Name: In vitro Testy agregacyjne z użyciem hiperfosforylowanego białka Tau (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2015-01-02T13:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 22 s
Description: Poznaj metodę testów agregacyjnych białka Tau in vitro, wykorzystującą hiperfosforylację i fluorescencję barwników tioflawinowych. Technika ta umożliwia badanie kinetyki agregacji i poszukiwanie terapii choroby Alzheimera.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Ta praca była wspierana przez National Institute on Aging (AG039768) dla MHK. Dziękujemy doktorom Thomasowi Sharkeyowi i Honggao Yanowi za hojne dostarczenie instrumentów, a także Seanowi Weise'owi i Yan Wu za pomoc techniczną.

1. Przygotowanie odczynników
<ol>
	<li>Przygotować bufor agregacyjny (20 mM Tris, pH 7,4, 100 mM NaCl, 1 mM EDTA). Przechowywać w RT, stabilnie przez miesiące. Uzupełnij 1 mM ditiotreitol (DTT) przed użyciem. 
	UWAGA: Bufor oparty na HEPES (10 mM HEPES, pH 7,5, 0,1 mM EDTA, 5 mM DTT) również daje podobne wyniki w agregacji tau.</li>
	<li>Przygotować roztwór podstawowy tioflawiny T lub tioflawiny S (3 mM, rozpuszczony w buforze agregacyjnym) i przefiltrować przez sterylną jednostkę filtrującą 0,22 μm. Przechowywać w temperaturze –20 °C w tubie pokrytej folią aluminiową, stabilnej przez wiele miesięcy.</li>
	<li>Przygotować podstawowy roztwór heparyny (300 μM, rozpuszczony w buforze agregacyjnym). Przechowywać w temperaturze –20 °C, stabilnie przez wiele miesięcy.</li>
	<li>Przygotować wywar z ditiotreitolu (DTT) (1 M, rozpuszczony w wodzie). Podwielokrotność rozlać na probówki o pojemności 1,5 ml. Przechowywać w temperaturze –20 °C. Przed testami agregacji rozmrozić 1 M roztwór w temperaturze pokojowej. Z tego 1,000x zapasu przygotuj porcję 100 mM materiału roboczego z wodą dejonizowaną. Pozostaw na lodzie, aż będzie gotowy.</li>
	<li>Wyjmij tau z zamrażarki o temperaturze –80 °C. Rozmrozić na lodzie. Dostosuj tau do wcześniej określonego stężenia za pomocą buforu agregacyjnego. Wirować w mikrowirówce o sile 20 800 x g przez 10 minut w temperaturze 4 °C w celu usunięcia wstępnie uformowanych dużych agregatów. Ten etap wstępnego wirowania zwiększa spójność w późniejszym pomiarze fluorescencji każdej partii preparatu białkowego. Przenieść supernatant do innej probówki; Pozostawić na lodzie do momentu, gdy będzie gotowa do złożenia reakcji agregacji.</li>
</ol>
2. Test końcowy bez barwnika
UWAGA: Reakcja agregacji tego testu odbywa się pod nieobecność barwnika fluorescencyjnego. Po wymieszaniu wszystkich składników reakcję pozwala się przeprowadzić do określonych punktów czasowych. Podwielokrotności są następnie wyjmowane z reakcji agregacji i mieszane z ThT lub ThS w celu wiązania amyloidu przed odczytem fluorescencji. Początkowa objętość reakcji agregacji zależy od liczby potrzebnych punktów czasowych. Takie podejście może wymagać dużej ilości białka tau, ale jest szybkie, proste i można je wykonać za pomocą fluorometru lub czytnika płytek wielodołkowych (patrz Dyskusja). Poniżej znajduje się operacja krok po kroku przy użyciu kompaktowego spektrofluorometru ISA SPEX FluoroMax-2 do ilościowego oznaczania fluorescencji.
<ol>
	<li>Umieścić mieszaninę agregacyjną w probówkach Eppendorfa o pojemności 1,5 ml zgodnie z tabelą 1. Każda kolumna reprezentuje składniki potrzebne do reakcji 100 μl, co wystarcza na jeden pomiar punktu czasowego. Dostosuj ilość dla całej kombinacji agregacji na podstawie punktów czasowych potrzebnych do przeprowadzenia danego eksperymentu. Dodaj dodatkowe 10% każdego składnika, aby zrobić miejsce na błąd pipetowania. Pokazana tutaj typowa reakcja z udziałem heparyny może być zastąpiona kwasem arachidonowym lub buforem agregacyjnym. Dodać DTT do 1 mM do mieszaniny reakcyjnej. Jeśli cała reakcja trwa dłużej niż jeden dzień, codziennie uzupełniaj świeżą naziemną telewizję cyfrową (1 mM), aby zapewnić środowisko redukujące.</li>
	<li>Odwróć rurkę kilka razy, aby wymieszać. Umieścić każdą reakcję w inkubatorze lub łaźni wodnej o temperaturze 37 °C. Mieszanie nie jest potrzebne do agregacji tau.</li>
	<li>Przed pomiarem fluorescencji włącz spektrofluorometr (najpierw lampa, potem komputer). 
	UWAGA: Ksenonowa lampa łukowa, której można użyć od razu. Jednak, aby uzyskać najlepsze wyniki, pozwól urządzeniu rozgrzać się przez około 10 minut przed odczytem fluorescencji.</li>
	<li>Uruchom oprogramowanie na komputerze.
	<ol>
		<li>Wybierz tryb wyświetlania w czasie rzeczywistym w Centrum sterowania instrumentami, ustaw długość fali wzbudzenia na 450 nm (szczelina do 2 nm) i długość fali emisji na 510 nm (szczelina na 5 nm). Zamknij okno trybu wyświetlania w czasie rzeczywistym, aby powrócić do Centrum sterowania instrumentami.</li>
		<li>Wybierz Analiza stałej długości fali, naciśnij przycisk Dodaj>> w górnej ramce, aby dodać zestawy długości fal. Ustaw parametry pobierania Błąd standardowy na 1 i Maksymalna liczba prób na 3, a następnie kliknij przycisk Dodaj. Kliknij przycisk Go!, aby otworzyć okno Data Display.</li>
		<li>W oknie Data Display (Wyświetlanie danych) kliknij przycisk Start Acq (Uruchom program Acq), aby otworzyć okno dialogowe New Sample (Nowa próbka). Wybierz "nieznany" dla typu próbki.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Do każdych 100 μl mieszaniny agregacyjnej dodać 98 μl buforu agregacyjnego i 2 μl 3 mM tioflawiny T. Pipet kilkakrotnie w celu wymieszania.</li>
	<li>Przenieś całą mieszaninę do kuwety (FCA3, wymiar zewnętrzny, szer. x dł. x wys. = 12,5 mm x 12,5 mm x 45 mm). Umieścić kuwetę w uchwycie na próbkę w komorze na próbkę i zamknąć pokrywę. Kliknij przycisk Uruchom, aby zebrać dane dotyczące fluorescencji. Zapisz dane.</li>
	<li>Wyjmij kuwetę i zdekantuj roztwór. Opłucz kuwetę wodą destylowaną 3 razy. Wysuszyć, wdmuchując powietrze do i na zewnątrz kuwety.</li>
</ol>
3. Test w trybie ciągłym z barwnikiem na czytniku płytek SpectraMax M2
UWAGA: Ten test różni się od poprzedniego tym, że barwnik fluorescencyjny ThT lub ThS jest zawarty w reakcji agregacji. Pozwala to na ciągły pomiar tego samego zestawu reakcji. Ze względu na powtarzające się stosowanie reakcji, metoda ta jest lepiej wykonywana za pomocą automatycznego czytnika płytek wielodołkowych (jak pokazano poniżej działanie SpectraMax M2). Zwykły fluorometr również działa, ale częstotliwość pomiaru reakcji szybkiej agregacji jest nieco ograniczona, ze względu na ręczny charakter operacji.
<ol>
	<li>Umieścić mieszaninę agregacyjną na 96-dołkowej płytce (96-dołkowa stała płytka, objętość studzienki 360 μl, płaskie dno), jak w tabeli 2. Każda kolumna reprezentuje składniki potrzebne do reakcji 200 μl, co wystarcza na jeden pomiar punktu czasowego. Dobrze wymieszaj, kilkakrotnie pipetując. Uzupełniaj świeżą naziemną telewizję cyfrową 1mM codziennie przez cały czas trwania eksperymentów.</li>
	<li>Inkubować 96-dołkową płytkę w temperaturze 37 °C.</li>
	<li>W każdym punkcie czasowym przed pomiarem fluorescencji włącz wielomodowy czytnik mikropłytek i komputer. Odczekaj wystarczająco dużo czasu, aby maszyna się ustabilizowała, około 10 minut.</li>
	<li>Uruchom oprogramowanie na komputerze. Ustaw temperaturę na 37 °C i wybierz tryb intensywności fluorescencji (FI-Top Read), ustaw długość fali wzbudzenia na 450 nm i długość fali emisji na 510 nm.</li>
	<li>Włóż 96-dołkową płytkę do szuflady i naciśnij READ, aby rozpocząć pomiar.</li>
	<li>Po odczytaniu odczytu wyjąć płytkę i umieścić ją z powrotem w inkubatorze o temperaturze 37 °C. Skopiuj dane i wklej je do arkusza kalkulacyjnego Excel w celu analizy danych i wykreślenia.</li>
</ol>
4. Test z barwnikiem, tryb ciągły na kompaktowym spektrofluorometrze
<ol>
	<li>Umieścić mieszaninę agregacyjną w probówkach Eppendorfa o pojemności 1,5 ml, jak pokazano w Tabeli 3. Każda kolumna reprezentuje składniki potrzebne do reakcji 200 μl, co wystarcza na jeden pomiar punktu czasowego.</li>
	<li>Odwróć rurkę kilka razy, aby wymieszać.</li>
	<li>Włącz spektrofluorometr i ustaw oprogramowanie jak w krokach 2.3 i 2.4.</li>
	<li>Przenieś całą mieszaninę do kuwety. Umieścić kuwetę w uchwycie na próbkę w komorze na próbkę i zamknąć pokrywę. Kliknij przycisk Uruchom, aby zebrać dane dotyczące fluorescencji. Zapisz dane.</li>
	<li>Kontynuuj czytanie w odpowiednich odstępach czasu, klikając przycisk Uruchom i rejestrując dane. Jeśli agregacja ma być monitorowana z wysoką częstotliwością (np. co 30 lub 60 sekund), należy pozostawić reakcję w kuwecie i w maszynie do czasu zakończenia pomiaru lub gdy jest wystarczająco dużo czasu na wymianę reakcji lub kuwet.</li>
	<li>Wyjmij kuwetę i zdekantuj roztwór. Opłucz kuwetę wodą destylowaną 3 razy. Wysuszyć, wdmuchując powietrze do i na zewnątrz kuwety.</li>
</ol>

Nie mamy nic do ujawnienia.

Protokół ten demonstruje różne warunki testowe i instrumenty, które wykrywają zależną od fosforylacji kinetykę szybkiej agregacji tau. W teście końcowym barwnik fluorescencyjny ThT dodaje się do części reakcji usuniętej z mieszanki wzorcowej w każdym punkcie czasowym. Następnie mierzy się fluorescencję indukowaną wiązaniem amyloidu 26. W drugim, z trybem barwnikowym, agregacja tau odbywa się w obecności ThT lub ThS, co sprawia, że ten rodzaj reakcji nadaje się do automatycznej oceny wzrostu agregatów tau w cza...

Choroba Alzheimera (AD) jest jednym z dużego zbioru zaburzeń neurodegeneracyjnych znanych jako tauopatie. Kwintesencją patologii leżącej u podstaw tauopatii są splątki neurofibrylarne, NFT, w neuronach, astrocytach i mikrogleju 1-4. Gęstość NFT koreluje z upośledzeniem funkcji poznawczych 3,5 i utratą neuronów 6. NFT zawiera głównie hiperfosforylowane białko tau (zwane dalej "p-tau"), które tworzy proste lub sparowane włókna spiralne (PHF) 7,8. Tau jest białkiem związanym z mikrotubulami, które ułatwia transport aksonalny, który jest niezbędny do sygnalizacji neuronalnej i transportu 9,10. Każda cząsteczka tau zawiera od 2 do 3 fosforanów w normalnym mózgu, ale zawartość fosforylu wzrasta kilkakrotnie u pacjentów z tauopatią. Wiele kinaz może przyczyniać się do hiperfosforylacji tau, w tym GSK3β (kinaza syntazy glikogenu 3β) i CDK5 (kinaza zależna od cykliny 5) 12,13, ale bezpośredni czynnik wywołujący patologiczną fosforylację pozostaje nieuchwytny 14. Nieprawidłowa fosforylacja w motywach wiążących mikrotubule lub w ich pobliżu dysocjuje tau od mikrotubuli 15 i powoduje błędną lokalizację tau w przedziale somatodendrytycznym, gdzie p-tau oligomeryzuje się w proste lub sparowane spiralne włókna, które mogą ostatecznie polimeryzować w inkluzje NFT. Ścisły związek między hiperfosforylacją tau, tworzeniem NFT i neurodegeneracją doprowadził do powszechnej hipotezy, że splątki p-tau wywołują apoptozę i inne reakcje cytotoksyczne, a zatem są podstawową przyczyną neurodegeneracji tauopatii 16,17. Uruchomiono badania przesiewowe leków i wczesne testy kliniczne oparte na tym założeniu 18 . Hipoteza ta napotyka jednak na wyzwania 19,20. Na przykład SantaCruz i in. wykazali, że funkcje poznawcze transgenicznych myszy można poprawić poprzez tłumienie ekspresji zmutowanego ludzkiego tau, mimo że NFT nadal tworzyły się z istniejących cząsteczek tau 21. W modelu Drosophila wykazano, że NFT sekwestruje toksyczne cytozolowe tau w celu ochrony leżących pod spodem komórek neuronalnych 22,23. Oczywiste jest, że rola patogenezy NFT, jeśli w ogóle będzie miała miejsce, będzie miała ogromny wpływ na kierunek rozwoju terapii tauopatycznych.
W wysokich stężeniach, rekombinowane lub normalne białko tau w mózgu spontanicznie, ale powoli polimeryzuje do struktury podobnej do PHF in vitro, na co wskazuje wiązanie kilku preferowanych przez arkusze β barwników fluorescencyjnych, mikroskopia elektronowa i spektroskopia rozpraszania światła 24-27. Dodanie heparyny lub kwasu arachidonowego, kwasu tłuszczowego występującego w dużych ilościach w ludzkim mózgu, drastycznie przyspiesza tworzenie PHF w sposób zależny od izoformy tau i stężenia induktora 28-32. Co ciekawe, hiperfosforylowane tau oczyszczone z mózgów AD lub przygotowane w wyczerpujących reakcjach fosforylacji in vitro agreguje szybciej i wydajniej 26,33-35. Wyniki te są doskonale zgodne z patologiczną rolą p-tau. System in vitro oparty na agregacji p-tau może zatem służyć jako potężne narzędzie do badań przesiewowych leków w kierunku choroby Alzheimera.
Biorąc pod uwagę ścisły związek między agregacją tau a postępującą neurodegeneracją AD, a także niedawne niepowodzenie w rozwoju leków ukierunkowanych na płytkę Aβ, kolejny kluczowy marker histologiczny AD 36-38, zainteresowanie odkrywaniem leków kontrolujących agregację tau rośnie. Rzeczywiście, kilka grup rozpoczęło już badania przesiewowe leków o różnej przepustowości, wykorzystując reakcje agregacji tau in vitro jako test podstawowy. Stwierdzono, że wiele substancji chemicznych wykazuje działanie hamujące lub odwracające agregację tau in vitro 39-42. Jednak wszystkie obecne badania przesiewowe regulatorów agregacji tau wykorzystują niezmodyfikowane tau, które pomija kluczowy patologiczny znak fosforylacji, co budzi obawy o specyficzność i skuteczność stosowania tych związków w leczeniu AD.
Jedną z głównych przeszkód w rozwoju testów agregacyjnych do charakterystyki biochemicznej i badań przesiewowych leków AD jest produkcja wystarczających ilości patoficzologicznie istotnego hiperfosforylowanego białka tau. Korzystając z systemu katalizy wspomaganego zamkami błyskawicznymi, w którym izoforma 1N4R tau i kinaza GSK-3β ulegają koekspresji w E. coli jako białka fuzyjne leucyny, pokonaliśmy to wyzwanie (Sui i wsp., przedłożone; patrz rysunek 1 dla końcowych produktów tau i p-tau; patrz również 43 dla wstępnej charakterystyki p-tau za pomocą spektrometrii mas). Z panelu dziewięciu przeciwciał specyficznych dla różnych miejsc fosforylacji tau, pozytywne sygnały zaobserwowano w ośmiu pozycjach (dane nie pokazane). Poniżej opisujemy protokoły i oprzyrządowanie, które mogą różnicować różnice kinetyczne agregacji między niezmodyfikowanymi gatunkami tau i p-tau. Testy te zostały zmodyfikowane na podstawie opublikowanych protokołów, które mierzyły wzrost fluorescencji tioflawiny T (ThT) lub tioflawiny S (ThS) po wiązaniu amyloidu (agregatów tau) 26. W pierwszym "końcowym", bezbarwnym podejściu, reakcje agregacji są łączone i inkubowane pod nieobecność barwnika amyloidowego. W różnych punktach czasowych podwielokrotność każdej reakcji jest usuwana i mieszana z równą objętością buforu zawierającego ThT, aby zatrzymać agregację i umożliwić ThT związanie agregatów tau. Fluorescencję mierzy się za pomocą fluorometru IAP FluoroMax-2. W drugim teście ciągłego monitorowania "z barwnikiem" ThT lub ThS jest uwzględniany w reakcjach agregacji. Fluorescencja może być mierzona w sposób ciągły przez cały czas trwania eksperymentu ręcznie lub za pomocą czytnika wielopłytkowego. Ponadto opisujemy test, który wykorzystuje bliskie fizjologicznemu stężeniu tau i p-tau do agregacji w trybie pomiaru ciągłego. Efekt fosforylacji pozostaje łatwo wykrywalny. Poniżej opiszemy procedury operacyjne krok po kroku i pokażemy reprezentatywne wyniki tych testów. Następnie omówione zostaną niektóre zalety i wady każdego podejścia, a także potencjalne zastosowania badań przesiewowych leków.
Przy wysokim stężeniu, tau spontanicznie agreguje się w struktury podobne do amyloidu. Jednak w laboratorium migotanie tau jest zwykle przyspieszane przez takie induktory, jak heparyna (średnia masa cząsteczkowa, 6,000 g/mol) i kwas arachidonowy. Przykłady przedstawione w niniejszym dokumencie obejmują heparynę 30 μM. Tworzenie agregatów amyloidu tau jest monitorowane przez fluorescencję wynikającą z wiązania amyloidu przez tioflawinę T (ThT) lub tioflawinę S (ThS). Po związaniu się z agregatami tau, ThT wykazuje przesunięcie ku czerwieni we fluorescencji (wzbudzenie: 450 nm; emisja szczytowa: 485 nm). Z drugiej strony ThS ma słabą emisję przy 510 nm (wzbudzenie przy 450 nm) przed wiązaniem amyloidu, ale ta fluorescencja znacznie wzrasta w obecności białka amyloidowego, takiego jak zagregowane tau 44. Oba barwniki dobrze sprawdzają się w wykrywaniu agregacji tau i p-tau. Ze względu na silny i stosunkowo szeroki pik emisyjny ThT (patrz rysunek 2), przy długości fali 510 nm następuje tylko 30% redukcja jednostki fluorescencji. Dla wygody używamy tej samej kombinacji długości fal wzbudzenia/emisji (tj. 450 nm/510 nm) do monitorowania agregacji tau podczas stosowania dowolnego barwnika.
Agregacja Tau może być przeprowadzona w obecności lub braku barwnika, w zależności od celu testu i dostępności białka tau. Oba tryby reakcji pokazano poniżej. Ponadto demonstrujemy działanie dwóch różnych przyrządów – fluorometru jednopróbkowego (ISA-SPEX FluoroMax-2) oraz czytnika wielopłytkowego (SpectraMax M2). Czytniki powinny być w stanie dostosować te protokoły do swoich konkretnych potrzeb i dostępności instrumentów.

<table><tbody><tr><td>Trizma&nbsp; podstawa</td><td>Sigma</td><td>T1503</td><td></td></tr><tr><td>NaCl</td><td>Macron Fine Chemicals</td><td>MAL-7581-06</td><td></td></tr><tr><td>Kwas etylenodiaminotetraoctowy (EDTA)</td><td>Invitrogen</td><td>15576-028</td><td></td></tr><tr><td>Tioflawina T</td><td>Sigma</td><td>T3516</td><td>Przechowywana w ciemnej</td></tr><tr><td>Tioflavinie S</td><td>Sigma</td><td>T1892</td><td>Przechowywana w ciemnej</td></tr><tr><td>heparynie</td><td>Sigma</td><td>H3393</td><td></td></tr><tr><td>DL-Ditiothreitol (DTT)</td><td>Sigma</td><td>D9779</td><td>Przechowywany w temperaturze 4 stopni; C</td></tr><tr><td>96-dołkowa płytka</td><td>Corning</td><td>3917</td><td></td></tr><tr><td>ISA SPEX FluoroMax-2</td><td>Horiba</td><td></td><td></td></tr><tr><td>SpectraMax M2 Multi-Mode Microlate Reader</td><td>Urządzenia</td><td></td><td></td>molekularne</tr><tr><td>Mysz Przeciwciało monoklonalne anty-Tau</td><td>R& Systemy D</td><td>MAB3494</td><td>przechowywane w &ndash; 80 stopni Celsjusza; Z</td></tr></tbody></table>

in vitro testy agregacyjne z użyciem hiperfosforylowanego białka tau

In Vitro Aggregation Assays Using Hyperphosphorylated Tau Protein

Choroba Alzheimera jest jedną z dużej grupy zaburzeń neurodegeneracyjnych znanych jako tauopaty, które objawiają się złogami neuronalnymi hiperfosforylowanego białka tau w postaci splątków neurofibrylarnych (NFT). Gęstość NFT dobrze koreluje z upośledzeniem funkcji poznawczych i innymi objawami neurodegeneracyjnymi, co skłania do opracowania terapii opartych na agregacji tau. Do tej pory jednak testy agregacji tau wykorzystują rekombinowany lub syntetyczny tau, który jest pozbawiony śladów fosforylacji związanych z patologią. Tutaj opisujemy dwa testy, w których jako temat podawane jest rekombinowane, hiperfosforylowane tau. Testy te można zwiększyć w celu uzyskania wysokoprzepustowych badań przesiewowych dla związków, które mogą modulować kinetykę lub stabilność hiperfosforylowanych agregatów tau. Nowatorskie metody leczenia choroby Alzheimera i innych tauopatii mogą zostać potencjalnie odkryte przy użyciu hiperfosforylowanych izoform tau.

Wykorzystując rekombinowane białko tau oraz p-tau (Rysunek 1), opracowaliśmy dwa różne protokoły w celu porównania kinetyki agregacji tau i p-tau, wykorzystując silną emisję fluorescencji ThT i ThS po związaniu z amyloidalnymi agregatami białkowymi, w tym tau i p-tau (Rysunek 2). Zarówno z dodatkiem, jak i bez dodatku barwnika fluorescencyjnego w reakcji agregacji, zaobserwowaliśmy spójne nasilenie agregacji tau przez hiperfosforylację (Rysunki 3–5). Stymulacja ta jest n...

Niezmodyfikowane i hiperfosforylowane białka tau zostały użyte w dwóch testach agregacji in vitro, aby ujawnić kinetykę szybkiej agregacji zależnej od hiperfosforylacji. Testy te torują drogę do przyszłych badań przesiewowych dla związków, które mogą modulować skłonność hiperfosforylowanego tau do tworzenia włókienek, które leżą u podstaw postępu choroby Alzheimera.

In vitro Testy agregacyjne z użyciem hiperfosforylowanego białka Tau

Alzheimer's disease is one of a large group of neurodegenerative disorders known as tauopathies that are manifested by the neuronal deposits of ...

Ogólnym celem niniejszej procedury jest monitorowanie i porównywanie kinetyki agregacji niezmodyfikowanych i hiperfosforylowanych form białka tau. Osiąga się to poprzez najpierw wygenerowanie niezmodyfikowanego i hiperfosforylowanego białka tau za pomocą systemu katalitycznego wspomaganego suwakami (zippers). Drugim krokiem jest przygotowanie testów agregacji tak, aby były one odpowiednie dla każdego z dwóch różnych urządzeń.Proces agregacji białka tau jest monitorowany za pomocą fluorescencji dwóch różnych barwników tioflawinowych: tioflawiny S oraz tioflawiny T. Ostatnim krokiem jest wykreślenie i porównanie krzywych agregacji. Ostatecznie zmiany kinetyczne fluorescencji tioflawiny wynikające z wiązania się z zagregowanymi formami białka tau są wykorzystywane do wykazania zależnego od hiperfosforylacji zwiększenia fibrylizacji białka tau in vitro.Witajcie w naszym artykule JoVE. Testy agregacji in vitro z wykorzystaniem hiperfosforylowanego białka tau. Nazywam się Minko, a eksperymenty zostaną przeprowadzone i zaprezentowane przez way.Do niniejszego protokołu wymagany jest stosunkowo świeży bufor agregacyjny, przygotowany w ciągu ostatniego miesiąca. Bezpośrednio przed użyciem należy dodać DIO trzy etol w stężeniu 1 mM. Wymagany jest również przefiltrowany roztwór zapasowy Theo Flavin tea lub S. Oba roztwory zapasowe mogą być przechowywane w temperaturze -20 °C, natomiast białko w temperaturze -80 °C.Przenieść próbkę na lód, a następnie dostosować jej stężenie za pomocą buforu agregacyjnego, aby zapewnić spójność. Odwirować próbkę w buforze agregacyjnym przy 20 800 G przez 10 minut w temperaturze czterech stopni Celsjusza. Następnie przenieść nadCiecz do innej probówki i przechowywać na lodzie do czasu przygotowania reakcji agregacji.Przygotuj mieszaninę do agregacji w mikroprobówkach wiriówkowych o pojemności 1,5 ml. Zgodnie z tabelą, 100 µl jest wystarczającą ilością dla jednej porcji odczynników. Oblicz całkowitą objętość na podstawie liczby reakcji i zwiększ ją o 10%, aby uwzględnić błędy pipetowania.W razie potrzeby pieprz można zastąpić kwasem raonicznym lub buforem agregacyjnym. Wymieszać reakcje poprzez odwracanie i przenieść je w temperaturze 37 °C bez inkubacji. Co 24 godziny uzupełniać reakcje dodatkową ilością 1 mM DTT, aby zapewnić środowisko redukcyjne niezbędne do pomiaru fluorescencji.Rozgrzewaj fluorymetr spektra przez około 10 minut. Poprawi to spójność pomiarów w oprogramowaniu komputerowym. Wybierz tryb wyświetlania w czasie rzeczywistym znajdujący się w centrum sterowania instrumentem.Ustaw długość fali wzbudzenia na 450 nanometrów z szerokością szczeliny wynoszącą dwa nanometry oraz długość fali emisji na 510 nanometrów z szerokością szczeliny pięciu nanometrów. Następnie wróć do centrum sterowania przyrządem i wybierz analizę przy stałej długości fali. Naciśnij klawisz dodawania w górnej ramce, aby dodać zestaw długości fal.Ustaw parametry akwizycji dla standardowego błędu na jeden, a maksymalną liczbę prób na trzy. Następnie kliknij add. W kolejnym kroku kliknij go, aby otworzyć okno wyświetlania danych.Teraz w oknie wyświetlania danych kliknij „start act”, aby otworzyć okno dialogowe nowej próbki, i wybierz „unknown” jako typ próbki. Następnie przygotuj reakcje, pipetując każdą do 100 µL, składającą się z 98 µL buforu agregującego oraz 2 µL 3 mM flawiny S lub T. Pipetuj mieszaninę kilkakrotnie, aby zapewnić dokładne wymieszanie.Przenieś wszystkie 200 µL jednej mieszaniny do FA three qve i umieść ją w odpowiedniej pozycji. Następnie uruchom pomiar, aby zebrać dane fluorescencyjne. Po usunięciu roztworu z vete, wypłucz go trzykrotnie wodą destylowaną i wysusz strumieniem powietrza. Ten test obejmuje barwnik fluorescencyjny w reakcji aion, co umożliwia pomiary ciągłe i jest lepiej wykonywane za pomocą automatycznego czytnika płytek wielodołkowych.Zastosowanie stałego parametru jest ograniczone szybkością operacji manualnych. Przygotuj mieszaninę agregacyjną w nieprzezroczystej czarnej płytce 96-dołkowej. Przy objętości dołka wynoszącej 360 µL, 200 µL jest wystarczającą ilością dla pomiaru w każdym punkcie czasowym.Każdą reakcję dokładnie wymieszaj, pipetując zawartość. Inkubuj płytkę 96-dołkową w temperaturze 37°C i co 24 godziny dodawaj dodatkowy 1 mM DTT, aby zapewnić środowisko redukujące w każdym punkcie czasowym. Przed wykonaniem pomiaru uruchom wielofunkcyjny czytnik mikro płytek oraz komputer z odpowiednim oprogramowaniem z co najmniej 10-minutowym wyprzedzeniem.Ustaw temperaturę na 37 °C i wybierz tryb intensywności fluorescencji. Następnie ustaw długość fali wzbudzenia na 450 nm oraz długość fali emisji na 510 nm. Wsuń płytkę 96-dołkową do szuflady i naciśnij przycisk odczytu.Po wykonaniu pomiarów należy niezwłocznie umieścić płytkę z powrotem w inkubatorze przed analizą danych; analizę w trybie ciągłym można przeprowadzić przy użyciu kompaktowego spektrofotometru. Przygotować mieszaninę agregującą w probówkach do mikrocentryfugi o pojemności 1,5 ml. Do pomiaru w danym punkcie czasowym wystarczające są reakcje o objętości 200 µl.Odwróć probówki, aby wymieszać zawartość. Przeprowadź reakcje w temperaturze 37 °C lub w temperaturze pokojowej, dodając co 24 godziny dodatkowy 1 mM DTT przed wykonaniem pomiarów. Przygotuj urometr oraz oprogramowanie w taki sam sposób, jak w przypadku testu końcowego bez zastosowania barwnika.Przenieś całą mieszaninę do kuwety i umieść ją w uchwycie na próbki w komorze pomiarowej, a następnie zamknij pokrywę. Kliknij „run”, aby zebrać dane fluorescencji w odpowiednich odstępach czasu. Jeśli odstęp ten jest krótki, na przykład 30 lub 60 sekund, dopuszczalne jest pozostawienie kuwety Q w urządzeniu pomiędzy pomiarami aż do osiągnięcia ostatniego punktu czasowego.Przenieś mieszaninę reakcyjną z vete z powrotem do probówki z próbką, a po zakończeniu procesu umieść probówkę w inkubatorze. Wyczyść vete zgodnie z wcześniejszymi instrukcjami, używając rekombinacyjnej białka tau i p tal. Opracowano dwa różne protokoły w celu porównania kinetyki agregacji tau i p tal, wykorzystując silną emisję fluorescencyjną flawiny t i s po związaniu z agregatami białek amyloidowych, w tym tau i p tal, z zastosowaniem lub bez zastosowania barwnika fluorescencyjnego.W reakcji agregacji zaobserwowano konsekwentne nasilenie agregacji białka tau przez hiperfosforylację. Zazwyczaj poziom T i p tau gwałtownie rośnie w ciągu pierwszych 30 minut, po czym następuje znaczne spowolenie, w tym w przypadku flawiny. T w reakcjach agregacji powoduje istotne opóźnienie szybkości agregacji.Zarówno Theof Flavian s, jak i t osiągnęły plateau po 160 minutach reakcji. Z kolei Bio flavin s nie spowodowały zauważalnego spowolnienia agregacji. Po zastosowaniu tej procedury, z wykorzystaniem tego testu można przeprowadzić dodatkowe badania nad izoformami ośrodkowego układu nerwowego lub innymi białkami podatnymi na agregację w przebiegu neurodegeneracji, takimi jakin, aby zrozumieć wpływ procesów proteinizacji w patogenezie po opracowaniu tej metody.Ta technika przygotowania nadmiaru fosforanowego białka wierzchołkowego PA służy do badań w tej dziedzinie, obejmujących liczne choroby w celu poszukiwania terapii i opracowywania leków.

in-vitro-aggregation-assays-using-hyperphosphorylated-tau-protein

Research

JoVE Journal

Biology

Biologia

In Vitro Testy agregacji z hiperfosforylowaną białkiem Tau

Wideo demonstruje test cytometrii przepływowej rezonansu fluorescencji (FRET) w celu wykrycia aktywności wysiewu agregatów białkowych wyizolowanych z próbek biologicznych. Komórki ssaków wykazujące ekspresję białek reporterowych tau są inkubowane z kompleksami transdukcji liposomów zawierającymi nasiona tau. Nasiona te pośredniczą w agregacji białek reporterowych, prowadząc do generowania dodatniego sygnału FRET w cytometrze przepływowym.

Technika cytometrii przepływowej FRET do wykrywania agregacji białek reporterowych indukowanej nasionami Tau

Ten film prezentuje test komórkowy określający ilościowo wychwyt Tau przez mysi mikroglej przy użyciu wrażliwych na pH, fluorescencyjnie znakowanych agregatów Tau, analizowanych za pomocą sortowania komórek aktywowanych fluorescencją w celu oceny ilościowej.

Test komórkowy do oceny wychwytu białka tau przez mikroglej

Ten film pokazuje ocenę in vitro zapadania się stożka wzrostu neuronów przez agregaty amyloid-β (Aβ). Traktowanie neuronów agregatami Aβ powoduje destabilizację cytoszkieletu, prowadzącą do zapadnięcia się stożków wzrostu na końcach aksonów. Leczone komórki porównuje się z komórkami kontrolnymi w celu oceny stopnia zapadania się stożka wzrostu.

Ocena in vitro zagregowanego β amyloidu na zapadanie się stożka wzrostu neuronów

Ten film pokazuje proces transdukcji ludzkich komórek nerwowych za pomocą lentiwirusa kodującego zmutowane ludzkie białko tau oznaczone żółtym białkiem fluorescencyjnym (YFP) w celu zbadania agregacji białek. Przedstawia etapy od wniknięcia wirusa do ekspresji zmutowanego tau, których kulminacją jest tworzenie widocznych cytoplazmatycznych agregatów tau w neuronach.

Transdukcja ludzkich neuronów za pośrednictwem lentiwirusa do analizy agregacji białka Tau

Opisujemy tutaj metodę identyfikacji wielokrotnych fosforylacji wewnętrznie nieuporządkowanego białka za pomocą spektroskopii magnetycznego rezonansu jądrowego (NMR), używając białka Tau jako studium przypadku. Rekombinowany Tau jest izotopowo wzbogacany i modyfikowany in vitro przez kinazę przed pozyskaniem i analizą danych.

Spektroskopia magnetycznego rezonansu jądrowego do identyfikacji wielokrotnych fosforylacji białek wewnętrznie nieuporządkowanych

Opisany jest skrócony protokół frakcjonowania do wzbogacania nierozpuszczalnych w detergentach agregatów białkowych z ludzkiego mózgu pośmiertnego.

Wzbogacanie nierozpuszczalnych w detergentach agregatów białkowych z ludzkiego mózgu pośmiertnego

Ten manuskrypt opisuje standardowe protokoły pomiaru hiperfosforylacji tau, pomiaru wiązania tau z mikrotubulami oraz lokalizacji wewnątrzkomórkowego tau po leczeniu farmakologicznym. Protokoły te mogą być stosowane wielokrotnie do badań przesiewowych leków lub innych związków, które są ukierunkowane na hiperfosforylację tau lub wiązanie mikrotubul.

Test fosforylacji i wiązania mikrotubul wraz z lokalizacją białka Tau w komórkach raka jelita grubego

Test agregacji tau opisany w tym manuskrypcie naśladuje przewidywane cechy błędnego fałdowania i agregacji tau in vivo.

In vitro Test do badania agregacji białka tau i badań przesiewowych leków

Tutaj opisujemy test komórkowy do ilościowej oceny wychwytu tau przez mikroglej w celu stworzenia narzędzia badawczego do lepszego scharakteryzowania mechanizmów działania przeciwciał anty-tau.

Test komórkowy do badania klirensu Tau za pośrednictwem przeciwciał przez mikroglej

Ten protokół szczegółowo opisuje procedurę, w której ludzkie kultury neuronalne są transdukowane za pomocą lentiwirusowych konstruktów kodujących zmutowane ludzkie tau. Transdukowane kultury wykazują agregaty tau i związane z nimi patologie.

Model in vitro do badania agregacji tau za pomocą transdukcji ludzkich neuronów za pośrednictwem lentiwirusa

Tau jest białkiem neuronalnym obecnym zarówno w cytoplazmie, gdzie wiąże mikrotubule, jak i w jądrze, gdzie pełni niekonwencjonalne funkcje, w tym modulację genów związanych z chorobą Alzheimera. W tym miejscu opisujemy metodę badania funkcji jądrowego Tau przy jednoczesnym wykluczeniu wszelkich zakłóceń pochodzących z cytoplazmatycznego Tau.

Modulacja lokalizacji subkomórkowej Tau jako narzędzie do badania ekspresji genów związanych z chorobą

Poznaj metodę testów agregacyjnych białka Tau in vitro, wykorzystującą hiperfosforylację i fluorescencję barwników tioflawinowych. Technika ta umożliwia badanie kinetyki agregacji i poszukiwanie terapii choroby Alzheimera.

In vitro Testy agregacyjne z użyciem hiperfosforylowanego białka Tau

Przeglądaj więcej filmów