Jednoetapowe oczyszczanie białek znakowanych podwójnymi paciorkowcami i ich kompleksów na żywicy Strep-Tactin usieciowanej suberatrynem bis(sulfosukcynimidylu) (BS3)

Witam, nazywam się Christina McKennan i reprezentuję Uniwersytet w Helsinkach w Finlandii. Jednym z wyzwań w charakteryzacji konkretnego kompleksu białkowego jest określenie jego składu molekularnego. Wymaga to opracowania metod izolacji i oczyszczania kompleksu z jego środowiska komórkowego.

Obszar badań nad drobnoustrojami obejmuje interakcje między wirusami roślin a ich gospodarzami, dlatego interesują nas różne kompleksy białek nukleokapsydowych wirusów tworzące się podczas infekcji. W przeszłości z sukcesem badaliśmy te kompleksy, stosując opracowaną przez nas metodę oczyszczania opartą na powinowactwie. Znacznik Twin-Strep okazał się jednym z najskuteczniejszych markerów.

Zaobserwowaliśmy jednak pewne ograniczenia w jej zastosowaniu, z których jednym była niska wydajność, dlatego chcieliśmy ulepszyć tę metodę. Dzień dobry, nazywam się Mata i przeprowadzę Państwa przez protokół eksperymentalny. Ale najpierw przedstawię ogólny opis metody.

Używamy kulek strep-tactin macro prep do oczyszczania specyficznych kompleksów pomiędzy białkami z podwójnym znacznikiem Strep i ich fizjologicznymi partnerami wiążącymi. Tetramer z podwójnym znacznikiem Strep przedstawiono na zielono, białko z podwójnym znacznikiem Strep na niebiesko, jego partner wiążący na pomarańczowo, a dwie kopie znacznika Strep na czerwono.

W podejściu kanonicznym niezwiązane białka, przedstawione jako szare sfery, są usuwane poprzez przemywanie. Związane kompleksy są eluowane konkurencyjnie za pomocą biotyny, zaznaczonej na różowo. Jednakże, stosując tę metodę, zaobserwowaliśmy niepełną elucję związanych kompleksów, przy czym tylko ich frakcja została skutecznie oddzielona od kulek strep-tachin.

Skutkuje to niskim odzyskiem białka docelowego. Co utrudnia dalszą analizę, odzysk białka docelowego można poprawić, stosując elucję denaturującą z SDS. Wokół zdenaturowanego białka przynęty Twin-Strep-tag tworzą się miscele.

Jego partner wiążący oraz zdysocjowane monomery streptaktyny. Powstałe zanieczyszczenie próbki uwolnioną streptaktyną jest niedopuszczalne, jeśli próbka ma być poddana dalszej analizie za pomocą spektrometrii mas. Aby rozwiązać problem zanieczyszczenia próbki, opracowaliśmy metodę, w której tetramer streptaktyny jest najpierw stabilizowany poprzez sieciowanie chemiczne.

Otrzymana sieciowana żywica służy do oczyszczania białka przynęty oraz próbki jego partnera wiążącego; elucja z użyciem SDS zapewnia wysoką odzyskowalność białek, natomiast chemiczne sieciowanie żywicy gwarantuje elucję białka przynęty z tagiem strept oraz jego partnera wiążącego bez zanieczyszczenia próbki uwolnionym streptem. Doprowadzić do temperatury pokojowej jedną szczelnie zamkniętą mikroprobówkę zawierającą 2 mg sieciującego BS3.

Przygotuj końcówkę pipety do przenoszenia żywicy, odcinając jej końcówkę. Ponownie zawieś żywicę strep tact i macro prep poprzez krótkie, energiczne wstrząsanie, a następnie natychmiast przenieś 600 µL zawiesiny do kolumny filtracyjnej CoStar spinx i wiruj przy 4 000 RPM przez 30 sekund. W temperaturze pokojowej dodaj 450 µL roztworu soli fosforanowo-buforowanej (PBS). Celem tego etapu jest zastąpienie pierwotnego buforu TRIS nieaktywnym fosforanem.

Odciek należy usunąć. Zawartość probówki należy wymieszać, kilkakrotnie nią obracając. Kroki wirowania i płukania należy powtórzyć dwukrotnie, a następnie pozostawić żywicę w 430 µL PBS pH 8.

Po ostatnim wirowaniu przebij folię probówki typu micro tube za pomocą końcówki pipety zawierającej 100 µL wody Milli-Q. Rozpuść proszek BS3 w wodzie, delikatnie pipetując go w górę i w dół. Gdy BS3 zostanie całkowicie rozpuszczony, niezwłocznie dodaj 20 µL roztworu do kolumny SpinX. Upewnij się, że zawartość została odpowiednio wymieszana.

Rotować kolumnę przez 30 minut w temperaturze pokojowej, upewniając się, że żywica została odpowiednio wymieszana z roztworem BS trzy. Aby przerwać reakcję, dodać sześć µL Tris o stężeniu 3 M, doprowadzonego do pH 7,5 za pomocą kwasu solnego. Rotować kolumnę przez kolejne 15 minut w temperaturze pokojowej, a następnie odwirować przy 4 000 RPM przez 30 sekund.

W temperaturze pokojowej zawiesić sieciowaną żywicę w 450 µL soli buforowanej trisem z tweenem 20 i odrzucić frakcję przepływową. Powtórzyć etapy wirowania i płukania jeszcze dwa razy. W ostatnim kroku ponownie zawiesić żywicę w 450 µL TBS. Przenieść zawiesinę żywicy do nowej probówki, pozostałą w kolumnie żywicę zawiesić w kolejnych 450 µL TBS i przenieść do tej samej probówki.

Powtórz ostatni krok jeszcze raz, aby zapewnić maksymalny transfer żywicy z kolumny do probówki. Pozostaw probówkę z zawiesiną żywicy na 10 minut w temperaturze pokojowej i dostosuj objętość do 600 µL. Po usunięciu nadmiaru TBS żywica jest gotowa do natychmiastowego użycia lub może być przechowywana w temperaturze czterech stopni Celsjusza bez zamrażania.

Metoda ta jest odpowiednia do oczyszczania dowolnego białka fuzyjnego z podwójnym znacznikiem strep oraz jego związanych kompleksów. Białko może pochodzić z organizmów zwierzęcych, roślinnych lub bakteryjnych i może być izolowane zarówno z całkowitego lizatu komórkowego, jak i z wzbogaconej frakcji organellowej. W tym przykładzie izolujemy białko z podwójnym znacznikiem strep, VPG Pro wirusa ziemniaka A, z frakcji jądrowej roślin zainfekowanych wirusem; należy rozpocząć od wirowania jednego mililitra próbki białka przynęci w buforze wiążącym przy 13 000 RPM przez 10 minut w temperaturze czterech stopni Celsjusza.

Przenieś supernatant do nowej probówki, aby zminimalizować wiązanie endogennych białek biotynylowanych z strep tact i żywicą. Dodaj avadon do stężenia końcowego 100 µg/mL, upewniając się, że zawartość została dokładnie wymieszana. Inkubuj w rotatorze przez 15 minut w temperaturze 4 °C.

Resuspendować sieciowaną żywicę za pomocą vortexa, a następnie, używając końcówki do pipety typu cup, niezwłocznie przenieść 50 µL zawiesiny żywicy do probówki zawierającej próbkę białka przynęty. Inkubować w rotacji przez kolejne 30 minut w temperaturze 4 °C. Ustawić termomikser na 55 °C i podgrzać 500 µL buforu Elu do wykorzystania w etapie elucji; wirować przy 2000 RPM przez jedną minutę w temperaturze 4 °C.

Odlej supernatant i przemyj żywicę jednym mililitrem schłodzonego buforu do płukania nr 1, rotując przez pięć minut w temperaturze 4 °C. Powtórz etapy wirowania i płukania trzy razy, wykonując to w ostatnim kroku.

Resuspender żywicę w 250 µL buforu płuczącego nr 2 i przenieść zawiesinę żywicy do nowej kolumny typu spinx. Resuspender pozostałą w probówce żywicę w kolejnych 250 µL buforu płuczącego nr 2, przenieść do tej samej kolumny i wirować przy 2000 RPM przez trzy minuty w temperaturze 4 °C. Przenieść kolumnę do nowej probówki typu dolphin nose o pojemności 2 mL i odrzucić frakcję przepływową.

Należy niezwłocznie przejść do następnego etapu elucji. Do kolumny spinx dodać 150 µL podgrzanego buforu do elucji. Roztwór inkubować w termomikserze przez pięć minut w temperaturze 55 °C przy wytrząsaniu z prędkością 1400 RPM, a następnie wirować z prędkością 4 000 RPM przez jedną minutę w temperaturze pokojowej i usunąć kolumnę.

Oczyszczone białka docelowe są teraz gotowe do dalszych analiz i mogą być przechowywane w temperaturze poniżej -20 °C. Obraz pokazuje, że eluowanie białka z żywicy strept actin macro prep za pomocą biotyny jest niepełne w porównaniu z eluowaniem za pomocą SDS. Różnica w intensywności sygnałów w western blot odzwierciedla różne wydajności białka uzyskane przy zastosowaniu obu technik eluowania. Chociaż eluowanie z SDS jest znacznie bardziej wydajne niż eluowanie z biotyną, prowadzi ono do zanieczyszczenia próbki uwolnioną streptaktyną.

Obraz przedstawia żel barwiony srebrem po elektroforezie SDS-PAGE z elucjami EIT streptaktyny z żywicy Macro prep; należy zwrócić uwagę na obecność uwolnionej streptaktyny w lewej ścieżce oraz jej brak w prawej ścieżce. Próbka po lewej pochodzi z żywicy nieusieciowanej, a próbka po prawej z żywicy usieciowanej za pomocą BS3. Na podstawie tych wyników wyciągamy wniosek, że sieciowanie za pomocą BS3 zapobiega uwalnianiu streptaktyny z żywicy podczas elucji w obecności SDS.

W tym przykładzie wykorzystaliśmy żywicę Streptactin macro prep sieciowaną za pomocą BS3 do oczyszczania białka przynęty VPG PRO oraz jego partnerów wiążących. Alikwot oczyszczonej próbki poddano analizie spektrometrii mas w celu identyfikacji białek. Brak specyficznego prążka w kontroli negatywnej potwierdza specyficzność procesu pull-down.

Dolny prążek odpowiada białku przynęcie VPG PRO, a górny prążek jego partnerowi wiążącemu NIB, zidentyfikowanemu za pomocą spektrometrii mas. Właśnie pokazaliśmy Państwu, w jaki sposób sieciowanie chemiczne może zostać wykorzystane do przezwyciężenia ograniczeń związanych z denaturacją i wymywaniem z żywicy strep-taktynowej. Oprócz oczyszczania kompleksów białko-białko, metodę tę można również stosować do oczyszczania kompleksów białek z kwasami nukleinowymi, w tym tych sieciowanych formaldehydem i poddanych odwróceniu sieciowania.

Wreszcie, metodę tę można wykorzystać do oczyszczania białek błonowych z tagiem strep tech. Rozpuszcza się je w detergentach. Detergenty są niezbędne, aby utrzymać te hydrofobowe białka w roztworze.

Jednakże ich obecność może prowadzić do zanieczyszczenia próbki uwolnioną streptawidyną. Nawet w przypadku zastosowania łagodnej elucji biotyny, uważamy, że sieciowanie żywicy może stanowić rozwiązanie problemu zanieczyszczenia próbek. Dziękujemy za oglądanie i życzymy powodzenia w przeprowadzeniu eksperymentów. Dobrze.