Name: Elektroprzędzone rusztowania włókniste z poli(dodekanodianu glicerolu) do inżynierii tkanek nerwowych z embrionalnych komórek macierzystych myszy (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-06-18T15:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 3 s
Description: Poznaj metodę elektroprzędzenia długich włókien z poli(dodekanodianu glicerolu) do inżynierii tkanek nerwowych z mysich embrionalnych komórek macierzystych.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Ta praca została przeprowadzona przy użyciu urządzeń Wydziału Inżynierii Biomedycznej na Międzynarodowym Uniwersytecie Florydy.

1. Konfiguracja kolektora elektroprzędzalniczego
<ol>
	<li>Pokrój folię aluminiową na prostokątny kawałek.</li>
	<li>Złóż prostokątny element w prostokątny pasek i przymocuj go prostopadle do płaskiej metalowej płytki za pomocą taśmy (Rysunek 1). Uwaga: Rozmiar maty z włókna zależy od długości i szerokości paska. W ten sposób wymiary taśmy można dostosować w zależności od potrzeb.</li>
</ol>
2. Przygotowanie roztworu polimerowego
<ol>
	<li>Mieszać glicerol i kwas dodekanodionowy (DDA) w stosunku molowym 1:1 w zlewce w temperaturze 120 °C przez 100 godzin, aby otrzymać polimer PGD.</li>
	<li>W probówce o pojemności 15 ml rozpuścić poli(tlenek etylenu) (PEO) i żelatynę w 65% etanolu w stosunku wagowym 1,5:3:95,5, dokręcić nakrętkę i podgrzać mieszaninę w piecu w temperaturze 60 °C przez 1 godzinę mieszając, aż stanie się jednorodnym roztworem (roztwór podstawowy).</li>
	<li>Do elektroprzędzenia należy wymieszać polimer PGD i roztwór podstawowy w stosunku wagowym 4:6. Uwaga: Stężenie PGD ma duży wpływ na średnicę włókna. 30%-50% procent PGD jest dopuszczalne do produkcji włókien dłuższych niż 5 cm przy zwiększonych średnicach włókien.</li>
	<li>Dodaj 0,1% ryboflawiny do roztworu polimerowego i dobrze wymieszaj.</li>
</ol>
3. Elektroprzędzenie
<ol>
	<li>Wprowadzić roztwór polimerowy do standardowej strzykawki o pojemności 5 ml z igłą ze stali nierdzewnej o sile 18 G.</li>
	<li>Włożyć strzykawkę do pompy strzykawkowej.</li>
	<li>Podłącz przewód uziemiający wysokiego napięcia źródła zasilania do metalowej płytki, a dodatnio naładowany przewód do igły.</li>
	<li>Dostosuj odległość między igłą a paskiem folii aluminiowej do 15 cm.</li>
	<li>Umieść pompkę strzykawkową pod kątem około 15° w stosunku do poziomu, aby zapobiec agregacji włókien z przodu paska.</li>
	<li>Włączyć pompę strzykawkową i wyregulować natężenie przepływu pompy na 0,6 ml/h.</li>
	<li>Włącz źródło zasilania wysokiego napięcia i ustaw napięcie robocze na 14,6 kV.</li>
</ol>
4. Przetwarzanie włókien
<ol>
	<li>Po zakończeniu zbierania wystaw matę z włókna na działanie światła UV przez 60 minut w celu usieciowania.</li>
	<li>Przenieś matę z włókna z paska folii aluminiowej na szalkę Petriego o średnicy 100 mm i wystawij ją na działanie światła UV przez kolejne 20 minut w celu sterylizacji.</li>
	<li>W komorze bezpieczeństwa biologicznego pokrój matę z włókna na okrągłe kawałki tego samego rozmiaru za pomocą ostrza chirurgicznego i umieść kawałki na 24-dołkowej płytce.</li>
	<li>W celu zaprawiania przed wysiewem komórek zanurzyć próbki włókien w 1 ml soli fizjologicznej buforowanej fosforanami (PBS) i inkubować w temperaturze 37 °C przez noc.</li>
	<li>Następnego dnia ostrożnie zassać PBS, dodać 1 ml pożywki różnicującej (DMEM/F12, N2 i FGF2) (patrz przepis w tabeli materiałów) do każdej studzienki i inkubować w temperaturze 37 °C przez 3 godziny.</li>
	<li>Ostrożnie odessać pożywkę różnicującą, dodać 0,2 ml matrigelu do każdej próbki włókien i inkubować w temperaturze 37 °C przez 30 minut. Uwaga: Laminina może być również używana do powlekania włókien. Dodać 0,2 ml 20 μg/ml lamininy do błonnika i inkubować w temperaturze pokojowej przez 3 godziny.</li>
	<li>Ostrożnie usuń nadmiar matrigelu z każdej studzienki. Spłukać raz 2 ml pożywki różnicującej. Uwaga: Próbki włókien są gotowe do hodowli komórkowej.</li>
</ol>
5. Wysiewanie komórek na włóknach
<ol>
	<li>Dodać 1 ml Accutazy do naczynia do hodowli komórek mES i inkubować przez 10 minut w temperaturze 37 °C.</li>
	<li>Po 10 minutach komórki mES odłącza się od naczynia hodowlanego. Dodać 4 ml pożywki różnicującej do płytki. Zbierz pływające komórki mES do probówki o pojemności 15 ml i pipetuj komórki w górę iw dół, aby rozbić kolonie (około 15x).</li>
	<li>Wirować przy 400 x g przez 5 minut i ponownie zawiesić komórki w 4 ml pożywki różnicującej.</li>
	<li>Policz komórki za pomocą hemocytometru. Przenieść 200 μl zawiesiny komórek do probówki o pojemności 15 ml i rozcieńczyć 10 razy pożywką różnicującą. Przenieść 15 μl rozcieńczonej zawiesiny komórek do komory na hemocytometrze z założonym szkiełkiem nakrywkowym. Policz komórki w środkowym kwadracie o średnicy 1 mm i czterech rogach hemocytometru pod mikroskopem. Uwaga: Komórka na ml = średnia liczba na kwadrat x współczynnik rozcieńczenia x 104</li>
	<li>Umieść około 5 x 10 4 komórek mES na każdym dołku. Powoli upuść zawiesinę komórek na środek próbek włókien, zamiast zsuwać się na bok studzienki, aby zapobiec spływaniu roztworu z maty włóknistej.</li>
	<li>Dodać 1 ml pożywki różnicującej do każdego dołka i utrzymywać płytkę w inkubatorze w temperaturze 37 °C i 5% CO2 w celu umożliwienia przyłączenia, wzrostu i różnicowania komórek.</li>
	<li>Odessać starą pożywkę z każdej studzienki i zastąpić ją 1 ml świeżej pożywki różnicującej co drugi dzień.</li>
</ol>
6. Żywotność komórek
<ol>
	<li>Odessać stare podłoże z każdej studzienki.</li>
	<li>Zmieszać 1/10 objętości odczynnika fluorescencyjnego Rezazuryny z pożywką hodowlaną i dodać 1 ml do każdej studzienki.</li>
	<li>Inkubować w temperaturze 37 °C i 5% CO2 przez 4 godziny, chroniąc przed bezpośrednim działaniem światła.</li>
	<li>Po 4 godzinach przenieś 100 μl 3x odczynnika z każdej studzienki na płytkę 96-dołkową, a następnie próbki są gotowe do pomiaru na spektrofotometrze fluorescencyjnym przy użyciu ustawień filtra 560EX nm/590EM.</li>
</ol>
7. PCR w czasie rzeczywistym
<ol>
	<li>Po 14 dniach hodowli dodać bufor do lizy do próbek i wyizolować całkowite RNA z komórek na próbkach włókien.</li>
	<li>Użyj 4 μl całkowitego RNA do syntezy cDNA w 20 μl skalach reakcji przez odwrotną transkrypcję.</li>
	<li>Przygotuj mieszaninę reakcyjną PCR w każdej probówce optycznej: 10 μl Master Mix (2x), 0,2 μl barwnika, 8 μl wody wolnej od nukleaz, 1 μl cDNA i 1 μl startera (startery użyte w tym badaniu są wymienione w tabeli 1).</li>
	<li>Ustaw program PCR: a. 95 °C 2:20 min, 1 cykl b. 95 °C 3 sek→60°C 1 min, 40 cykl ok. 95°C 15 sek., 1 cykl d. 60°C 1 min, 1 cykl e. 95°C 15 sek., 1 cykl. Wybierz metodę porównawczą CT, aby określić względne poziomy ekspresji genów.</li>
	<li>Po zakończeniu PCR przeanalizuj wyniki PCR w czasie rzeczywistym za pomocą oprogramowania StepOne i wyeksportuj wyniki do programu Excel.</li>
</ol>

<ol><li>Migneco, F., Huang, Y. -C., Birla, R. K., Hollister, S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Poly+%28glycerol-dodecanoate%29%2C+a+biodegradable+polyester+for+medical+devices+and+tissue+engineering+scaffolds%5BTitle%5D)+AND+%22Biomaterials%22%5BJournal%5D)">Poly (glycerol-dodecanoate), a biodegradable polyester for medical devices and tissue engineering scaffolds.</a> Biomaterials. 30, 6479-6484 (2009).</li>
<li>Reneker, D. H., Yarin, A. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Electrospinning+jets+and+polymer+nanofibers%5BTitle%5D)+AND+%22Polymer%22%5BJournal%5D)">Electrospinning jets and polymer nanofibers.</a> Polymer. 49, 2387-2425 (2008).</li>
<li>Wang, Y., Ameer, G. A., Sheppard, B. J., Langer, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+tough+biodegradable+elastomer%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+biotechnology%22%5BJournal%5D)">A tough biodegradable elastomer.</a> Nature biotechnology. 20, 602-606 (2002).</li>
<li>Panunzi, S., De Gaetano, A., Mingrone, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Approximate+linear+confidence+and+curvature+of+a+kinetic+model+of+dodecanedioic+acid+in+humans%5BTitle%5D)+AND+%22American+Journal+of+Physiology-Endocrinology+And+Metabolism%22%5BJournal%5D)">Approximate linear confidence and curvature of a kinetic model of dodecanedioic acid in humans.</a> American Journal of Physiology-Endocrinology And Metabolism. 289, (2005).</li>
<li>Park, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Apparatus+for+preparing+electrospun+nanofibers%3A+designing+an+electrospinning+process+for+nanofiber+fabrication%5BTitle%5D)+AND+%22Polymer+Internationa+l%22%5BJournal%5D)">Apparatus for preparing electrospun nanofibers: designing an electrospinning process for nanofiber fabrication.</a> Polymer Internationa l. 56, 1361-1366 (2007).</li>
<li>Barnes, C. P., Sell, S. A., Boland, E. D., Simpson, D. G., Bowlin, G. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nanofiber+technology%3A+designing+the+next+generation+of+tissue+engineering+scaffolds%5BTitle%5D)+AND+%22Advanced+drug+delivery+reviews%22%5BJournal%5D)">Nanofiber technology: designing the next generation of tissue engineering scaffolds.</a> Advanced drug delivery reviews. 59, 1413-1433 (2007).</li>
<li>Li, W. -J., Mauck, R. L., Tuan, R. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Electrospun+nanofibrous+scaffolds%3A+production%2C+characterization%2C+and+applications+for+tissue+engineering+and+drug+delivery%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Biomedical+Nanotechnology%22%5BJournal%5D)">Electrospun nanofibrous scaffolds: production, characterization, and applications for tissue engineering and drug delivery.</a> Journal of Biomedical Nanotechnology. 1, 259-275 (2005).</li>
<li>Pham, Q. P., Sharma, U., Mikos, A. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Electrospinning+of+polymeric+nanofibers+for+tissue+engineering+applications%3A+a+review%5BTitle%5D)+AND+%22Tissue+engineering%22%5BJournal%5D)">Electrospinning of polymeric nanofibers for tissue engineering applications: a review.</a> Tissue engineering. 12, 1197-1211 (2006).</li>
<li>Lim, S. H., Mao, H. -Q. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Electrospun+scaffolds+for+stem+cell+engineering%5BTitle%5D)+AND+%22Advanced+drug+delivery+reviews%22%5BJournal%5D)">Electrospun scaffolds for stem cell engineering.</a> Advanced drug delivery reviews. 61, 1084-1096 (2009).</li>
<li>Lowery, J. L., Datta, N., Rutledge, G. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effect+of+fiber+diameter%2C+pore+size+and+seeding+method+on+growth+of+human+dermal+fibroblasts+in+electrospun+poly+%28epsilon-caprolactone%29+fibrous+mats%5BTitle%5D)+AND+%22Biomaterials%22%5BJournal%5D)">Effect of fiber diameter, pore size and seeding method on growth of human dermal fibroblasts in electrospun poly (epsilon-caprolactone) fibrous mats.</a> Biomaterials. 31, 491-504 (2010).</li>
<li>Tillman, B. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+in+vivo+stability+of+electrospun+polycaprolactone-collagen+scaffolds+in+vascular+reconstruction%5BTitle%5D)+AND+%22Biomaterials%22%5BJournal%5D)">The in vivo stability of electrospun polycaprolactone-collagen scaffolds in vascular reconstruction.</a> Biomaterials. 30, 583-588 (2009).</li>
<li>Ju, Y. M., Choi, J. S., Atala, A., Yoo, J. J., Lee, S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bilayered+scaffold+for+engineering+cellularized+blood+vessels%5BTitle%5D)+AND+%22Biomaterials%22%5BJournal%5D)">Bilayered scaffold for engineering cellularized blood vessels.</a> Biomaterials. 31, 4313-4321 (2010).</li>
<li>McCullen, S. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+situ+collagen+polymerization+of+layered+cell-seeded+electrospun+scaffolds+for+bone+tissue+engineering+applications%5BTitle%5D)+AND+%22Tissue+Engineering+Part+C%3A+Methods%22%5BJournal%5D)">In situ collagen polymerization of layered cell-seeded electrospun scaffolds for bone tissue engineering applications.</a> Tissue Engineering Part C: Methods. 16, 1095-1105 (2010).</li>
</ol>

Nie stwierdzono konfliktu interesów.

Ograniczenia prostych kolektorów lub złożoność kolektorów obrotowych, które są obecnie używane do elektroprzędzenia, zwiększają ograniczenie w uzyskiwaniu pożądanej długości i rozmiaru maty włóknistej dla niektórych zastosowań. Dodatkowo przeniesienie włókien z kolektora gruntowego do naczynia hodowlanego lub innych substratów jest wyzwaniem5. W tym raporcie nowo zaprojektowany kolektor, wykonany po prostu przez przymocowanie paska folii aluminiowej do uziemionego kolektora, był w stanie uzyskać maty włókniste...

Elektroprzędzenie jest jedną z efektywnych metod przetwarzania do produkcji rusztowań z włókien o rozmiarach od mikro do nanometrów. Podstawowa zasada elektroprzędzenia polega na stożku roztworu Taylora, który jest utrzymywany w otworze igły poprzez przyłożenie wysokiego napięcia między końcówką igły a uziemionym kolektorem. Gdy odpychanie elektrostatyczne w roztworze pokonuje napięcie powierzchniowe, naładowany strumień płynu jest wyrzucany z końcówki igły, przemieszcza się w powietrzu z odparowaniem rozpuszczalnika i ostatecznie osadza się na uziemionym kolektorze. Pompa strzykawkowa zapewnia ciągły przepływ roztworu wyłaniającego się z dyszy przędzalniczej, dzięki czemu w krótkim czasie można wytworzyć wiele kopii włókien przędzonych elektrycznie. W trakcie opuszczania dyszy przędzalniczej w celu dotarcia do kolektora, naładowany strumień będzie poddawany rozciąganiu i ubijaniu zgodnie z szeregiem parametrów, w tym lepkością i napięciem powierzchniowym roztworu polimerowego, siłą elektrostatyczną w roztworze oraz oddziaływaniem zewnętrznego pola elektrycznego itp.
W procesie elektroprzędzenia, kolektor służy jako przewodzący substrat, na którym mogą być osadzane włókna mikro- i nanometrowe. W tym badaniu zaprojektowano nowy typ kolektora światłowodowego w celu uzyskania mat włóknistych o pożądanym rozmiarze (długość x szerokość). Tradycyjnie jako kolektor stosuje się folię aluminiową, ale trudno jest przenieść włókna z płaskiej powierzchni na inne podłoże. Trudność w zebraniu nienaruszonej maty włóknistej z tradycyjnego kolektora wynikała głównie z faktu, że włókna elektroprzędzone silnie przylegają do powierzchni kolektora. Dlatego zmodyfikowaliśmy kolektor, składając kawałek folii aluminiowej w prostokątny pasek i mocując go prostopadle do płaskiej metalowej płytki. Elektroprzędzone włókna są rozciągane w poprzek obszaru między końcówką paska a metalową płytką, którą można łatwo przenieść na inne podłoże.
Zainteresowanie termicznie usieciowanymi polimerami elastomerowymi szybko rośnie dzięki pionierskiej pracy grupy Roberta Langera, która w 2002 roku wprowadziła poli(sebakanian glicerolu) (PGS), poliester analogiczny do wulkanizowanego kauczuku 3. Podobnie jak PGS, z powodzeniem opracowaliśmy poli(dodekanian glicerolu) (PGD) poprzez termiczną kondensację glicerolu i kwasu dodekanodiowego i wykazaliśmy jego unikalną właściwość pamięci kształtu1. W przeciwieństwie do sztywniejszych materiałów syntetycznych, poli(maślanu hydroksylu) lub poli(L-laktydu) (moduły Younga odpowiednio 250 MPa i 660 MPa), PGD wykazuje właściwości elastomerowe, takie jak guma, z modułem Younga wynoszącym 1,08 MPa, gdy temperatura przekracza 37 °C, co jest bliskie nerwowi obwodowemu in situ (0,45 MPa). Ponadto PGD ulega biodegradacji, a czas degradacji można precyzyjnie dostosować, zmieniając stosunek glicerolu i kwasu dodekanodiowego. Kwas dodekanodiowy jest dwunastowęglową substancją z dwiema końcowymi grupami karboksylowymi, HOOC(CH2)10COOH. Parzyste kwasy dikarboksylowe, takie jak kwas sebacynowy i kwas dodekanodiowy, mogą być metabolizowane do acetylo-CoA i wchodzić w cykl kwasu trikarboksylowego (TCA)/(kwas cytrynowy). Produkt przemiany materii kwasów dikarboksylowych, sukcynylo-CoA, jest prekursorem glukoneogenetycznym i produktem pośrednim4. cyklu TCA. W związku z tym niektóre badania sugerowały, że mogą być one wykorzystywane jako alternatywny substrat paliwowy do żywienia dojelitowego i pozajelitowego, zwłaszcza w stanach patologicznych. Ponadto PGD wykazuje unikalną pamięć kształtu, ponieważ jego temperatura zeszklenia wynosi 31 °C, dzięki czemu wykazuje wyraźne właściwości mechaniczne w temperaturze pokojowej i w temperaturze ciała. Podsumowując, PGD jest biodegradowalny, biokompatybilny, wykazujący unikalne właściwości elastyczne o właściwościach mechanicznych zbliżonych do tkanek nerwowych; Dlatego jest to odpowiedni materiał do zastosowań w inżynierii tkanki nerwowej. W tym protokole elektroprzędzone długie włókna obejmujące dużą powierzchnię złoża zostały wytworzone za pomocą nowo zaprojektowanego kolektora firmy PGD. Rusztowania włókniste mogą wspierać wzrost i różnicowanie pluripotencjalnych komórek macierzystych myszy.

<table><tbody><tr><td>Glycerol</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G7757</td><td></td></tr><tr><td>Kwas dodekanodiowy</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D1009</td><td></td></tr><tr><td>Żelatyna</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D1890</td><td></td></tr><tr><td>Poli(tlenek etylenu) (PEO)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>182028</td><td></td></tr><tr><td>Ryboflawina</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>132350250</td><td>0,10%</td></tr><tr><td>Mysie embrionalne komórki</td> <td>macierzysteGlobalStem</td><td>GSC-5002</td><td></td></tr><tr><td>Matrigel</td><td>Becton Dickinson</td><td>356234</td><td></td></tr><tr><td>DMEM/F12</td><td>Thermo Scientific</td><td>SH30272.02</td><td></td></tr><tr><td>Suplement N2</td><td>Invitrogen</td><td>17502048</td><td>1%</td></tr><tr><td>FGF2</td><td>Stemgent</td><td>03-0002</td><td>10 ng/ml</td></tr><tr><td>Accutase</td><td>Invitrogen</td><td>A11105-01</td><td></td></tr><tr><td>Sól fizjologiczna buforowana fosforanami (PBS)</td><td>Invitrogen</td><td>10010-031</td><td></td></tr><tr><td>Barwnik fluorescencyjny Resazurin</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>62758-13-8</td><td></td></tr><tr><td>SV System izolacji całkowitego RNA System odwrotnej</td> transkrypcji <td>Promega</td><td>Z3100</td><td></td></tr><tr><td>GoScript System odwrotnej transkrypcji</td><td>Promega</td><td>A5000</td><td></td></tr><tr><td>GoTaq qPCR Master Mix</td><td>Promega</td><td>A6001</td><td></td></tr><tr><td>Pompa strzykawkowa&nbsp;</td><td>Fisher scientific</td><td>14-831-200</td><td></td></tr><tr><td>Źródło zasilania wysokiego napięcia&nbsp;</td><td>Spellman High Voltage Electronics Corporation</td><td></td><td>SL30</td></tr><tr><td>Światło UV</td><td>Philips</td><td></td><td>308643 15W/G15T8</td></tr><tr><td>Synergy HT Multi-Mode Microplate Reader</td><td>BioTek</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Perkin Elmer GeneAmp PCR System 9600</td><td>Perkin Elmer</td><td>8488</td><td></td></tr><tr><td>StepOne System PCR w czasie rzeczywistym</td><td>Applied Biosystems</td><td>4376357</td><td></td></tr></tbody></table>

elektroprzędzone rusztowania włókniste z poli(dodekanodianu glicerolu) do inżynierii tkanek nerwowych z embrionalnych komórek macierzystych myszy

Electrospun Fibrous Scaffolds of Poly(glycerol-dodecanedioate) for Engineering Neural Tissues From Mouse Embryonic Stem Cells

Dla zastosowań inżynierii tkankowej, przygotowanie biodegradowalnych i biokompatybilnych rusztowań jest najbardziej pożądanym, ale wymagającym zadaniem. Spośród różnych metod wytwarzania, elektroprzędzenie jest najbardziej atrakcyjne ze względu na swoją prostotę i wszechstronność. Dodatkowo elektroprzędzone nanowłókna naśladują rozmiar naturalnej macierzy zewnątrzkomórkowej, zapewniając dodatkowe wsparcie dla przetrwania i wzrostu komórek. Badanie to wykazało opłacalność wytwarzania długich włókien obejmujących większy obszar złoża dla nowego biodegradowalnego i biokompatybilnego polimeru o nazwie poli(dodekanian glicerolu) (PGD)1 przy użyciu nowo zaprojektowanego kolektora do elektroprzędzenia. PGD wykazuje unikalne właściwości elastyczne przy podobnych właściwościach mechanicznych do tkanek nerwowych, dzięki czemu nadaje się do zastosowań w inżynierii tkanek nerwowych. Konfiguracja syntezy i produkcji do wytwarzania włóknistych materiałów rusztowaniowych była prosta, wysoce powtarzalna i niedroga. W testach biokompatybilności komórki pochodzące z embrionalnych komórek macierzystych myszy mogą przylegać i rosnąć na elektroprzędzonych włóknach PGD. Podsumowując, protokół ten zapewnił wszechstronną metodę wytwarzania włókien elektroprzędzonych PGD w celu wspierania wzrostu komórek linii nerwowej pochodzących z embrionalnych komórek macierzystych myszy.

Główne elementy elektroprzędzenia są pokazane na rysunku 1. Matę z włókna o dużych rozmiarach uzyskiwano zwykle poprzez prostopadle przymocowany pasek folii aluminiowej i płaską metalową płytkę. Rysunek 2 przedstawia konstrukcję kolektora i matę z włókien elektroprzędzących. Szerokość i długość można dostosować do różnych zastosowań. Długość włókna wykonanego z mieszaniny polimeru PGD i roztworu podstawowego wynosi do 10 cm. Morfologię włókien elektroprzędzonych przedstawiono na ...

Zgłoszono syntezę i wytwarzanie długich włókien elektroprzędzionych obejmujących większy obszar złoża za pomocą nowo zaprojektowanego kolektora z nowego biodegradowalnego polimeru o nazwie poli(dodekanian glicerolu) (PGD). Włókna były w stanie wspierać wzrost komórek pochodzących z pluripotencjalnych komórek macierzystych myszy.

Elektroprzędzone rusztowania włókniste z poli(dodekanodianu glicerolu) do inżynierii tkanek nerwowych z embrionalnych komórek macierzystych myszy

For tissue engineering applications, the preparation of biodegradable and biocompatible scaffolds is the most desirable but challenging task. &#160;Among ...

Ta procedura polega na wytwarzaniu długich włókien przędzonych przez Electros z nowatorskiego biodegradowalnego polimeru o nazwie poliglicerol Dote Cano eight. Najpierw ustaw nowo zaprojektowany kolektor i przygotuj roztwór polimerowy do wirowania elektrycznego, za pomocą strzykawki i pompy dostarcz roztwór do kolektora. Następnie przenieś powstałą matę włóknistą do naczynia hodowlanego w celu usieciowania.Następnie nasiać embrionalne komórki macierzyste myszy na przeciętych włóknach. Ostatecznie wyniki mogą wykazać, że embrionalne komórki macierzyste myszy mogą przetrwać i różnicować się w komórki nerwowe na rusztowaniach włóknistych. W dzisiejszym filmie pokazaliśmy, jak przygotować biomateriał z produkcji komórek syn, a na koniec wykorzystać te włókna elektrorozpięte do hodowli komórek.Zwłaszcza, gdy połączymy z ogniwem pochodzącym z poli i komórki barwiącej. Mogą one mieć bardzo ważne zastosowanie w przyszłości w dostarczaniu komórek i tworzeniu funkcjonalnej tkanki. Tissue invis dzisiaj, że zademonstruje ci okropną procedurę.Jest najwspanialszą rzeczą w moim laboratorium. Pokrój folię aluminiową na prostokątny kawałek. Złóż prostokątny kawałek w prostokątny pasek i przymocuj go prostopadle do płaskiej metalowej płytki za pomocą taśmy.Długość paska zależy od wielkości maty włóknistej potrzebnej do roztworu polimerowego. Zmieszano glicerol i kwas dekanowo-diinowy w stosunku jeden do jednego mola w temperaturze 120 stopni Celsjusza przez 100 godzin. Aby uzyskać poliglicerol, wykonaj polimer dekanowy rozpuść tlenek etylenu i żelatynę w 65% etanolu o stosunku wagowym od 1,5 do trzech do 95,5 w 15-mililitrowej probówce.Dokręć nakrętkę i podgrzej mieszaninę w piekarniku w temperaturze 60 stopni Celsjusza przez godzinę, mieszając co 15 minut, aż roztwór podstawowy będzie jednorodny. Do wirowania elektrycznego wymieszaj polimer PGD i roztwór podstawowy. W stosunku wagowym od czterech do sześciu dodaj do mieszanki 0,1% ryboflawiny i dobrze wymieszaj.Wprowadzić roztwór polimerowy do pięciomililitrowej standardowej strzykawki z igłą ze stali nierdzewnej o rozmiarze 18. Następnie włożyć strzykawkę do pompy strzykawkowej. Podłącz przewód uziemiający wysokiego napięcia źródła zasilania do metalowej płytki, a dodatnio naładowany przewód do igły.Dostosuj również odległość między igłą a folią aluminiową. Pasek do 15 centymetrów. Teraz umieść pompkę strzykawkową pod kątem około 15 stopni w stosunku do poziomu, aby zapobiec agregacji włókien z przodu paska.Włącz pompę strzykawkową i dostosuj natężenie przepływu pompy do 0,6 mililitra na godzinę. Włącz źródło zasilania wysokiego napięcia i ustaw napięcie robocze na 14,6 kilowolta. Po zakończeniu zbierania wystaw matę z włókna na działanie światła UV przez 60 minut sieciowania.Przenieś matę z włókna z paska folii aluminiowej na 100-milimetrową szalkę Petriego. Pokrój matę z włókna na okrągłe kawałki tego samego rozmiaru za pomocą ostrza chirurgicznego i umieść kawałki w płytce 24-dołkowej. Następnie wystaw płytkę na działanie światła UV przez kolejne 20 minut sterylizacji komórek poprzedzających zabieg.Zanurz próbki błonnika w jednym mililitrze soli fizjologicznej buforowanej fosforanami i inkubuj w temperaturze 37 stopni Celsjusza przez noc następnego dnia. Ostrożnie zassać PBS. Dodaj jeden mililitr pożywki różnicującej do każdej studzienki i inkubuj w temperaturze 37 stopni Celsjusza przez trzy godziny.Po zassaniu pożywki różnicującej ostrożnie dodać 0,2 mililitra żelu matri do każdej próbki błonnika i inkubować w temperaturze 37 stopni Celsjusza przez 30 minut. Ostrożnie usuń nadmiar żelu matri z każdego z nich. Dobrze spłukać raz dwoma mililitrami pożywki różnicującej.Dodaj jeden mililitr smaku do naczynia do hodowli embrionalnych komórek macierzystych myszy po 10 minutach, w temperaturze 37 stopni Celsjusza. Po odłączeniu komórek MES dodaj cztery mililitry pożywki różnicującej. Zbierz pływające komórki MES do 15-mililitrowej wirówki probówkowej o stężeniu 400 G przez pięć minut.Ponownie zawiesić granulowane komórki w czterech mililitrach różnicowania. Średni. Przenieś 200 mikrolitrów zawiesiny komórek do 15-mililitrowej probówki i dodaj 10 objętości różnicowania. Średni. Przenieść 15 mikrolitrów rozcieńczonej zawiesiny komórek do komory na hemocytometrze.Mając na miejscu szkiełko nakrywkowe, policz komórki w środkowym kwadracie o długości jednego milimetra i cztery kwadraty narożne cytometru hemocytometru. Teraz upuść pięć razy 10 do czwartego. Mysie komórki ES powoli na środek próbek włókien.Dodaj jeden mililitr pożywki różnicującej do każdej studzienki i hoduj w temperaturze 37 stopni Celsjusza i 5% dwutlenku węgla do przyłączenia komórek. Wzrost i zróżnicowanie. Uzupełniaj jeden mililitr pożywki różnicującej co drugi dzień.Aby zmierzyć żywotność komórek, odessać stare podłoże z każdej studzienki i dodać jeden mililitr odczynnika do rozcieńczania i fluorescencji w hodowli jeden na 10. Pożywkę inkubować w temperaturze 37 stopni Celsjusza i 5% dwutlenku węgla przez cztery godziny, chroniąc przed bezpośrednim światłem. Następnie przenieś potrójne próbki po 100 mikrolitrów z każdej studzienki na płytkę 96-dołkową i zmierz obrazy z fluorescencyjnego skaningowego mikroskopu elektronowego, aby ocenić morfologię włókien przędzonych elektronowo.Średnice tych włókien wykonanych z 40% stężenia PGD mieszczą się tutaj w zakresie mikrometrów. Zróżnicowane embrionalne komórki macierzyste myszy hodowano przez trzy dni na włóknach, a mikroskopię konfokalną wykorzystano do wizualizacji nadekspresji białka zielonej fluorescencji. Zwiększona liczba zielonych komórek fluorescencyjnych w szóstym dniu wskazuje, że rusztowania z włókien mogą wspierać zarówno adhezję komórek, jak i proliferację komórek.Pomiary Zu i fluorescencji wykazały, że powlekanie matrigelem i lamininą skutkowało równoważną żywotnością komórek i stosunkowo wyższą proliferacją. Siła działania grypy i markery komórek nerwowych zostały określone ilościowo za pomocą PCR w czasie rzeczywistym w pierwszym dniu. Większość komórek MES hodowanych na włóknach wykazywała ekspresję markerów pluripotencji.PAŹDZIERNIK cztery nano i SOX dwa. Niewielka podgrupa wykazywała ekspresję markerów nerwowych komórek macierzystych PAC six i neston. Po dwóch tygodniach w hodowli stwierdzono zwiększony poziom ekspresji niektórych markerów komórek nerwowych, takich jak map two i DCX, a także marker oligodendrocytów oligo one i marker astrocytów.GFAP Raz opanowany. Tę technikę można wykonać w ciągu dwóch do trzech godzin, jeśli zostanie wykonana prawidłowo.

electrospun-fibrous-scaffolds-poly-glycerol-dodecanedioate-for

Research

JoVE Journal

Bioengineering

Bioinżynieria

Włókniste struktury nośne z poli(glicerolo-dodekandioinianu) uzyskane metodą elektroprzędzenia dla inżynierii tkanek nerwowych z mysich zarodkowych komórek macierzystych

W niniejszym artykule omówiono proces elektroprzędzenia polimerów do inżynierii tkankowej i hodowli komórkowych. W szczególności opisano elektroprzędzenie makromerów fotoreaktywnych z dodatkowymi możliwościami przetwarzania w postaci fotopatronowania oraz elektroprzędzenia wielopolimerowego.

Elektroprzędzenie włóknistych rusztowań polimerowych do inżynierii tkankowej i hodowli komórkowych

Uporządkowane włókna otrzymane metodą elektroprzędzenia kierują wzrostem neuronów in vitro i stanowią potencjalny komponent rusztowań do regeneracji nerwów. Opisujemy procedurę przygotowania podłoży z włókien elektroprzędzionych oraz bezsurowiczą hodowlę pierwotnych neuronów sensorycznych (DRG) i ruchowych szczura w stadium E15. Uwzględniono również wizualizację neuronów za pomocą immunocytochemii.

Hodowla pierwotnych neuronów ruchowych i sensorycznych w zdefiniowanych mediach na rusztowaniach z nanowłókien z poli-L-laktydu otrzymanych metodą elektroprzędzenia

Niniejsza praca szczegółowo opisuje przygotowanie trójwymiarowych (3D) rusztowań fibrynowych do hodowli i różnicowania pluripotencjalnych komórek macierzystych. Takie rusztowania mogą być wykorzystywane do badania wpływu różnych związków biologicznych na zachowanie komórek macierzystych, a także modyfikowane w celu włączenia systemów dostarczania leków.

Przygotowanie trójwymiarowych rusztowań fibrynowych do zastosowań w hodowli komórek macierzystych

W niniejszej pracy opisujemy zastosowanie samoorganizującego się rusztowania trójwymiarowego do hodowli ludzkich komórek progenitorowych neuronów. Przedstawiamy protokół uwalniania komórek z rusztowań w celu ich późniejszej analizy, np. za pomocą cytometrii przepływowej. Protokół ten może zostać dostosowany do innych typów komórek w celu przeprowadzenia szczegółowych badań mechanistycznych.

Hodowla ludzkich komórek progenitorowych neuronów w trójwymiarowym samoorganizującym się hydrożelu peptydowym

Rusztowania otrzymane metodą elektroprzędzenia mogą być poddawane obróbce po produkcji w celu zastosowania ich w inżynierii tkankowej. W niniejszym opracowaniu opisujemy metody przędzenia złożonych rusztowań (poprzez przędzenie sekwencyjne), tworzenia rusztowań o większej grubości (poprzez nakładanie wielu warstw z wykorzystaniem wyżarzania termicznego lub parowego), zapewniania sterylności (produkcja aseptyczna lub sterylizacja po produkcji) oraz uzyskiwania odpowiednich właściwości...

Obróbka potransprodukcyjna włókien otrzymywanych metodą elektroprzędzenia do inżynierii tkankowej

Ten protokół łączy elektroprzędzenie i mikrosfery w celu opracowania rusztowań inżynierii tkankowej do kierowania neuronami. Czynnik wzrostu nerwów zamknięto w mikrosferach PLGA i elektroprzędzono w rusztowania włókniste z kwasem hialuronowym (HA).  Bioaktywność białka badano poprzez wysiewanie rusztowań pierwotnymi zwojami korzenia grzbietowego piskląt i hodowlę przez 4-6 dni.

Elektroprzędzenie Czynnik wzrostu uwalniający mikrosfery do włóknistych rusztowań

Tutaj prezentujemy protokół wytwarzania elektroprzędzonych rusztowań z nanowłókien o stopniowanej organizacji włókien i badamy ich zastosowania w regulacji morfologii/orientacji komórek. Gradienty w odniesieniu do właściwości fizycznych i chemicznych rusztowań z nanowłókien oferują szeroką gamę zastosowań w dziedzinie biomedycyny.

Rusztowania z nanowłókien elektroprzędzonych z gradacją w organizacji włókien

Wgląd w złożone działania mózgu wymaga zaawansowanych narzędzi badawczych. Tutaj demonstrujemy nowatorski, oparty na jedwabnym kolagenie, zaprojektowany w 3D model tkanki nerwowej przypominający architekturę przypominającą mózg. Model może być wykorzystany do badania budowy sieci neuronalnej, prowadzenia aksonów, interakcji komórka-komórka i aktywności elektrycznej.

Zaprojektowany model 3D spolaryzowanej tkanki nerwowej oparty na jedwabiu

Tutaj prezentujemy protokół hodowli 3D komórek glejowych pochodzących z mózgu szczura, w tym astrocytów, mikrogleju i oligodendrocytów. Pokazujemy pierwotną hodowlę komórkową, syntezę hydrożelu metakrylowanego kwasu hialuronowego (HAMA), fotopolimeryzację HAMAfotopolimeryzację i enkapsulację komórek oraz przetwarzanie próbek do konfokalnego i skaningowego obrazowania mikroskopem elektronowym.

Ulepszone hodowle hydrożelowe 3D pierwotnych komórek glejowych do modelowania in vitro zapalenia układu nerwowego

Ten protokół opisuje wytwarzanie systemu hodowli komórek, który umożliwia wysiewanie komórek macierzystych na przewodzącym rusztowaniu polimerowym do stymulacji elektrycznej in vitro, a następnie implantację in vivo rusztowania z komórek macierzystych przy użyciu techniki minimalnie inwazyjnej.

Rusztowanie przewodzące prąd elektryczny do modulacji i dostarczania komórek macierzystych

Poznaj metodę elektroprzędzenia długich włókien z poli(dodekanodianu glicerolu) do inżynierii tkanek nerwowych z mysich embrionalnych komórek macierzystych.

Elektroprzędzone rusztowania włókniste z poli(dodekanodianu glicerolu) do inżynierii tkanek nerwowych z embrionalnych komórek macierzystych myszy (Wideo) | JoVE Journal

Elektroprzędzone rusztowania włókniste z poli(dodekanodianu glicerolu) do inżynierii tkanek nerwowych z embrionalnych komórek macierzystych myszy

Przeglądaj więcej filmów