Metoda pozyskiwania komórek pierwotnego raka jajnika z próbek litych
4 lutego 2014
To badanie opisuje szczegółową metodę izolacji i charakterystyki komórek pierwotnego raka jajnika z litych próbek klinicznych. Próbki kliniczne raka jajnika są poddawane trawieniu enzymatycznemu w celu uzyskania żywotnych, wolnych od fibroblastów komórek nabłonkowego raka jajnika (EOC), które doskonale nadają się do dalszych zastosowań.
Ogólnym celem tej procedury jest wyizolowanie i scharakteryzowanie komórek pierwotnego raka jajnika z litych próbek klinicznych. Osiąga się to poprzez najpierw pobranie próbki guza jajnika i umieszczenie jej na szalce Petriego. Drugim krokiem jest pocięcie próbki na kawałki i przeniesienie ich do stożkowej probówki z odczynnikami do wytrawiania w celu inkubacji.
Następnie zawiesina komórkowa jest przepuszczana przez filtr, w którym zbierane są tylko komórki Do wirowania ostatnim krokiem jest odrzucenie supernatantu i ponowne zawieszenie komórek w pożywkach w celu inkubacji przez noc. Ostatecznie komórki nabłonkowego raka jajnika będą rosły w hodowli przez tygodnie, co pozwala na dalsze zastosowania. Metoda ta może pomóc odpowiedzieć na kluczowe pytania w dziedzinie raka jajnika, takie jak najlepsza opcja leczenia dla każdej pacjentki.
Implikacje tej techniki rozciągają się w kierunku leczenia raka jajnika, ponieważ pozwala nam ona na wykorzystanie bardziej realistycznych kultur komórkowych, które są bardzo podatne na manipulacje genetyczne i są bardziej przydatne w testach przesiewowych leków. Na początek uzupełnij 500 mililitrów delcos, zmodyfikowanych orłów, pożywki lub DMEM z 10% płodowej surowicy bydlęcej lub FBS i 1% penicyliny, streptomycyny lub ps. Przechowywać podłoże w temperaturze czterech stopni Celsjusza.
Pobrać próbkę z sali operacyjnej i przetransportować ją na lodzie do laboratorium, nadal w transportowanym pojemniku. Umieścić próbkę w biologicznym kapturze bezpieczeństwa. Przenieść próbkę z 50-mililitrowej stożkowej rurki na szalkę Petriego o wymiarach 60 milimetrów na 60 milimetrów zawierającą 10 mililitrów świeżego, lodowatego PBS.
Następnie, używając sterylnej żyletki, pokrój próbkę na dwa milimetry lub mniejsze kawałki. Następnie potraktuj DMEM tubką z pastą dyskową w 15-litrowej stożkowej tubie. Przenieś zmielone tkanki do probówki z mieszanką DMEM dispa dwa.
Następnie inkubować próbkę w 5% dwutlenku węgla i temperaturze 37 stopni Celsjusza przez 30 minut. Ręcznie mieszaj gnojowicę komórkową co pięć minut, aby zapewnić optymalne trawienie. Po inkubacji przenieś zawiesinę komórek przez sitko o siatce 70 mikrometrów umieszczone na 50-mililitrowej stożkowej rurce.
Delikatnie dociśnij siatkę za pomocą tłoka strzykawki, wyrzuć wszelkie niezwiązane tkanki pozostałe na wierzchu siatki i zbierz uzyskaną zawiesinę komórek w sterylnej stożkowej probówce o pojemności 50 mililitrów. Następnie odwirować. Stożkowa rurka o ciśnieniu 320 razy G przez siedem minut w temperaturze czterech stopni Celsjusza.
Wyrzucić supernatant i ponownie zawiesić osad komórkowy w 10 mililitrach DMEM zawierającym 10% FBS i 1% ps. Następnie przenieś zawiesinę komórkową na szalkę Petriego i inkubuj zawiesinę w temperaturze 5% dwutlenku węgla i 37 stopni Celsjusza. Zmień pożywkę 24 godziny po początkowym posiewie, aby usunąć resztki komórkowe i większość erytrocytów obecnych w hodowli.
Na koniec należy zmieniać pożywkę co trzy dni przez kolejne dwa tygodnie, po czym kultury pierwotnych komórek EOC są gotowe do dalszych zastosowań. Natychmiast po poszyciu. Nabłonkowe komórki raka jajnika lub komórki EOC pojawiają się jako zawiesiny pojedynczych komórek i w kępkach z erytrocytami i obfitością szczątków komórkowych.
Hodowla komórek EOC trzy dni po posiewie wykazuje częściowo przylegające klastry komórek EOC i mniejsze zanieczyszczenie erytrocytów. Tydzień po wstępnym posiewie hodowla komórkowa EOC staje się przypominającym wir skupiskiem komórek rozprzestrzeniających się na plastikowej kulturze tkankowej. Typową morfologię nabłonka kostki brukowej można zaobserwować w zlewającej się monowarstwie komórek EOC po 14 dniach w hodowli.
Po obejrzeniu tego filmu powinnaś dobrze zrozumieć, jak wyizolować i scharakteryzować pierwotne komórki raka jajnika z litych próbek klinicznych.
Wyświetl pełny transkrypt i uzyskaj dostęp do tysięcy filmów naukowych
Przegląd
Niniejsze badanie opisuje szczegółową metodę izolacji i charakterystyki pierwotnych komórek raka jajnika z litego materiału klinicznego. Procedura ta umożliwia hodowlę komórek nabłonkowego raka jajnika, co ułatwia dalsze zastosowania.
Kluczowe elementy badania
Dziedzina nauki
- Onkologia
- Biologia komórki
- Badania kliniczne
Wstęp
- Rak jajnika stanowi istotny problem zdrowotny, a dostępne opcje leczenia są złożone.
- Izolacja żywotnych komórek nowotworowych jest kluczowa dla medycyny personalizowanej.
- Obecne metody mogą nie pozwalać na uzyskanie czystych komórek raka nabłonkowej jajnika.
- Celem niniejszego badania jest usprawnienie procesu izolacji w celu uzyskania lepszych wyników badawczych.
Cel badania
- Wyizolowanie pierwotnych komórek raka jajnika z próbek klinicznych.
- Charakterystyka wyizolowanych komórek w celu ich dalszego wykorzystania.
- Pogłębienie wiedzy na temat opcji terapeutycznych dla pacjentek z rakiem jajnika.
Zastosowane metody
- Pobieranie próbek guzów jajnika.
- Trawienie enzymatyczne próbek tkanek.
- Filtracja w celu wyizolowania żywych komórek.
- Wirowanie i resuspensja w podłożu hodowlanym.
Główne wyniki
- Skuteczna izolacja komórek raka nabłonkowego jajnika pozbawionych fibroblastów.
- Komórki mogą być hodowane przez wiele tygodni, co umożliwia prowadzenie szeroko zakrojonych badań.
- Metoda ta zapewnia niezawodne źródło komórek nowotworowych do celów badawczych.
- Potencjał w zakresie opracowywania spersonalizowanych strategii leczenia.
Wnioski
- Opisana metoda jest skuteczna w izolowaniu komórek raka jajnika.
- Wspiera ona dalsze badania nad metodami leczenia raka jajnika.
- Przyszłe badania mogą opierać się na tej metodzie w celu poprawy wyników leczenia pacjentek.
Najczęściej Zadawane Pytania
Znaczenie dla przemysłu
Utrwalanie pierwotnych komórek raka jajnika z litego materiału klinicznego umożliwia tworzenie modeli istotnych z punktu widzenia pacjenta, co ogranicza zależność od pasażowanych linii komórkowych z nagromadzonymi artefaktami genetycznymi. Podejście to wspiera ograniczanie ryzyka mechanistycznego w walidacji celów terapeutycznych poprzez zachowanie heterogeniczności guza oraz biologii specyficznej dla miejsca występowania zmian pierwotnych lub przerzutowych. Powstałe kultury stanowią odnawialne źródło do późniejszego screeningu, co zwiększa wiarygodność prognostyczną w procesie podejmowania decyzji na etapie przedklinicznym.
Strategiczne zastosowania w badaniach i rozwoju biofarmaceutycznym
Wczesne odkrywanie i walidacja celu
- Wartość naukowa: Umożliwia weryfikację hipotez terapeutycznych przy użyciu komórek odzwierciedlających profil genetyczny i fenotypowy oryginalnego materiału klinicznego.
- Wartość operacyjna: Redukuje niejednoznaczność mechaniczną poprzez unikanie artefaktów związanych z liniami komórkowymi poddawanymi długotrwałym pasażom.
- Wartość prognostyczna: Wspiera selekcję projektów w portfolio dzięki biologicznej walidacji celu w systemie istotnym dla danej jednostki chorobowej, co zmniejsza ryzyko badawcze.
Przesiewy i opracowywanie testów
- Wartość naukowa: Pozwala na otrzymanie komórek raka nabłonkowe jajnika odpowiednich do przesiewania leków z zachowaniem właściwości tumorigennych.
- Wartość operacyjna: Zapewnia zstandaryzowane, powtarzalne zawiesiny komórkowe po trawieniu enzymatycznym i filtracji.
- Skalowalność: Umożliwia przygotowanie wielu kultur pierwotnych z różnych próbek do równoległego przeprowadzania testów.
Badania translacyjne i przedkliniczne
- Ciągłość translacyjna: Łączy etap odkryć z badaniami przedklinicznymi poprzez wykorzystanie komórek pochodzących bezpośrednio z próbek pobranych od pacjentów.
- Zgodność biomarkerów: Wspiera ocenę celów terapeutycznych i biomarkerów w kontekście odzwierciedlającym guz pacjenta.
- Postęp z uwzględnieniem ryzyka: Dostarcza informacji niezbędnych do podjęcia decyzji o kontynuacji lub przerwaniu badań (go/no-go) na podstawie odpowiedzi w komórkach pierwotnych, które lepiej przewidują wyniki kliniczne.
Integracja potoku i przepływu pracy
Metoda ta wpisuje się w kontinuum procesu odkrywania, od wczesnych badań biologicznych po identyfikację związku wiodącego, dostarczając komórek pierwotnych, które zwiększają trafność późniejszych etapów przesiewowych i walidacyjnych.
- Biologia odkrywcza: Wspiera testowanie hipotez i wyjaśnianie szlaków sygnałowych z wykorzystaniem komórek zachowujących specyficzne cechy nowotworowe.
- Przesiewanie: Dostarcza gotowych do analizy pierwotnych komórek raka nabłonkowego jajnika o mierzalnym wzroście i morfologii do oceny związków chemicznych.
- Analityka: Umożliwia pomiar odpowiedzi na lek, proliferacji oraz zmian fenotypowych w genetycznie stabilnym systemie o niskim numerze pasażu.
- Badania translacyjne: Zachowuje istotność kliniczną dzięki bezpośredniemu wywodzeniu z próbek materiału biologicznego, wspierając walidację biomarkerów i celów terapeutycznych.
- Ponowne wykorzystanie w przedsiębiorstwie: Tworzy platformę wielokrotnego użytku do generowania kultur pierwotnych z różnych próbek, zmniejszając zależność od ograniczonych linii komórkowych.
Wpływ operacyjny i przedsiębiorczy
- Wartość naukowa: Zwiększa pewność prognostyczną dzięki wykorzystaniu komórek odzwierciedlających heterogeniczność i biologię oryginalnego guza.
- Wartość operacyjna: Zapewnia powtarzalność poprzez standaryzację etapów trawienia enzymatycznego, filtracji i inicjacji hodowli.
- Wartość strategiczna: Poprawia efektywność kapitałową poprzez redukcję ryzyka niepowodzenia na późnych etapach dzięki lepszej walidacji celów w badaniach przedklinicznych.
- Wpływ na portfolio: Umożliwia priorytetyzację kandydatów skorygowaną o ryzyko, w oparciu o aktywność w pierwotnych komórkach pochodzących od pacjentów.
Uwagi dotyczące wdrożenia
- Wymaga doświadczenia w sterylnym obchodzeniu się z tkankami, trawieniu enzymatycznym oraz technikach pierwotnych hodowli komórkowych.
- Zależy od dostępu do świeżych lub odpowiednio zakonserwowanych próbek guzów jajnika, pobranych w warunkach sterylnych.
- Wymaga zastosowania wirówki, filtracji oraz sprzętu do hodowli, w tym komór biosafety i inkubatorów CO2.
- Wiąże się z optymalizacją czasu trawienia i dysocjacji mechanicznej w celu maksymalizacji uzysku komórek nabłonkowych przy jednoczesnym ograniczeniu kontaminacji fibroblastami.
- Jest ograniczone przez dostępność i żywotność próbek, które mogą się różnić w zależności od czasu operacji i warunków transportu.
