Kwantyfikacja przepuszczalności pojedynczych mikronaczyń w izolowanym preparacie płuc szczura z perfuzją krwi

Ogólnym celem niniejszej procedury jest ilościowe określenie przepuszczalności pojedynczych mikronaczyń w izolowanych płucach szczura z wykorzystaniem metody opartej na fluorescencji. W pierwszej kolejności izoluje się płuca szczura, a następnie poddaje je perfuzji autologiczną krwią. Drugim etapem procedury jest wprowadzenie mikrokatetra do lewego przedsionka w niewielkim obszarze płuca w celu infuzji dekstryny znakowanej fluoroforem.

Następnie, podczas infuzji znakowanej dekstryny, gromadzone są obrazy mikro-naczyń płucnych. Ostatnim krokiem jest ilościowe określenie przepuszczalności pojedynczych mikronaczyń na podstawie obrazów przy użyciu oprogramowania. Ostatecznie wyniki mogą wykazać stopień przepuszczalności mikro-naczyń płucnych w różnych warunkach, na przykład po zastosowaniu LPS.

Procedurę tę zaprezentuje dr Kava Kasami, stażysta podoktorski z mojego laboratorium. Rozpocznij od wykonania tracheotomii u samca szczura znajdującego się w potwierdzonej chirurgicznej płaszczyźnie znieczulenia. Użyj kaniuli tchawiczej PE 90 i przymocuj ją szwami. Następnie podaj do serca od 100 do 200 jednostek heparyny, używając igły motylkowej o rozmiarze 21 G.

Odczekaj jedną minutę, a następnie upuść krew. Zbierz krew i odstaw ją wraz z solą fizjologiczną. Wypełnij dwie kaniule wykonane z dętki tigon o średnicy 3 mm i długości 4 cm, rozszerzone na jednym końcu.

Następnie wykonaj torakotomię. Wykonaj nacięcie o wielkości wystarczającej do wprowadzenia kaniuli do prawej komory i wsuń rozszerzony koniec kaniuli w kierunku tętnicy płucnej. Zabezpiecz kaniulę szwami.

Tą samą techniką wprowadź drugą kaniulę do wierzchołka lewej komory w kierunku lewego przedsionka. Zabezpiecz ją taśmą pępowinową o szerokości dwóch milimetrów. Następnie usuń przeszkadzające tkanki łączną i wyjmij płuca oraz serce wraz z kaniulami.

Przenieś je do szalki Petriego tak, aby powierzchnia przeponowa płuca była skierowana do góry, a wszystkie trzy kaniule znajdowały się w jednej linii. Przenieś preparat po sekcji na regulowany stolik wyposażony w rurki Tigon nr 18 podłączone do przetworników ciśnienia, które pełnią funkcję rurek doprowadzających i odprowadzających. Następnie wymieszaj zebraną krew z równą objętością 5% roztworu albuminy.

Dodaj tę mieszaninę do zbiornika zasilającego. Uruchom pompę z przepływem 14 milliliters per minute. Upewnij się, że w przewodach nie ma pęcherzyków powietrza.

Podczas przygotowania połącz tętnicę płucną z wlotową rurką płuca, a kaniulę lewego przedsionka z rurką wylotową. Ponownie sprawdź, czy w przewodach nie ma powietrza, a także upewnij się, że bocznik jest otwarty.

Podłącz kaniulę tchawiczą do trzeciego przetwornika ciśnienia. Napompuj płuca przez kaniulę tchawiczą tlenem w stężeniu 30%. Utrzymuj ciśnienie w płucach na poziomie 5 cm H₂O.

Teraz zacisnąć bypass i uruchomić pompę z przepływem 14 ml/min. Aby rozpocząć perfuzję płuc, dostosować ustawienia pompy tak, aby utrzymać ciśnienie płucne na poziomie około 10 cm H₂O oraz ciśnienie w lewym przedsionku na poziomie 3 cm H₂O. Przystąpić do przygotowania płuca poddanego infuzji krwi.

W pierwszej kolejności należy wykonać cewnik infuzyjny z 40 centymetrowego odcinka rurki PE 10 włożonej do 30 centymetrowego odcinka rurki PE 90. Drugi koniec rurki PE 10 należy połączyć z igłą o rozmiarze 30G przymocowaną do strzykawki o pojemności 1 cc. Przesuń koniec rurki przymocowany do płuca nad preparatem i podłącz do niego cewnik infuzyjny.

Wprowadź cewnik infuzyjny do lewego przedsionka, a następnie do płuca, aż do momentu napotkania oporu. Zbyt duża siła może spowodować uszkodzenie płuca. Prawidłowe wprowadzenie mikrocewnika jest kluczowe, ponieważ jakiekolwiek uszkodzenie płuca przez mikrocewnik obniży skuteczność protokołu.

Następnie napełnij strzykawkę roztworem Ringera i podłącz ją do pompy. Powoli infunduj roztwór z prędkością 10 µL na minutę. Miejsce infuzji będzie stopniowo blednąć w porównaniu z resztą płuca; aby utrzymać powierzchnię płuca w stanie wilgotnym, owiń je folią plastikową, z wyjątkiem miejsca infuzji.

Aby zwizualizować płuco, należy przygotować okno obserwacyjne, mocując o-ring do szkiełka nakrywkowego o średnicy 22 milimetrów. Za pomocą smaru do kurków należy przymocować o-ring do uchwytu do probówek. Następnie należy umieścić okno nad miejscem infuzji.

Zakończ konfigurację, przesuwając obiektyw 20x nad szkiełko nakrywkowe i ustawiając ostrość na płucach. Nie należy spodziewać się zniekształceń obrazu. Teraz wprowadź do płuc wybrany roztwór.

W tym przykładzie, po soli fizjologicznej, jeden mililitr koniugowanej dekstryny ZI jest wprowadzany do płuca za pomocą pompy strzykawkowej w ciągu 60 minut. Za pomocą oprogramowania do obrazowania należy rejestrować jeden obraz na minutę podczas godzinnego wlewu oraz kontynuować rejestrację przez kolejne 10 minut podczas etapu wypłukiwania. Po wprowadzeniu dekstryny FITC należy ją wypłukać, wprowadzając do płuca roztwór Ringera przez co najmniej kolejne 10 minut przy tej samej prędkości przepływu. Później, podczas analizy pozyskanych obrazów, należy ocenić maksymalną intensywność fluorescencji w obszarze zainteresowania podczas wlewu FITC.

Następnie zmierz maksymalną intensywność fluorescencji pozostałej fluorescencji po 10-minutowym wypłukiwaniu. Zmiany przepuszczalności naczyniowej badano za pomocą infuzji FITC-dekstryny po zastosowaniu bakteryjnego lipopolisacharydu, ponieważ jest to powszechnie stosowany model LI. Pozostała fluorescencja FITC była niska w mikronaczyniach traktowanych roztworem Ringera, ale wysoka w tych traktowanych LPS. Co więcej, w porównaniu z infuzją roztworu Ringera, infuzja LPS spowodowała istotną redukcję indeksu przepuszczalności, co sugeruje globalny wzrost przepuszczalności we wszystkich naczyniach w polu obrazu.

Ponadto, w porównaniu z infuzją roztworu Ringera, infuzja LPS spowodowała znaczną redukcję indeksu przepuszczalności, co sugeruje ogólny wzrost przepuszczalności we wszystkich naczyniach w polu obrazowania. Po obejrzeniu tego filmu widz powinien dobrze rozumieć, jak przygotować izolowane płuca ptaków, wprowadzić mikrocewnik do lewego otworu ogonowego oraz określić przepuszczalność w mikrokrażeniu.