronalnego w embrionach chimerycznych przepiórnik-kurczak. Metoda ta stanowi prostą i przejrzystą technikę śledzenia komórek grzebienia neuronalnego podczas migracji i różnicowania, których w przeciwnym razie trudno byłoby odróżnić w niezmodyfikowanym embrionie kurczaka.

Analiza migracji i różnicowania grzebienia neuronalnego za pomocą transplantacji międzygatunkowej

Wizualizacja danych eksperymentalnych stała się kluczowym elementem prezentacji wyników społeczności naukowej. Generowanie poklatkowych zapisów na żywo rosnących zarodków przyczynia się do lepszej prezentacji i zrozumienia złożonych procesów rozwojowych. Protokół ten jest przewodnikiem krok po kroku dotyczącym znakowania komórek poprzez fotokonwersję białka kaede u danio pręgowanego.

Wizualizacja rozwoju twarzoczaszki w sox10: transgeniczna linia danio pręgowanego kaede przy użyciu poklatkowej mikroskopii konfokalnej

Technika przeszczepiania tkanki twarzy "Extreme Anterior Domain" pomiędzy embrionami Xenopus laevis została opracowana. Tkanka może być przenoszona z jednego tła ekspresji genów do drugiego, co pozwala na badanie lokalnych wymagań dotyczących rozwoju twarzoczaszki i sygnalizowania interakcji między regionami twarzy.

Przeszczepy twarzy w zarodkach Xenopus laevis

Obrazowanie konfokalne w czasie jest potężną techniką przydatną do charakteryzowania rozwoju embrionalnego. W tym miejscu opisujemy metodologię i charakteryzujemy morfogenezę twarzoczaszki w zarodkach typu dzikiego, a także pdgfra, smad5 i zmutowanych smo.

Analiza morfogenezy twarzoczaszki u danio pręgowanego przy użyciu mikroskopii konfokalnej 4D

Opracowano metodę ilościowego określania wielkości i kształtu zarodków Xenopus laevis. W tym protokole tradycyjne pomiary wielkości są połączone z morfometrią geometryczną, aby umożliwić bardziej wyrafinowane analizy rozwoju i wad ustno-twarzowych.

Kwantyfikacja fenotypów ustno-twarzowych u Xenopus

Organizacja komórkowa kości twarzoczaszki od dawna była przedmiotem hipotezy, ale nigdy nie została bezpośrednio zwizualizowana. Wielospektralne znakowanie komórek i obrazowanie na żywo in vivo umożliwiają wizualizację dynamicznego zachowania komórek w dolnej szczęce danio pręgowanego. Tutaj szczegółowo opisujemy protokół manipulowania transgenicznymi rybami Zebrabow i bezpośrednio obserwujemy interkalację komórek i zmiany morfologiczne chondrocytów w chrząstce Meckla.

Wizualizacja interkalacji chondrocytów i proliferacji kierunkowej za pomocą analizy komórek klonalnych Zebrabow w embrionalnej chrząstce Meckla

Ten artykuł przedstawia metodę izolowania czystych tkanek embrionalnych z zarodków przepiórek i kurczaków, które mogą być łączone w celu utworzenia chimerycznych organów ex vivo.

Izolacja tkanek embrionalnych i tworzenie chimerycznych narządów przepiórki i kurczaka na przykładzie grasicy

Ten artykuł opisuje technikę przeszczepu tkanek, która została zaprojektowana w celu przetestowania właściwości sygnalizacyjnych i wzorcowych podstawy przodomózgowia podczas rozwoju twarzoczaszki.

Tworzenie ptasich chimer przodomózgowia w celu oceny rozwoju twarzy

Tutaj szczegółowo opisujemy metodę, która opiera się na mikrotomografii komputerowej, do segmentacji i pomiaru modeli 3D kości czaszkowo-szczękowo-twarzowych u myszy, dla lepszej oceny rozwoju kości czaszkowo-szczękowo-twarzowej u myszy niż jest to możliwe przy użyciu obecnych metod.

Analiza malformacji czaszkowo-szczękowo-twarzowych u myszy za pomocą trójwymiarowej mikrotomografii komputerowej

Poznaj metodę tworzenia chimer kaczko-przepiórczych do badania roli komórek grzebienia nerwowego w rozwoju twarzoczaszki. Technika ta pozwala analizować gatunkowo-specyficzne wzorce morfogenezy czaszki.

Ocena specyficznego dla gatunku wkładu w rozwój twarzoczaszki za pomocą chimer kaczki przepiórczej

Przeglądaj więcej filmów