Izolacja ludzkich monocytów przez wirowanie z podwójnym gradientem i ich różnicowanie do makrofagów w workach do hodowli komórkowych pokrytych teflonem
9 września 2014
Prezentujemy prosty i skuteczny protokół do generowania ludzkich makrofagów. Płaszcze kożuchowe są przetwarzane przez wirowanie gradientowe o podwójnej gęstości, a izolowane monocyty są następnie różnicowane do makrofagów w workach do hodowli komórkowych pokrytych teflonem. Maksymalizuje to wydajność makrofagów i ułatwia pobieranie komórek do kolejnych eksperymentów.
Ogólnym celem tej procedury jest wygenerowanie ludzkich makrofagów w dużej ilości i jakości przy użyciu standardowego sprzętu laboratoryjnego. Osiąga się to poprzez pierwsze odwirowanie krwi z płaszczy Buffy na gradiencie wywołania FI w celu zebrania C P BMC. Następnie w gradiencie na wywołanie monocyty są oddzielane od limfocytów.
Następnie monocyty wysiewa się w pokrytych teflonem workach do hodowli komórkowych i różnicuje. Po sześciu lub siedmiu dniach makrofagi są zbierane i wysiewane do kolejnych badań. Uzyskane komórki powinny wyrażać typowe markery dojrzałych makrofagów i reagować na różne bodźce, takie jak kohodowla z komórkami nowotworowymi lub stymulacja LPS, Główną zaletą tej techniki w porównaniu z istniejącymi metodami, takimi jak przeciwprąd, wirowanie lub sortowanie komórek aktywowanych magnetycznie, jest to, że ludzkie makrofagi można wytwarzać za pomocą standardowego sprzętu do warg bez konieczności stosowania drogich odczynników lub instrumentów.
Chociaż ta metoda jest łatwa do wykonania, osoby, które dopiero zaczynają korzystać z tej metody, mogą mieć trudności z wizualizacją i oddzieleniem różnych populacji komórek w gradientach gęstości. Dlatego wizualna demonstracja tych kroków pomoże przezwyciężyć te trudności. Protokół ten jest wykonywany w dwóch egzemplarzach, aby ułatwić wyważanie wirników.
Zacznij od zdezynfekowania dwóch worków frakcji kożucha z warstwowej krwi. Następnie przenieś płaszcze Buffy do dwóch 50-mililitrowych tubek na każdą warstwę buffy. Przygotuj trzy 50-mililitrowe probówki z 15 mililitrami roztworu FI o temperaturze pokojowej w stężeniu 1,077 grama na mililitr.
Teraz powoli i ostrożnie nałóż od 30 do 35 mililitrów puszystej sierści na każdą tubkę FI Call. Warstwy nie powinny mieszać tych probówek bez rozbijania przy 400 G przez pół godziny. W temperaturze pokojowej między dwiema fazami utworzy się biały pierścień komórek jednojądrzastych krwi obwodowej.
Usuń te warstwy za pomocą plastikowej pipety. Połącz warstwy trzech probówek od każdego dawcy w dwie 50-mililitrowe probówki na dawcę. Umyj zebrane komórki, dodając jeden milimolowy P-B-S-E-D-T-A do linii 40 mililitrów, a następnie odwiruj je przy 300 G przez 10 minut bez łamania w temperaturze pokojowej.
Teraz odessać i wyrzucić supernatanty. Następnie powtórz pranie i ponowne zawieś P-B-S-C-D-T-A i połącz granulki z każdego dawcy i 20 mililitrów RPMI plus FCS bez czerwieni fenolowej. Teraz na jednego dawcę powinna przypadać jedna probówka komórek.
Teraz przygotuj drugą mieszankę gradientu gęstości 23,13 mililitra temperatury pokojowej na roztwór wywołania z 1,87 mililitra 10 XPBS w 50-mililitrowej probówce. Przygotować jedną probówkę mieszanki na każde dwie próbki. Następnie przenieś 23 mililitry mieszanki do nowej 50-mililitrowej tuby.
Następnie dodaj 27 mililitrów RPMI plus FCS z czerwienią fenolową. Rezultatem jest rozwiązanie osmotyczne ISO na poziomie 46% na połączenie. Teraz dla każdego dawcy przenieś 25 mililitrów 46% roztworu do 50-mililitrowej probówki i ostrożnie nałóż warstwę na mieszaninę komórek.
Obie fazy powinny być rozróżnialne po kolorach bez przerwy. Wiruj komórki przez pół godziny w temperaturze pokojowej i przy 550 G. Biały pierścień monocytów zgromadzi się między dwiema twarzami. Zbierz te komórki do 50-mililitrowej probówki za pomocą plastikowej pipety.
Umyj monocyty jednym milimolowym P-B-S-E-D-T-A, wypełnionym do znaku 50 mililitrów. Następnie odwirować je przy 400 G bez łamania przez 10 minut w temperaturze pokojowej, wyrzucić supernatant i ponownie zawiesić granulowane monocyty w 20 mililitrach pożywki. Następnie przejdź do następnej sekcji.
W protokole tym wykorzystuje się worki hodowlane pokryte teflonem FEP jako komorę do hodowli. Zacznij od oszacowania liczby pobranych monocytów. Monocyty są duże i często o nieregularnym kształcie.
Nie licz mniejszych limfocytów. Jeśli dostępnych jest od 100 do 150 milionów komórek jednego dawcy, przygotuj 180 mililitrów uzupełnionego RPMI. Jeśli komórek jest mniej, przygotuj 30 mililitrów objętości pożywki na każde 30 do 50 milionów komórek.
W podwielokrotności 20 mililitrów ostrożnie wymieszaj komórki ze 180 mililitrami przygotowanego podłoża. Następnie załaduj worek hodowlany z komórkami za pomocą 50-mililitrowej strzykawki perfu przymocowanej do wtyczki na torbie hodowlanej. Wyjąć strzykawkę, wypchnąć pozostałe powietrze i zakryć korek stożkiem.
Teraz inkubuj worki przez sześć do siedmiu dni z 5% dwutlenkiem węgla. Po sześciu do siedmiu dniach inkubacji przenieś torebki hodowlane do lodu, aby zebrać komórki, całkowicie zanurz torebki w lodzie i pozwól im ostygnąć przez godzinę do trzech godzin, aby odłączyć komórki. Następnie delikatnie przeciągnij torby przez krawędź około 10 razy.
Następnie dokładnie zdezynfekuj zewnętrzną stronę worków. Zastąp stożek zatyczki strzykawką o pojemności 50 mililitrów. Następnie wyciągnij zawiesinę komórkową i przenieś ją do 50-mililitrowej probówki.
Gdy wszystkie probówki zostaną zebrane, wiruj je w dół przy 400 G przez 10 minut W temperaturze pokojowej teraz odessaj supernatant i zbierz wszystkie komórki w 10 mililitrach RPMI plus FCS. Następnie policz komórki jak poprzednio. Policz tylko makrofagi, ponieważ mogą być obecne resztkowe limfocyty.
Następnie użyj komórek do interesującego Cię zastosowania, aby ponownie wykorzystać worki hodowlane. Umyj je dwukrotnie 70% etanolem. Następnie napełnij je 50 mililitrami 70% etanolu i inkubuj przez noc w temperaturze pokojowej następnego dnia, wypłucz worki trzykrotnie sterylnym PBS.
Następnie zawiń je w papier sterylizacyjny i sterylizuj w autoklawie. Worek można łatwo ponownie wykorzystać przy 10-krotnym gradieniu gęstości. Wirowanie daje biały interfejs zawierający limfocyty i monocyty.
Tutaj badamy pierwszy gradient gęstości. Majowy Grunwald. Barwienie tych komórek wykazuje zarówno wysoki stosunek cytoplazmy jądra, typowy dla limfocytów, jak i jądra w kształcie fasoli lub pierścienia, typowe dla monocytów.
Te plamy pokazują wyniki drugiego gradientu. Każda kożuchowa powłoka daje około 150 milionów monocytów, które można różnicować w około 70 milionów makrofagów. W 20 preparatach 47% monocytów stało się makrofagami.
Oczyszczone makrofagi mogą być dodatkowo wzbogacone poprzez przyleganie do powierzchni z tworzywa sztucznego, co jest cechą niewspólną dla komórek zanieczyszczających. Po platerowaniu większość makrofagów wykazuje morfologię jajka sadzonego, podczas gdy inne mają rozciągnięty fenotyp wrzeciona. Komórki charakteryzują się ekspresją kilku markerów.
Typowe dla dojrzałych makrofagów. Ekspresja CD 11 B przemawia przeciwko różnicowaniu dendrytycznemu, podobnie jak brak ekspresji CD 2 0 9. Po różnicowaniu komórki pozostają aktywne funkcjonalnie i metabolicznie przez pięć do siedmiu dni.
Barwienie wapniem żywych komórek pokazuje ich zdolność do wchłaniania oznaczonych na czerwono pęcherzyków zewnątrzkomórkowych wydalanych z komórek nowotworowych. Dodatkowo makrofagi mogą być aktywowane, na przykład stymulacja lipopolisacharydem powoduje ekspresję kilku genów prozapalnych. Po tej procedurze wyizolowane makrofagi można poddać szerokiemu spektrum testów funkcjonalnych, aby odpowiedzieć na podstawowe pytania dotyczące biologii makrofagów w zdrowiu i chorobie.
Po obejrzeniu tego filmu powinieneś dobrze zrozumieć, jak generować dużą liczbę ludzkich makrofagów. Należy jednak pamiętać, że pracujesz z próbkami krwi ludzkiej, które mogą być potencjalnie zakaźne.
Przegląd
Ten artykuł przedstawia protokół wytwarzania ludzkich makrofagów z powłok buffy za pomocą dwukrotnej gradientowej centryfugacji gęstości. Metoda została zaprojektowana w celu maksymalizacji wydajności i uproszczenia pobierania komórek do dalszych eksperymentów.
Kluczowe komponenty badania
Obszar nauki
- Biologia komórki
- Immunologia
- Hematologia
Tło
- Ludzkie makrofagi są niezbędne do różnych badań immunologicznych.
- Istniejące metody wytwarzania makrofagów mogą być drogie i skomplikowane.
- Ten protokół ma na celu zapewnienie opłacalnej i prostej alternatywy.
- Zalecane są pomoce wizualne, aby pomóc w separacji populacji komórek.
Cel badania
- Opracować niezawodną metodę wytwarzania wysokiej jakości ludzkich makrofagów.
- Ułatwić używanie standardowego sprzętu laboratoryjnego w procesie.
- Poprawić dostępność badań nad makrofagami dla różnych zastosowań.
Zastosowane metody
- Dwukrotna gradientowa centryfugacja gęstości powłok buffy.
- Izolacja monocytów z limfocytów.
- Różnicowanie monocytów w makrofagi w Teflonowych torebkach kulturowych.
- Pobieranie i liczenie makrofagów na potrzeby dalszych badań.
Główne wyniki
- Z każdej powłoki buffy można uzyskać około 150 milionów monocytów.
- Z tych monocytów można wyróżnić około 70 milionów makrofagów.
- 47% monocytów pomyślnie różnicuje się w makrofagi.
- Uczyszczone makrofagi mogą być dalsze wzbogacone poprzez przyleganie do powierzchni plastikowych.
Wnioski
- Ten protokół zapewnia prosty i efektywny sposób wytwarzania ludzkich makrofagów.
- Eliminuje potrzebę drogich reagentów i skomplikowanych urządzeń.
- Demonstracje wizualne mogą pomóc w pomyślnej implementacji metody.
Często zadawane pytania
Executive Industry Relevance
Reliable access to high-quality human macrophages is critical for early-stage drug discovery, immunology research, and disease modeling. This protocol enables scalable, reproducible generation of functional human macrophages using standard laboratory infrastructure, supporting translational studies and mechanistic de-risking without reliance on animal-derived cells. The approach enhances predictive confidence in human-relevant systems, facilitating robust target validation and portfolio triage.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Enables interrogation of human macrophage biology in disease-relevant contexts.
- Supports functional target validation by providing primary human immune cells.
- Facilitates mechanistic de-risking through controlled differentiation and marker validation.
- Improves predictive confidence by circumventing species differences inherent to murine models.
Screening & Assay Development
- Provides standardized, reproducible macrophage populations for downstream functional assays.
- Enables quantitative assessment of macrophage responses to stimuli or compounds.
- Supports assay scalability and platform reuse through high-yield, cost-effective cell generation.
- Improves reliability of compound evaluation in human immune cell systems.
Translational & Preclinical Research
- Aligns disease models with human immune cell biology for translational biomarker studies.
- Enables continuity from discovery through preclinical validation in syngeneic human systems.
- Reduces translational risk by providing functionally validated human macrophages for mechanistic studies.
- Supports risk-adjusted advancement decisions based on human-relevant data.
Pipeline & Workflow Integration
This method integrates into the discovery continuum from early target validation through assay development and translational research, providing a reusable platform for generating human macrophages at scale.
- Discovery Biology: Supports hypothesis testing and pathway clarification using primary human macrophages.
- Screening: Delivers reproducible, validated cell populations for quantitative assay development.
- Analytics: Enables measurement of functional responses and marker expression for comparative analysis.
- Translational Research: Facilitates alignment with human disease models and biomarker strategies.
- Enterprise Reuse: Offers a scalable, cost-effective capability for repeated macrophage generation across programs.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence and reduces mechanistic ambiguity in immune cell studies.
- Operational Value: Standardizes macrophage production with reproducible yields and scalable workflows.
- Strategic Value: Enables better go/no-go decisions and capital efficiency by reducing reliance on animal models.
- Portfolio Impact: Supports risk-adjusted prioritization and advancement of immune-targeted programs.
Implementation Considerations
- Requires expertise in density gradient centrifugation and cell culture techniques.
- Needs access to standard laboratory centrifuges, Teflon-coated culture bags, and basic cell counting tools.
- Demands cross-team standardization for reproducibility and quality control.
- Adaptable to various human disease models but dependent on donor sample quality.
- Potential challenges include accurate cell population separation and contamination risk from human blood samples.
