Kwantyfikacja przepuszczalności pojedynczych mikronaczyń w izolowanym preparacie płuc szczura z perfuzją krwi

Ogólnym celem tej procedury jest ilościowe określenie przepuszczalności w pojedynczych mikronaczyniach izolowanych płuc szczura przy użyciu metody opartej na fluorescencji. Osiąga się to poprzez najpierw wyizolowanie płuc szczura i perfuzję ich krwią autologiczną. Drugim etapem procedury jest wprowadzenie mikrocewnika lewego przedsionka do małego obszaru płuca w celu wstrzyknięcia flory czteroznakowanej dekstryny.

Następnie, podczas infuzji znakowanej dekstryny, zbierane są obrazy mikronaczyń płucnych. Ostatnim krokiem jest ilościowe określenie przepuszczalności pojedynczych mikronaczyń na podstawie obrazów za pomocą oprogramowania. Ostatecznie wyniki mogą pokazać stopień przepuszczalności mikronaczyń płucnych w różnych warunkach, np. po leczeniu LPS.

Tę procedurę zademonstruje dr Kava Kasami, doktor habilitowany z mojego laboratorium Rozpocznij od wykonania tracheotomii na samcu szczura w potwierdzonej płaszczyźnie znieczulenia chirurgicznego. Użyj kaniuli dotchawiczej PE 90 i zabezpiecz ją szwami. Następnie napełnij serce 100 do 200 jednostkami heparyny za pomocą igły motylkowej o rozmiarze 21.

Odczekaj minutę, a następnie wykrwawij krew. Zbierz krew i odłóż ją na bok z solą fizjologiczną. Napełnij dwie kaniule wykonane z trzymilimetrowej rurki tigon o długości czterech centymetrów i rozszerzonej na jednym końcu.

Teraz wykonaj torakotomię. Wykonaj nacięcie na tyle duże, aby kaniula mogła wejść do prawej komory i wsunąć się w rozszerzone gniazdo jednej kaniuli w kierunku tętnicy płucnej. Zabezpiecz kaniulę szwami.

Użyj tej samej techniki, aby wprowadzić drugą kaniulę do wierzchołka lewej komory w kierunku lewego przedsionka. Zabezpiecz go taśmą pępowinową o szerokości dwóch milimetrów. Teraz usuń przeszkadzające tkanki łączne i usuń długą i sercową wraz z kaniulami.

Przenieś je na szalkę Petriego z przeponową powierzchnią płuca skierowaną do góry, a trzy kaniule są wyrównane. Przenieś wypreparowany preparat do regulowanego stolika wyposażonego w rurkę tigon nr 18 przymocowaną do przetworników ciśnienia, które służą jako rurki wlotowe i wylotowe. Teraz wymieszaj zbiór krwi z równą objętością 5% roztworu albuminy.

Dodaj tę mieszaninę do zbiornika załadowczego. Uruchom pompę z prędkością 14 mililitrów na minutę. Upewnij się, że w wężyku nie ma pęcherzyków powietrza.

W przygotowaniu. Przymocuj tętnicę płucną do rurki wlotowej płuca, a lewą kaniulę przedsionkową do rurki wylotowej. Dokładnie sprawdź, czy w przewodzie nie ma powietrza, a także sprawdź, czy bocznik jest otwarty.

Podłącz kaniulę tchawicy do trzeciego przetwornika ciśnienia. Napompuj płuca za pomocą kaniuli tchawicy 30% tlenu. Utrzymuj płuca na poziomie pięciu centymetrów ciśnienia wody.

Teraz zaciśnij bocznik i uruchom pompę z prędkością 14 mililitrów na minutę. Aby rozpocząć perfuzję płuc podczas perfuzji, wyreguluj pompę tak, aby utrzymać ciśnienie płucne na poziomie około 10 centymetrów wody i utrzymać ciśnienie w lewym przedsionku na poziomie trzech centymetrów wody. Zacznij od przygotowania płuca z krwią.

Najpierw zbuduj cewnik infuzyjny z rurki PE 10 o długości 40 centymetrów wprowadzonej do rurki PE 90 o długości 30 centymetrów. Podłącz drugi koniec rurki PE 10 do igły o rozmiarze 30 przymocowanej do strzykawki o pojemności 1 cm3. Umieścić koniec rurki przymocowanej do płuca powyżej preparatu i przymocować do niego cewnik infuzyjny

Wprowadzić cewnik infuzyjny do lewego przedsionka, a następnie do płuca, aż napotka opór. Nadmierna siła spowoduje uszkodzenie płuc. Prawidłowe nacięcie mikrocewnika ma kluczowe znaczenie, ponieważ każde uszkodzenie płuc przez mikrocewnik zmniejszy powodzenie protokołu.

Następnie napełnij strzykawkę dzwonkami i podłącz ją do pompy. Powoli wlewaj roztwór w ilości 10 mikrolitrów na minutę. Stopniowo miejsce infuzji stanie się blade w porównaniu z resztą płuc, aby utrzymać powierzchnię płuc szybko wilgotną w plastiku, z wyjątkiem miejsca infuzji.

Teraz, aby uwidocznić płuco, utwórz okno podglądu, przymocowując O-ring do 22-milimetrowego szkiełka nakrywkowego. Używając smaru do zaworów odcinających, przymocuj O-ring do uchwytu probówki. Następnie umieść okienko nad miejscem infuzji.

Zakończ konfigurację, przesuwając obiektyw 20 x nad szkiełkiem nakrywkowym i skupiając się na płucu. Nie przewiduje się żadnych zniekształceń wizualnych. Teraz napełnij płuca wybranym roztworem.

W tym przykładzie, po roztworze soli fizjologicznej, jeden mililitr dekstryny sprzężonej z ZI jest podawany do płuc za pomocą pompy strzykawkowej w ciągu 60 minut. Korzystając z oprogramowania do obrazowania, rejestruj jeden obraz na minutę przez godzinę infuzji i kontynuuj nagrywanie podczas kolejnego wymywania Etap przez kolejne 10 minut Po wstrzyknięciu dekstryny Fitz wypłucz ją, podając roztwór dzwonka w płucach przez co najmniej kolejne 10 minut z tą samą szybkością przepływu. Później. Analizując uzyskane obrazy, należy ocenić maksymalną intensywność fluorescencji w obszarze zainteresowania podczas infuzji fit e.

Następnie należy ocenić maksymalną intensywność fluorescencji resztkowej po 10-minutowym wypłukaniu. Zmiany w przepuszczalności naczyń badano za pomocą infuzji fitzy dekstryny po leczeniu lipopolisacharydem bakteryjnym, ponieważ jest to szeroko stosowany model LI.Fluorescencja resztkowa dopasowania e była niska w mikronaczyniach leczonych pierścieniami, ale wysoka u osób leczonych LPS. Ponadto, w porównaniu z infuzją Ringera, infuzja LPS spowodowała znaczne obniżenie wskaźnika przepuszczalności, co sugeruje globalny wzrost przepuszczalności we wszystkich naczyniach w obrębie pola obrazu.

Ponadto, w porównaniu z infuzją Ringera, infuzja LPS spowodowała znaczne obniżenie wskaźnika przepuszczalności, co sugeruje globalny wzrost przepuszczalności we wszystkich naczyniach w obrębie pola obrazu. Po obejrzeniu tego filmu powinien dobrze zrozumieć, jak przygotować izolowane płuca profilaktyczne dla ptaków, wprowadzić mikrocewnik do lewego ogona i określić przepuszczalność w mikro.