Name: Metoda pozyskiwania komórek pierwotnego raka jajnika z próbek litych (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-02-04T15:00:00.000+00:00
Duration: 5 min 58 s
Description: Poznaj metodę izolacji komórek pierwotnego raka jajnika z próbek litych. Technika ta umożliwia uzyskanie czystych komórek nabłonkowych do długoterminowej hodowli i badań nad spersonalizowanymi terapiami onkologicznymi.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Chcielibyśmy podziękować personelowi Zakładu Pozyskiwania Tkanek Uniwersytetu Minnesoty za pomoc w pobieraniu próbek tkanek od pacjentów. Praca ta była wspierana przez Program Badań nad Rakiem Jajnika (OCRP) Departamentu Obrony OC093424 do MB, przez Randy Shaver Cancer Research and Community Fund do MB, przez Minnesota Ovarian Cancer Alliance do MB oraz przez fundusz Departamentu Onkologii Ginekologicznej do MB. Fundatorzy nie odgrywali żadnej roli w projektowaniu badania, gromadzeniu i analizie danych, podejmowaniu decyzji o publikacji lub przygotowaniu manuskryptu.

Oświadczenie etyczne 
Stałe próbki raka jajnika uzyskano z University of Minnesota Tissue Procurement Facility (TPF) po zatwierdzeniu przez Institutional Review Board Committee: Human Subject Board (IRB).
1. Konfiguracja odczynnika
<ol>
	<li>Przygotuj kompletną pożywkę DMEM, uzupełniając DMEM o 10% FBS i 100 jednostek penicyliny-streptomycyny. Przed użyciem przechowywać podłoże w temperaturze 4 °C i ogrzać je do temperatury 37 °C.</li>
	<li>Podwielokrotność porcji rozdrobnić II do oddzielnych objętości 5–10 ml, aby uniknąć wielokrotnego rozmrażania i przechowywać w temperaturze -20 °C w zamrażarce niezabezpieczonej przed zamarzaniem.</li>
</ol>
2. Pobieranie tkanek
<ol>
	<li>Zbierz stałe próbki raka jajnika (o wielkości ~5 g) w czasie operacji z obszarów makroskopowo zidentyfikowanych jako rak przez patologa. Próbki kliniczne są pozbawione elementów pozwalających na identyfikację i rejestrowane zgodnie z protokołami instytucjonalnymi.</li>
	<li>Umieść próbki w sterylnym, zakręcanym pojemniku na próbki polipropylenowe wypełnionym 30 ml lodowatego PBS. Przetransportować próbki z laboratorium patologii chirurgicznej do laboratorium badawczego w celu przetworzenia na lodzie i w ciągu 30 minut od pobrania próbki (ryc. 1).</li>
</ol>
3. Przetwarzanie tkanek
<ol>
	<li>Pracując w sterylnych warunkach, przenieść próbki na szalkę Petriego (60 mm x 60 mm) zawierającą 10 ml świeżego, lodowatego PBS i za pomocą sterylnej żyletki pociąć na najmniejsze możliwe kawałki (2 mm lub mniej) (rysunki 2A i 2B).</li>
	<li>Przenieść rozdrobnione tkanki do stożkowej probówki o pojemności 15 ml zawierającej 10 ml podgrzanej (37 °C przez 30 min) dypazy II (2,4 U/ml) w DMEM i inkubować w temperaturze 5% CO2 i 37 °C przez 30 min. Aby zapewnić optymalne trawienie próbek, należy ręcznie mieszać zawiesinę komórkową co 5 minut.</li>
	<li>Po 30 minutach inkubacji przenieść (za pomocą pipety serologicznej o pojemności 10 ml) zawiesinę komórek na sitko do komórek (oczko 70 μm) umieszczone na stożkowej probówce o pojemności 50 ml i delikatnie docisnąć siatkę za pomocą tłoka strzykawki. Odrzucić wszelką niezdysocjowaną tkankę (pozostałą na wierzchu siatki) i zebrać otrzymaną zawiesinę komórkową do sterylnej stożkowej probówki o pojemności 50 ml. Wirować przy 320 x g przez 7 minut w temperaturze 4 °C (rysunek 3).</li>
	<li>Odrzucić supernatant i ponownie zawiesić osad komórek w 10 ml DMEM zawierającym 10% FBS.</li>
	<li>Zawiesinę komórkową inkubować na szalce Petriego w temperaturze 5% CO2 i temperaturze 37 °C (ryc. 4).</li>
	<li>Zmienić podłoże po 24 godzinach od pierwszego poszycia. Pozwala to na usunięcie resztek komórkowych i większości erytrocytów obecnych w hodowli.</li>
	<li>Zmieniaj pożywkę co trzy dni przez kolejne dwa tygodnie, po czym kultury pierwotnego EOC są gotowe do dalszych zastosowań.</li>
</ol>

<ol><li>Kurman, R. J., Visvanathan, K., Roden, R., Wu, T. C., Ie M, S. hih <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Early+detection+and+treatment+of+ovarian+cancer%3A+shifting+from+early+stage+to+minimal+volume+of+disease+based+on+a+new+model+of+carcinogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Am.+J.+Obstet.+Gynecol%22%5BJournal%5D)">Early detection and treatment of ovarian cancer: shifting from early stage to minimal volume of disease based on a new model of carcinogenesis.</a> Am. J. Obstet. Gynecol. 198 (4), 351-356 (2008).</li>
<li>Kuhn, E., Kurman, R. J., Shih, I. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ovarian+Cancer+Is+an+Imported+Disease%3A+Fact+or+Fiction%5BTitle%5D)+AND+%22Curr.+Obstet.+Gynecol.+Rep%22%5BJournal%5D)">Ovarian Cancer Is an Imported Disease: Fact or Fiction.</a> Curr. Obstet. Gynecol. Rep. 1 (1), 1-9 (2012).</li>
<li>Sarojini, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Early+detection+biomarkers+for+ovarian%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Oncol%22%5BJournal%5D)">Early detection biomarkers for ovarian.</a> J. Oncol. , (2012).</li>
<li>Shepherd, T. G., Theriault, B. L., Campbell, E. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nachtigal+M.W.+Primary+culture+of+ovarian+surface+epithelial+cells+and+ascites-derived+ovarian+cancer+cells+from+patients%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Protoc%22%5BJournal%5D)">Nachtigal M.W. Primary culture of ovarian surface epithelial cells and ascites-derived ovarian cancer cells from patients.</a> Nat. Protoc. 1 (6), 2643-2649 (2006).</li>
<li>Tsao, S. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Characterization+of+human+ovarian+surface+epithelial+cells+immortalized+by+human+papilloma+viral+oncogenes+%28HPV-E6E7+ORFs%29%5BTitle%5D)+AND+%22Exp.+Cell.+Res%22%5BJournal%5D)">Characterization of human ovarian surface epithelial cells immortalized by human papilloma viral oncogenes (HPV-E6E7 ORFs).</a> Exp. Cell. Res. 218 (2), 499-507 (1995).</li>
<li>Auersperg, N., Maines-Bandiera, S. L., Dyck, H. G., Kruk, P. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Characterization+of+cultured+human+ovarian+surface+epithelial+cells%3A+phenotypic+plasticity+and+premalignant+changes%5BTitle%5D)+AND+%22Lab.+Invest%22%5BJournal%5D)">Characterization of cultured human ovarian surface epithelial cells: phenotypic plasticity and premalignant changes.</a> Lab. Invest. 71 (4), 510-518 (1994).</li>
<li>Brewer, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vitro+model+of+normal%2C+immortalized+ovarian+surface+epithelial+and+ovarian+cancer+cells+for+chemoprevention+of+ovarian+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Gynecol.+Oncol%22%5BJournal%5D)">In vitro model of normal, immortalized ovarian surface epithelial and ovarian cancer cells for chemoprevention of ovarian cancer.</a> Gynecol. Oncol. 98 (2), 182-192 (2005).</li>
<li>Sueblinvong, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Establishment%2C+characterization+and+downstream+application+of+primary+ovarian+cancer+cells+derived+from+solid+tumors%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Establishment, characterization and downstream application of primary ovarian cancer cells derived from solid tumors.</a> PLoS One. 7 (11), (2012).</li>
<li>Rockwell, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vivo-in+vitro+tumour+cell+lines%3A+characteristics+and+limitations+as+models+for+human+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Br.+J.+Cancer+Suppl%22%5BJournal%5D)">In vivo-in vitro tumour cell lines: characteristics and limitations as models for human cancer.</a> Br. J. Cancer Suppl. 41 (4), 118-122 (1980).</li>
<li>Wong, C., Chen, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+development%2C+application+and+limitations+of+breast+cancer+cell+lines+to+study+tamoxifen+and+aromatase+inhibitor+resistance%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Steroid.+Biochem.+Mol.+Biol%22%5BJournal%5D)">The development, application and limitations of breast cancer cell lines to study tamoxifen and aromatase inhibitor resistance.</a> J. Steroid. Biochem. Mol. Biol. 131 (3-5), 83-92 (2012).</li>
</ol>

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Lepsze zrozumienie etiologii i rozwoju raka jajnika ma kluczowe znaczenie dla poprawy wyników leczenia kobiet dotkniętych tą wyniszczającą chorobą. W tym kontekście, wykorzystanie uznanej i "komercyjnie dostępnej" linii komórkowej raka jajnika było niewątpliwie niezwykle przydatne. Jednak dziś wiemy, że linie komórek nowotworowych nie są reprezentatywne dla ludzkiego nowotworu, z którego pochodzą, pod wieloma względami, w tym z powodu braku heterogeniczności9,10.
W tym miejscu przed...

Pomimo stosunkowo niskiej częstości występowania, rak jajnika jest najbardziej śmiertelną z chorób ginekologicznych i piątą najczęstszą przyczyną zgonów z powodu raka wśród kobiet1,2. Wynika to głównie z braku wiarygodnych narzędzi i modeli, które wiernie odwzorowują początek i postęp choroby3. Większość naszej dzisiejszej wiedzy na temat raka jajnika jest możliwa dzięki zastosowaniu unieśmiertelnionych komórek nabłonka powierzchni jajnika (IOSE), linii komórkowych raka jajnika i komórek pierwotnego raka jajnika odzyskanych z płynu puchlinowego4-7. Niestety, ich stosowanie ma kilka ograniczeń, w tym szereg zmian genetycznych i fenotypowych związanych z procesem unieśmiertelniania lub pasażami in vitro oraz niejednorodność populacji wynikającą z preparatu płynu puchowego.
Dlatego pierwotne komórki raka jajnika pochodzące z możliwych do zidentyfikowania i specyficznych stałych próbek raka jajnika stanowią unikalne narzędzie do badania progresji raka jajnika.
Główne trudności związane z uzyskaniem tych złośliwych komórek wynikają z przerostu komórek zrębu lub fibroblastów wraz z utratą żywotności i przedwczesnym brakiem zdolności proliferacyjnych w hodowli tych komórek EOC. Obecnie istnieje kilka metod tworzenia zawiesin jednokomórkowych z guzów litych, za pomocą środków mechanicznych lub dysocjacji enzymatycznej, jednak niektóre techniki dają większą ilość preferowanego wyniku8. Tutaj pokazujemy, że trawienie enzymatyczne z dyspazą II powoduje skuteczną regenerację żywotnych, wolnych od fibroblastów komórek EOC. Uzyskane w ten sposób kultury EOC są wysoce podatne na manipulacje genetyczne i są również przydatne w testach przesiewowych leków, co wskazuje, że te kultury EOC są odpowiednie do wielu dalszych zastosowań.

<table><tbody><tr><td>1x PBS, sterylne&nbsp;</td><td>Invitrogen</td><td>14190-144</td><td></td></tr><tr><td>Zakręcana pokrywka, polipropylenowy pojemnik na próbki, sterylne</td><td>Thermo Scientific</td><td>02 1090</td><td></td></tr><tr><td>DMEM podłoże, sterylne&nbsp;</td><td>Invitrogen</td><td>11995-065</td><td></td></tr><tr><td>Surowica bydlęca płodowa, sterylna</td><td>Thermo Scientific Hyclone</td><td>SH30396.03</td><td></td></tr><tr><td>100x Penicylina-streptomycyna, płyn</td><td>Invitrogen</td><td>15140-122</td><td></td></tr><tr><td>Dispase II, sterylne</td><td>Roche</td><td>04942 078 001</td><td></td></tr><tr><td>Małe kleszczyki z cienką końcówką i ostrze skalpela, sterylne</td><td>Kleszcze Fisher Scientific</td><td>: 08-953E, ostrza: 08-927-5D</td><td></td></tr><tr><td>Nożyczki preparacyjne małe, sterylne</td><td>Fisher Scientific</td><td>08-945</td><td></td></tr><tr><td>15 ml Probówki stożkowe, sterylne</td><td>BD Falcon</td><td>352097</td><td></td></tr><tr><td>50 ml Probówki stożkowe, sterylne</td><td>Falcon</td><td>352027</td><td></td></tr><tr><td>10 ml Pipeta serologiczna&nbsp;</td><td>Corning</td><td>13-678-11E</td><td></td></tr><tr><td>6 ml Tłok strzykawki, sterylny&nbsp;</td><td>Tyco Healthcare</td><td>8881516911</td><td></td></tr><tr><td>Filtr nylonowy (70 &mu; m ) sitko do komórek, sterylne</td><td>BD Falcon</td><td>352350</td><td></td></tr><tr><td>5 cm szalka Petriego, sterylne&nbsp;</td><td>Corning</td><td>430166</td><td></td></tr><tr><td>10 cm szalka Petriego, sterylna&nbsp;</td><td>Corning</td><td>430167</td><td></td></tr></tbody></table>

metoda pozyskiwania komórek pierwotnego raka jajnika z próbek litych

Method for Obtaining Primary Ovarian Cancer Cells From Solid Specimens

Pilnie potrzebne są niezawodne narzędzia do badania inicjacji i progresji raka jajnika. Chociaż wykorzystanie linii komórkowych raka jajnika pozostaje cennym narzędziem do zrozumienia raka jajnika, ich zastosowanie ma wiele ograniczeń. Należą do nich brak heterogeniczności i mnogość zmian genetycznych związanych z przedłużonym pasażowaniem in vitro. W tym artykule opisano metodę, która pozwala na szybkie ustalenie pierwotnych komórek raka jajnika z litych próbek klinicznych pobranych w czasie operacji. Metoda polega na poddaniu próbek klinicznych trawieniu enzymatycznemu przez 30 minut. Wyizolowana zawiesina komórkowa może rosnąć i może być stosowana do dalszych zastosowań, w tym do badań przesiewowych leków. Przewagą linii komórkowych pierwotnego raka jajnika nad ustalonymi liniami komórkowymi raka jajnika jest to, że są one reprezentatywne dla oryginalnych specyficznych próbek klinicznych, z których pochodzą, i mogą pochodzić z różnych miejsc, niezależnie od tego, czy jest to pierwotny lub przerzutowy rak jajnika.

Świeże próbki kliniczne raka jajnika są pobierane po operacji (Rycina 1) i cięte na małe fragmenty (Rycyny 2A i 2B), tworząc zawiesinę komórkową. Pozwala to na optymalną ekspozycję próbek na działanie enzymatyczne. Zawiesinę komórkową poddaje się trawieniu enzymatycznemu i inkubuje w temperaturze 37 °C przez 30 min. W czasie inkubacji zawiesina staje się coraz bardziej mętna (zwłaszcza po każdym wymieszaniu), co jest oznaką dezagregacji tkanki. Po zakończeniu inkubacji z...

To badanie opisuje szczegółową metodę izolacji i charakterystyki komórek pierwotnego raka jajnika z litych próbek klinicznych. Próbki kliniczne raka jajnika są poddawane trawieniu enzymatycznemu w celu uzyskania żywotnych, wolnych od fibroblastów komórek nabłonkowego raka jajnika (EOC), które doskonale nadają się do dalszych zastosowań.

Metoda pozyskiwania komórek pierwotnego raka jajnika z próbek litych

Reliable tools for investigating ovarian cancer initiation and progression are urgently needed. While the use of ovarian cancer cell lines remains a ...

Ogólnym celem niniejszej procedury jest izolacja i charakterystyka pierwotnych komórek raka jajnika z litych próbek klinicznych. Cel ten zostaje osiągnięty poprzez pobranie próbki guza jajnika i umieszczenie jej w szalce Petriego. W drugim kroku próbkę tnie się na fragmenty, które następnie przenosi się do probówki stożkowej z odczynnikami do trawienia w celu inkubacji.Następnie zawiesinę komórkową przepuszczono przez filtr, aby zebrać wyłącznie komórki. Ostatnim etapem wirowania jest odlanie supernatantu i resuspensja komórek w medium w celu inkubacji przez noc. Ostatecznie komórki raka nabłonkowej macicy będą rosły w hodowli przez wiele tygodni, co umożliwi przeprowadzenie dalszych analiz. Ta metoda może pomóc w odpowiedzi na kluczowe pytania w dziedzinie raka jajnika, takie jak wybór najlepszej opcji leczenia dla każdego pacjenta.Zastosowania tej techniki rozciągają się na leczenie raka jajnika, ponieważ pozwala ona na wykorzystanie bardziej realistycznych hodowli komórkowych, które są wysoce podatne na manipulacje genetyczne i bardziej użyteczne w testach przesiewowych leków. W pierwszej kolejności należy uzupełnić 500 mililitrów pożywki DMEM (Dulbecco's Modified Eagle Medium)

method-for-obtaining-primary-ovarian-cancer-cells-from-solid-specimens

Research

JoVE Journal

Medicine

Medycyna

Metoda uzyskania pierwotnych komórek raka jajnika z litych próbek

Opisujemy metodologie tworzenia heterotypowych trójwymiarowych modeli in vitro, składających się z fibroblastów jajnika oraz prawidłowych komórek nabłonkowych powierzchni jajnika lub komórek nabłonkowych raka jajnika. Omówiono zastosowanie tych modeli do badania oddziaływań stroma-nabłonek, które zachodzą podczas rozwoju raka jajnika.

Heterotypowe trójwymiarowe modelowanie in vitro oddziaływań stropowo-nabłonkowych podczas inicjacji i progresji raka jajnika

Ten protokół opisuje technikę przygotowania próbki poprzez kokulturację eksplantatów jajników z komórkami raka jajowodu. Próbki te są wizualizowane za pomocą obrazowej spektroskopii mas lub IMS w celu wykrycia wymiany małych cząsteczek między komórkami i tkankami, co prowadzi do rozwoju guza.

Modelowanie komunikacji raka jajnika do obrazowania analizy spektrometrii mas: metoda identyfikacji małocząsteczkowych komunikatorów chemicznych w rozwoju przerzutowego guza jajnika

W tym filmie opisujemy metodę izolowania i charakteryzowania komórek pierwotnego raka jajnika z próbek tkanek guza jajnika litego. Nabłonkowe komórki raka uzyskane za pomocą tego protokołu są odpowiednie do zrozumienia procesów, które mogą prowadzić do inicjacji i rozwoju raka jajnika.

Uzyskiwanie komórek pierwotnego raka jajnika z próbek litych: metoda hodowli komórek nabłonkowego raka jajnika z próbek guza jajnika

Inwazja komórek raka jajnika w błonie międzybłonkowej otrzewnej jest procesem dynamicznym w czasie. Wykorzystując analizator w czasie rzeczywistym, zdolność inwazyjną komórek raka jajnika w modelu kohodowli komórek sferoidalnych i międzybłonka można określić ilościowo w dłuższych okresach czasu, zapewniając wgląd w czynniki regulujące proces przerzutowy.

Ocena przyczepu sferoidalnego raka jajnika i inwazji komórek międzybłonka w czasie rzeczywistym

Komórki inicjujące nowotwór (TICs) mogą stanowić realny cel terapeutyczny w leczeniu raka jajnika, choroby często nawracającej i śmiertelnej. Przedstawiamy protokół dla warunków hodowli, które wzbogacają tę wysoce nowotworową populację komórek.

Metody in vitro Wzbogacanie komórek inicjujących nowotwór raka jajnika

Tutaj prezentujemy protokół do budowy trójwymiarowego modelu in vitro wyściółki jamy otrzewnej, składającego się z pierwotnych ludzkich komórek międzybłonka i fibroblastów pokrytych macierzą zewnątrzkomórkową, jako narzędzie do badania adhezji, inwazji i proliferacji komórek raka jajnika.

Modelowanie wczesnych etapów rozsiewu raka jajnika w organotypowym posiewie ludzkiej jamy otrzewnowej

Aby wyjaśnić wieloetapowy proces rozprzestrzeniania się raka jajnika w otrzewnej, obecne badanie przedstawia mysi eksperymentalny model pierwotnego rozwoju guza i przerzutów do otrzewnej poprzez ortotopową inokulację tymi komórkami nowotworowymi.<br...

Mysi eksperymentalny model pierwotnego rozwoju guza i przerzutów do otrzewnej za pomocą ortotopowej inokulacji komórkami raka jajnika

Organoidy pochodzące od pacjentów (PDO) to trójwymiarowa (3D) hodowla, która może naśladować środowisko guza in vitro. W surowiczym raku jajnika o wysokim stopniu złośliwości PDO stanowią model do badania nowych biomarkerów i środków terapeutycznych.

Wytwarzanie i hodowla organoidów surowiczego raka jajnika o wysokim stopniu złośliwości pochodzących od pacjentów

Przedstawiamy protokół, który może być wykorzystany do przeprowadzenia testów leków terapeutycznych z organoidami raka jajnika pochodzącymi od pacjentek.

Modele organoidowe pochodzące od pacjentek z rakiem jajnika do przedklinicznych testów leków

Ten protokół opisuje ustanowienie trójwymiarowego (3D) modelu ex vivo interakcji komórka rakowa - sieć komórkowa. Model ten stanowi platformę do wyjaśnienia mechanizmów pronowotworowych w niszy tkanki tłuszczowej oraz do testowania nowych terapii.

Model ex vivo przerzutów do otrzewnej raka jajnika z wykorzystaniem ludzkiej sieci

Ten protokół oferuje systematyczne ramy do tworzenia organoidów raka jajnika z różnych stadiów choroby i rozwiązuje wyzwania związane ze zmiennością specyficzną dla pacjenta, aby zwiększyć wydajność i umożliwić solidną, długoterminową ekspansję dla kolejnych zastosowań. Zawiera szczegółowe kroki przetwarzania tkanek, wysiewu, dostosowywania wymagań dotyczących pożywek i barwienia immunofluorescencyjnego.

Strategia biobankowania organoidów raka jajnika: rozwiązywanie problemów związanych z różnorodnością między pacjentami w podtypach histologicznych i stadiach choroby

Poznaj metodę izolacji komórek pierwotnego raka jajnika z próbek litych. Technika ta umożliwia uzyskanie czystych komórek nabłonkowych do długoterminowej hodowli i badań nad spersonalizowanymi terapiami onkologicznymi.

Metoda pozyskiwania komórek pierwotnego raka jajnika z próbek litych

Przeglądaj więcej filmów