Name: Krok dalej niż BRET: Fluorescencja przez niezwiązane wzbudzenie z luminescencji (FUEL) (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-05-23T14:45:00.000+00:00
Duration: 7 min 4 s
Description: Poznaj technikę FUEL do generowania fluorescencji przy użyciu bakterii bioluminescencyjnych i nanocząstek luminescencyjnych. Ta metoda umożliwia produkcję czerwonych fotonów na duże odległości bez absorberów.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Autorzy pragną wyrazić swoją wdzięczność za wsparcie finansowe od Fundacji Pasteura z Nowego Jorku (dla J.D., C.S., C.S.), programu EU-FP7 "Automatyzacja" (dla S.L.S.), Programu 11 Instytutu Carnota (dla J.D., A.H., A.R., R.T., S.L.S.) oraz Projektu IMNOS (dla R.T., S.L.S.), Conny-Maeve Charitable Foundation (S.L.S.), European Masters in Molecular Imaging (do IT), programy Region Ile de France MODEXA (S.L.S.), SESAME (S.L.S.) i DimMalInf (S.L.S., R.T.), Anr Program Grandes Investissement de l'avenir Infrastructures Nationales en Biologie-Santé: Francja LifebioImaging (FLI) France Life Imaging (R.T., S.L.S.), France Bioimaging (J.D., S.L.S) oraz Instytut Pasteura w Paryżu. Ponadto autorzy pragną podziękować José Bengoechea i Herbertowi Schweizerowi za odczynniki. Ponadto autorzy chcieliby podziękować Cindy Fevre, która wygenerowała przeciwciała.

1. Odczynniki
<ol>
	<li>Zakup lub opracowanie bakterii luminescencyjnych i odpowiednich pożywek hodowlanych, takich jak zmodyfikowane Escherichia coli wyrażające luksyABCDE21, Vibrio fischeri, Photobacterium sp. Klebsiella pneumoniae22.</li>
	<li>Przygotuj roztwory soli fizjologicznej (0,9% NaCl) i pożywki hodowlane zgodnie ze standardowymi recepturami. E. coli i K. pneumoniae hodowano w Luria Bertani (LB) w temperaturze 37 °C, a V. fischeri i Photobacterium sp w LB uzupełnionym 0,5 M NaCl w temperaturze 22 °C.</li>
	<li>Kup lub kup sondy fluorescencyjne, takie jak Q-tracker 705 (średnica 40 nm, określana jako QD705), Q-tracker 800 (średnica 40 nm, określana jako QD800), fluorescencyjna (średnica 40 nm) i niefluorescencyjne mikrosfery polistyrenowe (średnica 48 nm) oraz konwencjonalne barwniki fluorescencyjne.</li>
	<li>Przygotuj niezbędne odczynniki do znakowania bakterii.</li>
	<li>Zapewnij dostęp do całościowego urządzenia do obrazowania bioluminescencyjnego dla zwierząt, takiego jak IVIS Spectrum, które jest w stanie wykrywać sygnał w szerokim zakresie długości fal emisji i czasów ekspozycji. Czytnik płytek zdolny do pomiarów bioluminescencji wystarczy do większości opisywanych tu eksperymentów.</li>
</ol>
2. Podstawowa rekapitulacja PALIWA
<ol>
	<li>Zaczynając od pojedynczych kolonii na standardowych płytkach hodowlanych, rozpocznij nocne hodowle bakterii luminescencyjnych. Tutaj użyto V. fischeri.</li>
	<li>W dniu eksperymentów zainicjuj nowe subkultury i pozwól im się rozwijać, aż do osiągnięcia OD600 1-1,5. W celu uzyskania porównywalnych wyników najlepiej jest używać bakterii w podobnych stanach wzrostu, w których wytwarzają intensywne sygnały. Można to zapewnić, utrzymując stałą średnicę zewnętrzną600.</li>
	<li>Połączyć podwielokrotności po 100 μl z każdego z 5 μl QD705 lub soli fizjologicznej (PS), a następnie dodać do 895 μl PS do standardowych kuwet spektroskopowych. Umieść napełnione kuwety w IVIS Spectrum i wykonaj pomiary pod odpowiednimi zestawami filtrów. W tym przypadku zastosowano filtr emisji 710-730 nm.</li>
</ol>
3. PALIWO na różnych dystansach
<ol>
	<li>Napełnij dwie plastikowe kuwety fotometryczne o zmniejszonej objętości (1 ml) 50 μl QD705 lub 97,2 μl niefluorescencyjnych mikrosfer polistyrenowych 48 nm o łącznej objętości 1 ml PS. Zapewnia to podobną powierzchnię bryły na całkowitą objętość między dwoma elementami.</li>
	<li>Przygotuj kuwetę źródła światła, przykrywając trzecią kuwetę standardową czarną taśmą lub innym nieprzezroczystym materiałem zdolnym do blokowania światła. Ostrożnie przygotuj dwa identyczne okienka optyczne po przeciwnych stronach kuwety.</li>
	<li>Umieść wcześniej napełnione kuwety bezpośrednio po obu stronach kuwety źródła światła. Dodać 1 ml porcji V. fischeri lub innej kultury (np. luminescencyjnej E. coli lub Photobacterium sp) ze świeżej subkultury do kuwety źródła światła i przykryć ją nieprzezroczystym materiałem, takim jak papier, aby zmniejszyć zanieczyszczenie światłem.</li>
	<li>Wyobraź sobie, że trzy kuwety znajdują się pod odpowiednimi filtrami emisyjnymi, takimi jak filtry emisji Total Light i 710-730 nm, z czasami naświetlania wynoszącymi odpowiednio 10, 30 i 30 sekund.</li>
	<li>Ustaw obie kuwety zewnętrzne w równoważnych dalszych odległościach od kuwety centralnej, a następnie ponownie wyświetl wizualizację. Powtarzaj tę czynność, aż zostanie osiągnięta ostateczna odległość 3 cm od lewej do środkowej lub o zmniejszonej objętości twarzą w twarz. Na każdym etapie należy uzyskać obraz fluorescencyjny (wzbudzenie 450-480 nm, emisja 710-730 nm), aby zweryfikować lokalizację QD705.</li>
</ol>
4. Badanie potencjalnych par paliw
<ol>
	<li>Napełnić dwie kuwety o zmniejszonej objętości roztworami o objętości 1 ml zawierającymi fluorofor lub fluorescencyjną nanocząstkę będącą przedmiotem zainteresowania w jednej z nich, a PS lub PS niefluorescencyjnymi nanocząstkami jako kontrolą ujemną w drugiej. W ramach zademonstrowanych prac zbadano różne potencjalnie dostępne na rynku fluorofory FUEL i nanocząstki fluorescencyjne, jak przedstawiono w tabeli 1.</li>
	<li>Dodać 1 ml podwielokrotności świeżych bakterii V. fischeri lub innych bakterii luminescencyjnych do zaciemnionej trzeciej kuwety zawierającej dwa fizycznie równe okienka optyczne umieszczone po przeciwnych stronach. Przykryj kuwetę nieprzezroczystą substancją, taką jak kawałek czarnego papieru.</li>
	<li>W krótkiej, ale równej odległości umieść dwie kuwety o zmniejszonej objętości po obu stronach zaciemnionej kuwety i wizualizuj je pod odpowiednimi filtrami. Tutaj zastosowano odległość 0,7 cm. Powtórz z pozostałymi fluoroforami.</li>
</ol>
5. Docelowe PALIWO
<ol>
	<li>Przygotować biotynylowane przeciwciała specyficzne dla bakterii luminescencyjnych. Na przykład w tym przypadku pierwszorzędowe przeciwciała specyficzne dla K. pneumoniae (α-Kp) biotynylowano przy użyciu roztworu zawierającego EZ-Link Sulfo-NHS-LC-Biotin.</li>
	<li>Usunąć nadmiar odczynnika z przeciwciał za pomocą kolumn odsalających pod wirowaniem (1 500 x g) przez 2 minuty.</li>
	<li>Użyj standardowego testu Bradforda, aby określić stężenie białka i określić stopień biotynylacji przeciwciał za pomocą testu HABA.</li>
	<li>Otrzymać partie przeciwciał biotynylowanych (Ab) α-Kp-biot przez zmieszanie 100 μl (10 mM, rozpuszczonych w 1x PBS) z 40 μl przeciwciała α-Kp, uzyskując końcowy stopień podstawienia 16 reszt biotyny na Ab i końcowe stężenie białka 10 mg ml-1.</li>
	<li>Korzystając z wielu kultur replikowanych przez noc, celuj w umyte bakterie wyżej wymienionymi przeciwciałami zgodnie z odpowiednim protokołem.
	<ol>
		<li>W szczególności przemyć K. pneumoniae w 1x PBS i ponownie zawiesić w 1x PBS do OD 4 (ok. 4 x 108 CFU ml-1 OD-1).</li>
		<li>Dla każdej kontrpróby inkubować 100 μl PBS, przeciwciał α-Kp (10 μl α-Kp-biotB lub 10 μl PBS dla kontroli) i 100 μl komórek przez 90 minut w temperaturze 30 °C. Przemyć komórki trzykrotnie w 1x PBS i ponownie zawiesić w 196 μl PBS.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Oznacz komórki koniugatem streptawidyny QD705 i podziel je na dwie równoważne objętości.</li>
	<li>Umyj jeden roztwór trzy razy, a następnie ponownie wymieszaj go do odpowiedniej objętości.</li>
	<li>Rozprowadzić 100 μl umytych i nieumytych roztworów do indywidualnych dołków czarnej 96-dołkowej płytki. Zmierz wynikową luminescencję pod filtrami światła całkowitego, 490-510 nm i 710-730 nm. Stężenie fluoroforu można oznaczyć za pomocą wzbudzenia 450-480 nm i emisji 710-730 nm.</li>
</ol>

<ol><li>Hu, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+human+immunodeficiency+virus+type+1+protease+biosensor+assay+using+bioluminescence+resonance+energy+transfer%5BTitle%5D)+AND+%22J+Virol+Methods%22%5BJournal%5D)">A human immunodeficiency virus type 1 protease biosensor assay using bioluminescence resonance energy transfer.</a> J Virol Methods. 128, 93-103 (2005).</li>
<li>Contag, C. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Visualizing+gene+expression+in+living+mammals+using+a+bioluminescent+reporter%5BTitle%5D)+AND+%22Photochem+Photobiol%22%5BJournal%5D)">Visualizing gene expression in living mammals using a bioluminescent reporter.</a> Photochem Photobiol. 66, 523-531 (1997).</li>
<li>Badr, C. E., Tannous, B. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bioluminescence+imaging%3A+progress+and+applications%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+in+Biotechnology%22%5BJournal%5D)">Bioluminescence imaging: progress and applications.</a> Trends in Biotechnology. 29, 624-633 (2011).</li>
<li>Maywood, E. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Analysis+of+core+circadian+feedback+loop+in+suprachiasmatic+nucleus+of+mCry1-luc+transgenic+reporter+mouse%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+USA%22%5BJournal%5D)">Analysis of core circadian feedback loop in suprachiasmatic nucleus of mCry1-luc transgenic reporter mouse.</a> Proc Natl Acad Sci USA. 110, 9547-9552 (2013).</li>
<li>Condeelis, J., Weissleder, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+Vivo+Imaging+in+Cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Cold+Spring+Harbor+Perspectives+in+Biology%22%5BJournal%5D)">In Vivo Imaging in Cancer.</a> Cold Spring Harbor Perspectives in Biology. , (2010).</li>
<li>Madero-Visbal, R. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bioluminescence+imaging+correlates+with+tumor+progression+in+an+orthotopic+mouse+model+of+lung+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Surgical+Oncology%22%5BJournal%5D)">Bioluminescence imaging correlates with tumor progression in an orthotopic mouse model of lung cancer.</a> Surgical Oncology. 21, 23-29 (2012).</li>
<li>Thalhofer, C. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vivo+imaging+of+transgenic+Leishmania+parasites+in+a+live+host%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">In vivo imaging of transgenic Leishmania parasites in a live host.</a> J Vis Exp. 10, (2010).</li>
<li>Troy, T., Jekic-McMullen, D., Sambucetti, L., Rice, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantitative+comparison+of+the+sensitivity+of+detection+of+fluorescent+and+bioluminescent+reporters+in+animal+models%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Imaging%3A+Official+Journal+of+the+Society+for+Molecular+Imaging%22%5BJournal%5D)">Quantitative comparison of the sensitivity of detection of fluorescent and bioluminescent reporters in animal models.</a> Molecular Imaging: Official Journal of the Society for Molecular Imaging. 3, 9-23 (2004).</li>
<li>Michelini, E., Cevenini, L., Mezzanotte, L., Roda, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Luminescent+probes+and+visualization+of+bioluminescence%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">Luminescent probes and visualization of bioluminescence.</a> Methods Mol Biol. 574, 1-13 (2009).</li>
<li>Branchini, B. R., Ablamsky, D. M., Rosenberg, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chemically+Modified+Firefly+Luciferase+Is+an+Efficient+Source+of+Near-Infrared+Light%5BTitle%5D)+AND+%22Bioconjugate+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Chemically Modified Firefly Luciferase Is an Efficient Source of Near-Infrared Light.</a> Bioconjugate Chemistry. 21, 2023-2030 (2010).</li>
<li>Saito, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Luminescent+proteins+for+high-speed+single-cell+and+whole-body+imaging%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Commun%22%5BJournal%5D)">Luminescent proteins for high-speed single-cell and whole-body imaging.</a> Nat Commun. 3, 1262(2012).</li>
<li>Dragulescu-Andrasi, A., Chan, C. T., De, A., Massoud, T. F., Gambhir, S. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bioluminescence+resonance+energy+transfer+%28BRET%29+imaging+of+protein-protein+interactions+within+deep+tissues+of+living+subjects%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+USA%22%5BJournal%5D)">Bioluminescence resonance energy transfer (BRET) imaging of protein-protein interactions within deep tissues of living subjects.</a> Proc Natl Acad Sci USA. 108, 12060-12065 (2011).</li>
<li>Bacart, J., Corbel, C., Jockers, R., Bach, S., Couturier, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+BRET+technology+and+its+application+to+screening+assays%5BTitle%5D)+AND+%22Biotechnology+Journal%22%5BJournal%5D)">The BRET technology and its application to screening assays.</a> Biotechnology Journal. 3, 311-324 (2008).</li>
<li>So, M. -K., Xu, C., Loening, A. M., Gambhir, S. S., Rao, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Self-illuminating+quantum+dot+conjugates+for+in+vivo+imaging%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">Self-illuminating quantum dot conjugates for in vivo imaging.</a> Nat Biotechnol. 24, 339-343 (2006).</li>
<li>Wu, Q., Chu, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Self-illuminating+quantum+dots+for+highly+sensitive+in+vivo+real-time+luminescent+mapping+of+sentinel+lymph+nodes%5BTitle%5D)+AND+%22Int+J+Nanomedicine%22%5BJournal%5D)">Self-illuminating quantum dots for highly sensitive in vivo real-time luminescent mapping of sentinel lymph nodes.</a> Int J Nanomedicine. 7, 3433-3443 (2012).</li>
<li>Wu, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vivo+far-red+luminescence+imaging+of+a+biomarker+based+on+BRET+from+Cypridina+bioluminescence+to+an+organic+dye%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+USA%22%5BJournal%5D)">In vivo far-red luminescence imaging of a biomarker based on BRET from Cypridina bioluminescence to an organic dye.</a> Proc Natl Acad Sci USA. 106, 15599-15603 (2009).</li>
<li>Piston, D. W., Kremers, G. -J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fluorescent+protein+FRET%3A+the+good%2C+the+bad+and+the+ugly%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+Biochem+Sci%22%5BJournal%5D)">Fluorescent protein FRET: the good, the bad and the ugly.</a> Trends Biochem Sci. 32, 407-414 (2007).</li>
<li>Dragavon, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((in+Imaging%2C+Manipulation%2C+and+Analysis+of+Biomolecules%2C+Cells%2C+and+Tissues%5BTitle%5D)+AND+%22%22%5BJournal%5D)">in Imaging, Manipulation, and Analysis of Biomolecules, Cells, and Tissues.</a> , 790210-790219 (2011).</li>
<li>Dragavon, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vivo+excitation+of+nanoparticles+using+luminescent+bacteria%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences%22%5BJournal%5D)">In vivo excitation of nanoparticles using luminescent bacteria.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences. 109, 8890-8895 (2012).</li>
<li>Holland, A. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vitro+characterization+of+fluorescence+by+unbound+excitation+from+luminescence%3A+Broadening+the+scope+of+energy+transfer%5BTitle%5D)+AND+%22Methods%22%5BJournal%5D)">In vitro characterization of fluorescence by unbound excitation from luminescence: Broadening the scope of energy transfer.</a> Methods. , (2013).</li>
<li>Choi, K. -H., Schweizer, H. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((mini-Tn7+insertion+in+bacteria+with+single+attTn7+sites%3A+example+Pseudomonas+aeruginosa%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Prot%22%5BJournal%5D)">mini-Tn7 insertion in bacteria with single attTn7 sites: example Pseudomonas aeruginosa.</a> Nat. Prot. 1, 153-161 (2006).</li>
<li>Riottot, M. M., Fournier, J. M., Jouin, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Direct+evidence+for+the+involvement+of+capsular+polysaccharide+in+the+immunoprotective+activity+of+Klebsiella+pneumoniae+ribosomal+preparations%5BTitle%5D)+AND+%22Infect+Immun%22%5BJournal%5D)">Direct evidence for the involvement of capsular polysaccharide in the immunoprotective activity of Klebsiella pneumoniae ribosomal preparations.</a> Infect Immun. 31, 71-77 (1981).</li>
<li>Becker, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fluorescence+lifetime+imaging--techniques+and+applications%5BTitle%5D)+AND+%22J+Microsc%22%5BJournal%5D)">Fluorescence lifetime imaging--techniques and applications.</a> J Microsc. 247, 119-136 (2012).</li>
<li>Rogers, K. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Visualization+of+local+Ca2%2B+dynamics+with+genetically+encoded+bioluminescent+reporters%5BTitle%5D)+AND+%22Eur+J+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Visualization of local Ca2+ dynamics with genetically encoded bioluminescent reporters.</a> Eur J Neurosci. 21, 597-610 (2005).</li>
<li>Dubochet, J., McDowall, A. W., Menge, B., Schmid, E. N., Lickfeld, K. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Electron+microscopy+of+frozen-hydrated+bacteria%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Bacteriology%22%5BJournal%5D)">Electron microscopy of frozen-hydrated bacteria.</a> Journal of Bacteriology. 155, 381-390 (1983).</li>
<li>Graham, L. L., Harris, R., Villiger, W., Beveridge, T. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Freeze-substitution+of+gram-negative+eubacteria%3A+general+cell+morphology+and+envelope+profiles%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Bacteriology%22%5BJournal%5D)">Freeze-substitution of gram-negative eubacteria: general cell morphology and envelope profiles.</a> Journal of Bacteriology. 173, 1623-1633 (1991).</li>
<li>Hobot, J. A., Carlemalm, E., Villiger, W., Kellenberger, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Periplasmic+gel%3A+new+concept+resulting+from+the+reinvestigation+of+bacterial+cell+envelope+ultrastructure+by+new+methods%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Bacteriology%22%5BJournal%5D)">Periplasmic gel: new concept resulting from the reinvestigation of bacterial cell envelope ultrastructure by new methods.</a> Journal of Bacteriology. 160, 143-152 (1984).</li>
</ol>

Autorzy deklarują konkurencyjne interesy finansowe. J.D., S.B., K.L.R. i S.L.S. przyczynili się do powstania Europejskiego Patentu EP10290158.4 oraz zgłoszenia patentowego Światowej Organizacji Własności Intelektualnej WO/2011/117847.

Podstawową demonstrację FUEL można osiągnąć po prostu poprzez zmieszanie bakterii luminescencyjnych z fluorescencyjnymi nanocząstkami lub QD. Oba podmioty zostaną fizycznie oddzielone i pozostaną poza jakąkolwiek efektywną odległością RET. Trudniejsza jest optymalizacja sygnału FUEL zarówno in vitro , jak i in vivo. W warunkach in vitro , zarówno z obecnym absorberem optycznym, jak i bez niego, zwykle dodanie nadmiaru fluoroforu będzie wystarczające, aby zmaksymalizować odpowiedź FUEL. Jednak przy wysokich stężeniach zjawiska takie jak wygaszanie statyczne lub kolizyjne mogą prowadzić do utraty sygnału fluorescencyjnego. Wykonanie serii rozcieńczeń poprzez niezależną zmianę stężenia źródła luminescencyjnego i fluoroforu pomoże zoptymalizować pożądane stężenia. Ustalenie i optymalizacja FUEL w stężeniach in vivo jest znacznie trudniejsze i wymaga indywidualnego rozpatrzenia każdego przypadku. Stworzenie stanu, w którym źródło luminescencyjne może uzyskać optyczny dostęp do elementu fluorescencyjnego, może być trudne. W związku z tym, począwszy od bezpośredniego współwstrzykiwania dwóch części, można uzyskać informacje na temat powodzenia FUEL w optymalnych warunkach.
Istnieją standardowe protokoły znakowania bakterii i komórek eukariotycznych jednostkami fluorescencyjnymi, takimi jak seria Alexa i QD. Często wymaga to funkcjonalizacji powierzchni lub aktywacji za pomocą przeciwciał, co może prowadzić do niepożądanych efektów, takich jak zmniejszona żywotność komórek lub zmieniona aktywność metaboliczna. Aby temu zaradzić, ważne jest określenie optymalnej ilości potrzebnego przeciwciała lub czynnika aktywującego, który minimalizuje zaburzenia komórkowe, jednocześnie maksymalizując znakowanie fluorescencyjne. Zastosowanie QD jest korzystne ze względu na ich charakterystycznie szerokie widma wzbudzenia, wąskie i przestrajalne widma emisyjne oraz możliwość dużego przesunięcia Stokesa. Jednak QD mogą być cytotoksyczne i mogą nie być pożądane w niektórych przypadkach.
PALIWO jest zjawiskiem obecnym w wielu eksperymentach BRET13 i ma zastosowanie do różnych źródeł luminescencyjnych i fluorescencyjnych. Do tej pory fotony powstające w wyniku FUEL były uważane za produkt niespecyficznych oddziaływań lub niefortunny sygnał tła wynikający ze źle zaprojektowanych eksperymentów BRET. Tylko dzięki eksperymentom przedstawionym tutaj byliśmy w stanie zidentyfikować użyteczność tego niechcianego sygnału. W pokazanych przykładach bakterie luminescencyjne działają jako rozproszone źródło wzbudzenia, zdolne do wywołania standardowej odpowiedzi fluorescencyjnej z szerokiej gamy jednostek fluorescencyjnych. Ponadto, ze względu na znaczną odległość roboczą, można śmiało stwierdzić, że o ile FUEL można zbudować bez występowania BRET, o tyle generalnie nie można zaobserwować BRET bez udziału FUEL. Co ważne, ze względu na brak wymogu celowania, FUEL może być wykorzystany do wypełnienia luki przestrzennej, która istnieje między BRET a konwencjonalnymi technikami obrazowania całego zwierzęcia.

Genetyczna modyfikacja organizmów, takich jak wirusy 1,2, bakterie3 lub małe ssaki4 w celu wywołania lub konstytutywnego wyrażenia bioluminescencji, była bardzo udana i szeroko zademonstrowana5-7. Bioluminescencja, reakcja chemiluminescencyjna in vivo z udziałem naturalnie występujących odczynników, ma tę zaletę, że wytwarza światło bez konieczności stosowania zewnętrznego źródła światła. W związku z tym obrazowanie bioluminescencyjne nie cierpi z powodu typowych wad automatycznego i niespecyficznego sygnału, który można znaleźć w obrazowaniu fluorescencyjnym8. W związku z tym bioluminescencja ma znaczny stosunek sygnału do szumu, ponieważ każdy wykryty sygnał pochodzi wyłącznie z zamierzonego źródła. Podczas gdy wiele modeli wykorzystywało operon luksa z Photorhabdus luminescens (maksymalna emisja wyśrodkowana między 480 a 490 nm) do zastosowań in vitro i in vivo 9, jego zastosowanie u małych ssaków było problematyczne ze względu na samą naturę warunków obrazowania; Wszechobecne istnienie absorberów optycznych, takich jak hemoglobina, oraz czynników rozpraszających, takich jak tkanki i kości, silnie wpływa na długości fal od niebieskiego do żółtego3. Ekspresja zmodyfikowanej lucyferazy świetlików (maksimum emisji przy 617 nm) została niedawno opracowana i włączona, dostarczając narzędzia, które znacznie pokonuje absorpcję optyczną10, ale nadal podlega efektom rozpraszania.
W odpowiedzi podjęto wiele prób przesunięcia emitowanego sygnału ku czerwieni do pożądanego okna optycznego 650-900 nm, obszaru zminimalizowanej absorpcji i rozproszenia, przy użyciu transferu energii rezonansu bioluminescencji (BRET)11-13. Jako narzędzie poprawiające wykrywanie sygnału, BRET, który wykorzystuje źródło bioluminescencyjne jako donor i dodany fluorofor jako akceptor, odniósł ograniczony sukces. Jako przełomowy przykład tego zjawiska, "samoświecące kropki kwantowe" (SIQDs)14 składają się ze zmodyfikowanych lucyferazy Renilla reniformis związanych z zewnętrzną warstwą polimerowo-lizynową dostępnych na rynku kropek kwantowych (QD). Po dodaniu substratu, wynikowa reakcja bioluminescencyjna indukuje emisję fluorescencji z QD, generując znaczną produkcję czerwonych fotonów. Jednak te SIQD mają ograniczone zastosowanie do wizualizacji in vivo zdarzeń istotnych z fizjologicznego punktu widzenia. To ograniczone zastosowanie jest prawdopodobnie spowodowane trudnościami w powiązaniu podwójnej sondy z narządem, komórką lub genem będącym przedmiotem zainteresowania, ponieważ SIQD nie mogą być kodowane genetycznie i dlatego wymagałyby wtórnej modyfikacji powłoki polimerowej. Aby poprawić ich zastosowanie, ostatnio zastosowano alternatywne SIQD, w których lucyferazy są bezpośrednio związane z rdzeniem luminescencyjnym15. Opierając się na koncepcji SIQD, uzyskano bardziej odpowiedni system BRET poprzez przyłączenie lucyferazy Cypridina do barwnika indocyjaninowego16, który był w stanie specyficznie celować w nowotwory u myszy, wytwarzając jednocześnie znaczne przesunięcie ku czerwieni z 460 nm do 675 nm. Aby przejść nieradiacyjny transfer energii, BRET podlega tym samym podstawowym ograniczeniom, co jego fluorescencyjny odpowiednik: musi istnieć silne nakładanie się widm między emisją donorową a widmami wzbudzenia akceptora, a odległość robocza między dwiema cząstkami musi być rzędu promienia Förstera (5-14 nm w zależności od pary donor-akceptor, o maksymalnej efektywnej odległości dwukrotnie większej niż promień Förstera17). Ta zależność od odległości znacznie ogranicza typy zdarzeń, które można zaobserwować za pomocą BRET jako środka zwiększającego wykrywanie.
Niedawno zidentyfikowano nowe podejście, które zostało zademonstrowane zarówno w warunkach in vitro, jak i in vivo. Opierając się na fundamencie BRET, Fluorescence by Unbound Excitation from Luminescence (FUEL)18,19 wymaga również silnego nakładania się widmowego między składnikami luminescencyjnymi i fluorescencyjnymi. Jednak w przeciwieństwie do BRET, FUEL jest procesem całkowicie radiacyjnym, w którym foton emitowany ze źródła luminescencyjnego jest absorbowany przez optycznie dostępny fluorofor, który następnie emituje foton przesunięty ku czerwieni zgodnie z wydajnością kwantową fluoroforu. Podobnie jak w przypadku BRET, podejście to może być również wykorzystane do przezwyciężenia ograniczeń związanych z obrazowaniem w obecności absorberów optycznych. Wynikowe przesunięcie ku czerwieni zapewnia ogólny wzrost i swoistość wykrywanego sygnału ze względu na zmniejszenie tłumienia i zmniejszenie efektów rozpraszania optycznego. Doniesiono, że FUEL występuje między bioluminescencyjnymi Escherichia coli wyrażającymi operon luksa a QDs 18,19. Chociaż eksperymentalnie są podobne do SIQD, istnieje zasadnicza różnica: w FUEL nie jest konieczne, aby źródło luminescencyjne było fizycznie związane z fluoroforem, co pozwala na kodowanie genetyczne sondy luminescencyjnej. Ze względu na udane wykrycie FUEL między bakteriami luminescencyjnymi a QD, możliwe jest, że technika ta może być stosowana zarówno w przypadku infekcji powierzchownych (skóra), jak i tkanek głębokich (płuca, wątroba), takich jak Staphylococcus aureus i Klebsiellia pneumoniae.
Od czasu raportu o jego eksperymentalnym znaczeniu, FUEL rozwinął się, aby zawierać solidny model matematyczny20, który może być używany do przewidywania akceptowalnych par luminescencyjnych i fluorescencyjnych, a jego zastosowania rozszerzyły się o wykorzystanie do identyfikacji cech fotofizycznych, takich jak wydajność kwantowa. Poniżej opisujemy kilka podstawowych technik PALIWA. Po pierwsze, pokazujemy dowody na to zjawisko zarówno na krótkich (μm), jak i długich (cm) odległościach roboczych, co zasadniczo odróżnia FUEL od BRET. Po drugie, rozszerzamy możliwe pary FUEL, badając szeroką gamę fluoroforów i fluorescencyjnych nanocząstek. Po trzecie, zastosowania FUEL są badane poprzez porównywanie docelowych i niedocelowych par FUEL.

<table><tbody><tr><td>Escherichia coli wyrażający luxABCDE operon&nbsp;</td><td></td><td></td><td>dzięki uprzejmości Jos&eacute; A. Bengoechea za zgodą Herberta P. Schweizera</td></tr><tr><td>Klebsiella pneumoniae 52145&nbsp;</td><td></td><td></td><td>52145 to szczep referencyjny</td></tr><tr><td>Luria Bertani (LB)</td> o serotypie K2<td></td><td></td><td>standardowe podłoże</td></tr><tr><td>hodowlane Q-Tracker 705&nbsp;</td><td>Q21061MP</td><td></td>nauki <td>biologiczne</td></tr><tr><td>Q-Tracker 800</td><td>Nauki biologiczne</td><td></td> Q21071MP <td></td></tr><tr><td>Alexa 555</td><td>Nauki biologiczne</td><td>S21381</td><td></td></tr><tr><td>Alexa 568</td><td>Nauki biologiczne</td><td>S11226</td><td></td></tr><tr><td>Alexa 633</td><td>Nauki biologiczne</td><td>S21375</td><td></td></tr><tr><td>Alexa 700</td><td>Nauki biologiczne</td><td>S21383</td><td></td></tr><tr><td>Mikrosfery niefluorescencyjne</td><td>Polysciences, Inc</td><td>15913</td><td></td></tr><tr><td>Różowe mikrosfery</td><td>Nauki przyrodnicze</td><td>F8887</td><td>Średnica 40 nm</td></tr><tr><td>Żółte mikrosfery Nauki</td><td>przyrodnicze</td><td>F8888</td><td>Średnica 40 nm</td></tr><tr><td>Ivis Spectrum</td><td>PerkinElmer</td><td></td><td></td></tr><tr><td>EZ-Link Sulfo-NHS-LC-Biotyna</td><td>Thermo Scientific Pierce</td><td>21425</td><td></td></tr><tr><td>Kolumny odsalające Zeba Spin 7K MWCO</td>Zestaw testowy <td>Thermo Scientific Pierce</td><td>21425</td><td></td></tr><tr><td>HABA&nbsp;</td><td>Test Thermo Scientific Pierce</td><td>28005</td><td></td></tr><tr><td>Bradford</td><td>Bio-Rad</td><td>500-0201</td><td></td></tr></tbody></table>

krok dalej niż bret: fluorescencja przez niezwiązane wzbudzenie z luminescencji (fuel)

A Step Beyond BRET: Fluorescence by Unbound Excitation from Luminescence (FUEL)

Fluorescencja przez wzbudzenie niezwiązane z luminescencji (FUEL) to proces emisji wzbudzenia radiacyjnego, który powoduje zwiększenie sygnału i kontrastu w in vitro i in vivo. FUEL ma wiele tych samych podstawowych zasad, co bioluminescencyjny rezonansowy transfer energii (BRET), ale znacznie różni się pod względem dopuszczalnych odległości roboczych między źródłem luminescencyjnym a jednostką fluorescencyjną. Podczas gdy BRET jest skutecznie ograniczony do maksymalnie 2-krotności promienia Förstera, zwykle poniżej 14 nm, FUEL może występować w odległościach do μm lub nawet cm przy braku absorbera optycznego. W tym miejscu rozwijamy podstawy i możliwości zastosowania FUEL, dokonując przeglądu odpowiednich zasad stojących za tym zjawiskiem i wykazując jego kompatybilność z szeroką gamą fluoroforów i fluorescencyjnych nanocząstek. Ponadto badana jest użyteczność FUEL ukierunkowanego na przeciwciała. Przedstawione tutaj przykłady dostarczają dowodów na to, że FUEL może być wykorzystywany do zastosowań, w których BRET nie jest możliwy, wypełniając pustkę przestrzenną, która istnieje między BRET a tradycyjnym obrazowaniem całych zwierząt.

Rozszerzanie podstaw i możliwości zastosowania Fluorescencji przez Niezwiązane Wzbudzenie z Luminescencji (FUEL) poprzez badanie odpowiednich zasad i wykazanie jej zgodności z wieloma fluoroforami i warunkami ukierunkowanymi na przeciwciała.

Krok dalej niż BRET: Fluorescencja przez niezwiązane wzbudzenie z luminescencji (FUEL)

Fluorescence by Unbound Excitation from Luminescence (FUEL) is a radiative excitation-emission process that produces increased signal and contrast ...

Ogólnym celem następnego eksperymentu jest wykazanie prostoty paliwa oraz obserwacja generowania czerwonych fotonów w wyniku zdarzeń emisji wzbudzenia radiacyjnego. Osiąga się to poprzez połączenie bakterii bioluminescencyjnych i luminescencyjnych nanocząsteczek w celu produkcji paliwa. Następnie wykorzystuje się czytnik płytek bioluminescencyjnych do obserwacji powstających czerwonych fotonów; uzyskane wyniki pokazują, że znaczna ilość czerwonych fotonów może zostać wyprodukowana, gdy bakterie bioluminescencyjne i kropki kwantowe znajdują się w tym samym roztworze.Na podstawie zaobserwowanego wzrostu strumienia fotonów czerwonych, implikacje tej techniki prowadzą do zakwestionowania paradygmatu przeniesienia wejścia rezydentnego NCE lub Brett. Jest to często zgłaszane w literaturze. Zaczynając od pojedynczych kolonii na standardowych płytkach hodowlanych, należy przygotować nocne kultury bakterii luminescencyjnych.W niniejszym doświadczeniu wykorzystano szczepy Vibrio fischeri w dniu przeprowadzenia eksperymentu. Należy przygotować świeże subkultury i inkubować je do momentu uzyskania gęstości optycznej (OD) przy 600 nm w zakresie od 1 do 1,5. Aby uzyskać porównywalne wyniki, należy używać bakterii w podobnych stadiach wzrostu, w których generują one intensywne sygnały.Połączyć alikwoty o objętości 100 µL z każdego z nich z pięcioma µL sondy fluorescencyjnej QD 7 0 5 lub solą fizjologiczną. Następnie dodać mieszaninę do 895 µL soli fizjologicznej w standardowych kuwetach spektroskopowych. Umieścić wypełnione kuwety w obrazowniku bioluminescencyjnym dla całych zwierząt i przeprowadzić pomiary przy użyciu odpowiednich zestawów filtrów.W tym przypadku do pomiaru emisji w zakresie od 710 do 730 nanometrów zastosowano filtr emisyjny, aby przeprowadzić pomiary paliwa na różnych dystansach. Należy napełnić dwie plastikowe kuwety fotometryczne o zmniejszonej objętości albo 50 µL QD 7 0 5, albo 97,2 µL niefluorescencyjnych mikrosfer polistyrenowych o średnicy 48 nm, w całkowitej objętości 1 mL soli fizjologicznej. Zapewnia to zbliżoną powierzchnię właściwą ciała stałego w przeliczeniu na całkowitą objętość dla obu próbek.Przygotuj źródło światła qve, owijając trzecią qve standardową czarną taśmą lub innym nieprzezroczystym materiałem zdolnym do blokowania światła. Uważnie przygotuj dwa identyczne okna optyczne po przeciwnych stronach vete. Dodaj jedną mililitrową alikwot Vibrio fii lub innej kultury ze świeżej subkultury do vete będącej źródłem światła i przykryj ją nieprzezroczystym materiałem, takim jak czarny papier, aby ograniczyć ewentualne zanieczyszczenie światłem.Następnie umieść wcześniej napełnione kuwety bezpośrednio po obu stronach źródła światła w obrazowniku. Wizualizuj trzy kuwety przy użyciu odpowiednich filtrów emisyjnych, takich jak filtry światła całkowitego oraz emisji od 710 do 730 nanometrów, przy czasach naświetlania wynoszących odpowiednio 10, 30 i 30 sekund. Uzyskaj obraz fluorescencyjny przy wzbudzeniu od 450 do 480 nanometrów i emisji od 710 do 730 nanometrów, aby zweryfikować lokalizację QD 7 0 5.Przesuń oba zewnętrzne detektory Q vet w równych odstępach dalej od centralnego detektora Q Vet. Następnie zwizualizuj i wykonaj obraz fluorescencyjny przed powtórzeniem tego procesu aż do uzyskania końcowej odległości twarzą w twarz wynoszącej trzy centymetry. Napełnij dwie kuwety o zmniejszonej objętości jednym mililitrem roztworów zawierającychy odpowiednio fluorofor lub interesującą nanocząsteczkę fluorescencyjną w jednej oraz sól fizjologiczną z nanocząsteczkami niefluorescencyjnymi jako kontrolę negatywną w drugiej.Dodaj jedną mililitrową alikwot świeżych Vibrio FII lub innych bakterii luminescencyjnych do zaciemnionej trzeciej kuwety zawierającej dwa fizycznie równe okna optyczne znajdujące się po przeciwnych stronach; zakryj kuwetę nieprzezroczystą substancją, taką jak kawałek czarnego papieru, w krótkiej, ale równej odległości. Umieść dwie kuwety o zmniejszonej objętości po obu stronach zaciemnionej kuwety Q i obserwuj pod odpowiednimi filtrami; w tym przypadku zastosowano odległość 0,7 cm. Powtórz procedurę dla pozostałych frakcji qd 7 0 5 z bakteriami.W porównaniu do samych bakterii obserwuje się znaczny wzrost liczby czerwonych fotonów. Kontrolne przenikanie może zachodzić na długich dystansach w przypadku braku jakiegokolwiek absorbenta. Zależność ta od odległości może zostać opisana prawem odwrotnych kwadratów.W przypadku źródeł punktowych. Ukierunkowanie flory fours na błonę bakteryjną zdaje się nie mieć niemal żadnego wpływu na całkowitą ilość generowanego sygnału paliwa. W tym kontekście ukierunkowane paliwo jest utrzymywane nawet po kilku etapach płukania.Po obejrzeniu tego filmu powinni Państwo mieć dobre wyobrażenie o tym, jak przeprowadzić rekonstytucję paliwa w wielu modalnościach w celu generowania czerwonych fotonów z emisji wywołanych wzbudzeniem radiacyjnym.

a-step-beyond-bret-fluorescence-unbound-excitation-from-luminescence

Research

JoVE Journal

Bioengineering

Bioinżynieria

Krok poza BRET: Fluorescencja przez nieograniczane wzbudzenie z luminescencji (FUEL)

Omówiono konstrukcję i działanie złożonego nieliniowego układu optycznego, który wykorzystuje ultraszybkie przełączanie całkowicie optyczne do izolacji sygnałów Ramanowskich od sygnałów fluorescencyjnych. Dzięki zastosowaniu tego układu możliwe jest skuteczne rozdzielenie sygnałów Ramanowskich i fluorescencyjnych przy użyciu energii impulsów oraz mocy średniej, które pozostają bezpieczne biologicznie.

Eliminacja tła fluorescencyjnego w rezonansowej i spontanicznej mikrospektroskopii Ramana

Subkomórkowa lokalizacja białek jest kluczowa dla określenia czasowo-przestrzennej regulacji sygnalizacji komórkowej. W niniejszym opracowaniu opisujemy bimolekularną komplementację fluorescencji (BiFC) jako prostą metodę monitorowania przestrzennych oddziaływań białek w komórce.

Bimolekularna komplementacja fluorescencyjna

Ten film opisuje BiFC-PALM ― połączenie fotoaktywowanej mikroskopii lokalizacyjnej i dwucząsteczkowej komplementacji fluorescencji ― do oceny interakcji białko-białko. BiFC polega na fuzji dwóch fluorescencyjnych fragmentów białek z dwoma oddziałującymi białkami będącymi przedmiotem zainteresowania. Kiedy te dwa białka wchodzą w interakcję, fragmenty są zbliżane do siebie, co pozwala obu częściom połączyć się i odtworzyć funkcjonalne białko fluorescencyjne. Fluorescencja pojedynczego fluoroforu...

Mikroskopia lokalizacji fotoaktywowanej sprzężona z fluorescencją fluorescencji bimolekularnej

Interakcje między białkami są fundamentalne dla wszystkich procesów komórkowych. Korzystając z transferu energii rezonansu bioluminescencyjnego, można monitorować interakcję między parą białek w żywych komórkach i w czasie rzeczywistym. Ponadto można ocenić skutki potencjalnie patogennych mutacji.

Badanie interakcji białko-białko w żywych komórkach za pomocą transferu energii rezonansu bioluminescencyjnego

Opisujemy tutaj ulepszoną metodę transferu energii rezonansu luminescencji (LRET), w której wprowadzamy miejsce rozszczepienia proteazy między miejscem fluoroforu dawcy i akceptora. Modyfikacja ta pozwala na uzyskanie specyficznych sygnałów LRET pochodzących z interesujących nas białek błonowych, co pozwala na badanie białek błonowych bez oczyszczania białek.

Transfer energii rezonansu luminescencyjnego w celu zbadania zmian konformacyjnych w białkach błonowych ulegających ekspresji w komórkach ssaków

Badania biomolekuł in vivo są kluczowe dla zrozumienia funkcji molekularnej w kontekście biologicznym. W tym miejscu opisujemy nowatorską metodę pozwalającą na internalizację biomolekuł fluorescencyjnych, takich jak DNA czy białka, do żywych mikroorganizmów. Przedstawiono i omówiono również analizę danych in vivo zarejestrowanych za pomocą mikroskopii fluorescencyjnej.

Internalizacja i obserwacja biomolekuł fluorescencyjnych w żywych mikroorganizmach za pomocą elektroporacji

Ten protokół opisuje nową technikę obrazowania śródoperacyjnego, która wykorzystuje kompleks rutenu jako źródło chemiluminescencyjnej emisji światła, wytwarzając w ten sposób wysokie proporcje sygnału do szumu podczas obrazowania in vivo. Obrazowanie śródoperacyjne to rozwijająca się dziedzina, która może zrewolucjonizować sposób wykonywania zabiegów chirurgicznych.

Nowatorska technika generowania i obserwacji chemiluminescencji w środowisku biologicznym

Ten artykuł zawiera instrukcje krok po kroku, jak wykonać w pełni poprawione, dokładne pomiary FRET na indywidualnych, swobodnie dyfuzujących biomolekułach za pomocą niedrogiego smfBoxa o otwartym kodzie źródłowym, od włączenia, przez wyrównanie i skupienie, aż po zbieranie i analizę danych.

Wykonywanie precyzyjnych i dokładnych pomiarów fret pojedynczych cząsteczek za pomocą smfBox typu Open-Source

Dostępny jest protokół konfiguracji standardowego konfokalnego laserowo-skaningowego mikroskopu do pomiarów in vivo transferu energii rezonansu Förstera, a następnie oceny danych.

Pomiary rezonansu Förstera transferu energii w żywych komórkach roślinnych

Ten protokół opisuje test oparty na bret do pomiaru interakcji kinazy CRAF z białkami 14-3-3 w żywych komórkach. Protokół określa etapy przygotowania ogniw, odczytu emisji BRET i analizy danych. Przedstawiono również przykładowy wynik wraz z identyfikacją odpowiednich elementów sterujących i rozwiązywaniem problemów w celu optymalizacji testu.

Test oparty na rezonansie bioluminescencyjnym (BRET) do pomiaru oddziaływań CRAF z białkami 14-3-3 w żywych komórkach

Poznaj technikę FUEL do generowania fluorescencji przy użyciu bakterii bioluminescencyjnych i nanocząstek luminescencyjnych. Ta metoda umożliwia produkcję czerwonych fotonów na duże odległości bez absorberów.

Krok dalej niż BRET: Fluorescencja przez niezwiązane wzbudzenie z luminescencji (FUEL)

Przeglądaj więcej filmów