Name: Kwantyfikacja przepuszczalności pojedynczych mikronaczyń w izolowanym preparacie płuc szczura z perfuzją krwi (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-06-30T14:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 22 s
Description: Poznaj metodę kwantyfikacji przepuszczalności pojedynczych mikronaczyń w izolowanych płucach szczura z perfuzją krwi. Wykorzystuje się obrazowanie fluorescencyjne FITC-dextranu do badania odpowiedzi naczyń na LPS.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Badania były wspierane przez NIH HL75503 do KP.

Wszystkie eksperymenty przeprowadzone na zwierzętach zostały zatwierdzone przez Institutional Animal Care and Use Committee University of Tennessee Health Science Center.
1. Przewody do perfuzji preparatów płuc szczura
<ol>
	<li>Przygotować układ przewodów z rurek Tygon (#18) do perfuzji krwi, zgodnie z Rysunkiem 1. Podłączyć przetworniki ciśnienia (P23XL) i umieścić przewody na stoliku mikroskopu.</li>
	<li>Ustawić temperaturę kąpieli wodnej na 37 °C.</li>
	<li>Połączyć tymczasowo wlot i wylot płuca za pomocą rurek Tygon.</li>
</ol>
<img alt="Schemat układu izolowanej perfuzji płuc; przedstawia kaniule, przetwornik ciśnienia, pompę i wymiennik ciepła." fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/51552/51552fig1highres.jpg" width="500" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="Rycina 1"> 
Rycina 1. Przewody do perfuzji krwi. Schemat przedstawia układ przewodów użytych do krążenia krwi w preparacie izolowanych płuc. Wskazano również powiązane komponenty, przez które prowadzone są przewody. Dołączono schemat serca i płuc, aby pokazać miejsca połączeń między przewodami a kaniulą tętnicy płucnej (PA) oraz kaniulą lewego przedsionka (LA) (niebieskie przerywane linie).
2. Przygotowanie izolowanych płuc szczura
<ol>
	<li>Zanurzyć szczury (samce szczurów Sprague-Dawley; 250-300 g) w anestezji za pomocą ketaminy (80-100 mg/kg) oraz ksylazyny (5-10 mg/kg). Po upewnieniu się, że zwierzę osiągnęło chirurgiczną płaszczyznę znieczulenia, ułożyć je w pozycji na plecach.</li>
	<li>Wykonać tracheotomię, wprowadzić kaniulę tchawiczą (PE-90) i zabezpieczyć ją szwem chirurgicznym.</li>
	<li>Wprowadzić heparynę (100-200 U) do serca poprzez punkcję serca (igła motylkowa 21 G), odczekać 60 sec i przeprowadzić upuszczenie krwi (~12-15 ml krwi).</li>
	<li>Przygotować dwie kaniule (rurki Tygon, średnica 3 mm; długość 4 cm; jeden koniec rozszerzony) i napełnić je solą fizjologiczną.</li>
	<li>Wykonać torakotomię. Wykonać nacięcie (3 mm) w prawej komorze i wsunąć rozszerzony koniec kaniuli przez nacięcie w kierunku tętnicy płucnej. Zabezpieczyć kaniulę w tętnicy płucnej szwami chirurgicznymi.</li>
	<li>Naciąć (3 mm) szczyt lewej komory i wsunąć rozszerzony koniec drugiej kaniuli przez nacięcie. Poprowadzić kaniulę do lewego przedsionka. Zabezpieczyć kaniulę w lewej komorze za pomocą taśmy pępkowej (szerokość 2 mm).</li>
	<li>Przeprowadzić preparację tkanki łącznej, a następnie usunąć płuco i serce wraz z przyłączonymi kaniulami. Umieścić płuco i serce na szalce Petriego. Przemieścić płuco tak, aby powierzchnia przeponowa znajdowała się na górze. Trzy kaniule powinny być skierowane w tym samym kierunku.</li>
	<li>Umieścić preparat płuca na stoliku, który można przesuwać w kierunkach X-Y. Dowolny stolik dołączony do mikroskopu może zostać zmodyfikowany w celu utrzymania rurek lub, w razie potrzeby, można zbudować specjalny stolik.</li>
</ol>
3. Perfuzja krwi izolowanych płuc szczura
<ol>
	<li>Wymieszać upuszczoną krew z równą objętością roztworu albuminy (5%) i przelać do zbiornika. Uruchomić pompę perystaltyczną i ustawić szybkość przepływu na 14 ml/min. Pozwolić krwi wypełnić przewody.</li>
	<li>Przy otwartym boczniku usunąć tymczasowy konektor wlotowo-wylotowy płuc. Podłączyć kaniulę tętnicy płucnej do wlotu płuc, a kaniulę lewego przedsionka do wylotu. Upewnić się, że w przewodach nie ma pęcherzyków powietrza.</li>
	<li>Podłączyć kaniulę tchawiczą do trzeciego przetwornika ciśnienia (P23XL). Napompować płuca tlenem o stężeniu 30% przez kaniulę tchawiczą i utrzymywać ciśnienie na poziomie 5 cm H2O.</li>
	<li>Zamknąć bocznik za pomocą zacisku, aby rozpocząć perfuzję płuc. Utrzymywać ciśnienie w tętnicy płucnej i lewym przedsionku odpowiednio na poziomie ~10 i 3 cm H2O.</li>
</ol>
4. Przygotowanie płuc do infuzji mikro naczyniowej
<ol>
	<li>Unieś tylny koniec rurki przedłużającej cewnika powyżej poziomu płuca i zabezpiecz go.</li>
	<li>Przygotuj cewnik infuzyjny, wsuwając około 30 cm rurki PE10 o długości 40 cm do rurki PE90 o długości około 30 cm. Połącz odsłonięty koniec rurki PE10 z igłą (30 G) przymocowaną do strzykawki (1 cc).</li>
	<li>Wsuń zestaw cewników do uniesionego tylnego końca rurki przedłużającej. Przeprowadź zestaw cewników przez lewy przedsionek do płuca, aż napotkasz opór. Następnie wsuń sam cewnik PE10 głębiej do płuca, aż napotkasz opór. Należy pamiętać, że zastosowanie nadmiernej siły podczas wprowadzania cewnika spowoduje uszkodzenie płuca.</li>
	<li>Napełnij strzykawkę 1 cc roztworem Ringera i podłącz ją do pompy infuzyjnej. Ustaw prędkość infuzji na 10 µl/min.</li>
	<li>Miejsce infuzji stanie się blade w porównaniu z resztą płuca.</li>
	<li>Zwilż płuco solą fizjologiczną i przykryj je folią spożywczą z otworem wystarczająco dużym, aby pozostawić miejsce infuzji odsłoniętym.</li>
	<li>Nałóż niewielką ilość smaru do kurków na spód pierścienia O-ring (wykonanego na zamówienie), a następnie umieść szkiełko nakrywkowe (#1.5, średnica 22 mm) na spodzie pierścienia O-ring. Delikatnie ustaw pierścień O-ring z nakrywką na miejscu infuzji. Zabezpiecz pierścień O-ring standardowym uchwytem do probówek. Kombinacja szkiełka nakrywkowego i pierścienia O-ring nie zniekształca struktur pęcherzykowych pod nimi, zgodnie z ostatnimi doniesieniami15.</li>
	<li>Ustaw obiektyw (20X) mikroskopu fluorescencyjnego nad pierścieniem O-ring i ustaw ostrość na powierzchni płuca.</li>
</ol>
5. Obrazowanie transportu fluorescencyjnego dekstranu przez naczynia włosowate
<ol>
	<li>Przygotuj mikroskop do obrazowania fluorescencji FITC.</li>
	<li>Wybierz obszar do obrazowania i przejmij obrazy z częstotliwością 1/minutę, korzystając z oprogramowania do akwizycji obrazu.</li>
	<li>Rozpocznij infuzję FITC-dekstranu 20 kD (0.5 mg/ml) za pomocą pompy strzykawkowej. Fluorescencja w naczyniach krwionośnych będzie stopniowo rosnąć, aż osiągnie maksimum. Kontynuuj infuzję przez 60 min.</li>
	<li>Następnie przełącz się na infuzję roztworu Ringera, aby wypłukać fluorescencję z lumenu. Podtrzymuj infuzję przez ponad 10 min. Kontynuuj akwizycję obrazów z częstotliwością 1/min podczas wypłukiwania.</li>
</ol>
6. Analiza obrazu
<ol>
	<li>Otwórz plik z akwizycją obrazu.</li>
	<li>Wyznacz obszary zainteresowania (ROI) na mikronaczyniach w obrębie klatki obrazu.</li>
	<li>Odtwarzaj plik obrazu klatka po klatce i zarejestruj intensywność fluorescencji dla każdego obszaru zainteresowania we wszystkich klatkach.</li>
	<li>Nanieś na wykres zmianę intensywności fluorescencji dla każdego obszaru zainteresowania jako funkcję czasu.</li>
	<li>Ilościowo określ maksymalną intensywność fluorescencji oraz resztkową intensywność fluorescencji po 10 min wypłukiwania.</li>
	<li>Oblicz stosunek maksymalnej do resztkowej intensywności fluorescencji dla każdego obszaru zainteresowania, aby uzyskać wskaźnik przepuszczalności mikronaczyni przed nimi powiązanych.</li>
</ol>

<ol><li>Ware, L. B., Matthay, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+acute+respiratory+distress+syndrome%5BTitle%5D)+AND+%22N+Engl+J+Med%22%5BJournal%5D)">The acute respiratory distress syndrome.</a> N Engl J Med. 342, 1334-1349 (2000).</li>
<li>Matthay, M. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+acute+respiratory+distress+syndrome%5BTitle%5D)+AND+%22J+Clin+Invest%22%5BJournal%5D)">The acute respiratory distress syndrome.</a> J Clin Invest. 122, 2731-2740 (2012).</li>
<li>Bhattacharya, J., Matthay, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Regulation+and+repair+of+the+alveolar-capillary+barrier+in+acute+lung+injury%5BTitle%5D)+AND+%22Annu+Rev+Physiol%22%5BJournal%5D)">Regulation and repair of the alveolar-capillary barrier in acute lung injury.</a> Annu Rev Physiol. 75, 593-615 (2013).</li>
<li>Parthasarathi, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Connexin+43+mediates+spread+of+Ca2%2B-dependent+proinflammatory+responses+in+lung+capillaries%5BTitle%5D)+AND+%22J+Clin+Invest%22%5BJournal%5D)">Connexin 43 mediates spread of Ca2+-dependent proinflammatory responses in lung capillaries.</a> J Clin Invest. 116, 2193-2200 (2006).</li>
<li>Parthasarathi, K., Bhattacharya, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Localized+Acid+instillation+by+a+wedged-catheter+method+reveals+a+role+for+vascular+gap+junctions+in+spatial+expansion+of+Acid+injury%5BTitle%5D)+AND+%22Anat+Rec+%28Hoboken%29%22%5BJournal%5D)">Localized Acid instillation by a wedged-catheter method reveals a role for vascular gap junctions in spatial expansion of Acid injury.</a> Anat Rec (Hoboken). 294, 1585-1591 (2011).</li>
<li>Gorin, A. B., Stewart, P. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Differential+permeability+of+endothelial+and+epithelial+barriers+to+albumin+flux%5BTitle%5D)+AND+%22J+Appl+Physiol+Respir+Environ+Exerc+Physiol%22%5BJournal%5D)">Differential permeability of endothelial and epithelial barriers to albumin flux.</a> J Appl Physiol Respir Environ Exerc Physiol. 47, 1315-1324 (1979).</li>
<li>Boutoille, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((FITC-albumin+as+a+marker+for+assessment+of+endothelial+permeability+in+mice%3A+comparison+with+125I-albumin%5BTitle%5D)+AND+%22Exp+Lung+Res%22%5BJournal%5D)">FITC-albumin as a marker for assessment of endothelial permeability in mice: comparison with 125I-albumin.</a> Exp Lung Res. 35, 263-271 (2009).</li>
<li>Thorball, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((FITC-dextran+tracers+in+microcirculatory+and+permeability+studies+using+combined+fluorescence+stereo+microscopy%2C+fluorescence+light+microscopy+and+electron+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Histochemistry%22%5BJournal%5D)">FITC-dextran tracers in microcirculatory and permeability studies using combined fluorescence stereo microscopy, fluorescence light microscopy and electron microscopy.</a> Histochemistry. 71, 209-233 (1981).</li>
<li>Stevens, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Functional+and+molecular+heterogeneity+of+pulmonary+endothelial+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Am+Thorac+Soc%22%5BJournal%5D)">Functional and molecular heterogeneity of pulmonary endothelial cells.</a> Proc Am Thorac Soc. 8, 453-457 (2011).</li>
<li>Ofori-Acquah, S. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Heterogeneity+of+barrier+function+in+the+lung+reflects+diversity+in+endothelial+cell+junctions%5BTitle%5D)+AND+%22Microvasc+Res%22%5BJournal%5D)">Heterogeneity of barrier function in the lung reflects diversity in endothelial cell junctions.</a> Microvasc Res. 75, 391-402 (2008).</li>
<li>Kandasamy, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Real-time+imaging+reveals+endothelium-mediated+leukocyte+retention+in+LPS-treated+lung+microvessels%5BTitle%5D)+AND+%22Microvasc+Res%22%5BJournal%5D)">Real-time imaging reveals endothelium-mediated leukocyte retention in LPS-treated lung microvessels.</a> Microvasc Res. 83, 323-331 (2012).</li>
<li>Kandasamy, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lipopolysaccharide+induces+endoplasmic+store+Ca2%2B-dependent+inflammatory+responses+in+lung+microvessels%5BTitle%5D)+AND+%22PloS+One%22%5BJournal%5D)">Lipopolysaccharide induces endoplasmic store Ca2+-dependent inflammatory responses in lung microvessels.</a> PloS One. 8, (2013).</li>
<li>Qiao, R. L., Bhattacharya, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Segmental+barrier+properties+of+the+pulmonary+microvascular+bed%5BTitle%5D)+AND+%22J+Appl+Physiol%22%5BJournal%5D)">Segmental barrier properties of the pulmonary microvascular bed.</a> J Appl Physiol. 71, 2152-2159 (1991).</li>
<li>Parthasarathi, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Endothelial+connexin43+mediates+acid-induced+increases+in+pulmonary+microvascular+permeability%5BTitle%5D)+AND+%22Am+J+Physiol+Lung+Cell+Mol+Physiol%22%5BJournal%5D)">Endothelial connexin43 mediates acid-induced increases in pulmonary microvascular permeability.</a> Am J Physiol Lung Cell Mol Physiol. 303, (2012).</li>
<li>Wu, Y., Perlman, C. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+situ+methods+for+assessing+alveolar+mechanics%5BTitle%5D)+AND+%22J+Appl+Physiol+1985%22%5BJournal%5D)">In situ methods for assessing alveolar mechanics.</a> J Appl Physiol 1985. 112, 519-526 (2012).</li>
<li>Kuebler, W. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+novel+signaling+mechanism+between+gas+and+blood+compartments+of+the+lung%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+Clin+Invest%22%5BJournal%5D)">A novel signaling mechanism between gas and blood compartments of the lung.</a> Journal Clin Invest. 105, 905-913 (2000).</li>
</ol>

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Izolowany preparat płuc z perfuzją krwi w połączeniu z obrazowaniem w czasie rzeczywistym stanowi proste narzędzie do określania zmian przepuszczalności w pojedynczych mikronaczyniach płucnych. Zastosowaliśmy tę metodę do zdefiniowania zmian przepuszczalności w odpowiedzi na infuzje LPS. Nasze dane jednoznacznie sugerują, że infuzja LPS spowodowała wzrost przepuszczalności mikronaczyniowej. Co więcej, dane wskazują również, że zmiany przepuszczalności wywołane przez LPS były podobne zarówno w żyłkach, jak i naczyniach wł...

Zwiększona przepuszczalność mikronaczyniowa w płucach prowadzi do rozwoju obrzęku pęcherzyków płucnych i upośledzenia wymiany gazowej i jest główną cechą ostrego uszkodzenia płuc (ALI)1-3. W związku z tym szacunki przepuszczalności naczyń krwionośnych są ważne w określaniu zakresu uszkodzenia płuc i skuteczności proponowanych interwencji terapeutycznych. Analiza grawimetryczna, taka jak stosunek mokrej do suchej płuc bez krwi i współczynnik filtracji mikronaczyniowej, są szeroko stosowanymi metodami do szacowania przepuszczalności4,5. Inne metody obejmują ilościowe określanie retencji sond radioaktywnych lub fluorescencyjnych w tkance płucnej6-8. Jednak powyższe metody wymagają poeksperymentalnego przetwarzania próbek tkanki płucnej w celu wyjaśnienia danych dotyczących przepuszczalności. Ponadto, ponieważ jedno zwierzę może być wykorzystane tylko do jednego protokołu leczenia, do przeprowadzenia pełnego badania może być potrzebna duża liczba zwierząt. Wspólną cechą powyższych metod jest to, że określają one średnią przepuszczalność naczyń krwionośnych dla wszystkich naczyń krwionośnych w próbce tkanki. Wiadomo jednak, że mikro- i makronaczynia płucne różnią się fenotypowo9. W związku z tym reakcje przepuszczalności mogą być również niejednorodne między różnymi segmentami naczyń9,10. W związku z tym ilościowe określenie średniej przepuszczalności wszystkich naczyń płucnych w próbce tkanki może nie odzwierciedlać odpowiednio tej niejednorodności.
W izolowanym preparacie płuc z perfuzją krwi, naczynia krwionośne na powierzchni płuc mogą być widoczne za pomocą mikroskopu pionowego4,11,12. Umożliwia to scharakteryzowanie odpowiedzi w pojedynczych naczyniach, a tym samym zajęcie się dowolną niejednorodnością w odpowiedziach13. Ponadto, wykorzystując obrazowanie fluorescencyjne mikronaczyń, można włączyć testy oparte na fluorescencji. Ponadto mikrocewnik lewego przedsionka może być używany do dostarczania środków i sond fluorescencyjnych do naczyń krwionośnych11,14. Mikrocewnik ogranicza dostarczanie do małego obszaru płuc, narażając w ten sposób tylko naczynia krwionośne w tym regionie na działanie podawanych w infuzji środków i fluoroforów. Pozwala to na wykorzystanie wielu małych obszarów w tym samym płucu do oddzielnych eksperymentów, co prowadzi do ogólnego zmniejszenia liczby zwierząt potrzebnych do badania.
Obrazowanie w czasie rzeczywistym umożliwia uchwycenie dynamicznych zmian we fluorescencji naczyniowej i zewnątrznaczyniowej pojedynczych mikronaczyń izolowanego preparatu płucnego. W ten sposób dla każdego mikronaczynia w polu obrazu można zarejestrować zmiany fluorescencji podczas infuzji fluoroforów i zmywania oraz określić ilościowo offline14. Korzystając z wartości maksymalnej i resztkowej fluorescencji naczyniowej, można określić wskaźnik przepuszczalności dla każdego mikronaczynia w polu obrazowania. Aby określić zmiany przepuszczalności w odpowiedzi na czynniki zapalne lub uszkadzające, można najpierw podać pożądany środek, a następnie określić wskaźnik przepuszczalności. Ponadto pole obrazu można ustawić w dowolnym miejscu w obszarze płuc podawanym przez mikrocewnik, co zapewnia wysoki stopień elastyczności w doborze pożądanej sieci naczyniowej. W związku z tym izolowany preparat płuc z perfuzją krwi w połączeniu z obrazowaniem w czasie rzeczywistym stanowi atrakcyjny model eksperymentalny do ilościowego określania przepuszczalności w pojedynczych mikronaczyniach płucnych.

<table><tbody><tr><td>Tygon Rurka</td><td>Fisher Scientific</td><td></td><td>#18</td></tr><tr><td>Przetwornik ciśnienia</td><td>Data Sciences International</td><td>P23XL</td><td>Potrzebna ilość 3</td></tr><tr><td>Igła motylkowa</td><td>Greiner Bio-One</td><td>450081</td><td>21 G</td></tr><tr><td>Pompa perystaltyczna</td><td>Cole</td><td>Parmer Masterflex L/S</td><td></td></tr><tr><td>PE-90</td><td>rurka Becton Dickinson</td><td>427421</td><td>30 cm potrzebna</td></tr><tr><td>Rurka PE-10</td><td>Becton Dickinson</td><td>427401</td><td>potrzebna 40 cm</td></tr><tr><td>Pompa strzykawkowa</td><td>O-ring</td><td></td> Braintree Scientific BS8000 <td></td></tr><tr><td></td><td>Wykonane na zamówienie z otworem o średnicy 20 mm i uchwytem do mocowania O-ringu do uchwytu</td>Pionowy mikroskop fluorescencyjny Olympus America BX61WI Oprogramowanie do akwizycji obrazów Urządzenia molekularne Metamorph <td></td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>FITC Dextran 20KD</td><td>Sigma Aldrich</td><td></td><td>0,5 mg/ml (można wybrać dekstran o różnej wielkości cząsteczki, jeśli doświadczenia próbne wskazują na jego przydatność na podstawie obliczonych wartości wskaźnika przepuszczalności)&nbsp;</td></tr><tr><td>Lipopolisacharyd</td><td>Sigma Aldrich</td><td></td><td>Serotyp 0111:B4</td></tr></tbody></table>

kwantyfikacja przepuszczalności pojedynczych mikronaczyń w izolowanym preparacie płuc szczura z perfuzją krwi

Quantifying Single Microvessel Permeability in Isolated Blood-perfused Rat Lung Preparation

Izolowany preparat płucny z perfuzją krwi jest szeroko stosowany do wizualizacji i definiowania sygnalizacji w pojedynczych mikronaczyniach. Dzięki połączeniu tego preparatu z obrazowaniem w czasie rzeczywistym, możliwe staje się określenie zmian przepuszczalności w poszczególnych mikronaczyniach płucnych. W tym artykule opisujemy kroki izolowania płuc szczura i perfuzji ich krwią autologiczną. Następnie przedstawiamy kroki, które należy wykonać, aby wprowadzić fluorofory lub środki za pomocą mikrocewnika do małego obszaru płuc. Korzystając z opisanych procedur, określiliśmy wzrost przepuszczalności mikronaczyń płuc szczura w odpowiedzi na wlewy lipopolisacharydu bakteryjnego. Dane ujawniły, że lipopolisacharyd zwiększył wyciek płynu zarówno w odcinkach mikronaczyń komorowych, jak i włosowatych. W związku z tym metoda ta umożliwia porównanie odpowiedzi przepuszczalności między segmentami naczyniowymi, a tym samym zdefiniowanie dowolnej niejednorodności odpowiedzi. Podczas gdy powszechnie stosowane metody określania przepuszczalności płuc wymagają przetwarzania końcowego próbek tkanki płucnej, zastosowanie obrazowania w czasie rzeczywistym eliminuje ten wymóg, co wynika z obecnej metody. W związku z tym izolowane przygotowanie płuc w połączeniu z obrazowaniem w czasie rzeczywistym ma kilka zalet w porównaniu z tradycyjnymi metodami określania przepuszczalności mikronaczyniowej płuc, a jednocześnie jest metodą prostą do opracowania i wdrożenia.

Izolowany preparat płuca z perfuzją krwi, połączony z przewodami perfuzyjnymi i powiązanym sprzętem, przedstawiono na Rysunku 2. W celach demonstracyjnych wykorzystano szczura rasy Sprague Dawley, choć opisane tutaj procedury można zastosować u każdego gatunku szczura. Infuzje poprzez mikrocewnik przedsionka lewego docierają tylko do niewielkiego obszaru płuca. Obszar poddany infuzji można zidentyfikować po wywołanym infuzją odbarwieniu (Rysunek 3). Preparat płuca w pozycji do obrazowani...

Izolowany preparat płucny z perfuzją krwi umożliwia wizualizację sieci mikronaczyń na powierzchni płuc. W tym miejscu opisujemy podejście do ilościowego określania przepuszczalności pojedynczych mikronaczyń w izolowanych płucach za pomocą obrazowania fluorescencyjnego w czasie rzeczywistym.

Kwantyfikacja przepuszczalności pojedynczych mikronaczyń w izolowanym preparacie płuc szczura z perfuzją krwi

The isolated blood-perfused lung preparation is widely used to visualize and define signaling in single microvessels. By coupling this preparation with ...

Ogólnym celem niniejszej procedury jest ilościowe określenie przepuszczalności pojedynczych mikronaczyń w izolowanych płucach szczura z wykorzystaniem metody opartej na fluorescencji. W pierwszej kolejności izoluje się płuca szczura, a następnie poddaje je perfuzji autologiczną krwią. Drugim etapem procedury jest wprowadzenie mikrokatetra do lewego przedsionka w niewielkim obszarze płuca w celu infuzji dekstryny znakowanej fluoroforem.Następnie, podczas infuzji znakowanej dekstryny, gromadzone są obrazy mikro-naczyń płucnych. Ostatnim krokiem jest ilościowe określenie przepuszczalności pojedynczych mikronaczyń na podstawie obrazów przy użyciu oprogramowania. Ostatecznie wyniki mogą wykazać stopień przepuszczalności mikro-naczyń płucnych w różnych warunkach, na przykład po zastosowaniu LPS.Procedurę tę zaprezentuje dr Kava Kasami, stażysta podoktorski z mojego laboratorium. Rozpocznij od wykonania tracheotomii u samca szczura znajdującego się w potwierdzonej chirurgicznej płaszczyźnie znieczulenia. Użyj kaniuli tchawiczej PE 90 i przymocuj ją szwami. Następnie podaj do serca od 100 do 200 jednostek heparyny, używając igły motylkowej o rozmiarze 21 G.Odczekaj jedną minutę, a następnie upuść krew. Zbierz krew i odstaw ją wraz z solą fizjologiczną. Wypełnij dwie kaniule wykonane z dętki tigon o średnicy 3 mm i długości 4 cm, rozszerzone na jednym końcu.Następnie wykonaj torakotomię. Wykonaj nacięcie o wielkości wystarczającej do wprowadzenia kaniuli do prawej komory i wsuń rozszerzony koniec kaniuli w kierunku tętnicy płucnej. Zabezpiecz kaniulę szwami.Tą samą techniką wprowadź drugą kaniulę do wierzchołka lewej komory w kierunku lewego przedsionka. Zabezpiecz ją taśmą pępowinową o szerokości dwóch milimetrów. Następnie usuń przeszkadzające tkanki łączną i wyjmij płuca oraz serce wraz z kaniulami.Przenieś je do szalki Petriego tak, aby powierzchnia przeponowa płuca była skierowana do góry, a wszystkie trzy kaniule znajdowały się w jednej linii. Przenieś preparat po sekcji na regulowany stolik wyposażony w rurki Tigon nr 18 podłączone do przetworników ciśnienia, które pełnią funkcję rurek doprowadzających i odprowadzających. Następnie wymieszaj zebraną krew z równą objętością 5% roztworu albuminy.Dodaj tę mieszaninę do zbiornika zasilającego. Uruchom pompę z przepływem 14 milliliters per minute. Upewnij się, że w przewodach nie ma pęcherzyków powietrza.Podczas przygotowania połącz tętnicę płucną z wlotową rurką płuca, a kaniulę lewego przedsionka z rurką wylotową. Ponownie sprawdź, czy w przewodach nie ma powietrza, a także upewnij się, że bocznik jest otwarty.Podłącz kaniulę tchawiczą do trzeciego przetwornika ciśnienia. Napompuj płuca przez kaniulę tchawiczą tlenem w stężeniu 30%. Utrzymuj ciśnienie w płucach na poziomie 5 cm H₂O.Teraz zacisnąć bypass i uruchomić pompę z przepływem 14 ml/min. Aby rozpocząć perfuzję płuc, dostosować ustawienia pompy tak, aby utrzymać ciśnienie płucne na poziomie około 10 cm H₂O oraz ciśnienie w lewym przedsionku na poziomie 3 cm H₂O. Przystąpić do przygotowania płuca poddanego infuzji krwi.W pierwszej kolejności należy wykonać cewnik infuzyjny z 40 centymetrowego odcinka rurki PE 10 włożonej do 30 centymetrowego odcinka rurki PE 90. Drugi koniec rurki PE 10 należy połączyć z igłą o rozmiarze 30G przymocowaną do strzykawki o pojemności 1 cc. Przesuń koniec rurki przymocowany do płuca nad preparatem i podłącz do niego cewnik infuzyjny.Wprowadź cewnik infuzyjny do lewego przedsionka, a następnie do płuca, aż do momentu napotkania oporu. Zbyt duża siła może spowodować uszkodzenie płuca. Prawidłowe wprowadzenie mikrocewnika jest kluczowe, ponieważ jakiekolwiek uszkodzenie płuca przez mikrocewnik obniży skuteczność protokołu.Następnie napełnij strzykawkę roztworem Ringera i podłącz ją do pompy. Powoli infunduj roztwór z prędkością 10 µL na minutę. Miejsce infuzji będzie stopniowo blednąć w porównaniu z resztą płuca; aby utrzymać powierzchnię płuca w stanie wilgotnym, owiń je folią plastikową, z wyjątkiem miejsca infuzji.Aby zwizualizować płuco, należy przygotować okno obserwacyjne, mocując o-ring do szkiełka nakrywkowego o średnicy 22 milimetrów. Za pomocą smaru do kurków należy przymocować o-ring do uchwytu do probówek. Następnie należy umieścić okno nad miejscem infuzji.Zakończ konfigurację, przesuwając obiektyw 20x nad szkiełko nakrywkowe i ustawiając ostrość na płucach. Nie należy spodziewać się zniekształceń obrazu. Teraz wprowadź do płuc wybrany roztwór.W tym przykładzie, po soli fizjologicznej, jeden mililitr koniugowanej dekstryny ZI jest wprowadzany do płuca za pomocą pompy strzykawkowej w ciągu 60 minut. Za pomocą oprogramowania do obrazowania należy rejestrować jeden obraz na minutę podczas godzinnego wlewu oraz kontynuować rejestrację przez kolejne 10 minut podczas etapu wypłukiwania. Po wprowadzeniu dekstryny FITC należy ją wypłukać, wprowadzając do płuca roztwór Ringera przez co najmniej kolejne 10 minut przy tej samej prędkości przepływu. Później, podczas analizy pozyskanych obrazów, należy ocenić maksymalną intensywność fluorescencji w obszarze zainteresowania podczas wlewu FITC.Następnie zmierz maksymalną intensywność fluorescencji pozostałej fluorescencji po 10-minutowym wypłukiwaniu. Zmiany przepuszczalności naczyniowej badano za pomocą infuzji FITC-dekstryny po zastosowaniu bakteryjnego lipopolisacharydu, ponieważ jest to powszechnie stosowany model LI. Pozostała fluorescencja FITC była niska w mikronaczyniach traktowanych roztworem Ringera, ale wysoka w tych traktowanych LPS. Co więcej, w porównaniu z infuzją roztworu Ringera, infuzja LPS spowodowała istotną redukcję indeksu przepuszczalności, co sugeruje globalny wzrost przepuszczalności we wszystkich naczyniach w polu obrazu.Ponadto, w porównaniu z infuzją roztworu Ringera, infuzja LPS spowodowała znaczną redukcję indeksu przepuszczalności, co sugeruje ogólny wzrost przepuszczalności we wszystkich naczyniach w polu obrazowania. Po obejrzeniu tego filmu widz powinien dobrze rozumieć, jak przygotować izolowane płuca ptaków, wprowadzić mikrocewnik do lewego otworu ogonowego oraz określić przepuszczalność w mikrokrażeniu.

quantifying-single-microvessel-permeability-isolated-blood-perfused

Research

JoVE Journal

Biology

Biologia

Określenie przepuszczalności pojedynczych naczyń w krążącej, izolowanych płucach szczura

Poniższy protokół opisuje proces izolacji, wentylacji i instrumentacji płuc myszy w celu pomiaru stacjonarnych lub pulsacyjnych zależności między ciśnieniem a przepływem w naczyniach płucnych, aby określić wpływ przepływu krwi, przepływu powietrza, zmian w drogach oddechowych i zmian naczyniowych na obciążenie następcze prawej komory.

Charakterystyka izolowanego, wentylowanego i opomiarowanego płuca mysiego poddanego perfuzji przepływem pulsacyjnym

Prezentujemy test in vivo do badania przepuszczalności naczyń krwionośnych. Test ten opiera się na dożylnym wstrzyknięciu barwnika, a następnie wizualizacji jego dyfuzji do przestrzeni śródmiąższowych.

Test in vivo do badania przepuszczalności naczyń krwionośnych

Niedotlenienie naczyń płucnych (HPV) jest ważnym zjawiskiem fizjologicznym, dzięki któremu przy niedotlenieniu pęcherzyków płucnych perfuzja płuc jest dopasowana do wentylacji. Głównym segmentem naczyniowym przyczyniającym się do HPV jest tętnica wewnątrzgroniasta. W tym miejscu opisujemy nasz protokół analizy HPV mysich naczyń płucnych o średnicach 20-100 μm.

Analiza wideomorfometryczna niedotlenionego zwężenia naczyń płucnych tętnic wewnątrzpłucnych przy użyciu mysich precyzyjnie wyciętych plastrów płuc

Celem niniejszego badania było sprawdzenie odtwarzalności modelu BBB in vitro z udziałem syngenicznej kohodowli komórek śródbłonka i astrocytów na szczurach. Monowarstwa komórek śródbłonka charakteryzowała się wysoką przepuszczalnością TEER i niską przepuszczalnością LY. Oceniano ekspresję specyficznych białek TJ, funkcjonalne odpowiedzi na stan zapalny oraz funkcjonalność transporterów i receptorów.

Tworzenie modelu in vitro bariery krew-mózg szczura (BBB): skupienie się na nieprzepuszczalności bariery krew-mózg i transporcie za pośrednictwem receptorów

Przedstawiono metodę pomiaru prędkości przepływu krwi mikrokrążącej w raku płuc z przerzutami do powierzchni opłucnej u szczurów w sposób zautomatyzowany, przy użyciu mikroskopii przyżyciowej płuc z zamkniętą klatką piersiową. Model ten ma potencjał do wykorzystania jako szeroko rozpowszechnione narzędzie do prowadzenia badań fizjologicznych nad przerzutami do płuc u gryzoni.

Zautomatyzowany pomiar prędkości przepływu krwi w mikrokrążeniu w przerzutach do płuc szczurów

Perfuzja płuc Ex-Vivo (EVLP) umożliwiła przeszczep płuc u ludzi dzięki umożliwieniu oceny narządów i rozszerzeniu puli dawców. W tym miejscu opisujemy rozwój programu EVLP dla szczurów i udoskonalenia, które pozwalają na stworzenie powtarzalnego modelu do przyszłej rozbudowy.

Metoda izolowanej perfuzji płuc ex vivo w modelu szczurzym: wnioski wyciągnięte z opracowania programu EVLP dla szczurów

Zmodyfikowana technika Landisa umożliwia sparowany pomiar przewodnictwa hydraulicznego poszczególnych mikronaczyń w krezce normalnych i genetycznie zmodyfikowanych szczurów w warunkach kontrolnych i testowych przy użyciu technik mikroperfuzji. Stanowi wygodną metodę oceny mechanizmów regulujących przepuszczalność mikronaczyń i wymianę transnaczyniową w warunkach fizjologicznych.

Technika mikroperfuzji do badania regulacji przepuszczalności mikronaczyń w krezce szczura

Ten manuskrypt opisuje protokoły mikroskopii wideo in vitro do oceny funkcji naczyniowej w tętnicach oporowych mózgu szczurów. W manuskrypcie opisano również techniki oceny gęstości mikronaczyń za pomocą znakowanej fluorescencyjnie lektyny i perfuzji tkanek za pomocą laserowej przepływometrii dopplerowskiej.

Ocena mechanizmów kontroli naczyniowej z wykorzystaniem wideomikroskopii izolowanych tętnic opornych szczurów

Preparat z izolowanych płuc królika jest złotym standardem w badaniach płuc. Niniejsza publikacja ma na celu opisanie techniki opracowanej do badania fizjologicznych i patologicznych mechanizmów związanych z reaktywnością dróg oddechowych, zachowaniem płuc oraz badaniami przedklinicznymi w zakresie transplantacji płuc i obrzęku płuc.

Izolowany system perfuzji płuc w modelu królika

Tutaj opisujemy prosty i ekonomiczny protokół do przeprowadzenia bezstronnej kwantyfikacji gęstości mikrokrążenia płuc dla całej tkanki płucnej myszy za pomocą pojedynczego barwienia izolektyny B4.

Kwantyfikacja gęstości mikronaczyniowej płuc u myszy w poprzek zrazików

Poznaj metodę kwantyfikacji przepuszczalności pojedynczych mikronaczyń w izolowanych płucach szczura z perfuzją krwi. Wykorzystuje się obrazowanie fluorescencyjne FITC-dextranu do badania odpowiedzi naczyń na LPS.

Kwantyfikacja przepuszczalności pojedynczych mikronaczyń w izolowanym preparacie płuc szczura z perfuzją krwi

Przeglądaj więcej filmów