Charakterystyka wielowarstwowych łusek ryb (szpatułka Atractosteus) za pomocą nanoindentacji, rentgenowskiej tomografii komputerowej, FTIR i SEM
10 lipca 2014
Ten artykuł przedstawia metody używane do badania przestrzennie skorelowanych właściwości chemicznych, strukturalnych i mechanicznych wielowarstwowej skali szpatułki Atractosteus (A. szpatułka) za pomocą nanowgłębienia, spektroskopii w podczerwieni z transformacją Fouriera (FTIR), skaningowej mikroskopii elektronowej (SEM) i rentgenowskiej tomografii komputerowej (X-ray CT). Wyniki eksperymentów wykorzystano do zbadania zasad projektowania ochronnych materiałów biologicznych.
Ogólnym celem tej procedury jest określenie struktury, chemii i właściwości mechanicznych wielowarstwowych zmineralizowanych łusek ryb poprzez wykonanie rentgenowskiej tomografii komputerowej, nano wgłębienia dla transformacyjnej spektroskopii w podczerwieni i skaningowej mikroskopii elektronowej w połączeniu ze spektroskopią rentgenowską z dyspersją energii. Osiąga się to poprzez najpierw przygotowanie poszczególnych łusek do analizy poprzez usunięcie tkanki miękkiej z łusek, zamontowanie i podzielenie łusek na sekcje, a następnie wykonanie stopniowego polerowania. Drugim krokiem jest wykonanie przestrzennie skorelowanego nano wgłębienia wzdłuż przekroju poprzecznego skali za pomocą diamentowej końcówki percovich w celu określenia lokalnych właściwości nanomechanicznych.
Następnie wewnętrzna i zewnętrzna warstwa rybiej łuski jest badana za pomocą mikroskopu FTIR w celu zidentyfikowania głównych grup funkcjonalnych w odpowiednich warstwach. Ostatnim krokiem jest użycie detektora EDX w skaningowym mikroskopie elektronowym w celu skorelowania lokalnego składu chemicznego z nanowgłębieniami wykonanymi w rybich łuskach oraz uchwycenia obrazów wgłębień w różnych warstwach i powierzchniach pęknięć. Ostatecznie, łącząc te różne techniki eksperymentalne, naturalne zasady projektowania zmineralizowanych rybich łusek są wyjaśniane poprzez zrozumienie relacji właściwości struktury.
Główną zaletą tej techniki w porównaniu z innymi istniejącymi metodami testowymi, takimi jak masowe statystyczne nanowgłębienia, jest to, że naprawdę zapewnia bezpośrednią korelację między składem chemicznym, strukturą a lokalnymi właściwościami mechanicznymi. Jednak w interesujących nas obszarach zastosowaliśmy tę metodę do badania rozkładu przestrzennego oraz składu chemicznego, struktury i właściwości mechanicznych w biomateriałach strukturalnych. Ma również wiele zastosowań, w tym materiały na bazie cementu, kompozyty wielofazowe i naprawdę każdy rodzaj niejednorodnego materiału, który wykazuje tę niejednorodność w skali mikrometrów i nanometrów.
Aby zbadać poprzeczny przekrój krótkiej osi rybiej łuski, przytrzymaj rybią łuskę w formie na próbkę o średnicy 32 milimetrów, używając dostępnego w handlu plastikowego uchwytu na próbkę, aby utrzymać prawidłową orientację próbki podczas montażu w żywicy epoksydowej. Po umieszczeniu próbki w formie należy ją nalać nieutwardzoną żywicą epoksydową. Po pozostawieniu żywicy epoksydowej do utwardzenia zgodnie ze wskazówkami producenta, należy przeciąć zamontowaną próbkę za pomocą precyzyjnej piły do cięcia z tarczą diamentową na linii środkowej próbki.
Po załadowaniu próbki do nano i wgnieceniu wprowadź użyj elementów sterujących oprogramowania, aby przesunąć próbkę do miejsca pierwszego wcięcia, wykonaj cztery równoległe rzędy wcięć oddalonych od siebie o 15 mikrometrów, aby uzyskać statystycznie istotny zestaw danych rozpoczynający się w tej lokalizacji. Następnie ustaw nano indenture na maksymalne obciążenie pięciu miliniutonów, szybkość ładowania i rozładowywania 0,1 miliniutonów na sekundę, całkowity czas 30 sekund i minimalny odstęp między wcięciami wynoszący pięć mikrometrów dla każdego rzędu. Po zakończeniu partii połowa nano indenture tworzy wgłębienia referencyjne o maksymalnym obciążeniu 100 miliniutonów na pierwszym i ostatnim wcięciu, które powinny znajdować się w żywicy epoksydowej odpowiednio przed warstwą anoe i po warstwie kości.
Po wgłębieniu nano umieść próbkę z powrotem w roztworze PBS, aby uniknąć dalszego odwodnienia. Zamontuj próbkę na sztywno tak, aby najdłuższy wymiar był równoległy do detektora. Po ustawieniu skanera przymocuj zamontowaną próbkę do stolika skanera za pomocą materiałów przezroczystych dla promieni rentgenowskich, takich jak styropian i paraform.
Ustawić próbkę tak, aby znajdowała się w środku obrotu. W trakcie skanowania należy wybrać najwyższą rozdzielczość, która pozwala na to, aby cała skala znajdowała się w polu widzenia, które w tym przypadku wynosi 7,5 mikrometra. Po zebraniu danych zrekonstruuj obrazy projekcyjne promieniowania rentgenowskiego, aby utworzyć zestaw danych zawierający obrazy przekrojowe.
Następnie użyj oprogramowania, aby uzyskać ostateczny obraz 3D w skali szarości. Dostosuj zakres skali szarości do odpowiedniego poziomu, aby usunąć artefakty ze styropianu i paraformy W przypadku obrazowania SEM lub skaningowej mikroskopii elektronowej nano wgłębień na polerowanej próbce, przymocuj próbkę do króćca SEM za pomocą dwustronnej taśmy węglowej z wciętą powierzchnią skierowaną do góry. Następnie umieść próbkę w komorze SEM i przepompuj komorę w tryb niskiej próżni.
Dostosuj odległość roboczą w zakresie od 3.0 do 5.0 milimetrów. Aktywuj wysokie napięcie i przejdź do obszarów zainteresowania na próbce, którymi w tym przypadku są struktury obecne w warstwach anoe i kości. Następnie uzyskaj obrazy przy wysokim napięciu od pięciu kilowoltów do 15 kilowoltów i prądzie dolnej wiązki 3,9 nanoampera.
Aby poprawić rozdzielczość, należy rejestrować obrazy z co najmniej trzech obszarów zainteresowania w powiększeniach od 250 x do 10 000 x za pomocą detektora BSE BSE z wstecznie rozproszonymi elektronami o niskiej próżni, aby pomóc w identyfikacji zmian zawartości i gęstości biominerałów. Następnie przejdź do obszaru zainteresowania na wypolerowanej próbce, który zawiera siatkę nano wcięć wskazywaną przez znaki odniesienia na końcu każdej linii wcięć. Upewnij się, że wysokie napięcie wynosi co najmniej 15 kilowoltów.
Prąd wiązki wynosi co najmniej 3,9 nano ampera, a odległość robocza jest większa niż 5,0 milimetra. Następnie przechwyć obraz elektronów rozproszonych wstecznie obszaru do analizy za pomocą EDX. Korzystanie z oprogramowania analitycznego EDX.
Uchwyć ten sam obraz, aby pomóc w zlokalizowaniu obszarów do przeprowadzenia analizy chemicznej wzdłuż linii wcięć. Następnie, korzystając z techniki analizy liniowej, ustaw linię, aby przeprowadzić analizę chemiczną wzdłuż linii zainteresowania wcięć, zaczynając od pierwszego wcięcia i kończąc na ostatnim wcięciu. Określ liczbę punktów analizy, które mają zostać umieszczone wzdłuż linii, używając tej samej liczby, co liczba obecnych wcięć, aby zapewnić bezpośrednią korelację przestrzenną między składem chemicznym a właściwościami mechanicznymi.
Gdy linia jest ustawiona, a punkty są określone poprawnie. Po zakończeniu analizy liniowej należy rozpocząć analizę liniową za pomocą oprogramowania EDX. Zidentyfikuj elementy będące przedmiotem zainteresowania, które mają zostać określone ilościowo, na podstawie widm punktowych uzyskanych wzdłuż określonej linii na wypolerowanej powierzchni próbki.
Po zidentyfikowaniu elementów będących przedmiotem zainteresowania należy przeprowadzić kalibrację tła, aby uwzględnić promieniowanie płuc ze słomy brem i inne skutki. Wybierz opcję analizy dekonwolucyjnej oprogramowania, aby uzyskać analizę ilościową dla każdego punktu wzdłuż określonej linii w celu ilościowego określenia składu chemicznego w każdym punkcie. Na koniec zapisz wyniki ilościowej analizy chemicznej wraz z obrazem określonej linii, która została przeanalizowana, aby pomóc w korelacji przestrzennej z właściwościami mechanicznymi mierzonymi za pomocą nano wgłębienia w warstwie anoe, nano indenture obliczyło średni moduł 69,0 giga paskali i twardość 3,3 giga paskala.
Nano indenture określiło średni moduł 14,3 giga paskali i twardość 0,5 giga paskali dla warstwy kostnej. Warstwa anoe i kości zawiera wymierne różnice w składzie chemicznym. Skok węgla w warstwie kostnej można przypisać niskiej mineralizacji, co powoduje wzrost zawartości węgla i spadek jasności obrazu BSE, widma FTIR kości i warstwy ENE wykazują sygnatury hydroksyapatytu w zewnętrznej warstwie gwe i sygnatury kolagenu w wewnętrznej warstwie kości.
Rentgenowska tomografia komputerowa pokazuje, że warstwa gwe nie pokrywa warstwy kostnej, w której łuski zachodzą na siebie. Jaśniejsze szare warstwy kości są gęstsze, twardsze i sztywniejsze, podczas gdy ciemniejsze szare warstwy kości są mniej gęste i mniej sztywne. Obserwuje się wyraźne wżery w pobliżu środka warstwy ging, które świadczą o jej niejednorodności.
Obraz SEM w mniejszym powiększeniu wytrawionej powierzchni pęknięcia ujawnił nanostruktury zorganizowane w warstwowy wzór dla warstwy ging, który koreluje z SEM o wyższym powiększeniu FTIR, obrazy wytrawionej powierzchni złamania pokazują zorientowane nanopręty w warstwie ging, podczas gdy nanostruktura podobna do włókna jest obserwowana w warstwie kostnej po jej opracowaniu. Technika ta utorowała drogę do dodatkowych badań nad biomateriałami i materiałami kompozytowymi w celu zbadania przestrzennego rozkładu składu chemicznego, struktury i właściwości mechanicznych, a także przyjrzenia się granicom faz w wielofazowych materiałach kompozytowych. W porządku, po obejrzeniu tego filmu powinieneś dobrze rozumieć, jak przygotowywać próbki i przeprowadzać analizy, aby przestrzennie skorelować skład chemiczny ze strukturą i właściwościami mechanicznymi w biomateriałach strukturalnych.
Techniki te mają również zastosowanie i można je dostosować do badania innych rodzajów niejednorodnych materiałów wielofazowych.
Przegląd
To badanie bada strukturę, chemię i właściwości mechaniczne wielowarstwowych łusek ryb za pomocą zaawansowanych technik obrazowania i testowania mechanicznego. Zastosowanie metod takich jak nanoindentacja, spektroskopia FTIR i tomografia komputerowa X-ray pozwala wyjaśnić zasady projektowania tych biologicznych materiałów.
Kluczowe elementy badania
Dziedzina nauki
- Neuronauki
- Biomateriały
- Właściwości mechaniczne
Tło
- Łuski ryb wykazują złożone wielowarstwowe struktury.
- Rozumienie ich właściwości może pomóc w projekcie biomimetycznych materiałów.
- Istniejące metody często brakuje korelacji przestrzennej między strukturą a właściwościami.
- To badanie ma na celu wypełnienie tej luki za pomocą zaawansowanych technik.
Cel badania
- Analiza przestrzennie skorelowanych właściwości łusek ryb.
- Określenie związku między składem chemicznym a właściwościami mechanicznymi.
- Poprawa rozumienia strukturalnych biomateriałów.
Zastosowane metody
- Przygotowanie łusek ryb poprzez usunięcie miękkich tkanek i przecięcie.
- Nanoindentacja w celu oceny lokalnych właściwości mechanicznych.
- Mikroskopia FTIR do analizy składu chemicznego.
- Skaningowa mikroskopia elektronowa (SEM) do obrazowania i analizy EDX.
Główne wyniki
- Sukces w korelowniu właściwości mechanicznych ze składem chemicznym.
- Identyfikacja grup funkcyjnych w różnych warstwach łusek.
- Wgląd w zasady projektowania skamieniałych biologicznych materiałów.
- Potencjalne zastosowania w różnych dziedzinach, w tym kompozyty i biomateriały.
Wnioski
- Badanie dostarcza kompleksowej metody analizy biomateriałów.
- Wyniki mogą wpływać na przyszłe badania w dziedzinie nauki o materiałach.
- Metodologia może być zastosowana do innych materiałów heterogenicznych.
Często zadawane pytania
Executive Industry Relevance
Understanding structure-property relationships in heterogeneous biomaterials enables predictive confidence in biomimetic design and material de-risking. This approach supports early discovery by linking nanoscale mechanical behavior to chemical composition, informing target validation for protective material systems. The methodology provides translational value for R&D pipelines focused on multi-phase composites and bio-inspired material development.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Enables interrogation of hierarchical structure-property relationships in mineralized biomaterials.
- Operational Value: Supports functional target validation through spatially correlated nanoindentation and chemical mapping.
- Predictive Value: Clarifies structure-function linkages to de-risk mechanistic hypotheses in biomaterial design.
Screening & Assay Development
- Scientific Value: Prepares validated biological systems for downstream correlative analysis of mechanics and chemistry.
- Operational Value: Standardizes specimen preparation for reproducible nanoindentation and imaging workflows.
- Assay Readiness: Facilitates quantitative output generation for screening heterogeneous material responses.
Translational & Preclinical Research
- Translational Continuity: Bridges discovery-scale characterization to preclinical evaluation of biomimetic prototypes.
- Predictive De-risking: Identifies failure initiation points via nanoscale property mapping in layered systems.
- Biomarker Alignment: Supports identification of structural signatures correlating with functional performance.
Pipeline & Workflow Integration
This method integrates into the discovery continuum from early target validation through lead identification by providing mechanistic insights into material performance.
- Discovery Biology: Supports hypothesis testing of structure-property relationships in protective biomaterials.
- Screening: Enables assay readiness through standardized, spatially resolved mechanical and chemical profiling.
- Analytics: Delivers quantitative nanoindentation modulus and hardness data correlated with FTIR and EDX chemical maps.
- Translational Research: Connects nanoscale characterization to preclinical assessment of biomimetic material candidates.
- Enterprise Reuse: Establishes a reusable platform for analyzing heterogeneous multi-scale materials across projects.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Predictive confidence through direct correlation of nanomechanical properties with chemical composition and structure.
- Operational Value: Standardization, reproducibility, and scalability of multi-modal characterization workflows.
- Strategic Value: Improved go/no-go decisions in biomaterial development by reducing late-stage performance uncertainty.
- Portfolio Impact: Risk-adjusted prioritization of material candidates based on validated structure-function relationships.
Implementation Considerations
- Expertise in biomaterials characterization, nanoindentation, and vibrational spectroscopy.
- Instrumentation including nanoindenter, FTIR microscope, SEM-EDX, and X-ray CT systems.
- Cross-team standardization of specimen preparation, polishing, and coordinate registration protocols.
- Adaptation considerations for varying mineralized or heterogeneous material systems.
- Practical limitations include sample accessibility for transverse sectioning and potential artifacts from epoxy infiltration.
