Name: Izolacja ludzkich monocytów przez wirowanie z podwójnym gradientem i ich różnicowanie do makrofagów w workach do hodowli komórkowych pokrytych teflonem (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-09-09T13:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 32 s
Description: Naucz się izolować monocity z krwi za pomocą wirowania z podwójnym gradientem gęstości i różnicować je do makrofagów w workach pokrytych teflonem. Ta metoda pozwala uzyskać około 70 milionów makrofagów z jednego buforowego koagulatu przy użyciu standardowego wyposażenia laboratoryjnego.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Autorzy chcieliby podziękować Pani Meike Schaffrinski za jej zawsze doskonałą pomoc techniczną w ciągu ostatnich kilku lat.
Ta praca została sfinansowana przez Niemiecką Radę ds. Badań Naukowych (DFG) w ramach wspólnej grupy badawczej 942 (FOR942) oraz przez Program Badawczy Wydziału Lekarskiego Uniwersytetu Georga Augusta w Getyndze.

1. Przygotowanie sterylnej ludzkiej surowicy AB
<ol>
	<li>Zbierz 4-5 worków świeżo mrożonego osocza (FFP). Przechowywać worki w temperaturze -20 °C, dopóki nie zostanie zebrana wystarczająca ilość worków.</li>
	<li>Rozmrozić worki i inkubować przez 30 minut w temperaturze 56 °C w łaźni wodnej w celu dezaktywacji, dopełniacza i usunięcia fibryny.</li>
	<li>Dokładnie zdezynfekować zewnętrzną stronę worków i przenieść osocze do probówek o pojemności 50 ml.</li>
	<li>Wirować przy 3 000 x g przez 15 minut w temperaturze pokojowej, aby pozbyć się osadów i zalegających płytek krwi.</li>
	<li>Zebrać wszystkie supernatanty i wyrzucić granulki.</li>
	<li>Próbki surowicy należy rozlać do 15 ml probówek i przechowywać w temperaturze -20 °C. 
	UWAGA: Alternatywnie można użyć dostępnej w handlu inaktywowanej termicznie normalnej ludzkiej surowicy AB.</li>
</ol>
2. Izolacja monocytów
Aby ułatwić równoważenie wirówki, zaleca się równoległe przetwarzanie dwóch warstw buffy. Należy jednak pamiętać, aby używać oddzielnych materiałów dla każdego dawcy i nie mieszać komórek. W przypadku, gdy nie można łatwo uzyskać kożuchówki, można zamiast tego użyć 400 ml heparynizowanej krwi obwodowej.
<ol>
	<li>Ostrożnie zdezynfekuj plastikowe torebki zawierające kożuchy i przenieś zawartość każdej z nich do dwóch probówek o pojemności 50 ml.</li>
	<li>Dla każdej kożuchy napełnij trzy probówki o pojemności 50 ml 15 ml roztworu Ficollu (1,077 g/ml). Do przygotowania Ficoll powinien mieć temperaturę pokojową.</li>
	<li>Ułóż 30-35 ml krwi kożucha na wierzchu roztworu Ficoll, aby uzyskać pierwszy gradient gęstości. Uważaj, aby robić to powoli i ostrożnie, aby zapobiec mieszaniu się obu warstw.</li>
	<li>Wirować przy 400 x g bez hamulca przez 30 minut w temperaturze pokojowej.</li>
	<li>Dla każdego gradientu zebrać biały pierścień komórek jednojądrzastych krwi obwodowej (PBMC), który znajduje się między dwiema fazami, za pomocą plastikowej pipety Pasteura i przenieść do probówki o pojemności 50 ml.</li>
	<li>Napełnij każdą probówkę PBS-EDTA (1 mM) łącznie do 40 ml.</li>
	<li>Wirować przy 300 x g przez 10 minut bez przerwy w temperaturze pokojowej.</li>
	<li>Odessać supernatant i ponownie przepłukać osad 40 ml PBS-EDTA (1 mM).</li>
	<li>Dla każdego dawcy pula granulek w 20 ml RPMI-1640 bez czerwieni fenolowej + 10% FCS.</li>
	<li>Przygotować izoosmotyczny roztwór Percollu dla drugiego gradientu gęstości: Dla dwóch donorów zmieszać 23,13 ml roztworu Percollu (gęstość: 1,131 g/ml) w probówce o pojemności 50 ml z 1,87 ml 10-krotnym PBS. Następnie przenieś 23 ml tego roztworu do nowej probówki o pojemności 50 ml i dodaj 27 ml RPMI-1640 z czerwienią fenolową + 10% FCS, aby otrzymać 46% izoosmotyczny roztwór Percollu. Percoll powinien mieć temperaturę pokojową do przygotowania.</li>
	<li>Dla każdego dawcy przenieść 25 ml przygotowanego roztworu Percoll do probówki o pojemności 50 ml i nałożyć roztwór PBMC przygotowany w 2.9) na roztwór Percoll. Uważaj, aby robić to bardzo powoli i ostrożnie, obie warstwy mają tendencję do łatwego mieszania się. Jeśli zrobisz to poprawnie, dwie fazy można rozróżnić ze względu na różnicę w kolorze.</li>
	<li>Wirować przy 550 x g bez hamulca przez 30 minut w temperaturze pokojowej.</li>
	<li>Dla każdego gradientu zebrać biały pierścień monocytów, który znajduje się między dwiema fazami, za pomocą plastikowej pipety Pasteura i przenieść do probówki o pojemności 50 ml.</li>
	<li>Napełnij każdą probówkę PBS-EDTA (1 mM) łącznie do 50 ml.</li>
	<li>Wirować przy 400 x g przez 10 minut bez hamulca w temperaturze pokojowej.</li>
	<li>Odessać supernatant i ponownie zawiesić granulki w 20 ml RPMI-1640 z czerwienią fenolową + 10% FCS.</li>
</ol>
3. Różnicowanie monocytów do makrofagów
<ol>
	<li>Określić liczbę wyizolowanych monocytów w rozcieńczeniu 1:10 w błękitu trypanowym. Policz tylko duże, często nieregularne komórki, które są monocytami. Nie licz mniejszych, okrągłych komórek, które są limfocytami. 
	UWAGA: Liczby monocytów nie muszą być określane zbyt dokładnie, ponieważ dają one jedynie wskazówkę, ile i jakie worki pokryte teflonem FEP (małe lub duże) muszą być użyte do różnicowania komórek.</li>
	<li>W przypadku 1,0-1,5 x 108 monocytów od jednego dawcy, wysiewaj komórki w dużej torbie do hodowli komórkowej pokrytej teflonem FEP. Dla każdej torebki należy przygotować pożywkę hodowlaną składającą się ze 174 ml RPMI-1640, 2% ludzkiej surowicy AB (przygotowanej w sekcji 1), 1% penicyliny/streptomycyny i 2,5 ng/ml M-CSF (całkowita objętość: 180 ml).
	<ol>
		<li>W przypadku 3,0-5,0 x 107 monocytów od jednego dawcy, wysiewaj komórki w małej torbie do hodowli komórkowej pokrytej teflonem. Dla każdej torebki należy przygotować pożywkę hodowlaną składającą się z 28,5 ml RPMI-1640, 2% ludzkiej surowicy AB (przygotowanej w sekcji 1), 1% penicyliny/streptomycyny i 2,5 ng/ml M-CSF (całkowita objętość: 30 ml). 
		UWAGA: Jeśli uzyskane zostaną np. monocyty 8,0 x 107, zalecamy wysiewanie ich w dwóch workach o mniejszej objętości po 4,0 x 107 komórek każdy. Zamiast M-CSF, monocyty można alternatywnie różnicować za pomocą czynnika stymulującego tworzenie kolonii makrofagów granulocytów (GM-CSF) w tym samym stężeniu (2,5 ng/ml).</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Dodać zawiesinę komórkową (20 ml) do przygotowanego podłoża i dokładnie wymieszać. Jeśli od jednego dawcy przygotowywane są dwie torebki, dodaj 20 ml RPMI-1640 do zawiesiny komórek, a następnie dodaj połowę zawiesiny do każdego preparatu pożywki.</li>
	<li>Fakultatywnie: W celu ustalenia, czy preparat monocytów pozostał sterylny, należy rozerwać jedną kroplę zawiesiny komórek na płytce z agarem z krwią i inkubować przez noc w temperaturze 37 °C.</li>
	<li>Dokręcić osłonę strzykawki z perfuzorem o pojemności 50 ml do zatyczki worka do hodowli komórkowych pokrytego teflonem FEP i napełnić ją przygotowaną zawiesiną komórkową.</li>
	<li>Odłączyć strzykawkę od korka i wypchnąć pozostałe powietrze z worka. Zamknij torbę stożkiem zamykającym.</li>
	<li>Inkubować worki przez 6-7 dni w temperaturze 37 °C z 5% CO2 .</li>
</ol>
4. Żniwa makrofagów
<ol>
	<li>Pokryte teflonem worki do hodowli komórkowych FEP ze zróżnicowanymi makrofagami należy umieścić na lodzie na co najmniej 1 godzinę, aby ułatwić oderwanie komórek (możliwa jest inkubacja trwająca do 3 godzin). Upewnij się, że cała powierzchnia worka jest pokryta lodem.</li>
	<li>Przeciągnij torbę z minimalnym naciskiem 10x przez krawędź biurka/deski.</li>
	<li>Ostrożnie zdezynfekuj zewnętrzną część worka i usuń stożek zamykający.</li>
	<li>Dokręcić strzykawkę o pojemności 50 ml na korku worka, usunąć zawiesinę komórek i przenieść ją do probówek o pojemności 50 ml.</li>
	<li>Wirować przy 400 x g przez 10 minut w temperaturze pokojowej, aby odwirować komórki.</li>
	<li>Odessać supernatant i zebrać granulki z jednego worka w 10 ml RPMI-1640 + łącznie 10% FCS.</li>
	<li>Określ liczbę komórek w hemocytometrze (rozcieńczenie 1:4-1:10 w błękitu trypanowym). Policz tylko duże okrągłe komórki. 
	UWAGA: Po różnicowaniu makrofagów w workach pokrytych teflonem FEP mogą pojawić się resztki komórek, np. limfocytów, w zależności od dawcy i jakości izolacji monocytów.</li>
	<li>Aby ponownie użyć worków pokrytych teflonem FEP, umyj je dwukrotnie 70% etanolem, aby usunąć resztki komórek. Napełnij je 50 ml 70% etanolu i inkubuj przez noc. Umyj worki 3x sterylnym PBS, zawiń je w papier sterylizacyjny i sterylizuj w autoklawie przy użyciu standardowych procedur. 
	UWAGA: Worki do hodowli komórkowych mogą być wielokrotnie używane bez utraty wydajności makrofagów. Zdecydowaliśmy się jednak wyrzucić worki po 10 użyciach, zanim zaczną przeciekać.</li>
	<li>Do kolejnych eksperymentów hoduje się makrofagi w RPMI-1640 + 10% FCS. Jeśli wymagane są niższe stężenia w surowicy, możliwa jest również hodowla w RPMI-1640 z 1% FCS. Wysiewaj i inkubuj komórki przez 3-4 godziny. Po tym okresie należy zauważyć, że makrofagi przyczepiają się do powierzchni naczynia do hodowli komórkowej, podczas gdy wszelkie zanieczyszczające komórki (tj. erytrocyty, limfocyty i komórki dendrytyczne) pozostają w zawiesinie. Umyj komórki co najmniej dwa razy PBS, aby usunąć nieprzylegające komórki.</li>
	<li>Aby odłączyć hodowane makrofagi od naczynia do hodowli komórkowych w celu przeprowadzenia dalszych eksperymentów, ostrożnie zeskrob je z powierzchni. Alternatywnie, inkubować szalki przez 20 minut na lodzie, odessać pożywkę hodowlaną i dodać 1 ml bezenzymatycznego buforu dysocjacji komórek. Po 5 minutach inkubacji w temperaturze 37 °C dodać 4 ml PBS i oddzielić komórki, pipetując w górę i w dół przez co najmniej 3 minuty.</li>
</ol>

<ol><li>Wynn, T. A., Chawla, A., Pollard, J. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Macrophage+biology+in+development%2C+homeostasis+and+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Macrophage biology in development, homeostasis and disease.</a> Nature. 496, 445-455 (2013).</li>
<li>Iwasaki, A., Medzhitov, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Regulation+of+Adaptive+Immunity+by+the+Innate+Immune+System%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Regulation of Adaptive Immunity by the Innate Immune System.</a> Science. 327, 291-295 (2010).</li>
<li>Sica, A., Mantovani, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Macrophage+plasticity+and+polarization%3A+in+vivo+veritas%5BTitle%5D)+AND+%22J+Clin+Invest%22%5BJournal%5D)">Macrophage plasticity and polarization: in vivo veritas.</a> J Clin Invest. 122, 787-795 (2012).</li>
<li>Lionakis, M. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CX%283%29CR1-dependent+renal+macrophage+survival+promotes+Candida+control+and+host+survival%5BTitle%5D)+AND+%22J+Clin+Invest%22%5BJournal%5D)">CX(3)CR1-dependent renal macrophage survival promotes Candida control and host survival.</a> J Clin Invest. 123 (3), 5035-5051 (2013).</li>
<li>Blumenthal, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Wingless+homolog%2C+WNT5A+and+its+receptor+Frizzled-5+regulate+inflammatory+responses+of+human+mononuclear+cells+induced+by+microbial+stimulation%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">The Wingless homolog, WNT5A and its receptor Frizzled-5 regulate inflammatory responses of human mononuclear cells induced by microbial stimulation.</a> Blood. 108, 965-973 (2006).</li>
<li>Lima, D. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Inflammasome-derived+IL-1+beta+production+induces+nitric+oxide-mediated+resistance+to+Leishmania%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Med%22%5BJournal%5D)">Inflammasome-derived IL-1 beta production induces nitric oxide-mediated resistance to Leishmania.</a> Nat Med. 19, 909-915 (2013).</li>
<li>Pollard, J. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tumour-educated+macrophages+promote+tumour+progression+and+metastasis%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Cancer%22%5BJournal%5D)">Tumour-educated macrophages promote tumour progression and metastasis.</a> Nat Rev Cancer. 4, 71-78 (2004).</li>
<li>Subramanian, V., Ferrante, A. W. Jr <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Obesity%2C+inflammation%2C+and+macrophages%5BTitle%5D)+AND+%22Nestle+Nutrition+workshop+series.+Paediatric+programme%22%5BJournal%5D)">Obesity, inflammation, and macrophages.</a> Nestle Nutrition workshop series. Paediatric programme. 63, 151-159 (2009).</li>
<li>Moore, K. J., Sheedy, F. J., Fisher, E. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Macrophages+in+atherosclerosis%3A+a+dynamic+balance%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Immunol%22%5BJournal%5D)">Macrophages in atherosclerosis: a dynamic balance.</a> Nat Rev Immunol. 13, 709-721 (2013).</li>
<li>Pradere, J. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hepatic+macrophages+but+not+dendritic+cells+contribute+to+liver+fibrosis+by+promoting+the+survival+of+activated+hepatic+stellate+cells+in+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Hepatology%22%5BJournal%5D)">Hepatic macrophages but not dendritic cells contribute to liver fibrosis by promoting the survival of activated hepatic stellate cells in mice.</a> Hepatology. 58, 1461-1473 (2013).</li>
<li>Danciger, J. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Method+for+large+scale+isolation%2C+culture+and+cryopreservation+of+human+monocytes+suitable+for+chemotaxis%2C+cellular+adhesion+assays%2C+macrophage+and+dendritic+cell+differentiation%5BTitle%5D)+AND+%22J+Immunol+Methods%22%5BJournal%5D)">Method for large scale isolation, culture and cryopreservation of human monocytes suitable for chemotaxis, cellular adhesion assays, macrophage and dendritic cell differentiation.</a> J Immunol Methods. 288, 123-134 (2004).</li>
<li>Reiling, N., Blumenthal, A., Flad, H. D., Ernst, M., Ehlers, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mycobacteria-induced+TNF-alpha+and+IL-10+formation+by+human+macrophages+is+differentially+regulated+at+the+level+of+mitogen-activated+protein+kinase+activity%5BTitle%5D)+AND+%22J+Immunol%22%5BJournal%5D)">Mycobacteria-induced TNF-alpha and IL-10 formation by human macrophages is differentially regulated at the level of mitogen-activated protein kinase activity.</a> J Immunol. 167, 3339-3345 (2001).</li>
<li>Andreesen, R., Picht, J., Lohr, G. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Primary+Cultures+of+Human+Blood-Borne+Macrophages+Grown+on+Hydrophobic+Teflon+Membranes%5BTitle%5D)+AND+%22J+Immunol+Methods%22%5BJournal%5D)">Primary Cultures of Human Blood-Borne Macrophages Grown on Hydrophobic Teflon Membranes.</a> J Immunol Methods. 56, 295-304 (1983).</li>
<li>van der Meer, J. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Culture+of+human+bone+marrow+in+the+teflon+culture+bag%3A+identification+of+the+human+monoblast%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+the+Reticuloendothelial+Society%22%5BJournal%5D)">Culture of human bone marrow in the teflon culture bag: identification of the human monoblast.</a> Journal of the Reticuloendothelial Society. 32, 355-369 (1982).</li>
<li>van der Meer, J. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Characteristics+of+human+monocytes+cultured+in+the+Teflon+culture+bag%5BTitle%5D)+AND+%22Immunology%22%5BJournal%5D)">Characteristics of human monocytes cultured in the Teflon culture bag.</a> Immunology. 47, 617-625 (1982).</li>
<li>Martinez, F. O., Gordon, S., Locati, M., Mantovani, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transcriptional+profiling+of+the+human+monocyte-to-macrophage+differentiation+and+polarization%3A+New+molecules+and+patterns+of+gene+expression%5BTitle%5D)+AND+%22J+Immunol%22%5BJournal%5D)">Transcriptional profiling of the human monocyte-to-macrophage differentiation and polarization: New molecules and patterns of gene expression.</a> J Immunol. 177, 7303-7311 (2006).</li>
<li>Gordon, S., Taylor, P. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Monocyte+and+macrophage+heterogeneity%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Immunol%22%5BJournal%5D)">Monocyte and macrophage heterogeneity.</a> Nat Rev Immunol. 5, 953-964 (2005).</li>
<li>Hashimoto, S., Yamada, M., Motoyoshi, K., Akagawa, K. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Enhancement+of+macrophage+colony-stimulating+factor-induced+growth+and+differentiation+of+human+monocytes+by+interleukin-10%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">Enhancement of macrophage colony-stimulating factor-induced growth and differentiation of human monocytes by interleukin-10.</a> Blood. 89, 315-321 (1997).</li>
<li>Tushinski, R. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Survival+of+Mononuclear+Phagocytes+Depends+on+a+Lineage-Specific+Growth-Factor+That+the+Differentiated+Cells+Selectively+Destroy%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Survival of Mononuclear Phagocytes Depends on a Lineage-Specific Growth-Factor That the Differentiated Cells Selectively Destroy.</a> Cell. 28, 71-81 (1982).</li>
<li>Rietkotter, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Zoledronic+acid+inhibits+macrophage%2Fmicroglia-assisted+breast+cancer+cell+invasion%5BTitle%5D)+AND+%22Oncotarget%22%5BJournal%5D)">Zoledronic acid inhibits macrophage/microglia-assisted breast cancer cell invasion.</a> Oncotarget. 4, 1449-1460 (2013).</li>
<li>Pilling, D., Fan, T., Huang, D., Kaul, B., Gomer, R. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+of+Markers+that+Distinguish+Monocyte-Derived+Fibrocytes+from+Monocytes%2C+Macrophages%2C+and+Fibroblasts%5BTitle%5D)+AND+%22Plos+One%22%5BJournal%5D)">Identification of Markers that Distinguish Monocyte-Derived Fibrocytes from Monocytes, Macrophages, and Fibroblasts.</a> Plos One. 4, E7475(2009).</li>
<li>Rey-Giraud, F., Hafner, M., Ries, C. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vitro+generation+of+monocyte-derived+macrophages+under+serum-free+conditions+improves+their+tumor+promoting+functions%5BTitle%5D)+AND+%22Plos+One%22%5BJournal%5D)">In vitro generation of monocyte-derived macrophages under serum-free conditions improves their tumor promoting functions.</a> Plos One. 7, e42656(2012).</li>
<li>Waldo, S. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Heterogeneity+of+human+macrophages+in+culture+and+in+atherosclerotic+plaques%5BTitle%5D)+AND+%22Am+J+Pathol%22%5BJournal%5D)">Heterogeneity of human macrophages in culture and in atherosclerotic plaques.</a> Am J Pathol. 172, 1112-1126 (2008).</li>
<li>Chernykh, E. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+generation+and+properties+of+human+M2-like+macrophages%3A+potential+candidates+for+CNS+repair%3F%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Ther+Transplant%22%5BJournal%5D)">The generation and properties of human M2-like macrophages: potential candidates for CNS repair?</a> Cell Ther Transplant. 2, (2010).</li>
<li>Verreck, F. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+IL-23-producing+type+1+macrophages+promote+but+IL-10-producing+type+2+macrophages+subvert+immunity+to+%28myco%29bacteria%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Human IL-23-producing type 1 macrophages promote but IL-10-producing type 2 macrophages subvert immunity to (myco)bacteria.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 101, 4560-4565 (2004).</li>
<li>Pukrop, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Wnt+5a+signaling+is+critical+for+macrophage-induced+invasion+of+breast+cancer+cell+lines%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Wnt 5a signaling is critical for macrophage-induced invasion of breast cancer cell lines.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 103, 5454-5459 (2006).</li>
<li>Hagemann, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Macrophages+induce+invasiveness+of+epithelial+cancer+cells+via+NF-kappa+B+and+JNK%5BTitle%5D)+AND+%22J+Immunol%22%5BJournal%5D)">Macrophages induce invasiveness of epithelial cancer cells via NF-kappa B and JNK.</a> J Immunol. 175, 1197-1205 (2005).</li>
<li>Pereira, C., Schaer, D. J., Bachli, E. B., Kurrer, M. O., Schoedon, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Wnt5A%2FCaMKII+signaling+contributes+to+the+inflammatory+response+of+macrophages+and+is+a+target+for+the+antiinflammatory+action+of+activated+protein+C+and+interleukin-10%5BTitle%5D)+AND+%22Arterioscl+Throm+Vas%22%5BJournal%5D)">Wnt5A/CaMKII signaling contributes to the inflammatory response of macrophages and is a target for the antiinflammatory action of activated protein C and interleukin-10.</a> Arterioscl Throm Vas. 28, 504-510 (2008).</li>
</ol>

Autorzy nie mają nic do ujawnienia, ponieważ nie ma konfliktu interesów.

Makrofagi są ważnymi komórkami efektorowymi wrodzonego układu odpornościowego i pełnią ważne funkcje w immunomodulacji, prezentacji antygenu i homeostazie tkanek. Ze względu na swoją niezwykłą plastyczność są w stanie reagować na różne bodźce zmianami swojego fenotypu. Jednak do tej pory wiele danych dotyczących polaryzacji makrofagów uzyskano w systemie mysim, chociaż istnieją doniesienia pokazujące, że tylko około 50% markerów polaryzacji makrofagów można bezpośrednio przetłumaczyć z myszy naczłowieka16. Dlatego przedstawiamy tutaj metodę otrzymywania pierwotnych ludzkich makrofagów w wystarczającej liczbie i czystości bez konieczności stosowania drogich materiałów, np. kulek magnetycznych MACS lub przeciwprądowego urządzenia do elutriacji odśrodkowej.
Nasza metoda opiera się na izolacji monocytów z PBMC, a następnie ich różnicowaniu do makrofagów w workach do hodowli komórkowych pokrytych teflonem FEP w obecności niskich stężeń M-CSF11-13. Podczas gdy monocyty stanowią mniej niż 5 do 10% leukocytów krwi obwodowej u ludzi, po stymulacji są rekrutowane do miejsc obwodowych, gdzie różnicują się do rezydujących makrofagów tkankowych lub komórek dendrytycznych17. Cytokina M-CSF jest ważna dla przetrwania monocytów i napędza ich różnicowanie do makrofagów18,19. Do tej pory stężenia M-CSF, które zostały wybrane do różnicowania monocytów, wahały się do 100 ng/ml, jednak w naszym protokole jesteśmy w stanie uzyskać wystarczającą liczbę dojrzałych makrofagów przy stężeniu M-CSF wynoszącym zaledwie 2,5 ng/ml12,20. Ponadto komórki są hodowane w workach do hodowli komórkowych pokrytych teflonem FEP, które ułatwiają oderwanie makrofagów i ich późniejszy wysiew w określonej liczbie komórek. Ponieważ worki mogą być wielokrotnie używane, dodatkowo obniża to koszty procesu izolacji.
Makrofagi uzyskane w tej procedurze są wysoce dodatnie dla CD45, CD14, CD11b, CD11c i wykazują ekspresję receptora mannozy CD206, co przemawia za populacją czystych, dojrzałych makrofagów21,22. Szczególnie wysoka ekspresja CD14 jest typowa dla makrofagów zróżnicowanych w obecności M-CSF23. Po wysianiu komórek wykazują szybkie przyleganie do powierzchni z tworzywa sztucznego, przy czym niektóre komórki wykazują typową morfologię wrzecionowatą, podczas gdy inne wykazują fenotyp jajka sadzonego. Jest to zgodne z obserwacjami innych autorów18,22,24.
Doniesiono, że różnicowanie monocytów w obecności M-CSF prowadzi do makrofagów spolaryzowanych M216,25. Jednak makrofagi wyizolowane przez nasz protokół nadal są w stanie reagować na szeroki zakres bodźców, w tym ekspozycję na mikropęcherzyki pochodzące z komórek nowotworowych i kohodowlę z komórkami nowotworowymi26,27 lub ekspozycję na LPS, na którą reagują indukcją genów prozapalnych, takich jak IL-1β, TNFα, Wnt5a lub różne metaloproteinazy macierzy, które są uważane za typowe dla makrofagów spolaryzowanych M13,5,28.
Podsumowując, izolacja monocytów przez wirowanie w gradionym gradifikacji o podwójnej gęstości, a następnie różnicowanie w kierunku makrofagów w workach do hodowli komórkowych pokrytych teflonem FEP skutkuje dużą liczbą makrofagów bez konieczności przeprowadzania technicznie trudnych lub kosztownych procedur. Uzyskane makrofagi mogą być wykorzystane do późniejszej analizy, począwszy od klasycznej aktywacji, poprzez LPS, aż po kohodowlę z komórkami nowotworowymi.

Komórki z linii monocytowej i ich ostatecznie zróżnicowane pochodne - makrofagi - wykazują uderzającą plastyczność w odniesieniu do swojej funkcji biologicznej, co prowadzi do ich udziału w tak różnorodnych procesach, jak rozwój, naprawa tkanek i odporność1. To ostatnie wynika z ich zdolności fagocytarnej i antygenowej, która umieszcza makrofagi na skrzyżowaniu między wrodzoną i nabytą odpowiedzią immunologiczną2. Jednak ich zdolność do wydzielania cytokin, chemokin, czynników wzrostu i innych cząsteczek sygnałowych1 nie tylko zwiększa ich funkcję immunomodulacyjną, ale także służy jako podstawa dla ich dodatkowych funkcji. Próby odzwierciedlenia tych różnych etapów aktywacji w kontekście warunków niezależnych od drobnoustrojów zaowocowały kategoriami M1 i M23. Chociaż klasyfikacja ta nie jest kompletna, pozwala na podstawowe zrozumienie biologii makrofagów.
Ze względu na te wieloaspektowe możliwości, nie jest zaskoczeniem, że makrofagi są związane z wieloma schorzeniami, które w jakiś sposób wiążą się z przebudową tkanek lub stanem zapalnym. Oprócz ich fundamentalnej roli w rozpoznawaniu i usuwaniu inwazyjnych patogenów4-6, makrofagi coraz częściej znajdują zastosowanie w miażdżycy, zwłóknieniu, otyłości i nowotworach7-10. Powtarzalna metoda generowania ludzkich makrofagów ma zatem kluczowe znaczenie dla zrozumienia tych patologii. W niniejszym artykule przedstawiono metodę polegającą na izolacji ludzkich monocytów z krwi obwodowej zdrowych dawców za pomocą techniki wirowania w gradiacji o podwójnej gęstości, jak opisano wcześniej11. Aby ułatwić różnicowanie w kierunku makrofagów, izolowane komórki monocytarne inkubuje się w obecności niskich stężeń M-CSF i normalnej ludzkiej surowicy12. Aby ułatwić dalszą obróbkę i pobieranie komórek, różnicowanie przeprowadza się w przepuszczalnych dla gazu, pokrytych teflonem FEP workach do hodowli komórkowych o powierzchnihydrofobowej 12-15. Powstałe w ten sposób makrofagi w stanie spoczynku można poddać szerokiej gamie testów, ponieważ nadal są one w stanie reagować w sposób podobny do M1 lub M2. Alternatywne metody izolacji monocytów i późniejszego różnicowania, takie jak magnetyczne sortowanie komórek aktywowanych (MACS) lub przeciwprądowa elutriacja odśrodkowa (CCE), mają pewne ograniczenia dotyczące wymaganej wydajności, kosztów i czasu. Opisany w niniejszym dokumencie protokół ma tę zaletę, że może być przeprowadzany przy użyciu standardowego sprzętu laboratoryjnego bez konieczności stosowania specjalnych odczynników (np. kulek magnetycznych MACS) lub urządzeń (np. aparatury CCE) i pozwala na przetwarzanie dużych ilości komórek.

<table><tbody><tr><td>Przeciwciała do immunofenotypowania</td><td>Beckman Coulter</td><td></td><td>na przykład: CD11c-PE (IM1760), CD45-FITC (7782), kontrola izotypu IgG1-PE (A07796), kontrola izotypu IgG1-FITC (A07795)</td></tr><tr><td></td><td>BioLegends</td><td></td><td>, na przykład: CD14-FITC (325603), CD206-PE (321105)</td></tr><tr><td>Axiovert 200M</td><td>mikroskop Zeiss</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Calcein AM</td><td>AnaSpec</td><td>89201</td><td></td></tr><tr><td>Stożki zamykające Combi-korek</td><td>Braun</td><td>4495101</td><td></td></tr><tr><td>1x PBS, bez Ca i Mg</td><td>Pan biotech</td><td>P04-36500</td><td>do PBS-EDTA (1 mM) dodać 1 ml 0,5 M EDTA na 500 ml PBS</td></tr><tr><td>10x PBS, bez Ca i Mg</td><td>Invitrogen</td><td>14200-067</td><td></td></tr><tr><td>EDTA (Titriplex III)</td><td>Merck</td><td>1084211000</td><td>przygotować 0,5 M roztwór w H2O, użyj sterylnego filtra</td></tr><tr><td>Bufor dysocjacji komórek (bez enzymów, na bazie PBS)</td><td>Gibco</td><td>13151-014</td><td></td></tr><tr><td>Surowica cielęca płodu (FCS)</td><td>Invitrogen</td><td>10091148</td><td>inaktywowany termicznie</td></tr><tr><td>Ficoll (gęstość 1,077 g/ml)</td><td>Biochrom AG</td><td>L6115</td><td></td></tr><tr><td>FACSCanto II</td><td>BD Biosciences</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Kozia anty-mysz FITC</td><td>santa cruz</td><td>sc-2010</td><td></td></tr><tr><td>LPS z E.coli</td><td>Sigma</td><td>L8274</td><td>stężenie końcowe: 100 ng/ml</td></tr><tr><td>Multifuge 3 L-R</td><td>Heraeus</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Penicylina/streptomycyna</td><td>Biochrom AG</td><td>A2213</td><td></td></tr><tr><td>Percoll (gęstość 1,131 g/ml)</td><td>GE Healthcare</td><td>17-0891-02</td><td></td></tr><tr><td>Strzykawka z perfuzorem 50 ml</td><td>Braun</td><td>8728844F</td><td></td></tr><tr><td>Phalloidin-TRITC</td><td>Sigma</td><td>P1951</td><td>ponownie zawiesina w metanolu (c = 0,1 mg / ml)</td></tr><tr> <td colspan="4">[nagłówek]</td></tr><tr><td>Plastikowe jednorazowe pipety Pasteura</td><td>Technologie LVL</td><td>2655181</td><td></td></tr><tr><td>rh M-CSF</td><td>ImmunoTools</td><td>11343117</td><td>Resuspend in 500 &micro; l sterylny H2O (c = 100 ng/&mikro; l), podwielokrotność</td></tr><tr><td>RPMI-1640 z czerwienią fenolową</td><td>Gibco</td><td>21875-034</td><td></td></tr><tr><td>RPMI-1640 bez czerwieni fenolowej</td><td>Gibco</td><td>11835-063</td><td></td></tr><tr><td>Papier do sterylizacji</td><td>grupa VP</td><td>3KFKFS230116</td><td></td></tr><tr><td>Niebieska plama trypanowa (0,4% w/v)</td><td>Sigma</td><td>T8154</td><td></td></tr><tr><td>FEP Worek do hodowli komórkowych pokryty teflonem, mały</td><td>CellGenix</td><td>72-C</td><td></td></tr><tr><td>Worek do hodowli komórkowych FEP pokryty teflonem, duży</td><td>CellGenix</td><td>197-C</td><td></td></tr></tbody></table>

izolacja ludzkich monocytów przez wirowanie z podwójnym gradientem i ich różnicowanie do makrofagów w workach do hodowli komórkowych pokrytych teflonem

Isolation of Human Monocytes by Double Gradient Centrifugation and Their Differentiation to Macrophages in Teflon-coated Cell Culture Bags

Ludzkie makrofagi biorą udział w wielu procesach patologicznych, począwszy od chorób zakaźnych, a skończywszy na raku. Stanowią one zatem cenne narzędzie do zrozumienia mechanizmów leżących u podstaw tych chorób. W związku z tym przedstawiamy prosty protokół izolacji ludzkich monocytów z kożuchówki, a następnie procedurę różnicowania, która skutkuje wysoką wydajnością makrofagów. Technika ta opiera się głównie na powszechnie dostępnym sprzęcie laboratoryjnym, a tym samym zapewnia efektywny kosztowo i czasowo sposób uzyskiwania dużych ilości ludzkich makrofagów. Krótko mówiąc, kożuchy od zdrowych dawców krwi są poddawane wirowaniu w gradionym tempie podwójnej gęstości w celu pobrania monocytów z krwi obwodowej. Te monocyty są następnie hodowane w workach do hodowli komórkowych pokrytych teflonem z fluorowanego etylenu i propylenu (FEP) w obecności czynnika stymulującego tworzenie kolonii makrofagów (M-CSF). Zróżnicowane makrofagi można łatwo zebrać i wykorzystać do późniejszych badań i testów funkcjonalnych. W protokole zostaną podkreślone ważne metody kontroli jakości i walidacji etapów izolacji i różnicowania. Podsumowując, opisany tutaj protokół umożliwia naukowcom rutynowe i powtarzalne izolowanie ludzkich makrofagów bez konieczności stosowania kosztownych narzędzi. Co więcej, modele chorób mogą być badane w syngenicznym systemie ludzkim, omijając użycie mysich makrofagów.

Pierwsze wirowanie w gradiencie gęstości z użyciem Ficollu pozwala na uzyskanie białej interfaszy zawierającej PBMC (Rysunek 1A) t. j. limfocyty i monocyty. Można to potwierdzić poprzez barwienie metodą May-Gruenwalda (Rysunki 1B i C) zebranych komórek, w której widoczny jest zarówno wysoki stosunek jądra do cytoplazmy (typowy dla limfocytów), jak i jądra o kształcie fasolkowatym lub pierścieniowatym (typowe dla monocytów). Gdy komórki te zostaną następnie naniesione na drugi gradient gęstości z wykorzystaniem Percoll, monocyty mogą zostać dodatkowo oddzielone od limfocytów i ponownie pojawić się w postaci białej interfazy (Ryciny 1D-F). W przypadku każdej warstwy leukocytarnej opisane dwustopniowe wirowanie w gradiencie gęstości pozwala rutynowo uzyskać 150 ± 40 x 106 monocyty, które mogą zostać zróżnicowane do 70 ± 30 x 106 makrofagi (Rycina 2) na warstwę leukocytową. Średnia wydajność makrofagów z 20 niezależnych preparatów wyniosła 47 ± 14% całkowitej liczby wyizolowanych monocytów.
Po wirowaniu w gradiencie Percoll w preparacie mogą nadal występować pozostałości komórek niemonocytarnych, co zależy od dawcy krwi, a także od dokładności procesu izolacji. Jednak po fazie różnicowania trwającej 6-7 dni preparat składa się głównie z dojrzałych makrofagów (Rycina 3), które można dodatkowo wzbogacić dzięki ich przyleganiu do powierzchni plastikowych – cechy, której nie wykazują przypadkowe komórki zanieczyszczające (Ryciny 4A i B). Po wysianiu większość makrofagów wykazuje klasyczną morfologię przypominającą „smażone jajko”, choć występują również komórki o rozciągniętym, wrzecionowatym fenotypie (Ryciny 4C i D). Odzwierciedla to rozkład F-aktyny w cytoplazmie oraz skupiska adhezyjne. Zróżnicowane komórki charakteryzują się ekspresją CD45, CD14, CD16, CD206 (receptor mannozowy), CD11b i CD11c, które są typowymi markerami dojrzałych makrofagów (Rycina 5). Obecność CD11b przemawia przeciwko dominującej różnicowaniu w kierunku komórek dendrytycznych, co potwierdza fakt, że komórki są negatywne pod kątem markera komórek dendrytycznych CD209 (DC-SIGN).
Po procesie różnicowania komórki pozostają funkcjonalnie i metabolicznie aktywne przez około 5-7 dni (Rysunek 6), co można zwizualizować za pomocą barwienia calcein AM oraz ocenić na podstawie ich zdolności do pochłaniania pęcherzyków zewnątrzkomórkowych wydzielanych przez komórki nowotworowe. Ponadto komórki mogą nadal być aktywowane, co wykazano np. poprzez stymulację lipopolisacharydem (LPS), która prowadzi do ekspresji kilku genów prozapalnych (Rysunek 7).
<img alt="Oddzielanie krwi; probówki do wirowania; obrazy mikroskopowe; badanie morfologii komórek; analiza eksperymentalna." fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/51554/51554fig1highres.jpg" width="500" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="Rysunek 1"> 
Rysunek 1. Wygląd i skład warstwy PBMC oraz monocytów po podwójnym wirowaniu w gradiencie gęstości.Fotografia przedstawiająca (A) prążek PBMC po gradiencie Ficoll oraz (D) fazę monocytów po wirowaniu w izoosmotycznym gradiencie Percoll. Barwienia metodą May-Grünwalda preparatów cytospinowych frakcji PBMC (B, C) oraz pozostałych monocytów (E, F). Pasek skali = 200 µm w B i E, = 50 µm w C i F.
<img alt="Wykres porównania liczby komórek, monocyty vs. makrofagi, wykres rozrzutu, dane z badań biologicznych." fo:content-width="3in" src="/files/ftp_upload/51554/51554fig2highres.jpg" width="300" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="Rysunek 2"> 
Rysunek 2. Wydajność monocytów i makrofagów. Reprezentatywne zliczenia komórek izolowanych monocytów i makrofagów z 20 preparatów warstwy leukocytarnej.
<img alt="Typy komórek krwi: analiza mikroskopowa monocytów, limfocytów i makrofagów; wykresy rozkładu wielkości." fo:content-width="6in" src="/files/ftp_upload/51554/51554fig3highres.jpg" width="600" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="Rysunek 3"> 
Rysunek 3. Mikrofotografie i pomiary wielkości komórek monocytów i makrofagów. Mikroskopia kontrastowa zawiesiny komórek monocytarnych przed (A) i po (B) różnicowaniu w makrofagi. Odpowiednie histogramy wielkości komórek monocytów (C) i makrofagów (D). Pasek skali = 100 µm.
<img alt="Porównanie mikroskopowe kultur komórkowych, pole jasne vs. znakowanie fluorescencyjne, analiza struktury komórkowej." fo:content-width="6in" src="/files/ftp_upload/51554/51554fig4highres.jpg" width="600" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="Rycina 4"> 
Rycina 4. Morfologia i organizacja cytoszkieletu makrofagów adherentnych. Mikroskopia kontrastowa makrofagów adherentnych przed (A) i po (B) usunięciu komórek nieadherentnych. (C, D) Barwienie faloidyną-TRITC aktyny filamentowej w adherentnych, niestymulowanych makrofagach. Pasek skali = 100 µm w A-C, 20 µm w D. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/51554/51554fig4highres.jpg" target="_blank">Aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny, kliknij tutaj.</a>
<img alt="Wyniki cytometrii przepływowej wykazujące markery komórkowe: FSC-A vs SSC-A, CD11b, CD11c, CD14, CD45, CD206, CD209, CD16." fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/51554/51554fig5highres.jpg" width="500" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="Rysunek 5"> 
Rysunek 5. Immunofenotyp zróżnicowanych makrofagów. Analiza cytometrii przepływowej makrofagów po 6 dniach różnicowania w workach do hodowli komórkowej FEP powlekanych teflonem (oznaczone na czerwono). Odpowiednie kontrole izotypowe przedstawiono w kolorze szarym. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/51554/51554fig5highres.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.</a>
<img alt="Analiza żywotności komórek; obrazy z mikroskopu fluorescencyjnego przedstawiające barwienie żywe/martwe kultur komórkowych." fo:content-width="6in" src="/files/ftp_upload/51554/51554fig6highres.jpg" width="600" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="Rysunek 6"> 
Rysunek 6. Wchłanianie mikropęcherzyków komórek nowotworowych przez makrofagi. Mikrografie makrofagów adherentnych po ekspozycji na pochodne z komórek nowotworowych mikropęcherzyki znakowane PKH26 (czerwona fluorescencja). Obrazy są nałożone na odpowiadające im (A) obrazy w polu jasnym lub (B) barwienie cytozolu barwnikiem żywotności calceina AM. Paski skali = 100 µm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/51554/51554fig6highres.jpg" target="_blank">Aby wyświetlić większą wersję tego rysunku, kliknij tutaj.</a>
<img alt="Wykres słupkowy ekspresji genów; dane dotyczące mRNA/cytokin; IL-1ß, Wnt5a, MMP, IL-6, TNFα; +LPS vs ctl." fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/51554/51554fig7highres.jpg" width="500" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="Figure 7"> 
Rycina 7. Zwiększona ekspresja IL-1β, Wnt5a, TNFα, IL-6, MMP-2, MMP-7 oraz MT1-MMP po stymulacji makrofagów LPS (100 ng/ml) przez 24 h. Ekspresję genów mierzono za pomocą ilościowego RT-PCR z próbek całkowitego RNA (A) i normalizowano względem ekspresji HPRT1 oraz GNB2L1. Przedstawione wartości to krotność zmian w porównaniu z kontrolą nieleczoną (średnie ± SD, n=5, *p&lt;0.05, **p&lt;0.01, ***p&lt;0.001). Indukcję TNFα i IL-6 pod wpływem stymulacji LPS potwierdzono dodatkowo za pomocą metody ELISA (B) (średnie ± SD, *p&lt;0.05).

Prezentujemy prosty i skuteczny protokół do generowania ludzkich makrofagów. Płaszcze kożuchowe są przetwarzane przez wirowanie gradientowe o podwójnej gęstości, a izolowane monocyty są następnie różnicowane do makrofagów w workach do hodowli komórkowych pokrytych teflonem. Maksymalizuje to wydajność makrofagów i ułatwia pobieranie komórek do kolejnych eksperymentów.

Izolacja ludzkich monocytów przez wirowanie z podwójnym gradientem i ich różnicowanie do makrofagów w workach do hodowli komórkowych pokrytych teflonem

Human macrophages are involved in a plethora of pathologic processes ranging from infectious diseases to cancer. Thus they pose a valuable tool to ...

Ogólnym celem niniejszej procedury jest otrzymanie ludzkich makrofagów w dużej ilości i o wysokiej jakości przy użyciu standardowego wyposażenia laboratoryjnego. Osiąga się to najpierw poprzez wirowanie krwi z warstw leukocytarnych (Buffy coats) w gradiencie Ficolla w celu wyizolowania PBMC. Następnie, w gradiencie percoll, monocyty są oddzielane od limfocytów.Następnie monocyty wysiewa się do worków do hodowli komórkowej powlekanych teflonem i poddaje różnicowaniu. Po sześciu lub siedmiu dniach makrofagi są zbierane i wysiewane do dalszych badań. Uzyskane komórki powinny wykazywać ekspresję typowych markerów dojrzałych makrofagów i reagować na różne bodźce, takie jak kokultywacja z komórkami nowotworowymi lub stymulacja LPS. Główną zaletą tej techniki w porównaniu z istniejącymi metodami, takimi jak przeciwprądowa separacja, wirowanie czy magnetyczna separacja komórek (MACS), jest możliwość generowania ludzkich makrofagów przy użyciu standardowego wyposażenia laboratoryjnego, bez konieczności stosowania drogich odczynników lub aparatury.Choć metoda ta jest łatwa w wykonaniu, osoby rozpoczynające pracę z tą techniką mogą mieć trudności z wizualizacją i oddzielaniem poszczególnych populacji komórek w gradientach gęstości. Dlatego też demonstracja wizualna tych kroków pomoże przezwyciężyć te trudności. Protokół ten jest wykonywany w dwóch powtórzeniach, aby ułatwić wyważenie wirników.Należy rozpocząć od zdezynfekowania dwóch woreczków z frakcją warstwy leukocytowej krwi warstwowej. Następnie przenieść warstwy leukocytowe do dwóch probówek o objętości 50 ml dla każdej z nich. Przygotować trzy probówki o objętości 50 ml zawierające 15 ml roztworu FI w temperaturze pokojowej o gęstości 1,077 g/ml.Następnie powoli i ostrożnie nanieś warstwę 30 do 35 mililitrów puffy coat na każdą probówkę z FI call. Warstwy nie powinny się wymieszać. Wirować te probówki bez hamowania przy 400 G przez pół godziny. W temperaturze pokojowej, pomiędzy dwiema fazami, utworzy się biały pierścień mononuklearnych komórek krwi obwodowej.Usunąć te warstwy za pomocą plastikowej pipety. Połączyć warstwy z trzech probówek od każdego dawcy do dwóch probówek o pojemności 50 ml na dawcę. Przemyć zebrane komórki, dodając 1 mM PBS-EDTA do linii 40 ml, a następnie wirować je z prędkością 300 G przez 10 minut bez hamowania w temperaturze pokojowej.Następnie odessać i odrzucić nadsączniki. Powtórzyć płukanie, a następnie w P-B-S-C-D-T-A resuspenderować i połączyć osady od każdego dawcy w 20 ml RPMI z FCS bez czerwieni fenolowej. W tym momencie dla każdego dawcy powinna znajdować się jedna probówka z komórkami.Teraz przygotuj drugą mieszaninę gradientu gęstości, łącząc 23,13 mililitrów roztworu Percoll o temperaturze pokojowej z 1,87 mililitrów 10x PBS w probówce o pojemności 50 mililitrów. Przygotuj jedną probówkę mieszaniny na każde dwie próbki. Następnie przenieś 23 mililitry mieszaniny do nowej probówki o pojemności 50 mililitrów.Następnie należy dodać 27 ml medium RPMI z FCS i czerwienią fenolową. W wyniku otrzymamy roztwór osmotyczny do komórek o stężeniu 46% ISO. Teraz dla każdego dawcy należy przenieść 25 ml 46% roztworu do probówki o pojemności 50 ml i ostrożnie nałożyć na niego mieszaninę komórek.Dwie fazy powinny być wyraźnie rozróżnialne ze względu na kolor, bez widocznej przerwy między nimi. Wirować komórki przez pół godziny w temperaturze pokojowej przy 550 G. Biały pierścień monocytów zgromadzi się pomiędzy dwiema fazami. Zebrać te komórki do probówki o pojemności 50 ml za pomocą plastikowej pipety.Przemyj monocyty 1 mM PBS-EDTA, dopełniając objętość do kreski 50 ml. Następnie odwiruj je przy 400 G bez hamowania przez 10 minut w temperaturze pokojowej, odlej nadsącz i resuspenduj osad z monocytów w 20 ml pożywki. Następnie przejdź do następnej sekcji.W niniejszym protokole jako komora hodowlana wykorzystuje się worki hodowlane powlekane teflonem FEP. Należy rozpocząć od oszacowania liczby zebranych monocytów. Monocyty są duże i często mają nieregularny kształt.Nie należy liczyć mniejszych limfocytów. Jeśli dostępnych jest od 100 do 150 milionów komórek od jednego dawcy, należy przygotować 180 ml uzupełnionego medium RPMI. W przypadku mniejszej liczby komórek należy przygotować 30 ml medium na każde 30 do 50 milionów komórek.Do 20 mililitrowej aliquoty ostrożnie wmieszać komórki w 180 mililitrów przygotowanego medium. Następnie wprowadzić komórki do worka hodowlanego za pomocą strzykawki perfuzyjnej o pojemności 50 mililitrów podłączonej do korka worka. Usunąć strzykawkę, wypchnąć pozostałe powietrze i zamknąć korek stożkiem.Następnie inkubuj worki przez sześć do siedmiu dni w atmosferze 5% carbon dioxide. Po sześciu do siedmiu dniach inkubacji przenieś worki z hodowlą na lód w celu zbioru komórek; zanurz worki całkowicie w lodzie i pozostaw je do schłodzenia od jednej do trzech godzin, aby odkleić komórki. Następnie delikatnie przeciągnij worki przez krawędź około 10 razy.Następnie dokładnie zdezynfekuj zewnętrzną stronę worków. Zastąp stożek zatyczki strzykawką o pojemności 50 mililitrów. Następnie odessaj zawiesinę komórkową i przenieś ją do probówki o pojemności 50 mililitrów.Po zebraniu wszystkich probówek, odwiruj je z prędkością 400 G przez 10 minut w temperaturze pokojowej, następnie odessaj nadsącz i połącz wszystkie komórki w 10 milliliters medium RPMI z dodatkiem FCS. Następnie policz komórki w ten sam sposób co wcześniej. Licz wyłącznie makrofagi, ponieważ w próbce mogą znajdować się pozostałości limfocytów.Następnie wykorzystaj komórki do odpowiedniej aplikacji, aby ponownie użyć worków hodowlanych. Przemyj je dwukrotnie 70% etanolem. Następnie napełnij je 50 mililitrami 70% etanolu i inkubuj przez noc w temperaturze pokojowej; następnego dnia przemyj worki trzykrotnie sterylnym PBS.Następnie należy zawinąć je w papier do sterylizacji i poddać autoklawowaniu. Worki można z łatwością wykorzystać ponownie 10 razy. Centryfugacja w gradiencie gęstości pozwala uzyskać białą warstwę przejściową zawierającą limfocyty i monocyty.Tutaj badamy pierwszą frakcję gradientu gęstości. Barwienie tych komórek wykazuje zarówno wysoki stosunek jądra do cytoplazmy, typowy dla limfocytów, jak i jądra o kształcie fasolki lub pierścienia, typowe dla monocytów.Barwienia te przedstawiają wyniki drugiego gradientu. Każda warstwa leukocytarna (buffy coat) dostarcza około 150 milionów monocytów, które mogą zróżnicować się w około 70 milionów makrofagów. W 20 preparatach 47% monocytów przekształciło się w makrofagi.Oczyszczone makrofagi można dodatkowo wzbogacić poprzez ich przyleganie do powierzchni plastikowych, co jest cechą, której nie posiadają komórki zanieczyszczające. Po wysianiu większość makrofagów wykazuje morfologię przypominającą jajko sadzone, podczas gdy inne mają rozciągnięty fenotyp wrzecionowaty. Komórki te charakteryzują się ekspresją kilku markerów.Typowe dla dojrzałych makrofagów. Ekspresja CD 11 B przemawia przeciwko różnicowaniu w komórki dendrytyczne, podobnie jak brak ekspresji CD 2 0 9. Po różnicowaniu komórki pozostają funkcjonalnie i metabolicznie aktywne przez pięć do siedmiu dni.Barwienie wapniem żywych komórek wykazuje ich zdolność do pobierania czerwono znakowanych pęcherzyków zewnątrzkomórkowych uwalnianych przez komórki nowotworowe. Dodatkowo makrofagi mogą zostać aktywowane; na przykład stymulacja lipopolisacharydem prowadzi do ekspresji kilku genów prozapalnych. Po przeprowadzeniu tej procedury wyizolowane makrofagi mogą zostać poddane szerokiemu spektrum testów funkcjonalnych w celu uzyskania odpowiedzi na podstawowe pytania dotyczące biologii makrofagów w zdrowiu i chorobie.Po obejrzeniu tego filmu powinni Państwo posiadać gruntowną wiedzę na temat tego, jak generować dużą liczbę ludzkich makrofagów. Należy jednak pamiętać, że praca z próbkami ludzkiej krwi wiąże się z potencjalnym ryzykiem zakażenia.

isolation-human-monocytes-double-gradient-centrifugation-their

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Immunologia i infekcje

Izolacja ludzkich monocytów przez dwukrotną gradientową centryfugację i ich różnicowanie w makrofagi w pokrytych teflonem workach do hodowli komórkowej

W tym filmie pokazujemy izolację monocytów z pełnej krwi ludzkiej za pomocą immunomagnetycznej separacji ujemnej. Wyizolowane monocyty można wykorzystać do dalszej analizy.

Izolacja monocytów z krwi pełnej za pomocą negatywnej selekcji immunomagnetycznej

Ten film pokazuje proces wstępowania pierwotnych monocytów do makrofagów. Pierwotne ludzkie monocyty można wyizolować i zróżnicować do fenotypu prozapalnego podobnego do M1 przy użyciu czynnika stymulującego tworzenie kolonii granulocytów-makrofagów (GM-CSF) lub do fenotypu przeciwzapalnego podobnego do M2 za pomocą czynnika stymulującego tworzenie kolonii makrofagów (M-CSF).

Hodowla in vitro i różnicowanie pierwotnych monocytów do makrofagów

W tym filmie demonstrujemy procedurę indukowania różnicowania i polaryzacji monocytów pochodzących z krwi obwodowej na makrofagi M1 lub M2. Inkubacja z czynnikiem stymulującym tworzenie kolonii granulocytów-makrofagów, lipopolisacharydem i interferonem-gamma daje prozapalne makrofagi M1, podczas gdy inkubacja z czynnikiem stymulującym tworzenie kolonii makrofagów i interleukiną-4 indukuje przeciwzapalną produkcję makrofagów M2.

Różnicowanie i polaryzacja komórek pochodzących z monocytów w komórki podobne do makrofagów

Makrofagi pochodzące z monocytów są ważnymi komórkami wrodzonego układu odpornościowego. W tym miejscu opisujemy łatwy w użyciu model in vitro do generowania tych komórek. Korzystając z wirowania gradientowego, izolacji ujemnych kulek i określonych warunków hodowli komórek, można wygenerować makrofagi pochodzące z monocytów do badań fenotypowych i funkcjonalnych.

Model in vitro do badania heterogeniczności różnicowania i polaryzacji ludzkich makrofagów

Przedstawiono protokół dla hodowli komórkowej makrofagów makrofagów stymulujących tworzenie kolonii (M-CSF) zróżnicowanych ludzkich makrocytów pochodzących z monocytów. Protokół wykorzystuje krioprezerwację monocytów w połączeniu z ich masowym różnicowaniem do makrofagów. Następnie zebrane makrofagi można następnie wysiać w studzienkach hodowlanych o wymaganej gęstości komórek do przeprowadzenia eksperymentów.

Posiew czynnika stymulującego tworzenie kolonii makrofagów Zróżnicowane ludzkie makrofagi pochodzące z monocytów

Przedstawiamy protokół uzyskiwania sygnatur proteomicznych ludzkich makrofagów i stosowania go do określania wpływu środowiska o niskiej zawartości tlenu na polaryzację makrofagów.

Analiza proteomiczna polaryzacji ludzkich makrofagów w środowisku o niskiej zawartości tlenu

Prezentowany tutaj jest zoptymalizowany protokół izolacji, hodowli, transfekcji i różnicowania ludzkich pierwotnych monocytów od osób zakażonych wirusem HIV i zdrowych osób kontrolnych.

Izolacja, transfekcja i hodowla pierwotnych ludzkich monocytów

Makrofagi podobne do M2 związane z nowotworami (TAM) są związane z progresją guza i złym rokowaniem w raku. Protokół ten służy jako szczegółowy przewodnik do powtarzalnego różnicowania i polaryzacji komórek podobnych do monocytów THP-1 w makrofagi podobne do M2 w ciągu 14 dni. Model ten jest podstawą do badania przeciwzapalnego działania TAM w mikrośrodowisku guza.

Różnicowanie i polaryzacja makrofagów do fenotypu podobnego do M2 przy użyciu ludzkiej linii komórkowej białaczki THP-1 podobnej do monocytów

Tutaj prezentujemy szczegółowy protokół oceny potencjału immunomodulacyjnego powierzchni implantów in vitro, mający na celu poprawę wiarygodności i odtwarzalności obecnych protokołów oraz promowanie dalszych badań. Profile cytokin wydzielniczych, ekspresję mRNA i markery powierzchni komórek monitorowano za pomocą makrofagów pochodzących z monocytów krwi w celu zbadania polaryzacji makrofagów hodowanych na tytanie.

Polaryzacja i charakterystyka ludzkich makrofagów pochodzących z monocytów typu M1 i M2 na powierzchniach implantów

Tutaj prezentujemy protokół do badania interakcji pierwotnych ludzkich makrofagów pochodzących z monocytów z sferoidą guza w trójwymiarowej (3D) matrycy kolagenu I, z możliwością porównania wpływu rozpuszczalnych i fizycznych właściwości mikrośrodowiska na inwazję komórek.

Test koinwazji sferoidów makrofagów i guzów

Monocyty i makrofagi to bardzo plastyczne i reprogramowalne komórki odpornościowe, kluczowe dla zdrowia i choroby. Wyczuwają i reagują na szeroki zakres bodźców, przyjmując określone programy różnicowania i fenotypy. Ustandaryzowaliśmy model in vitro do badania polaryzacji i przeprogramowania makrofagów, zapewniając cenne narzędzie do badań.

Przeprogramowanie modelu ludzkich makrofagów pochodzących z monocytów do testów in vitro

Naucz się izolować monocity z krwi za pomocą wirowania z podwójnym gradientem gęstości i różnicować je do makrofagów w workach pokrytych teflonem. Ta metoda pozwala uzyskać około 70 milionów makrofagów z jednego buforowego koagulatu przy użyciu standardowego wyposażenia laboratoryjnego.

Izolacja ludzkich monocytów przez wirowanie z podwójnym gradientem i ich różnicowanie do makrofagów w workach do hodowli komórkowych pokrytych teflonem (Wideo) | JoVE Journal

Izolacja ludzkich monocytów przez wirowanie z podwójnym gradientem i ich różnicowanie do makrofagów w workach do hodowli komórkowych pokrytych teflonem

Przeglądaj więcej filmów