Ocena specyficznego dla gatunku wkładu w rozwój twarzoczaszki za pomocą chimer kaczki przepiórczej

Ogólnym celem tej procedury jest wykorzystanie chimer przewodów przepiórczych jako środka do zbadania mechanizmów, za pomocą których komórki skorupy nerwowej generują specyficzne dla gatunku wzorce podczas rozwoju czaszki twarzy. Osiąga się to poprzez najpierw wypreparowanie i usunięcie paska fałdu nerwowego ze środkowego i przedniego tylnego obszaru mózgu zarodka przepiórki w stadium 9,5. Drugi etap polega na przeniesieniu fałdu nerwowego dawcy przepiórki do zarodka gospodarza kaczki.

Trzeci krok polega na wypreparowaniu i usunięciu równoważnego regionu zarodka gospodarza kaczki w stadium 9.5. Ostatnim krokiem jest umieszczenie fałdu nerwowego cewki w kaczce, środkowej i przedniej części tylnego mózgu. Ostatecznie powstałe chimeryczne zarodki mogą wskazać zmiany w ekspresji genów za pośrednictwem grzebienia nerwowego poprzez hybrydyzację C dwa, a także mogą ujawnić zmiany morfologiczne poprzez analizy histologiczne.

Po raz pierwszy wpadłem na pomysł tej metody, gdy obserwowałem pelikany brunatne przelatujące nad Ocean Beach w San Francisco. Zdałem sobie sprawę, że komórki grzebienia nerwowego muszą być źródłem specyficznego dla gatunku wzorca, ponieważ dają początek kościom i chrząstkom ich szkieletu długiego dzioba. Chociaż nie udało mi się wytropić jaj brązowych pelikanów, udało mi się znaleźć białą kaczkę po pekińsku.

Biorąc pod uwagę, że San Francisco ma największe Chinatown poza Azją, wykorzystując różnice w tempie dojrzewania i morfologii między przepiórkami a kaczkami. Ta metoda może pomóc nam odpowiedzieć na kluczowe pytania w biologii rozwoju, takie jak zrozumienie pochodzenia wzorca specyficznego dla gatunku, Operację wykona dr Jennifer Fish, która jest doktorem habilitowanym W moim laboratorium asystować będzie Kate Ovitz, która jest doktorantką Za pomocą bułek i palnika podgrzej wąski koniec pipety z pastą, aż szkło wzdłuż stożka zacznie się topić. Zdejmij ją z ognia i pociągnij za końcówkę, aż pipeta się uszczelni.

Upewnij się, że część zwężającej się części ma średnicę zewnętrzną od 0,7 do jednego milimetra. Następnie oderwij uszczelniony koniec około czterech centymetrów od stożka. Następnie przymocuj około dwóch stóp gumowej rurki do otwartego końca pipety na drugim końcu.

Powietrze nie powinno przepływać przez złącze lub drugi koniec pipety, zapewniając jednocześnie delikatny nacisk poprzez na rurkę. Użyj ołówka propanowego, palnika płomieniowego, aby podgrzać owalny obszar po jednej stronie pipety, tuż poniżej początku stożka. Gdy tylko szkło zacznie wyginać się na zewnątrz, zdejmij pipetę z płomienia i delikatnie przedmuchaj gumową rurkę.

Spowoduje to, że podgrzana część szklanki utworzy bąbelek w kształcie kiełbasy. Zbyt duży nacisk spowoduje pęknięcie szklanej bańki i należy tego unikać. Powstałe okienko w pipecie powinno mieć około jednego centymetra szerokości i półtora do dwóch centymetrów długości.

Teraz skieruj zwężający się koniec do góry i zeskrob bańkę do szklanego pojemnika na odpady, delikatnie przedmuchując rurkę, aby zapobiec przedostawaniu się odłamków szkła do pipety. Następnie za pomocą płomienia propanu ostrożnie wypal pozostałe krawędzie bańki i wypoleruj ogniem boki otwartego okna. Następnie przytrzymaj ołówek z diamentową końcówką w pozycji pionowej, użyj ołówka z diamentową końcówką, aby naciąć zwężający się koniec pipety o jeden centymetr od początku stożka.

Za pomocą kleszczy delikatnie przełam pipetę na naciętej linii. Aby usunąć końcówkę, sprawdź pod mikroskopem preparacyjnym, aby upewnić się, że pęknięcie jest czyste i nie jest postrzępione. Trzymaj pipetę tak, jak trzyma się ołówek palcem wskazującym nad otwartym okienkiem w odległości około 9,5 milimetra od końcówki.

Zmiękcz szklankę pipety, trzymając ją przy krawędzi płomienia palnika alkoholowego. Dociśnij końcówkę kleszczami, aby zgiąć wąską końcówkę pipety pod kątem 60 stopni pod lunetą sekcyjną. Szybko i ostrożnie, ogień wypolerował końcówkę palnikiem alkoholowym.

Gotowy otwór powinien być zaokrąglony i drożny. Należy pamiętać, że końcówka stanie się zwężona i bezużyteczna, jeśli będzie trzymana w płomieniu zbyt długo. Teraz nasmaruj gumową rurkę o długości 2,5 centymetra 70% etanolem.

Nasuń go na trzon pipety od dołu do góry, aby zakryć otwarte okienko. Następnie umieść dwumililitrową bańkę lateksową na otwartym końcu pipety. Aby utrzymać wewnętrzne ciśnienie powietrza, najpierw przygotuj jajo żywiciela.

Przeciąć błonę Vitale za pomocą zaostrzonej płomieniem igły wolframowej i naciągnąć błonę na zarodek. Następnie ponownie zamknij komórkę jajową taśmą, tak jak to ma miejsce w przypadku komórki jajowej dawczyni. Usuń taśmę z okienka na komórce jajowej dawczyni, aby przeciąć fałd nerwowy z zarodka dawczyni.

Wykonaj szczeliny po obu stronach cewy nerwowej za pomocą zaostrzonej płomieniowo igły wolframowej. Następnie przetnij cewę nerwową na pożądanym przednim i tylnym poziomie przeszczepu i oddziel przeszczep od reszty cewy nerwowej. Zwróć uwagę na wszelkie szczególne szczegóły anatomiczne, takie jak przedni i tylny kształt przeszczepu, które sprawią, że tkanka dawcy będzie prawidłowo zorientowana.

Po umieszczeniu w hoście upewnij się, że igła wolframowa jest bardzo ostra. Używaj szybkich i celowych pociągnięć, aby całkowicie usunąć tkankę i w jednym kawałku, Usuń fałd nerwowy z zarodka dawcy za pomocą pipety szamana. Pobieraj jak najmniej płynu, w przeciwnym razie tkanka może odpłynąć podczas przenoszenia.

Teraz usuń taśmę z okienka na jaju gospodarza i użyj pipety szamana, aby umieścić fałd nerwowy dawcy obok zarodka gospodarza w sąsiedztwie obszaru cewy nerwowej, która otrzyma przeszczep. Teraz oddziel fałd nerwowy od cewy nerwowej zarodka gospodarza, tak jak to miało miejsce w przypadku dawcy. Należy pamiętać o usunięciu przeszczepu o takiej samej wielkości jak tkanka dawcy.

Delikatnie odepchnij tę tkankę gospodarza daleko od zarodka. Następnie igłą wolframową lub zaokrągloną końcówką mikropipety delikatnie przesuń fałd nerwowy dawcy do cewy nerwowej gospodarza, utrzymując prawidłową orientację tylną i grzbietową brzuszną. Upewnij się, że przeszczep jest schowany po bokach, ale pamiętaj, aby nie szturchnąć ani nie uszkodzić leżących pod spodem tkanek.

Sterylną sól fizjologiczną należy ostrożnie i delikatnie nakładać na zarodek gospodarza. Jeśli pojawią się jakiekolwiek oznaki wysuszenia, teraz ostrożnie ponownie zamknij i oznacz jajo, a następnie delikatnie umieść je w inkubatorze o wysokiej wilgotności, gdzie chimeryczny zarodek może rozwinąć się do pożądanego etapu. Do analizy.

Do analizy zbierz chimeryczne zarodki w świeżo przygotowanym zimnym utrwalaczu Sary. Następnie natychmiast umieść je na bujaku w temperaturze czterech stopni Celsjusza, aby utrwalić je na noc. Pozwoli to na bardziej czułe wykrywanie jaj przepiórczych za pomocą przeciwciała anty przepiórczego.

Kolejnym ważnym krokiem w analizie ekspresji genów za pomocą ilościowego PCR w czasie rzeczywistym jest zamrożenie zarodków i ciekłego azotu przed RNA. Cewki ekstrakcyjne i kaczki wykazują znaczne różnice w wielkości i kształcie, a co za tym idzie ich zarodki idealnie nadają się do budowy systemu chimerycznego. Badanie rozwoju czaszkoczaszki C.

W szczególności system jest przydatny do badania roli komórek grzebienia nerwowego. Podczas modelowania szkieletu twarzy w chimerycznym qua embrionie dawcy komórek grzebienia nerwowego przepiórki migrują do łuku żuchwowego kaczki gospodarza. W kształcie kaczki komórki dawcy przepiórki w kolorze zielonym są oglądane z przeciwciałem anty przepiórczym z widoku brzusznego.

W zarodku chimerycznym w stadium 12 grzebień nerwowy dawcy generuje szkielet żuchwy, który jest podobny do przepiórki pod względem wielkości i kształtu. Po opanowaniu każdy przeszczep można wykonać w około pięć minut. Jeśli będzie to robione prawidłowo, naraża zarodek na ryzyko wysuszenia, a wskaźnik przeżycia zmniejszy się.

Podczas wykonywania tej procedury ważne jest, aby zwracać uwagę na swoją postawę, rozluźnić ramiona i utrzymać dobrą pozycję dłoni. Opracuj również rutynę i umieszczaj narzędzia chirurgiczne i odczynniki w tym samym miejscu za każdym razem, aby móc trzymać oczy w mikroskopie i poruszać rękami w zautomatyzowany sposób.