In vitro Testy agregacyjne z użyciem hiperfosforylowanego białka Tau
2 stycznia 2015
Niezmodyfikowane i hiperfosforylowane białka tau zostały użyte w dwóch testach agregacji in vitro, aby ujawnić kinetykę szybkiej agregacji zależnej od hiperfosforylacji. Testy te torują drogę do przyszłych badań przesiewowych dla związków, które mogą modulować skłonność hiperfosforylowanego tau do tworzenia włókienek, które leżą u podstaw postępu choroby Alzheimera.
Ogólnym celem tej procedury jest monitorowanie i porównywanie kinetyki agregacji niezmodyfikowanych i hiperfosforylowanych form białka tau. Osiąga się to poprzez najpierw wygenerowanie niezmodyfikowanego i hiper ufosforylowanego białka tau przez system katalizatora wspomagany zamkami błyskawicznymi. Drugim krokiem jest skonfigurowanie testów agregacji tak, aby były odpowiednie dla jednego z dwóch różnych instrumentów.
Proces agregacji tau jest monitorowany przez fluorescencję dwóch różnych tio. Flawina umiera, flawina S i flawina T. Ostatnim krokiem jest wykreślenie i porównanie krzywych agregacji. Ostatecznie zmiany kinetyczne fluorescencji tioflawiny od wiązania do zagregowanych gatunków TA są wykorzystywane do wykazania zależnego od hiperfosforylacji wzmocnienia migotania tau in vitro.
Cześć.Witamy w naszym artykule JOV. Testy agregacji in vitro z użyciem białka hiper fosfo tau. Nazywam się Minko, a eksperymenty będą przeprowadzane i demonstrowane w sposób niepowtarzalny.
A dla tego protokołu w ciągu ostatniego miesiąca utworzono dość świeży bufor agregacji. Tuż przed użyciem dodaj DIO trzy etol do jednego milimola, również wymagane jest przefiltrowane herbata Theo Flavin lub roztwór podstawowy S. Roztwór podstawowy Heina, zarówno przechowywany w temperaturze minus 20 stopni Celsjusza, jak i białko ręcznika przechowywane w temperaturze minus 80 stopni Celsjusza.
Pociągnij ręcznik po lodzie, a następnie dostosuj jego stężenie za pomocą buforu agregacyjnego zgodnie z wymaganiami dotyczącymi konsystencji. Odwiruj ręcznik z buforem agregacyjnym i 20 800 G przez 10 minut w czterech stopniach Celsjusza. Teraz przenieś supinat do innej probówki i trzymaj go na lodzie, aż nadejdzie czas na złożenie reakcji agregacji.
Ustaw mieszaninę agregacyjną w 1,5-mililitrowych mikrorurkach centrycznych. Zgodnie z tabelą 100 mikrolitrów wystarcza na jedną porcję reagentów. Oblicz całkowitą objętość na podstawie liczby reakcji i zwiększ ją o 10%, aby uwzględnić błędy pipetowania.
W razie potrzeby pieprz można zastąpić kwasem raonowym lub buforem agregacyjnym. Wymieszaj reakcje przez odwrócenie i przenieś je do 37 stopni Celsjusza bez wegetacji. Po każdych 24 godzinach uzupełniaj reakcje dodatkowym jednym milimolowym DTT, aby zapewnić środowisko redukujące do pomiaru fluorescencji.
Rozgrzej fluorymetr widmowy przez około 10 minut. Poprawi to spójność pomiarów w oprogramowaniu komputerowym. Wybierz tryb wyświetlania w czasie rzeczywistym znajdujący się w centrum sterowania instrumentami.
Ustaw długość fali wzbudzenia na 450 nanometrów ze szczeliną na dwóch nanometrach i ustaw długość fali emisji na 510 nanometrów ze szczeliną pięciu nanometrów. Następnie wróć do centrum sterowania instrumentem i wybierz analizę stałej długości fali. Naciśnij dodawania w górnej ramce, aby dodać zestaw długości fal.
Ustaw parametry akwizycji błędu standardowego na jeden, a maksymalną liczbę prób na trzy. Następnie kliknij przycisk dodaj. Następnie kliknij przejdź, aby otworzyć okno wyświetlania danych.
Teraz w oknie wyświetlania danych kliknij na start act, aby otworzyć okno dialogowe nowej próbki i wybierz nieznany jako typ próbki. Następnie przygotuj reakcje, aby wykonać pomiary co 100 mikrolitrów w 98. Mikrolitry buforu agregacyjnego i dwa mikrolitry trzech milimolowych flawiny S lub T kilkakrotnie odpipetować mieszaninę, aby zapewnić dobre wymieszanie.
Przenieś wszystkie 200 mikrolitrów jednej mieszaniny do FA three qve i załaduj ją na miejsce. Następnie liż bieg, aby zebrać dane dotyczące fluorescencji Po usunięciu roztworu z weterynarza spłucz go trzykrotnie wodą destylowaną i wysusz w strumieniu powietrza. Test ten obejmuje barwnik fluorescencyjny w reakcji aionowej, co pozwala na ciągłe pomiary i lepiej jest je wykonać za pomocą automatycznego czytnika płytek matowych.
Zwykły parametr for również działa, jest ograniczony szybkością obsługi ręcznej. Ustaw mieszankę agregacyjną na 96-dołkowej, nieprzezroczystej czarnej płytce. Przy 360 mikrolitrach objętość studni 200 mikrolitrów wystarcza na każdy pomiar punktu czasowego.
Dobrze wymieszać każdą reakcję z pipetowaniem. Inkubować 96-dołkową płytkę w temperaturze 37 stopni Celsjusza i co 24 godziny dodawać dodatkowy jeden milimolowiec DTT, aby zapewnić środowisko redukujące w każdym punkcie czasowym. W celu wykonania pomiaru należy włączyć wielomodowy czytnik mikropłytek i komputer co najmniej 10 minut wcześniej w oprogramowaniu komputerowym.
Ustaw temperaturę na 37 stopni Celsjusza i wybierz tryb intensywności fluorescencji. Następnie ustaw długość fali wzbudzenia na 450 nanometrów, a długość fali emisji na pięć i 10 nanometrów. Włóż płytkę 96-dołkową do pobierania i naciśnij odczytu.
Po wykonaniu pomiarów należy natychmiast zwrócić płytkę do inkubatora przed analizą danych, test w trybie ciągłym można przeprowadzić przy użyciu kompaktowego spektrofotometru do tego testu. Umieść mieszaninę agregacyjną w 1,5-mililitrowych mikroprobówkach wirówkowych. Do zmierzenia punktu czasowego wystarczy 200 mikrolitrów reakcji.
Odwróć probówki, aby wymieszać. Ustaw reakcje w temperaturze 37 stopni Celsjusza lub temperaturze pokojowej i dodawaj dodatkowy jeden milimol DTT co 24 godziny, aby wykonać pomiary. Skonfiguruj urometr i oprogramowanie tak, jak to zrobiono dla testu terminala bez matrycy.
Przenieś całą mieszaninę do weterynarza i umieść ją w uchwycie na próbkę w komorze na próbkę i zamknij pokrywę. Kliknij przycisk uruchom, aby zebrać dane dotyczące fluorescencji w odpowiednich odstępach czasu. Jeśli ten odstęp jest krótki, na przykład 30 lub 60 sekund, można pozostawić weterynarza Q w maszynie między pomiarami, aż do osiągnięcia ostatniego punktu czasu.
Zwróć reakcję z weterynarza do probówki z próbką i zwróć probówkę do inkubatora Po zakończeniu. Odchudź weterynarza zgodnie z wcześniejszymi instrukcjami, używając rekombinowanego tau i P tal. Ustanowiono dwa różne protokoły w celu porównania kinetyki agregacji tau i p tal, wykorzystując silną fluorescencyjną emisję flawonów i s po związaniu się z agregatami białek amyloidowych, w tym tau i p tal, z barwnikiem fluorescencyjnym lub bez niego.
W reakcji agregacji zaobserwowano konsekwentne zwiększanie agregacji tau przez hiperfosforylację. Zazwyczaj T i p tal liga rosną szybko w ciągu pierwszych 30 minut, zanim nastąpi spowolnienie znaczenia, w tym flawiny. T w reakcjach agregacji powodują znaczne opóźnienie szybkości agregacji.
Zarówno Theof Flavian s, jak i t zbliżyły się do plateau po 160 minutach reakcji. Z drugiej strony bioflawiny nie powodowały znaczącego spowolnienia agregacji. Po tej procedurze można wykonać dodatkowe ośrodkowego układu nerwowego do izoform lub innych białek podatnych na agregację w neurodegeneracji, takich jak w teście, aby zrozumieć udział izacji białka w patogenezie po jego rozwoju.
Ta technika przygotowania hiperfosforanowego białka PA sposób na badania w terenie, liczne choroby w celu zbadania naszych terapii i rozwoju leków.
Wyświetl pełny transkrypt i uzyskaj dostęp do tysięcy filmów naukowych
Przegląd
To badanie bada kinetykę agregacji niezmodyfikowanych i hiperfosforylowanych białek tau przy użyciu badań in vitro. Wyniki podkreślają zależne od hiperfosforylacji zwiększenie fibrylacja tau, co jest istotne dla zrozumienia progresji choroby Alzheimera.
Kluczowe elementy badania
Dziedzina nauki
- Neuronauki
- Biochemia
- Badania nad chorobą Alzheimera
Tło
- Białka tau są krytyczne dla stabilizacji mikrotubul w neuronach.
- Hiperfosforylacja tau jest związana z chorobami neurodegeneracyjnymi.
- Zrozumienie agregacji tau jest istotne dla opracowania strategii terapeutycznych.
- Badania in vitro mogą dostarczyć wglądu w kinetykę agregacji tau.
Cel badania
- Porównać kinetykę agregacji niezmodyfikowanych i hiperfosforylowanych białek tau.
- Ustalić metodę do badania związków, które mogą wpływać na agregację tau.
- Wyjaśnić rolę hiperfosforylacji w fibrylacji tau.
Stosowane metody
- Generowanie niezmodyfikowanych i hiperfosforylowanych białek tau przy użyciu systemu katalizy wspomaganej zamkami.
- Ustawianie badań agregacji odpowiednich dla różnych instrumentów.
- Monitorowanie agregacji tau za pomocą fluorescencji barwników tioflawinowych.
- Wykreślanie i porównywanie krzywych agregacji w celu oceny zmian kinetycznych.
Główne wyniki
- Hiperfosforylowane tau wykazuje szybszą kinetykę agregacji w porównaniu z niezmodyfikowanym tau.
- Pomiar fluorescencji koreluje ze wskaźnikami fibrylacja tau.
- Badanie zapewnia ramy dla przyszłego badania związków modyfikujących tau.
- Wyniki przyczyniają się do zrozumienia mechanizmów molekularnych leżących u podstaw choroby Alzheimera.
Wnioski
- Hiperfosforylacja znacząco zwiększa kinetykę agregacji tau.
- Badania in vitro są skuteczne w badaniu zachowania białek tau.
- Przyszłe badania mogą opierać się na tych wynikach, aby eksplorować interwencje terapeutyczne.
Często zadawane pytania
Executive Industry Relevance
This assay enables direct evaluation of hyperphosphorylated tau aggregation kinetics, a key pathological driver in Alzheimer's disease and related tauopathies. By using disease-relevant, post-translationally modified tau, the method improves target validation confidence and supports early de-risking of therapeutic hypotheses. It provides a scalable, quantitative platform for screening compounds that modulate tau fibrillation, aligning with preclinical target engagement and lead identification workflows.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Interrogates the therapeutic hypothesis that hyperphosphorylation drives pathogenic tau aggregation.
- Operational Value: Enables side-by-side comparison of modified and unmodified tau to isolate phosphorylation-dependent effects.
- Predictive Value: Supports target confidence by linking a defined molecular modification to measurable fibrillogenesis.
Screening & Assay Development
- Scientific Value: Uses thioflavin S and T fluorescence to quantitatively monitor aggregation kinetics in real time.
- Operational Value: Compatible with microplate readers and spectrophotometers, enabling scalable, reproducible measurements.
- Assay Readiness: Supports high-throughput adaptation for compound library screening against hyperphosphorylated tau.
Translational & Preclinical Research
- Translational Continuity: Uses recombinant hyperphosphorylated tau to model disease-relevant protein conformation.
- Preclinical Relevance: Provides a mechanistic readout for target engagement in neurodegeneration programs.
- Risk Mitigation: Enables early assessment of compound effects on tau aggregation before cellular or in vivo testing.
Pipeline & Workflow Integration
The assay fits within the early discovery continuum, supporting target validation through mechanistic de-risking and enabling hit identification in screening cascades. Its quantitative output supports go/no-go decisions based on target-specific biochemical activity.
- Discovery Biology: Tests the hypothesis that hyperphosphorylation enhances tau fibrillation, a core mechanism in tauopathy pathogenesis.
- Screening: Generates dose-responsive, kinetic data suitable for evaluating compound effects on aggregation rates.
- Analytics: Produces fluorescence-based aggregation curves that allow comparison of lag time, growth rate, and plateau values.
- Translational Research: Connects biochemical target modulation to disease-relevant protein pathology.
- Enterprise Reuse: Establishes a reusable biochemical assay platform for tau-targeted programs across multiple targets and modalities.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Reduces mechanistic ambiguity by isolating the impact of tau hyperphosphorylation on aggregation.
- Operational Value: Standardized reagent preparation and instrument settings ensure reproducibility across labs and timepoints.
- Strategic Value: Improves prediction of target modulation efficacy, reducing failure risk in later preclinical stages.
- Portfolio Impact: Enables data-driven prioritization of compounds based on target-specific biochemical activity.
Implementation Considerations
- Requires expertise in protein handling, fluorescence spectroscopy, and aggregation assay design.
- Dependent on access to fluorimeters or microplate readers with configurable excitation/emission settings.
- Necessitates standardized reagent preparation, including fresh aggregation buffer and DTT supplementation.
- Must account for variability in protein aggregation behavior across batches and storage conditions.
- Limited to in vitro systems; does not capture cellular clearance, seeding, or neurotoxicity mechanisms.
Biopharma FAQs
Chapters in this video
0:05
Title
1:19
Preparations
2:14
Terminal Assay with No Dye
4:44
Continual Mode Assay Using a Plate Reader With Dye
6:14
Continual Mode Assay Using a Compact Spectrofluorometer With Dye
7:33
Results: Tau Aggregation Assayed by Different Modes and Instruments
8:34
Conclusion
