Charakterystyka wielowarstwowych łusek ryb (szpatułka Atractosteus) za pomocą nanoindentacji, rentgenowskiej tomografii komputerowej, FTIR i SEM

Ogólnym celem niniejszej procedury jest określenie struktury, składu chemicznego oraz właściwości mechanicznych wielowarstwowych zmineralizowanych łusek ryb poprzez wykonanie komputerowej tomografii rentgenowskiej, nanoindentacji, transformacyjnej spektroskopii w podczerwieni oraz skaningowej mikroskopii elektronowej sprzężonej z spektroskopią rentgenowską z dyspersją energii. Cel ten realizowany jest poprzez przygotowanie poszczególnych łusek do analizy, polegające na usunięciu tkanek miękkich, zamocowaniu i przecinaniu łusek, a następnie wykonaniu stopniowego polerowania. Drugim krokiem jest przeprowadzenie przestrzennie skorelowanej nanoindentacji wzdłuż przekroju poprzecznego łuski za pomocą diamentowego wgłębnika Berkovicha w celu określenia lokalnych nanomechanicznych właściwości.

Następnie wewnętrzne i zewnętrzne warstwy łuski ryb są badane za pomocą mikroskopu FTIR w celu zidentyfikowania głównych grup funkcyjnych w poszczególnych warstwach. Ostatnim etapem jest wykorzystanie detektora EDX w skaningowym mikroskopie elektronowym, aby powiązać lokalny skład chemiczny z nano wgłębieniami wykonanymi w łuskach ryb oraz zarejestrować obrazy tych wgłębień w różnych warstwach i na powierzchniach przełomów. Ostatecznie, dzięki połączeniu tych różnych technik eksperymentalnych, naturalne zasady budowy zmineralizowanych łusek ryb zostają wyjaśnione poprzez zrozumienie zależności między strukturą a właściwościami.

Główną zaletą tej techniki w porównaniu z innymi istniejącymi metodami badawczymi, takimi jak statystyczna nanoindentacja objętościowa, jest to, że zapewnia ona bezpośrednią korelację między strukturą składu chemicznego a lokalnymi właściwościami mechanicznymi. W obszarach zainteresowania zastosowaliśmy tę metodę przede wszystkim do badania rozkładu przestrzennego, struktury składu chemicznego oraz właściwości mechanicznych w biomateriałach strukturalnych. Znajduje ona również wiele zastosowań, w tym w badaniach materiałów cementowych, kompozytów wielofazowych oraz właściwie każdego rodzaju materiału heterogenicznego, który wykazuje taką heterogeniczność w skali mikrometrycznej i nanometrycznej.

Aby zbadać przekrój poprzeczny krótkiej osi łuski ryby, należy umieścić łuskę w formie do próbek o średnicy 32 milimetrów, używając dostępnego w handlu plastikowego uchwytu do próbek, aby zachować prawidłową orientację próbki podczas zatapiania w żywicy epoksydowej. Po umieszczeniu próbki w formie, należy wlać na nią nieutwardzoną żywicę epoksydową. Po utwardzeniu żywicy zgodnie z instrukcją producenta, należy przeciąć zatopioną próbkę wzdłuż jej linii środkowej, używając precyzyjnej przecinarki z tarczą diamentową.

Po umieszczeniu próbki w nanoindentatorze, należy użyć sterowania programowego, aby przenieść preparat w miejsce pierwszego wcięcia i wykonać cztery równoległe rzędy wcięć w odstępach 15 µm, aby uzyskać statystycznie istotny zestaw danych począwszy od tej lokalizacji. Następnie należy ustawić nanoindentator na maksymalne obciążenie 5 mN, prędkość obciążania i odciążania 0,1 mN/s, całkowity czas 30 s oraz minimalny odstęp między wcięciami 5 µm dla każdego rzędu. Po zakończeniu serii, za pomocą nanoindentatora, należy stworzyć wcięcia referencyjne z maksymalnym obciążeniem 100 mN w miejscu pierwszego i ostatniego wcięcia, które powinny znajdować się odpowiednio w żywicy epoksydowej przed warstwą kostną i po warstwie kostnej.

Po nanoindentacji umieść próbkę z powrotem w roztworze PBS, aby zapobiec dalszemu odwodnieniu. Próbkę zamocuj sztywno tak, aby jej najdłuższy wymiar był równoległy do detektora. Po skonfigurowaniu skanera przymocuj zamontowaną próbkę do stolika skanera za pomocą materiałów przezroczystych dla promieni rentgenowskich, takich jak styropian i parafina.

Ustaw próbkę tak, aby znajdowała się w centrum obrotu. Przez cały czas trwania skanowania wybieraj najwyższą rozdzielczość, która pozwala na ujęcie całej skali w polu widzenia, co w tym przypadku wynosi 7.5 micrometers. Po pozyskaniu danych zrekonstruuj obrazy projekcyjne rentgenowskie, aby stworzyć zestaw danych zawierający obrazy przekrojów poprzecznych.

Następnie należy użyć oprogramowania w celu uzyskania końcowego obrazu 3D w skali szarości. Zakres skali szarości należy dostosować do odpowiedniego poziomu, aby usunąć artefakty pochodzące ze styropianu i paraformy. W przypadku obrazowania nanoodtłoków na wypolerowanej próbce za pomocą SEM lub skaningowej mikroskopii elektronowej, próbkę należy przymocować do stubu SEM za pomocą dwustronnej taśmy węglowej, tak aby powierzchnia z odtłokami była skierowana do góry. Następnie preparat należy umieścić w komorze SEM i wypompować powietrze z komory do trybu niskiej próżni.

Ustaw odległość roboczą w zakresie od 3,0 do 5,0 milimetrów. Włącz wysokie napięcie i przejdź do obszarów zainteresowania na próbce, którymi w tym przypadku są struktury obecne w warstwach anoe i kości. Następnie wykonaj obrazy przy wysokim napięciu od 5 kilowoltów do 15 kilowoltów i niższym natężeniu wiązki wynoszącym 3,9 nano ampera.

Aby poprawić rozdzielczość, należy zarejestrować obrazy z co najmniej trzech obszarów zainteresowania przy powiększeniach od 250 x do 10 000 x, korzystając z detektora elektronów wstecznie rozproszonych BSE w niskiej próżni, co pomoże w identyfikacji zmian w zawartości i gęstości biominerałów. Następnie należy przejść do obszaru zainteresowania na polerowanej próbce, który obejmuje siatkę nanoindentacji wskazaną przez znaczniki fiducyjne na końcu każdej linii wcięć. Należy upewnić się, że wysokie napięcie wynosi co najmniej 15 kV.

Prąd wiązki wynosi co najmniej 3,9 nA, a odległość robocza jest większa niż 5,0 mm. Następnie należy zarejestrować obraz elektronów wstecznie rozproszonych obszaru, który ma zostać poddany analizie EDX, korzystając z oprogramowania do analizy EDX.

Przechwyć ten sam obraz, aby ułatwić lokalizację obszarów do przeprowadzenia analizy chemicznej wzdłuż linii wgnieceń. Następnie, stosując technikę analizy liniowej, ustaw linię tak, aby przeprowadzić analizę chemiczną wzdłuż interesującej linii wgnieceń, zaczynając od pierwszego, a kończąc na ostatnim wgnieceniu. Określ liczbę punktów analizy rozmieszczonych wzdłuż linii, przyjmując taką samą wartość, jak liczba występujących wgnieceń, aby zapewnić bezpośrednią korelację przestrzenną między składem chemicznym a właściwościami mechanicznymi.

Po odpowiednim ustawieniu linii i poprawnym określeniu punktów, rozpocznij analizę linii za pomocą oprogramowania EDX, a następnie przeprowadź ją do końca. Zidentyfikuj interesujące elementy do ilościowego oznaczenia na podstawie widm punktowych uzyskanych wzdłuż określonej linii na wypolerowanej powierzchni próbki.

Po zidentyfikowaniu interesujących elementów należy przeprowadzić kalibrację tła, aby uwzględnić promieniowanie hamowania i inne efekty. Należy wybrać opcję analizy dekonwolucyjnej w oprogramowaniu, aby uzyskać analizę ilościową każdego punktu wzdłuż określonej linii w celu określenia składu chemicznego w każdym punkcie. Na koniec należy zapisać wyniki ilościowej analizy chemicznej wraz z obrazem analizowanej linii, co pomoże w korelacji przestrzennej z właściwościami mechanicznymi zmierzonymi za pomocą nanoindentacji w warstwie anoe; nanoindentacja wykazała średni moduł sprężystości wynoszący 69,0 giga pascals oraz twardość wynoszącą 3,3 giga Pascals.

Nanoindentacja wykazała średni moduł sprężystości wynoszący 14,3 GPa oraz twardość na poziomie 0,5 GPa dla warstwy kostnej. Warstwy anoe i kostna wykazują mierzalne różnice w składzie chemicznym. Wzrost zawartości węgla w warstwie kostnej można przypisać niskiej mineralizacji, co skutkuje wzrostem ilości węgla i zmniejszeniem jasności obrazu BSE. Widma FTIR warstw kostnej i ENE wykazują sygnatury hydroksyapatytu w zewnętrznej warstwie gwe oraz sygnatury kolagenu w wewnętrznej warstwie kostnej.

Tomografia komputerowa rentgenowska wykazuje, że warstwa gwe nie pokrywa warstwy kostnej w miejscach, w których łuski nachodzą na siebie. Jaśniejsze szare warstwy gwe są gęstsze, twardsze i sztywniejsze, podczas gdy ciemniejsze szare warstwy kostne są mniej gęste i mniej sztywne. W pobliżu centrum warstwy ging obserwuje się wyraźne wgłębienia, co świadczy o jej niejednorodności.

Obraz SEM powierzchni przełomu po trawieniu przy niskim powiększeniu ujawnił nanostruktury zorganizowane w warstwowy wzór w obrębie warstwy ging, co koreluje z wynikami FTIR. Obrazy SEM powierzchni przełomu po trawieniu przy większym powiększeniu wykazują zorientowane nanopręty w warstwie ging, podczas gdy w warstwie kostnej po jej rozwoju obserwuje się nanostrukturę przypominającą włókna. Technika ta utorowała drogę do dalszych badań nad biomateriałami i materiałami kompozytowymi w celu analizy przestrzennego rozkładu składu chemicznego, struktury i właściwości mechanicznych, a także badania granic międzyfazowych w wielofazowych materiałach kompozytowych. Po obejrzeniu tego filmu powinni Państwo posiadać solidną wiedzę na temat tego, jak przygotowywać próbki i przeprowadzać analizy w celu przestrzennej korelacji składu chemicznego ze strukturą i właściwościami mechanicznymi w strukturalnych biomateriałach.

Techniki te są również możliwe do zastosowania i dostosowania do badania innych rodzajów heterogenicznych materiałów wielofazowych.