Name: Jednoetapowe oczyszczanie białek znakowanych podwójnymi paciorkowcami i ich kompleksów na żywicy Strep-Tactin usieciowanej suberatrynem bis(sulfosukcynimidylu) (BS3) (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-04-20T14:00:00.000+00:00
Duration: 18 min 27 s
Description: Poznaj metodę oczyszczania białek znakowanych podwójnymi paciorkowcami i ich kompleksów na żywicy Strep-Tactin usieciowanej BS3. Technika zapewnia wysoką czystość i wydajność, umożliwiając analizę spektrometryczną.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Z wdzięcznością dziękujemy za wsparcie techniczne Sini Miettinen, Minna Pöllänen i Taru Rautavesi. Dziękujemy Helce Nurkkala za dostarczenie komórek HEK 293 wykazujących ekspresję GFP znakowanego podwójnie Strep oraz Pekce Evijärvi za dostarczenie sprzętu do nagrywania dźwięku. Praca ta została sfinansowana przez Akademię Fińską, granty o numerach 138329, 134684 i 258978.

1. Sieciowanie żywicy polimetakrylanowej Strep-Tactin z podergatem bis(sulfosuccinimidylu) (BS3)
<ol>
	<li>Zrównoważyć jedną szczelną mikroprobówkę zawierającą 2 mg środka sieciującego BS3 do temperatury pokojowej. UWAGA: BS3 jest substancją niebezpieczną. Nosić rękawice i okulary ochronne.</li>
	<li>Ponownie zawiesić żywicę polimetakrylanową Strep-Tactin (50% zawiesiny w 100 mM Tris-HCl, pH 8,0; 1 mM EDTA; 150 mM NaCl) przez krótkie, energiczne wstrząsanie i natychmiast przenieść 600 μl zawiesiny do kolumny wirowej za pomocą końcówki pipety z odciętym końcem.</li>
	<li>Wirować przy 1 500 x g przez 30 sekund w temperaturze pokojowej. Odrzucić przepływowy płyn i dodać 450 μl soli fizjologicznej buforowanej fosforanami (PBS) do kolumny.</li>
	<li>Powtórz poprzedni krok jeszcze 2 razy, aby całkowicie zastąpić bufor Tris PBS i pozostawić żywicę w 430 μl PBS dostosowanym do pH 8,0 po ostatnim odwirowaniu.</li>
	<li>Nakłuć folię mikroprobówki za pomocą BS3 za pomocą końcówki pipety zawierającej 100 μl ultraczystej wody. Rozpuść proszek BS3 w wodzie, delikatnie pipetując w górę i w dół, a następnie natychmiast dodaj 20 μl roztworu do kolumny wirowej. Końcowe stężenie BS3 w reakcji sieciowania wynosi ~1,2 mM.</li>
	<li>Obracaj kolumnę przez 30 minut w temperaturze pokojowej. Sprawdź, czy żywica jest prawidłowo wymieszana z roztworem BS3.</li>
	<li>Aby wygasić reakcję, dodaj 6 μl 3M Tris-HCl o pH 7,5 i obracaj kolumnę przez kolejne 15 minut w temperaturze pokojowej.</li>
	<li>Wirować przy 1 500 x g przez 30 sekund w temperaturze pokojowej. Odrzucić przepływowy roztwór i ponownie zawiesić usieciowaną żywicę w 450 μl soli fizjologicznej buforowanej Tris za pomocą Tween 20 (TBST). Powtórz etapy wirowania i mycia jeszcze dwa razy. Na ostatnim etapie należy ponownie zawiesić żywicę w 450 μl TBS.</li>
	<li>Przenieść zawiesinę żywicy do świeżej probówki za pomocą końcówki pipety z odciętym końcem. Ponownie zawiesić żywicę pozostałą w kolumnie z kolejnymi 450 μl TBS i przenieść do tej samej probówki. Powtórz ostatni krok jeszcze raz, aby zapewnić maksymalny transfer żywicy z kolumny do probówki.</li>
	<li>Pozostaw probówkę na 10 minut w temperaturze pokojowej i dostosuj objętość do 600 μl, usuwając nadmiar TBS. Żywica jest gotowa do natychmiastowego użycia (zalecane) lub może być przechowywana w temperaturze 4 °C, bez zamrażania.</li>
</ol>
2. Wiązanie białka przynęty znakowanego podwójnie paciorkowcami i powiązanych kompleksów z usieciowaną żywicą polimetakrylanową Strep-Tactin
<ol>
	<li>Odwirować 1 ml próbki białka przynęty w buforze wiążącym o sile 17 000 x g przez 10 minut w temperaturze 4 °C i przenieść supernatant do świeżej probówki.</li>
	<li>Aby zminimalizować wiązanie endogennych biotynylowanych białek z żywicą Strep-Tactin, należy dodać awidynę do końcowego stężenia 100 μg/ml i obracać przez 15 minut w temperaturze 4 °C.
	<ol>
		<li>Jeżeli żywica usieciowana z kroku 1.10 była przechowywana przez dłuższy czas w temperaturze 4 °C, zebrać żywicę przez odwirowanie w temperaturze 400 x g przez 1 minutę w temperaturze 4 °C, odrzucić supernatant i przemyć żywicę 1 ml TBST. Powtórzyć etapy wirowania i płukania jeszcze dwa razy, najpierw z TBST, a następnie z TBS. Odwirować probówkę o stężeniu 400 x g przez 1 minutę w temperaturze 4 °C i dostosować do pierwotnej objętości, usuwając nadmiar TBS.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Ponownie zawiesić usieciowaną żywicę Strep-Tactin przez wirowanie. Natychmiast dodać 50 μl zawiesiny żywicy do probówki zawierającej próbkę białka przynęty za pomocą przeciętej końcówki pipety i obracać przez kolejne 30 minut w temperaturze 4 °C.</li>
	<li>Czekając, ustaw termomikser na 55 °C i podgrzej 500 μl buforu elucyjnego do użycia w kroku 3.1.</li>
	<li>Wirować przy 400 x g przez 1 minutę w temperaturze 4 °C. Odrzucić supernatant i przemywać żywicę na rotatorze przez 5 minut w temperaturze 4 °C z 1 ml wstępnie schłodzonego buforu do przemywania #1. Powtórz etapy wirowania i mycia trzy razy. W ostatnim kroku ponownie zawieś żywicę w 250 μl buforu do płukania #2.</li>
	<li>Przenieś zawiesinę żywicy do nowej kolumny wirowej. Zawiesić żywicę pozostałą w probówce w kolejnych 250 μl buforu płuczącego #2 i przenieść do tej samej kolumny.</li>
	<li>Wirować przy 400 x g przez 3 minuty w temperaturze 4 °C, odrzucić przepływ i przenieść kolumnę do świeżej probówki o pojemności 2 ml z nosem delfina. Przejdź natychmiast do poniższego etapu elucji.</li>
</ol>
3. Elucja specyficznych kompleksów białkowych
<ol>
	<li>Dodać 150 μl wstępnie podgrzanego buforu elucyjnego z kroku 2.4 do kolumny wirowej.</li>
	<li>Inkubować w termomieszalniku przez 5 minut w temperaturze 55 °C, wstrząsając z prędkością 1 400 obr./min.</li>
	<li>Wirować przy 1 500 x g przez 1 minutę w temperaturze pokojowej.</li>
	<li>Odrzucić kolumnę i przechowywać oczyszczone białka docelowe w temperaturze ≤ -20 °C.</li>
</ol>
<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="598">
	<tbody>
		<tr height="20">
			<td colspan="2" height="20" style="wysokość:20px;szerokość:597px;">sól fizjologiczna buforowana fosforanami (PBS)</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="wysokość:20px;szerokość:299px;">Na2HPO4</td>
			<td style="szerokość:299px;">10 mM</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="wysokość:20px;szerokość:299px;">KH2PO4</td>
			<td style="szerokość:299px;">2mM</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="wysokość:20px;szerokość:299px;">NaCl</td>
			<td style="szerokość:299px;">137 mM</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="wysokość:20px;szerokość:299px;">KCl</td>
			<td style="szerokość:299px;">2,7 mM</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td colspan="2" height="20" style="wysokość:20px;szerokość:597px;">pH dostosowane do 7,4, chyba że zaznaczono inaczej (pH 8,0 w sekcji 1.4)</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td colspan="2" height="20" style="wysokość:20px;szerokość:597px;">Sól fizjologiczna buforowana Tris (TBS)</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="wysokość:20px;szerokość:299px;">Tris-HCl, pH 7.4</td>
			<td style="szerokość:299px;">50 mM</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="wysokość:20px;szerokość:299px;">NaCl</td>
			<td style="szerokość:299px;">150 mM</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td colspan="2" height="20" style="wysokość:20px;szerokość:597px;">Sól fizjologiczna buforowana Tris z Tween 20 (TBST)</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="wysokość:20px;szerokość:299px;">Tris-HCl, pH 7.4</td>
			<td style="szerokość:299px;">50 mM</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="wysokość:20px;szerokość:299px;">NaCl</td>
			<td style="szerokość:299px;">150 mM</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="wysokość:20px;szerokość:299px;">Animacja 20</td>
			<td style="szerokość:299px;">0.1% (v/v)</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td colspan="2" height="20" style="wysokość:20px;szerokość:597px;">Bufor wiązania</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="wysokość:20px;szerokość:299px;">Tris-HCl, pH 8.0</td>
			<td style="szerokość:299px;">25 mM</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="wysokość:20px;szerokość:299px;">NaCl</td>
			<td style="szerokość:299px;">550 mM</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="wysokość:20px;szerokość:299px;">NaF</td>
			<td style="szerokość:299px;">5 mM</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="wysokość:20px;szerokość:299px;">EDTA</td>
			<td style="szerokość:299px;">0,5 mM</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="wysokość:20px;szerokość:299px;">Glicerol</td>
			<td style="szerokość:299px;">10% (pionowo)</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="wysokość:20px;szerokość:299px;">PMSF</td>
			<td style="szerokość:299px;">0.1 mM</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td colspan="2" height="20" style="wysokość:20px;szerokość:597px;">Bufor mycia #1</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="wysokość:20px;szerokość:299px;">Tris-HCl, pH 8.0</td>
			<td style="szerokość:299px;">25 mM</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="wysokość:20px;szerokość:299px;">NaCl</td>
			<td style="szerokość:299px;">500 mM</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="wysokość:20px;szerokość:299px;">NaF</td>
			<td style="szerokość:299px;">5 mM</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="wysokość:20px;szerokość:299px;">EDTA</td>
			<td style="szerokość:299px;">0,4 mM</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="wysokość:20px;szerokość:299px;">Igepal CA-630</td>
			<td style="szerokość:299px;">0.2% (v/v)</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="wysokość:20px;szerokość:299px;">Glicerol</td>
			<td style="szerokość:299px;">5% (v/v)</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="wysokość:20px;szerokość:299px;">PMSF</td>
			<td style="szerokość:299px;">0.1 mM</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td colspan="2" height="20" style="wysokość:20px;szerokość:597px;">Bufor mycia #2</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="wysokość:20px;szerokość:299px;">Tris-HCl, pH 8.0</td>
			<td style="szerokość:299px;">25 mM</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="wysokość:20px;szerokość:299px;">NaCl</td>
			<td style="szerokość:299px;">150 mM</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td colspan="2" height="20" style="wysokość:20px;szerokość:597px;">Bufor elucji</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="wysokość:20px;szerokość:299px;">Tris-HCl, pH 8.0</td>
			<td style="szerokość:299px;">25 mM</td>
		</tr>
		<tr wysokość="22">
			<td height="22" style="wysokość:22px;szerokość:299px;">SDS</td>
			<td style="szerokość:299px;">1% (szer./szer.)</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>
Tabela 1. wykorzystane w niniejszym badaniu.

<ol><li>Voss, S., Skerra, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mutagenesis+of+a+flexible+loop+in+streptavidin+leads+to+higher+affinity+for+the+Strep-tag+II+peptide+and+improved+performance+in+recombinant+protein+purification%5BTitle%5D)+AND+%22Protein+Eng%22%5BJournal%5D)">Mutagenesis of a flexible loop in streptavidin leads to higher affinity for the Strep-tag II peptide and improved performance in recombinant protein purification.</a> Protein Eng. 10 (8), 975-982 (1997).</li>
<li>Schmidt, T. G., Skerra, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Strep-tag+system+for+one-step+purification+and+high-affinity+detection+or+capturing+of+proteins%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Protoc%22%5BJournal%5D)">The Strep-tag system for one-step purification and high-affinity detection or capturing of proteins.</a> Nat. Protoc. 2 (6), 1528-1535 (2007).</li>
<li>Junttila, M. R., Saarinen, S., Schmidt, T., Kast, J., Westermarck, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single-step+Strep-tag+purification+for+the+isolation+and+identification+of+protein+complexes+from+mammalian+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Proteomics%22%5BJournal%5D)">Single-step Strep-tag purification for the isolation and identification of protein complexes from mammalian cells.</a> Proteomics. 5 (5), 1199-1203 (2005).</li>
<li>Hafren, A., Hofius, D., Ronnholm, G., Sonnewald, U., Makinen, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((HSP70+and+its+cochaperone+CPIP+promote+potyvirus+infection+in+Nicotiana+benthamiana+by+regulating+viral+coat+protein+functions%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+Cell%22%5BJournal%5D)">HSP70 and its cochaperone CPIP promote potyvirus infection in Nicotiana benthamiana by regulating viral coat protein functions.</a> Plant Cell. 22 (2), 523-535 (2010).</li>
<li>Jaskiewicz, M., Peterhansel, C., Conrath, U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Detection+of+histone+modifications+in+plant+leaves%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Vis.+Exp%22%5BJournal%5D)">Detection of histone modifications in plant leaves.</a> J. Vis. Exp. (55), (2011).</li>
<li>Witte, C. P., Noel, L. D., Gielbert, J., Parker, J. E., Romeis, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rapid+one-step+protein+purification+from+plant+material+using+the+eight-amino+acid+StrepII+epitope%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+Mol.+Biol%22%5BJournal%5D)">Rapid one-step protein purification from plant material using the eight-amino acid StrepII epitope.</a> Plant Mol. Biol. 55 (1), 135-147 (2004).</li>
<li>Werner, A. K., Sparkes, I. A., Romeis, T., Witte, C. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification%2C+biochemical+characterization%2C+and+subcellular+localization+of+allantoate+amidohydrolases+from+Arabidopsis+and+soybean%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+Physiol%22%5BJournal%5D)">Identification, biochemical characterization, and subcellular localization of allantoate amidohydrolases from Arabidopsis and soybean.</a> Plant Physiol. 146 (2), 418-430 (2008).</li>
<li>Panwar, P., Deniaud, A., Pebay-Peyroula, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Contamination+from+an+affinity+column%3A+an+encounter+with+a+new+villain+in+the+world+of+membrane-protein+crystallization%5BTitle%5D)+AND+%22Acta+Crystallogr.+D.+Biol.+Crystallogr%22%5BJournal%5D)">Contamination from an affinity column: an encounter with a new villain in the world of membrane-protein crystallization.</a> Acta Crystallogr. D. Biol. Crystallogr. 68 (10), 1272-1277 (2012).</li>
<li>Hendrickson, W. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Crystal+structure+of+core+streptavidin+determined+from+multiwavelength+anomalous+diffraction+of+synchrotron+radiation%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.+S.+A%22%5BJournal%5D)">Crystal structure of core streptavidin determined from multiwavelength anomalous diffraction of synchrotron radiation.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 86 (7), 2190-2194 (1989).</li>
<li>Bernot, K. M., Lee, C. H., Coulombe, P. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+small+surface+hydrophobic+stripe+in+the+coiled-coil+domain+of+type+I+keratins+mediates+tetramer+stability%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">A small surface hydrophobic stripe in the coiled-coil domain of type I keratins mediates tetramer stability.</a> J. Cell Biol. 168 (6), 965-974 (2005).</li>
<li>Singh, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Solution+structure+of+human+von+Willebrand+factor+studied+using+small+angle+neutron+scattering%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Biol.+Chem%22%5BJournal%5D)">Solution structure of human von Willebrand factor studied using small angle neutron scattering.</a> J. Biol. Chem. 281 (50), 38266-38275 (2006).</li>
<li>Weldon, W. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Enhanced+immunogenicity+of+stabilized+trimeric+soluble+influenza+hemagglutinin%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Enhanced immunogenicity of stabilized trimeric soluble influenza hemagglutinin.</a> PLoS One. 5 (9), (2010).</li>
<li>Wang, W., Barger, S. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Roles+of+quaternary+structure+and+cysteine+residues+in+the+activity+of+human+serine+racemase%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Biochem%22%5BJournal%5D)">Roles of quaternary structure and cysteine residues in the activity of human serine racemase.</a> BMC Biochem. 12, 63(2011).</li>
<li>Rappsilber, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+beginning+of+a+beautiful+friendship%3A+cross-linking%2Fmass+spectrometry+and+modelling+of+proteins+and+multi-protein+complexes%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Struct.+Biol%22%5BJournal%5D)">The beginning of a beautiful friendship: cross-linking/mass spectrometry and modelling of proteins and multi-protein complexes.</a> J. Struct. Biol. 173 (3), 530-540 (2011).</li>
<li>Sousa, M. M., Steen, K. W., Hagen, L., Slupphaug, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Antibody+cross-linking+and+target+elution+protocols+used+for+immunoprecipitation+significantly+modulate+signal-to+noise+ratio+in+downstream+2D-PAGE+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Proteome+Sci%22%5BJournal%5D)">Antibody cross-linking and target elution protocols used for immunoprecipitation significantly modulate signal-to noise ratio in downstream 2D-PAGE analysis.</a> Proteome Sci. 9, 45(2011).</li>
</ol>

Nie stwierdzono konfliktu interesów.

Powyższy protokół może być stosowany do oczyszczania dowolnego białka przynęty znakowanego podwójnie paciorkowcami i powiązanych z nim kompleksów w dowolnym odpowiednim buforze, który nie zawiera biotyny ani silnych denaturantów. W obecnej wersji protokołu wiązanie i pranie odbywa się w stosunkowo rygorystycznych warunkach w obecności wysokiej zawartości soli i niejonowego detergentu. Chociaż powoduje to mniejsze tło, delikatne kompleksy białkowe mogą dysocjować w tych warunkach. Aby zachować takie kompleksy o niższym po...

W ostatnich latach technologia Strep-tag stała się szeroko stosowana w wielu dziedzinach badań biomedycznych, w tym w proteomice i biologii strukturalnej. Ta technologia oczyszczania białek, która opiera się na fuzji rekombinowanych białek z krótkim peptydem Strep-Tag, dojrzała wraz z pojawieniem się matryc powinowactwa zawierających Strep-Tactin, genetycznie zmodyfikowany wariant streptawidyny o ulepszonej zdolności wiązania peptydów. 1,2 Białka fuzyjne zawierające dwie kopie Strep-tag II, oznaczone jako twin-Strep-tag lub SIII-tag, wykazują większe powinowactwo do matryc Strep-Tactin niż te zawierające tylko jeden Strep-tag, zapewniając bardziej efektywne oczyszczanie rekombinowanych białek i związanych z nimi partnerów wiążących. Jednak wyższe powinowactwo białek znakowanych bliźniaczymi paciorkowcami do Strep-Tactin ma również swoje wady. Kompetycyjna elucja takich białek z nadmiarem biotyny może być niekompletna, co prowadzi do zmniejszenia docelowej wydajności białka. Bardziej wydajną alternatywą jest elucja za pomocą SDS, ale prowadzi ona do niepożądanego zanieczyszczenia próbki Strep-Tactin uwalnianą z żywicy, co sprawia, że test jest niezgodny z analizą proteomiczną. W artykule przedstawiono technikę przezwyciężenia tego ograniczenia poprzez najpierw stabilizację tetrameru sprzężonego z żywicą Strep-Tactin poprzez chemiczne sieciowanie, a następnie użycie SDS do elucji białek znakowanych podwójnymi paciorkowcami i powiązanych z nimi kompleksów z powstałej żywicy usieciowanej. W ten sposób można osiągnąć wystarczającą wydajność białka bez zanieczyszczenia próbki Strep-Tactin, co umożliwia dalszą analizę za pomocą spektrometrii mas.
Metoda jest odpowiednia do oczyszczania dowolnego rekombinowanego białka fuzyjnego z powierzchniowo eksponowanym znacznikiem SIII-tag3 lub podwójnym znacznikiem Strep-tag (sekwencja aminokwasów WSHPQFEK(GGGS)3 WSHPQFEK i SAWSHPQFEK(GGGS)2 GGSAWSHPQFEK, odpowiednio). Białko może być pochodzenia zwierzęcego, roślinnego lub bakteryjnego i może być wyizolowane z całkowitego lizatu komórkowego lub wzbogaconej frakcji organelli. Jako przykład opisujemy tutaj oczyszczanie znakowanego SIII białka VPg-Pro wirusa ziemniaka A (PVA)4 z frakcji jądrowej roślin Nicotiana benthamiana zakażonych PVA. Frakcję jądrową wyizolowano zgodnie z wcześniejszym opisem5, z następującymi modyfikacjami: komórki nie traktowano formaldehydem, maślan sodu podstawiono we wszystkich 5 mM fluorkiem sodu, kompletny inhibitor proteazy zastąpiono PMSF, stężenie Triton X-100 w buforze ekstrakcyjnym #2 obniżono do 0,3% (v/v), a osad jądrowy otrzymany przez odwirowanie przez poduszkę sacharozową (bufor ekstrakcyjny #3) zawieszono ponownie w 1,45 ml wstępnie schłodzonego wiązania bufor i obracany przez 1,5 godziny w temperaturze 4 °C. Otrzymany ekstrakt jądrowy zawierający białko przynęty znakowane SIII i związane z nim kompleksy (próbka białka przynęty) został przetworzony zgodnie z protokołem opisanym poniżej (patrz sekcja 2).

<table><tbody><tr><td>Suberat bis(sulfosuccinimidylu) (BS3), format No-Wagh, 8 x 2 mg</td><td>Pierce/Thermo Scientific</td><td>21585</td><td><a href="http://www.fishersci.com">www.fishersci.com UWAGA: Substancja niebezpieczna. Powoduje poważne podrażnienie dróg oddechowych, skóry i oczu. Nosić rękawice ochronne i okulary ochronne.</a></td></tr><tr><td>Żywica Strep-Tactin MacroPrep (50% zawiesina)</td><td>IBA</td><td>2-1505</td><td><a href="http://www.iba-lifesciences.com/">www.iba-lifesciences.com</a></td></tr><tr><td>Filtr probówkowy wirówkowy Spin-X, membrana z octanu celulozy, wielkość porów 0,45 i mu; m, niesterylne</td><td>Costar (Corning)</td><td>8163</td><td><a href="http://www.corning.com/lifesciences/">www.corning.com/lifesciences/</a></td></tr><tr><td>Rurki z nosem delfina</td><td>Costar (Corning)</td><td>3213</td><td><a href="http://www.corning.com/lifesciences/">www.corning.com/lifesciences/</a></td></tr><tr><td>Avidin&nbsp;</td><td>IBA</td><td>2-0204</td><td><a href="http://www.iba-lifesciences.com/">www.iba-lifesciences.com</a></td></tr></tbody></table>

jednoetapowe oczyszczanie białek znakowanych podwójnymi paciorkowcami i ich kompleksów na żywicy strep-tactin usieciowanej suberatrynem bis(sulfosukcynimidylu) (bs3)

One-step Purification of Twin-Strep-tagged Proteins and Their Complexes on Strep-Tactin Resin Cross-linked With Bis(sulfosuccinimidyl) Suberate (BS3)

Oczyszczanie powinowactwa białek fuzyjnych oznaczonych Strep-Strep na żywicach zawierających zmodyfikowaną streptawidynę (Strep-Tactin) stało się powszechnie stosowaną metodą izolacji kompleksów białkowych w warunkach fizjologicznych. Białka fuzyjne zawierające dwie kopie Strep-tag II, oznaczone jako twin-Strep-tag lub SIII-tag, mają tę zaletę, że mają wyższe powinowactwo do Strep-Tactin w porównaniu z tymi, które zawierają tylko jeden Strep-tag, umożliwiając w ten sposób bardziej efektywne oczyszczanie białek. Jednak ta zaleta jest równoważona przez fakt, że elucja białek znakowanych podwójnie paciorkowcami za pomocą biotyny może być niekompletna, co prowadzi do niskiego odzysku białka. Odzysk można znacznie poprawić, stosując denaturację elucji za pomocą dodecylosiarczanu sodu (SDS), ale prowadzi to do zanieczyszczenia próbki Strep-Tactin uwalnianym z żywicy, co sprawia, że test jest niezgodny z dalszą analizą proteomiczną. Aby przezwyciężyć to ograniczenie, opracowaliśmy metodę, w której sprzężony z żywicą tetramer Strep-Tactin jest najpierw stabilizowany przez kowalencyjne sieciowanie z suberatianem bis(sulfosukcynimidylu) (BS3), a powstała żywica usieciowana jest następnie wykorzystywana do oczyszczania docelowych kompleksów białkowych w jednym etapie oczyszczania partii. Wydajna elucja za pomocą SDS zapewnia dobry odzysk białka, podczas gdy brak zanieczyszczającej Strep-Tactin umożliwia dalszą analizę białek za pomocą spektrometrii mas. Jako dowód słuszności koncepcji opisujemy tutaj protokół oczyszczania białka wirusowego VPg-Pro znakowanego SIII z jąder zakażonych wirusem roślin N. benthamiana przy użyciu żywicy polimetakrylanowej Strep-Tactin usieciowanej BS3. Ten sam protokół może być stosowany do oczyszczania dowolnego białka znakowanego bliźniaczymi paciorkowcami i charakteryzowania jego fizjologicznych partnerów wiążących.

Procedura oczyszczania została schematycznie przedstawiona na Rysunku 1, wraz z przedstawieniem problemów związanych z innymi istniejącymi metodami oczyszczania.
<img alt="Schemat procesu oczyszczania białek z wykorzystaniem Strep-Tactin, SDS PAGE oraz analizy LC-MS/MS." fo:content-width="5.5in" src="/files/ftp_upload/51536/51536fig1highres.jpg" width="650" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="Rysunek 1"> 
Rysunek 1. Sche...

Opisano metodę skutecznego oczyszczania białek fuzyjnych znakowanych podwójnie Strep-Strep-i ich specyficznych kompleksów na zmodyfikowanej żywicy streptawidyny (Strep-Tactin) kowalencyjnie usieciowanej z suberianem bis(sulfosukcynimidylu) (BS3). Zaletą metody jest duża szybkość, dobry odzysk białka docelowego i wysoka czystość, a także jest kompatybilna z późniejszą analizą za pomocą spektrometrii mas.

Jednoetapowe oczyszczanie białek znakowanych podwójnymi paciorkowcami i ich kompleksów na żywicy Strep-Tactin usieciowanej suberatrynem bis(sulfosukcynimidylu) (BS3)

Affinity purification of Strep-tagged fusion proteins on resins carrying an engineered streptavidin (Strep-Tactin) has become a widely used method for ...

Witam, nazywam się Christina McKennan i reprezentuję Uniwersytet w Helsinkach w Finlandii. Jednym z wyzwań w charakteryzacji konkretnego kompleksu białkowego jest określenie jego składu molekularnego. Wymaga to opracowania metod izolacji i oczyszczania kompleksu z jego środowiska komórkowego.Obszar badań nad drobnoustrojami obejmuje interakcje między wirusami roślin a ich gospodarzami, dlatego interesują nas różne kompleksy białek nukleokapsydowych wirusów tworzące się podczas infekcji. W przeszłości z sukcesem badaliśmy te kompleksy, stosując opracowaną przez nas metodę oczyszczania opartą na powinowactwie. Znacznik Twin-Strep okazał się jednym z najskuteczniejszych markerów.Zaobserwowaliśmy jednak pewne ograniczenia w jej zastosowaniu, z których jednym była niska wydajność, dlatego chcieliśmy ulepszyć tę metodę. Dzień dobry, nazywam się Mata i przeprowadzę Państwa przez protokół eksperymentalny. Ale najpierw przedstawię ogólny opis metody.Używamy kulek strep-tactin macro prep do oczyszczania specyficznych kompleksów pomiędzy białkami z podwójnym znacznikiem Strep i ich fizjologicznymi partnerami wiążącymi. Tetramer z podwójnym znacznikiem Strep przedstawiono na zielono, białko z podwójnym znacznikiem Strep na niebiesko, jego partner wiążący na pomarańczowo, a dwie kopie znacznika Strep na czerwono.W podejściu kanonicznym niezwiązane białka, przedstawione jako szare sfery, są usuwane poprzez przemywanie. Związane kompleksy są eluowane konkurencyjnie za pomocą biotyny, zaznaczonej na różowo. Jednakże, stosując tę metodę, zaobserwowaliśmy niepełną elucję związanych kompleksów, przy czym tylko ich frakcja została skutecznie oddzielona od kulek strep-tachin.Skutkuje to niskim odzyskiem białka docelowego. Co utrudnia dalszą analizę, odzysk białka docelowego można poprawić, stosując elucję denaturującą z SDS. Wokół zdenaturowanego białka przynęty Twin-Strep-tag tworzą się miscele.Jego partner wiążący oraz zdysocjowane monomery streptaktyny. Powstałe zanieczyszczenie próbki uwolnioną streptaktyną jest niedopuszczalne, jeśli próbka ma być poddana dalszej analizie za pomocą spektrometrii mas. Aby rozwiązać problem zanieczyszczenia próbki, opracowaliśmy metodę, w której tetramer streptaktyny jest najpierw stabilizowany poprzez sieciowanie chemiczne.Otrzymana sieciowana żywica służy do oczyszczania białka przynęty oraz próbki jego partnera wiążącego; elucja z użyciem SDS zapewnia wysoką odzyskowalność białek, natomiast chemiczne sieciowanie żywicy gwarantuje elucję białka przynęty z tagiem strept oraz jego partnera wiążącego bez zanieczyszczenia próbki uwolnionym streptem. Doprowadzić do temperatury pokojowej jedną szczelnie zamkniętą mikroprobówkę zawierającą 2 mg sieciującego BS3.Przygotuj końcówkę pipety do przenoszenia żywicy, odcinając jej końcówkę. Ponownie zawieś żywicę strep tact i macro prep poprzez krótkie, energiczne wstrząsanie, a następnie natychmiast przenieś 600 µL zawiesiny do kolumny filtracyjnej CoStar spinx i wiruj przy 4 000 RPM przez 30 sekund. W temperaturze pokojowej dodaj 450 µL roztworu soli fosforanowo-buforowanej (PBS). Celem tego etapu jest zastąpienie pierwotnego buforu TRIS nieaktywnym fosforanem.Odciek należy usunąć. Zawartość probówki należy wymieszać, kilkakrotnie nią obracając. Kroki wirowania i płukania należy powtórzyć dwukrotnie, a następnie pozostawić żywicę w 430 µL PBS pH 8.Po ostatnim wirowaniu przebij folię probówki typu micro tube za pomocą końcówki pipety zawierającej 100 µL wody Milli-Q. Rozpuść proszek BS3 w wodzie, delikatnie pipetując go w górę i w dół. Gdy BS3 zostanie całkowicie rozpuszczony, niezwłocznie dodaj 20 µL roztworu do kolumny SpinX. Upewnij się, że zawartość została odpowiednio wymieszana.Rotować kolumnę przez 30 minut w temperaturze pokojowej, upewniając się, że żywica została odpowiednio wymieszana z roztworem BS trzy. Aby przerwać reakcję, dodać sześć µL Tris o stężeniu 3 M, doprowadzonego do pH 7,5 za pomocą kwasu solnego. Rotować kolumnę przez kolejne 15 minut w temperaturze pokojowej, a następnie odwirować przy 4 000 RPM przez 30 sekund.W temperaturze pokojowej zawiesić sieciowaną żywicę w 450 µL soli buforowanej trisem z tweenem 20 i odrzucić frakcję przepływową. Powtórzyć etapy wirowania i płukania jeszcze dwa razy. W ostatnim kroku ponownie zawiesić żywicę w 450 µL TBS. Przenieść zawiesinę żywicy do nowej probówki, pozostałą w kolumnie żywicę zawiesić w kolejnych 450 µL TBS i przenieść do tej samej probówki.Powtórz ostatni krok jeszcze raz, aby zapewnić maksymalny transfer żywicy z kolumny do probówki. Pozostaw probówkę z zawiesiną żywicy na 10 minut w temperaturze pokojowej i dostosuj objętość do 600 µL. Po usunięciu nadmiaru TBS żywica jest gotowa do natychmiastowego użycia lub może być przechowywana w temperaturze czterech stopni Celsjusza bez zamrażania.Metoda ta jest odpowiednia do oczyszczania dowolnego białka fuzyjnego z podwójnym znacznikiem strep oraz jego związanych kompleksów. Białko może pochodzić z organizmów zwierzęcych, roślinnych lub bakteryjnych i może być izolowane zarówno z całkowitego lizatu komórkowego, jak i z wzbogaconej frakcji organellowej. W tym przykładzie izolujemy białko z podwójnym znacznikiem strep, VPG Pro wirusa ziemniaka A, z frakcji jądrowej roślin zainfekowanych wirusem; należy rozpocząć od wirowania jednego mililitra próbki białka przynęci w buforze wiążącym przy 13 000 RPM przez 10 minut w temperaturze czterech stopni Celsjusza.Przenieś supernatant do nowej probówki, aby zminimalizować wiązanie endogennych białek biotynylowanych z strep tact i żywicą. Dodaj avadon do stężenia końcowego 100 µg/mL, upewniając się, że zawartość została dokładnie wymieszana. Inkubuj w rotatorze przez 15 minut w temperaturze 4 °C.Resuspendować sieciowaną żywicę za pomocą vortexa, a następnie, używając końcówki do pipety typu cup, niezwłocznie przenieść 50 µL zawiesiny żywicy do probówki zawierającej próbkę białka przynęty. Inkubować w rotacji przez kolejne 30 minut w temperaturze 4 °C. Ustawić termomikser na 55 °C i podgrzać 500 µL buforu Elu do wykorzystania w etapie elucji; wirować przy 2000 RPM przez jedną minutę w temperaturze 4 °C.Odlej supernatant i przemyj żywicę jednym mililitrem schłodzonego buforu do płukania nr 1, rotując przez pięć minut w temperaturze 4 °C. Powtórz etapy wirowania i płukania trzy razy, wykonując to w ostatnim kroku.Resuspender żywicę w 250 µL buforu płuczącego nr 2 i przenieść zawiesinę żywicy do nowej kolumny typu spinx. Resuspender pozostałą w probówce żywicę w kolejnych 250 µL buforu płuczącego nr 2, przenieść do tej samej kolumny i wirować przy 2000 RPM przez trzy minuty w temperaturze 4 °C. Przenieść kolumnę do nowej probówki typu dolphin nose o pojemności 2 mL i odrzucić frakcję przepływową.Należy niezwłocznie przejść do następnego etapu elucji. Do kolumny spinx dodać 150 µL podgrzanego buforu do elucji. Roztwór inkubować w termomikserze przez pięć minut w temperaturze 55 °C przy wytrząsaniu z prędkością 1400 RPM, a następnie wirować z prędkością 4 000 RPM przez jedną minutę w temperaturze pokojowej i usunąć kolumnę.Oczyszczone białka docelowe są teraz gotowe do dalszych analiz i mogą być przechowywane w temperaturze poniżej -20 °C. Obraz pokazuje, że eluowanie białka z żywicy strept actin macro prep za pomocą biotyny jest niepełne w porównaniu z eluowaniem za pomocą SDS. Różnica w intensywności sygnałów w western blot odzwierciedla różne wydajności białka uzyskane przy zastosowaniu obu technik eluowania. Chociaż eluowanie z SDS jest znacznie bardziej wydajne niż eluowanie z biotyną, prowadzi ono do zanieczyszczenia próbki uwolnioną streptaktyną.Obraz przedstawia żel barwiony srebrem po elektroforezie SDS-PAGE z elucjami EIT streptaktyny z żywicy Macro prep; należy zwrócić uwagę na obecność uwolnionej streptaktyny w lewej ścieżce oraz jej brak w prawej ścieżce. Próbka po lewej pochodzi z żywicy nieusieciowanej, a próbka po prawej z żywicy usieciowanej za pomocą BS3. Na podstawie tych wyników wyciągamy wniosek, że sieciowanie za pomocą BS3 zapobiega uwalnianiu streptaktyny z żywicy podczas elucji w obecności SDS.W tym przykładzie wykorzystaliśmy żywicę Streptactin macro prep sieciowaną za pomocą BS3 do oczyszczania białka przynęty VPG PRO oraz jego partnerów wiążących. Alikwot oczyszczonej próbki poddano analizie spektrometrii mas w celu identyfikacji białek. Brak specyficznego prążka w kontroli negatywnej potwierdza specyficzność procesu pull-down.Dolny prążek odpowiada białku przynęcie VPG PRO, a górny prążek jego partnerowi wiążącemu NIB, zidentyfikowanemu za pomocą spektrometrii mas. Właśnie pokazaliśmy Państwu, w jaki sposób sieciowanie chemiczne może zostać wykorzystane do przezwyciężenia ograniczeń związanych z denaturacją i wymywaniem z żywicy strep-taktynowej. Oprócz oczyszczania kompleksów białko-białko, metodę tę można również stosować do oczyszczania kompleksów białek z kwasami nukleinowymi, w tym tych sieciowanych formaldehydem i poddanych odwróceniu sieciowania.Wreszcie, metodę tę można wykorzystać do oczyszczania białek błonowych z tagiem strep tech. Rozpuszcza się je w detergentach. Detergenty są niezbędne, aby utrzymać te hydrofobowe białka w roztworze.Jednakże ich obecność może prowadzić do zanieczyszczenia próbki uwolnioną streptawidyną. Nawet w przypadku zastosowania łagodnej elucji biotyny, uważamy, że sieciowanie żywicy może stanowić rozwiązanie problemu zanieczyszczenia próbek. Dziękujemy za oglądanie i życzymy powodzenia w przeprowadzeniu eksperymentów. Dobrze.

one-step-purification-twin-strep-tagged-proteins-their-complexes-on

Research

JoVE Journal

Biology

Biologia

Jednoetapowa oczyszczanie białek oznaczonych podwójnym Strep-tagiem i ich kompleksów na żywice Strep-Tactin skrzyżlowanej z Bis(sulfosukcynimidylo) suberanem (BS3)

W niniejszej pracy opisujemy nową ilościową technikę proteomiczną służącą do identyfikacji kompleksów białkowych u Saccharomyces cerevisiae. W badaniu tym wykorzystaliśmy metodę SILAC wraz z oczyszczaniem powinowactwowym, a następnie tandemową spektrometrią mas, aby z wysoką specyficznością zidentyfikować partnerów wiążących białko ER, Scs2p.

Identyfikacja kompleksów białkowych z wykorzystaniem proteomiki ilościowej u S. cerevisiae

Opracowano i szczegółowo opisano nowatorski i wysoce wydajny dwuetapowy protokół chromatografii powinowactwa. Metoda ta opiera się na niewielkim znaczniku oczyszczającym o dwóch wrodzonych powinowactwach i jest możliwa do zastosowania w odniesieniu do szerokiego zakresu białek docelowych o różnych właściwościach.<br...

Ortogonalne oczyszczanie białek wspomagane przez mały bispecyficzny znacznik powinowactwa

Tandemowa puryfikacja powinowactwa (TAP) jest skuteczną metodą identyfikacji białek wiążących. W ramach dowodu koncepcji metodologię tę zastosowano do dobrze scharakteryzowanego czynnika inicjacji translacji eIF4E w celu koprecypitacji czynników komórkowych gospodarza zaangażowanych w inicjację translacji. Metoda ta może być łatwo zaadaptowana do dowolnego białka komórkowego lub wirusowego.

Identyfikacja partnerów oddziaływań białkowych z wykorzystaniem tandemowej oczyszczania powinowactwa

Oczyszczanie powinowactwa oznaczonych białek w połączeniu ze spektrometrią mas (APMS) to potężna metoda systematycznego mapowania sieci interakcji białek i badania mechanistycznych podstaw procesów biologicznych. W tym miejscu opisujemy zoptymalizowaną procedurę APMS opartą na powinowactwie do peptydów sekwencyjnych (SPA) opracowaną dla bakterii Escherichia coli, która może być stosowana do izolowania i charakteryzowania stabilnych kompleksów wielobiałkowych do niemal jednorodności, nawet...

Identyfikacja kompleksów białkowych w Escherichia coli za pomocą sekwencyjnego oczyszczania powinowactwa peptydów w połączeniu z tandemową spektrometrią mas

Źródło: Murata, T., et al. Oczyszczanie białka o wysokiej masie cząsteczkowej w Streptococcus mutans. J. Vis. Exp. (2019)Ten film pokazuje krok po kroku procedurę oczyszczania białka znakowanego polihistydyną wydzielanego przez Streptococcus mutans.

Procedura oczyszczania białka znakowanego polihistydyną ze Streptococcus mutans

Ten film demonstruje tandemowe oczyszczanie powinowactwa — technikę oczyszczania kompleksów białkowych z komórek eukariotycznych w celu zbadania interakcji białko-białko. Kompleks zawiera dwa białka znakowane różnymi znacznikami epitopów. Po oczyszczeniu kompleksu za pomocą dwóch żywic o powinowactwie do dwóch różnych znaczników w sposób sekwencyjny, obecność obu białek w elucie potwierdza oddziaływanie między nimi.

Tandemowy test oczyszczania powinowactwa do badania interakcji białko-białko

Metoda Tandem Affinity Purification (TAP) była szeroko stosowana do izolowania natywnych kompleksów z ekstraktu komórkowego, głównie eukariotycznego, do proteomiki. W tym miejscu przedstawiamy protokół metody TAP zoptymalizowany pod kątem oczyszczania kompleksów natywnych do badań strukturalnych.

Oczyszczanie kompleksów natywnych do badań strukturalnych za pomocą metody tandemowego znacznika powinowactwa

Opisujemy tutaj nowatorską, solidną i efektywną metodę tandemowego oczyszczania powinowactwa (TAP) do ekspresji, izolacji i charakterystyki kompleksów białkowych z komórek eukariotycznych. Protokół ten może być wykorzystany do biochemicznej charakterystyki dyskretnych kompleksów, a także do identyfikacji nowych interaktorów i modyfikacji potranslacyjnych, które regulują ich funkcję.

Tandemowe oczyszczanie kompleksów białkowych z komórek eukariotycznych

Kompleksy RNA/białkowe oczyszczone przy użyciu strategii botyna-streptawidyna są eluowane do roztworu w warunkach denaturacji w formie nieodpowiedniej do dalszego oczyszczania i analizy funkcjonalnej. Tutaj opisujemy modyfikację tej strategii, która wykorzystuje fotorozszczepialny łącznik w RNA i delikatny etap elucji UV, dając natywne i w pełni funkcjonalne kompleksy RNA / białko.

Jednoetapowe oczyszczanie kompleksów makromolekularnych za pomocą RNA przyłączonego do biotyny i łącznika fotorozszczepialnego

Opisana tutaj jest prosta metoda oczyszczania produktu genowego u Streptococcus mutans. Technika ta może być korzystna w oczyszczaniu białek, zwłaszcza białek błonowych i białek o dużej masie cząsteczkowej, i może być stosowana z różnymi innymi gatunkami bakterii.

Oczyszczanie białka o wysokiej masie cząsteczkowej w Streptococcus mutans

Rekonstrukcja in vitro białek cytoszkieletu jest kluczowym narzędziem do zrozumienia podstawowych właściwości funkcjonalnych tych białek. W niniejszej pracy opisano protokół oczyszczania i oceny jakości rekombinowanych kompleksów septynowych, które odgrywają kluczową rolę w podziale i migracji komórek.

Oczyszczanie i kontrola jakości rekombinowanych kompleksów septynowych do rekonstytucji bezkomórkowej

Poznaj metodę oczyszczania białek znakowanych podwójnymi paciorkowcami i ich kompleksów na żywicy Strep-Tactin usieciowanej BS3. Technika zapewnia wysoką czystość i wydajność, umożliwiając analizę spektrometryczną.

Jednoetapowe oczyszczanie białek znakowanych podwójnymi paciorkowcami i ich kompleksów na żywicy Strep-Tactin usieciowanej suberatrynem bis(sulfosukcynimidylu) (BS3) (Wideo) | JoVE Journal

Jednoetapowe oczyszczanie białek znakowanych podwójnymi paciorkowcami i ich kompleksów na żywicy Strep-Tactin usieciowanej suberatrynem bis(sulfosukcynimidylu) (BS3)

Przeglądaj więcej filmów