Krok dalej niż BRET: Fluorescencja przez niezwiązane wzbudzenie z luminescencji (FUEL)
23 maja 2014
Rozszerzanie podstaw i możliwości zastosowania Fluorescencji przez Niezwiązane Wzbudzenie z Luminescencji (FUEL) poprzez badanie odpowiednich zasad i wykazanie jej zgodności z wieloma fluoroforami i warunkami ukierunkowanymi na przeciwciała.
Ogólnym celem następnego eksperymentu jest wykazanie prostoty paliwa oraz obserwacja generowania czerwonych fotonów w wyniku zdarzeń emisji wzbudzenia radiacyjnego. Osiąga się to poprzez połączenie bakterii bioluminescencyjnych i luminescencyjnych nanocząsteczek w celu produkcji paliwa. Następnie wykorzystuje się czytnik płytek bioluminescencyjnych do obserwacji powstających czerwonych fotonów; uzyskane wyniki pokazują, że znaczna ilość czerwonych fotonów może zostać wyprodukowana, gdy bakterie bioluminescencyjne i kropki kwantowe znajdują się w tym samym roztworze.
Na podstawie zaobserwowanego wzrostu strumienia fotonów czerwonych, implikacje tej techniki prowadzą do zakwestionowania paradygmatu przeniesienia wejścia rezydentnego NCE lub Brett. Jest to często zgłaszane w literaturze. Zaczynając od pojedynczych kolonii na standardowych płytkach hodowlanych, należy przygotować nocne kultury bakterii luminescencyjnych.
W niniejszym doświadczeniu wykorzystano szczepy Vibrio fischeri w dniu przeprowadzenia eksperymentu. Należy przygotować świeże subkultury i inkubować je do momentu uzyskania gęstości optycznej (OD) przy 600 nm w zakresie od 1 do 1,5. Aby uzyskać porównywalne wyniki, należy używać bakterii w podobnych stadiach wzrostu, w których generują one intensywne sygnały.
Połączyć alikwoty o objętości 100 µL z każdego z nich z pięcioma µL sondy fluorescencyjnej QD 7 0 5 lub solą fizjologiczną. Następnie dodać mieszaninę do 895 µL soli fizjologicznej w standardowych kuwetach spektroskopowych. Umieścić wypełnione kuwety w obrazowniku bioluminescencyjnym dla całych zwierząt i przeprowadzić pomiary przy użyciu odpowiednich zestawów filtrów.
W tym przypadku do pomiaru emisji w zakresie od 710 do 730 nanometrów zastosowano filtr emisyjny, aby przeprowadzić pomiary paliwa na różnych dystansach. Należy napełnić dwie plastikowe kuwety fotometryczne o zmniejszonej objętości albo 50 µL QD 7 0 5, albo 97,2 µL niefluorescencyjnych mikrosfer polistyrenowych o średnicy 48 nm, w całkowitej objętości 1 mL soli fizjologicznej. Zapewnia to zbliżoną powierzchnię właściwą ciała stałego w przeliczeniu na całkowitą objętość dla obu próbek.
Przygotuj źródło światła qve, owijając trzecią qve standardową czarną taśmą lub innym nieprzezroczystym materiałem zdolnym do blokowania światła. Uważnie przygotuj dwa identyczne okna optyczne po przeciwnych stronach vete. Dodaj jedną mililitrową alikwot Vibrio fii lub innej kultury ze świeżej subkultury do vete będącej źródłem światła i przykryj ją nieprzezroczystym materiałem, takim jak czarny papier, aby ograniczyć ewentualne zanieczyszczenie światłem.
Następnie umieść wcześniej napełnione kuwety bezpośrednio po obu stronach źródła światła w obrazowniku. Wizualizuj trzy kuwety przy użyciu odpowiednich filtrów emisyjnych, takich jak filtry światła całkowitego oraz emisji od 710 do 730 nanometrów, przy czasach naświetlania wynoszących odpowiednio 10, 30 i 30 sekund. Uzyskaj obraz fluorescencyjny przy wzbudzeniu od 450 do 480 nanometrów i emisji od 710 do 730 nanometrów, aby zweryfikować lokalizację QD 7 0 5.
Przesuń oba zewnętrzne detektory Q vet w równych odstępach dalej od centralnego detektora Q Vet. Następnie zwizualizuj i wykonaj obraz fluorescencyjny przed powtórzeniem tego procesu aż do uzyskania końcowej odległości twarzą w twarz wynoszącej trzy centymetry. Napełnij dwie kuwety o zmniejszonej objętości jednym mililitrem roztworów zawierającychy odpowiednio fluorofor lub interesującą nanocząsteczkę fluorescencyjną w jednej oraz sól fizjologiczną z nanocząsteczkami niefluorescencyjnymi jako kontrolę negatywną w drugiej.
Dodaj jedną mililitrową alikwot świeżych Vibrio FII lub innych bakterii luminescencyjnych do zaciemnionej trzeciej kuwety zawierającej dwa fizycznie równe okna optyczne znajdujące się po przeciwnych stronach; zakryj kuwetę nieprzezroczystą substancją, taką jak kawałek czarnego papieru, w krótkiej, ale równej odległości. Umieść dwie kuwety o zmniejszonej objętości po obu stronach zaciemnionej kuwety Q i obserwuj pod odpowiednimi filtrami; w tym przypadku zastosowano odległość 0,7 cm. Powtórz procedurę dla pozostałych frakcji qd 7 0 5 z bakteriami.
W porównaniu do samych bakterii obserwuje się znaczny wzrost liczby czerwonych fotonów. Kontrolne przenikanie może zachodzić na długich dystansach w przypadku braku jakiegokolwiek absorbenta. Zależność ta od odległości może zostać opisana prawem odwrotnych kwadratów.
W przypadku źródeł punktowych. Ukierunkowanie flory fours na błonę bakteryjną zdaje się nie mieć niemal żadnego wpływu na całkowitą ilość generowanego sygnału paliwa. W tym kontekście ukierunkowane paliwo jest utrzymywane nawet po kilku etapach płukania.
Po obejrzeniu tego filmu powinni Państwo mieć dobre wyobrażenie o tym, jak przeprowadzić rekonstytucję paliwa w wielu modalnościach w celu generowania czerwonych fotonów z emisji wywołanych wzbudzeniem radiacyjnym.
Przegląd
Niniejsze badanie analizuje technikę fluorescencji indukowanej przez niezwiązane wzbudzenie z luminescencji (FUEL), demonstrując jej kompatybilność z różnymi fluoroforami oraz warunkami z wykorzystaniem przeciwciał celujących. Eksperyment przedstawia generowanie czerwonych fotonów poprzez oddziaływanie bakterii bioluminescencyjnych i nanocząstek luminescencyjnych.
Kluczowe elementy badania
Dziedzina nauki
- Techniki fluorescencyjne
- Bioluminescencja
- Interakcje nanocząsteczek
Wstęp
- FUEL to nowatorska technika fluorescencyjna.
- Wykorzystuje ona bakterie bioluminescencyjne do generowania fotonów.
- Kompatybilność z różnymi fluoroforami jest kluczowa dla jej zastosowania.
- Zrozumienie procesu generowania fotonów może wpłynąć na badania nad fluorescencją.
Cel badania
- Aby zademonstrować prostotę techniki FUEL.
- Aby zaobserwować generowanie czerwonych fotonów w wyniku interakcji bioluminescencyjnych.
- Aby ocenić wpływ techniki FUEL na istniejące paradygmaty fluorescencji.
Zastosowane metody
- Połączenie bakterii bioluminescencyjnych i nanocząsteczek luminescencyjnych.
- Wykorzystanie czytnika płytek bioluminescencyjnych do pomiaru fotonów.
- Przygotowanie roztworów o różnych odległościach w celu obserwacji fotonów.
- Wizualizacja przy użyciu specyficznych filtrów emisyjnych w celu walidacji wyników.
Główne wyniki
- Zaobserwowano znaczną emisję czerwonych fotonów.
- Opisano zależność generowania fotonów od odległości.
- Ukierunkowanie fluoroforów na błony bakteryjne miało minimalny wpływ na sygnał.
- Metoda FUEL może skutecznie działać na dużych odległościach bez udziału absorbentów.
Wnioski
- FUEL jest obiecującą techniką w zastosowaniach fluorescencyjnych.
- Podważa ona istniejące paradygmaty w badaniach nad fluorescencją.
- Dalsze zgłębianie metody FUEL może usprawnić badania nad bioluminescencją.
Najczęściej zadawane pytania
Zastosowanie w przemyśle
FUEL rozszerza odległość roboczą wzbudzenia opartego na luminescencji poza limity nanometrowe BRET, umożliwiając generowanie sygnału w zakresach od mikrometrów do centymetrów bez udziału absorberów. Możliwość ta wypełnia krytyczną lukę przestrzenną w obrazowaniu molekularnym, wspierając zastosowania, w których tradycyjne metody transferu energii są nieskuteczne. W badaniach i rozwoju sektora biofarmaceutycznego FUEL oferuje skalowalne, kompatybilne z etykietowaniem podejście do badania oddziaływań biologicznych w obrębie większych architektur komórkowych lub tkankowych, co usprawnia walidację celów w złożonych systemach.
Strategiczne zastosowania w badaniach i rozwoju biofarmaceutycznym
Wczesna faza odkrywania i walidacja celu
- Wartość naukowa: Umożliwia badanie oddziaływań molekularnych w odległościach niedostępnych dla BRET, co wspiera walidację celów w kontekście rzadkich lub rozproszonych biomarkerów.
- Wartość operacyjna: Wykorzystuje proste mieszanie źródeł bioluminescencyjnych i fluoroforów, co zmniejsza złożoność testu i umożliwia kompatybilność z analizami wysokoprzepustowymi.
- Wartość prognostyczna: Zapewnia ilościowe odczyty fotonów w zakresie czerwieni, które korelują z bliskością sond, pomagając w identyfikacji związków wiodących i ograniczaniu ryzyka mechanistycznego.
Przesiewanie i opracowywanie testów
- Wartość naukowa: Kompatybilność z różnorodnymi fluoroforami i nanocząstkami, co pozwala na elastyczne projektowanie testów dla różnych klas celów.
- Wartość operacyjna: Generowanie sygnału utrzymuje się po etapach płukania, co zapewnia powtarzalną detekcję w próbkach heterogenicznych.
- Gotowość do analizy: Funkcjonuje w standardowej soli fizjologicznej bez konieczności stosowania specjalistycznych buforów, co ułatwia integrację z istniejącymi platformami screeningowymi.
Badania translacyjne i przedkliniczne
- Ciągłość translacyjna: Umożliwia obrazowanie całej próbki na zwiększonych dystansach, co wspiera ekstrapolację z modeli in vitro do in vivo.
- Dopasowanie biomarkerów: FUEL ukierunkowany na przeciwciała utrzymuje sygnał po związaniu, co pozwala na monitorowanie specyficznego oddziaływania z celem w większych skalach przestrzennych.
- Łagodzenie ryzyka: Sygnał zależny od odległości podlega prawu odwrotności kwadratu, zapewniając przewidywalne ramy ilościowe do porównań między badaniami.
Integracja rurociągu i przepływu pracy
FUEL wpisuje się w kontinuum odkrywania leków, od wczesnego screeningu wiązania z celem po walidację przedkliniczną, szczególnie w przypadkach, gdy wymagana jest rozdzielczość przestrzenna wykraczająca poza bliskość molekularną.
- Biologia odkrywcza: Wspiera testowanie hipotez dotyczących lokalizacji celu i tworzenia kompleksów w środowiskach komórkowych, w których sondy mogą nie pozostawać w bezpośrednim kontakcie.
- Przesiewanie: Umożliwia standaryzację testów dzięki regulowanemu w zależności od odległości sygnałowi wyjściowemu, co poprawia odtwarzalność wyników między laboratoriami.
- Analityka: Generuje mierzalny strumień fotonów czerwonych, który można określić za pomocą standardowych obrazerów bioluminescencyjnych, co umożliwia analizę porównawczą różnych warunków.
- Badania translacyjne: Łączy zdarzenia wiązania in vitro z detekcją sygnału na poziomie tkankowym, wspierając walidację biomarkerów w modelach przedklinicznych.
- Ponowne wykorzystanie w przedsiębiorstwie: Wymaga jedynie źródła bioluminescencyjnego i fluoroforu, co czyni tę metodę przenośnym i niskokosztowym rozwiązaniem możliwym do zastosowania w wielu projektach.
Wpływ operacyjny i organizacyjny
- Wartość naukowa: Rozszerza zakres przestrzenny testów opartych na luminescencji, ograniczając liczbę wyników fałszywie ujemnych w przypadku celów o niskiej obfitości lub rozproszonej dystrybucji.
- Wartość operacyjna: Eliminuje konieczność precyzyjnej koniugacji molekularnej lub bliskiego sąsiedztwa, co upraszcza przygotowanie odczynników i zmniejsza zmienność.
- Wartość strategiczna: Zwiększa pewność decyzji o kontynuacji lub przerwaniu badań (go/no-go), umożliwiając wykrycie celów, które unikają detekcji w testach opartych na BRET ze względu na ograniczenia dystansu.
- Wpływ na portfolio: Wspiera priorytetyzację skorygowaną o ryzyko poprzez zapewnienie ortogonalnej walidacji zaangażowania celu w złożonych matrycach biologicznych.
Kwestie związane z wdrożeniem
- Wymaga dostępu do kultur bakterii bioluminescencyjnych lub zmodyfikowanych genetycznie systemów luminescencyjnych.
- Zależne od standardowego sprzętu do obrazowania bioluminescencji z odpowiednimi filtrami emisji przesuniętej w stronę czerwieni (np. 710–730 nm).
- Wymaga optymalizacji stężenia sondy oraz mocy źródła, aby uniknąć nasycenia sygnału na krótkich dystansach.
- Podczas interpretacji intensywności sygnału w zależności od odległości należy uwzględnić prawo odwrotnych kwadratów.
- Ograniczone przez luminescencję tła w próbkach autofluorescencyjnych lub rozpraszających światło, co wymaga zastosowania odpowiednich kontroli.
