Profile ekspresji mikroRNA ludzkich komórek iPS, nabłonka barwnikowego siatkówki pochodzącego z iPS oraz nabłonka barwnikowego siatkówki płodu

Ogólnym celem niniejszej procedury jest porównanie ekspresji mikro RNA w indukowanych pluripotencjalnych komórkach macierzystych, komórkach nabłonka barwnikowego siatkówki pochodzących z indukowanych pluripotencjalnych komórek macierzystych oraz płodowych komórkach nabłonka barwnikowego siatkówki. Cel ten zostaje osiągnięty poprzez uprzednią hodowlę i ekspansję komórek iPSC oraz płodowych RPE.

Drugim krokiem jest zróżnicowanie komórek iPS w komórki RPE. Następnie z komórek iPS, komórek iPS-RPE oraz płodowych komórek RPE ekstrahuje się RNA. Ostatnim krokiem jest przeprowadzenie analizy mikroarray miRNA na próbkach RNA i analiza uzyskanych danych.

Ostatecznie analiza szlaków i sieci jest wykorzystywana do identyfikacji różnicowo ekspresywnych microRNA, które biorą udział w wielu sieciach komórkowych, w tym w proliferacji i progresji cyklu komórkowego. Metoda ta może pomóc w udzieleniu odpowiedzi na kluczowe pytania w dziedzinie badań nad wzrokiem, takie jak rola micro RNA w regulacji różnicowania w dojrzałe komórki RPE, progresji cyklu komórkowego, proliferacji oraz starzenia się komórek. Zastosowanie tej techniki rozciąga się na terapie wykorzystujące nabłonek barwnika siatkówki pochodzenia komórek macierzystych do zastąpienia chorych lub uszkodzonych komórek RPE, ponieważ pozwala ona na określenie optymalnego numeru pasażu komórek wykorzystywanych w terapii.

Choć metoda ta może dostarczyć wglądu w czynniki regulujące różnicowanie RRP z IPS, można ją również zastosować do innych układów narządowych, np. do różnicowania innych typów komórek specyficznych dla TC z IPS. Aby rozpocząć tę procedurę, wysiej indukowane pluripotencjalne komórki macierzyste w zagęszczeniu około 350 kolonii komórek na studzienkę na nowo powlekaną płytkę w pożywce M tester one i pozwól koloniom IPSL rozwijać się w hodowli przez cztery do pięciu dni.

Następnie co trzy dni wymieniaj pożywkę M tesser one na 4 mL pożywki różnicującej oraz wymieniaj połowę pożywki na świeżą pożywkę różnicującą. Pozostaw pigmentowane ogniska do momentu, aż urosną na tyle duże, by można je było ręcznie wyciąć z hodowli, co trwa od 40 do 50 dni. Następnie za pomocą końcówki do pipety 200 µL wytnij i podnieś pigmentowane kolonie.

Zebrane i połączone wyizolowane kolonie przenieś do stożkowej probówki o pojemności 15 ml. Do połączonych komórek RPE dodaj 5 ml pożywki DMMF 12 i wiruj przy 300 GS przez 5 minut. Następnie usuń pożywkę, resuspenduj osad komórkowy w 5 ml pożywki i powtórz wirowanie.

Usunąć medium z osadu komórkowego. Następnie przygotować zawiesinę pojedynczych komórek, inkubując połączone I-P-S-R-P-E z 0,25% TRIPSIN EDTA przez 5 do 10 minut w 37 °C, aż skupiska komórek rozpadną się na pojedyncze komórki. Przepłukać komórki I-P-S-R-P-E medium I-P-S-R-P-E, a następnie wysiać zebrane komórki na świeżą płytkę pokrytą Matrigelem w 4 mL medium hodowlanego I-P-S-R-P-E; hodować komórki przez trzy tygodnie przed pasażowaniem i wymieniać medium na świeże medium I-P-S-R-P-E co trzy dni na potrzeby eksperymentu.

Wysiej komórki I-P-S-R-P-E w zagęszczeniu 100, 000 cells per square centimeter, a następnie zbierz komórki 17 dni po wysianiu w celu uzyskania niezróżnicowanych komórek IPS. Hoduj komórki do momentu, aż niezróżnicowane kolonie staną się gęste w centrum. Po zaobserwowaniu tego stanu przemyj kolonie pożywką D-M-E-M-F 12, a następnie zdysocjuj komórki IPS do pojedynczych komórek przy użyciu Accutane.

Zebrać komórki do konicznej probówki o pojemności 15 ml i wirować z prędkością 300 G przez pięć minut. Odessać nadsącz i resuspendować osad komórkowy w dwóch mililitrach pożywki D-M-E-M-F 12. Aby zebrać płodowe RPE, najpierw przepłukać hodowle komórek płodowego RPE pożywką D-M-E-M-F 12. Następnie dysocjować hodowle do pojedynczych komórek, używając 0,25% TRIPSIN EDTA przez okres od pięciu do 10 minut w temperaturze 37 °C.

Zebrać płodowe komórki RPE do 15 mililitrowej probówki stożkowej i wirować z prędkością 300 GS przez pięć minut. Następnie odessać nadsącz i resuspender osad komórkowy w 2 mililitrach pożywki D-M-E-M-F 12.

Zebierz komórki I-P-S-R-P-E w 17. dniu. Po trzecim i piątym pasażu przepłucz komórki I-P-S-R-P-E dwukrotnie w PBS i przygotuj zawiesinę pojedynczych komórek poprzez inkubację z 1 ml 0,25% trypsyny przez 5 do 10 minut w temperaturze 37 °C. Następnie zneutralizuj trypsynę za pomocą 2 ml schłodzonego do temperatury lodu medium I-P-S-R-P-E i zbierz komórki do 15 ml probówki stożkowej.

Wiruj probówkę przez pięć minut przy 300 G, a następnie odessij supernatant. Resuspender osad komórkowy w trzech mililitrach buforu barwiącego z zestawu do kulek mikro Magnetycznych; wiruj zawiesinę komórkową I-P-S-R-P-E w buforze barwiącym przy 300 G przez pięć minut. Następnie odessij supernatant i resuspender.

Resuspender osad komórkowy do stężenia 2 × 10⁶ komórek na 100 µL buforu barwiącego z zestawu do mikrokulek. Dodać 10 µL przeciwciała anty-TRA1-60 PE na każde 2 × 10⁶ komórek. Dokładnie wymieszać, a następnie inkubować w temperaturze 4 °C przez 10 minut.

Przemyć komórki w 1 mL buforu barwiącego na każde 2 × 10⁶ komórek. Następnie odwiruj zawiesinę komórkową przez 10 minut przy 300 ×g. Potem odessaj nadsącz i resuspender osad komórkowy w 80 µL buforu barwiącego na każde 2 × 10⁶ komórek.

Następnie należy dodać 20 µL mikrokulek znakowanych anty-PE na 2×10⁶ komórek. Dobrze wymieszać i inkubować przez 15 minut w temperaturze 4 °C. Dodać 1 mL buforu barwiącego na 2×10⁶ komórek, wirować przez 10 minut przy 300 ×g, a następnie odessać nadsącz.

Następnie ponownie zawiesić pellet komórkowy w 500 µL buforu barwiącego i wyselekcjonować komórki TRA-1-60-ujemne za pomocą magnetycznego separatora komórek, zgodnie z opisem w towarzyszącym protokole tekstowym. Następnie poddać komórki lizie, przepuszczając każdą próbkę przez komercyjnie dostępną kolumnę homogenizującą do mikrocentryfugi (mini spin column), przeznaczoną do mini-preparatyki kwasów nukleowych. Następnie wyekstrahować całkowity RNA z komórek iPS, iPS-RPE oraz płodowego RPE przy użyciu komercyjnie dostępnego zestawu do ekstrakcji RNA, zaprojektowanego w celu zachowania małych cząsteczek RNA.

Do oznaczenia całkowitego stężenia RNA należy użyć spektrofotometru NanoDrop, a następnie utworzyć plik Excel z listą mikroRNA, w których stwierdzono co najmniej dwukrotną różnicę w poziomach ekspresji pomiędzy grupami próbek. Następnie należy zalogować się do internetowego programu do analizy szlaków RNA i przesłać plik Excel. W polu formatu pliku należy wybrać „flexible format”, a z listy rozwijanej w polu identyfikatora wybrać „Agilent”.

Wpisz dane pod nagłówkiem danych surowych (raw data). Przypisz ID do kolumny probe ID oraz observation one i log ratio do kolumny log ratio. Wybierz opcję ignore dla wszystkich pozostałych kolumn.

Wybierz parametry analizy w następujący sposób: w sekcji confidence zaznacz jedynie „experimentally observed”, uwzględnij zależności bezpośrednie i pośrednie (direct and indirect relationships) oraz włącz substancje endogenne (endogenous chemicals). Jako zestaw referencyjny wybierz bazę wiedzy Ingenuity. Następnie wybierz bazę danych cząsteczek referencyjnych.

Obejmuje to dane ze wszystkich gatunków, wszystkich linii komórkowych i tkanek oraz wszystkich mutacji. Po wybraniu wszystkich parametrów uruchom analizę sieciową, wybierając opcję sieci (networks). Następnie wybierz nakładające się sieci (overlapping networks), a potem kliknij interesującą Cię sieć, aby zobaczyć wyniki.

Komórki IPS, które zróżnicowano do komórek I-P-S-R-P-E, wykazywały klasyczny fenotyp RPE w postaci sześciobokowej morfologii pigmentowanych komórek, co jest podobne do płodowych komórek RPE. Porównanie profilu ekspresji microRNA niedróżnicowanych komórek IPS z komórkami I-P-S-R-P-E wykazało nadekspresję 47 microRNA i niedoekspresję 36 microRNA, podczas gdy w płodowych komórkach RPE stwierdzono nadekspresję 61 microRNA w porównaniu z komórkami I-P-S-R-P-E oraz niedoekspresję 49 microRNA. Analiza szlaków z użyciem oprogramowania ingenuity IPA wskazała, że geny docelowe różnicowo eksponowanych microRNA były zaangażowane w procesy komórkowe, w tym rozwój, wzrost i cykl komórkowy. Analiza ta wykazała również, że microRNA eksponowane in vivo w tkankach oka były wzbogacone w I-P-S-R-P-E i płodowym RPE w porównaniu z komórkami IPS. Podczas przeprowadzania tej procedury ważne jest, aby zapobiegać kontaminacji i degradacji próbek RNA po zakończeniu procesu.

W celu potwierdzenia poziomu ekspresji mikroRNA w każdym typie komórek po ich wdrożeniu można zastosować inne metody, takie jak RT-PCR. Technika ta utorowała drogę badaczom w dziedzinie badań nad wzrokiem do zgłębienia roli mikroRNA w różnicowaniu i progresji cyklu komórkowego w rrp. Po obejrzeniu tego filmu powinni Państwo posiadać gruntowną wiedzę na temat tego, jak pozyskiwać RPE z iPS oraz jak porównywać profil ekspresji mikroRNA w iPS-RPE z komórkami iPS oraz płodowym RPE.