Name: Profile ekspresji mikroRNA ludzkich komórek iPS, nabłonka barwnikowego siatkówki pochodzącego z iPS oraz nabłonka barwnikowego siatkówki płodu (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-06-24T13:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 19 s
Description: Poznaj profilowanie ekspresji mikroRNA w ludzkich komórkach iPS i nabłonku barwnikowym siatkówki. Ta metoda pozwala porównać komórki iPS-RPE z płodowym RPE, ujawniając różnice w regulacji genów.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Opinie lub twierdzenia zawarte tutaj są prywatnymi poglądami autorów i nie mogą być interpretowane jako oficjalne lub odzwierciedlające poglądy Departamentu Armii lub Departamentu Obrony.
To badanie zostało przeprowadzone, gdy autorzy Whitney A. Greene, Alberto Muñiz, i Ramesh R. Kaini zajmowali stanowisko doktora habilitowanego w USAISR.
Testy mikromacierzy zostały przeprowadzone przez Greehey Children's Cancer Research Institute, Microarray Core Facility and Bioinformatics Department w UT Health Science Center w San Antonio.
Ta praca była wspierana przez U.S. Army Clinical Rehabilitative Medicine Research Program (CRMRP) oraz Military Operational Medicine Research Program (MOMRP).

1. Przygotowanie odczynników do hodowli i płytek hodowlanych
<ol>
	<li>Nośnik mTeSR1: Przygotuj nośnik mTeSR1 zgodnie ze wskazówkami producenta. Rozmrozić 100 ml mTeSR1 5x suplementu przez noc w temperaturze 4 °C. Dodać 100 ml mTeSR1 5x suplementu do 400 ml podłoża podstawowego mTeSR1 i dobrze wymieszać. Pożywka ta jest stabilna w temperaturze 4 °C przez okres do 2 tygodni i w temperaturze -20 °C przez 6 miesięcy.</li>
	<li>Pożywki różnicujące: Przygotuj pożywkę różnicującą w DMEM/F12, aby uzyskać 0,1 mM β-merkaptoetanolu, 0,1 mM aminokwasów endogennych, 2,0 mM L-glutaminy, 10% surowicy nokautującej i 10 μg/ml gentamycyny.</li>
	<li>Pożywki iPS-RPE: Przygotuj pożywkę iPS-RPE w MEM, aby uzyskać 1x suplement N1, 0,1 mM aminokwasów endogennych, 250 μg/ml tauryny, 13 ng/ml soli sodowej trijodo-L-tyroniny, 20 ng/ml hydrokortyzonu, 5 μg/ml gentamycyny i 15% FBS26.</li>
	<li>Roztwór podstawowy soli sodowej trijodo-L-tyroniny. Aby przygotować roztwór podstawowy, rozpuścić 1,0 mg soli sodowej trijodo-L-tyroniny w 1 N wodorotlenku sodu, delikatnie obracając. Następnie dodać 49,0 ml pożywki bazowej, aby uzyskać 50,0 ml 20 μg/ml soli sodowej trójjodo-L-tyroniny. Przygotować porcje i zamrozić w temperaturze -20 °C do czasu, aż będą potrzebne. Użyj odpowiedniej objętości, aby osiągnąć pożądane stężenie w końcowych pożywkach hodowlanych.</li>
	<li>Roztwór podstawowy hydrokortyzonu: Aby przygotować roztwór podstawowy hydrokortyzonu, należy rozpuścić 1 mg hydrokortyzonu w 1 ml bezwzględnego etanolu przez delikatne mieszanie. Następnie dodać 19,0 ml pożywki bazowej do 20 ml roztworu podstawowego hydrokortyzonu o stężeniu 50 μg/ml podwielokrotności i zamrozić w temperaturze -20 °C do momentu, gdy będzie potrzebna. Użyj odpowiedniej objętości, aby osiągnąć pożądane stężenie w końcowej pożywce hodowlanej.</li>
	<li>Pożywka wzrostowa RPE dla płodu. Przygotować pożywkę wzrostową, mieszając wszystkie odczynniki z zestawu RTEGM z podłożem podstawowym, zgodnie ze wskazówkami producenta, z wyjątkiem FBS.</li>
	<li>Pożywka do powlekania RPE płodu. Przygotować podłoże galwaniczne, przenosząc niewielką ilość pożywki wzrostowej do sterylnego pojemnika i dodać FBS do końcowego stężenia 2%.</li>
	<li>Dyspaza: Przygotować roztwór roboczy dypazy o stężeniu 1 mg/ml w DMEM/F12.</li>
	<li>Płytki pokryte Matrigelem: Przygotować matrigel w DMEM/F12 do 0,08 mg/ml.</li>
	<li>Pokryć każde zagłębienie płytki 6-dołkowej 1,0 ml roztworu matrigelu.</li>
	<li>Inkubować powlekane płytki w temperaturze pokojowej przez 1,0 godziny.</li>
	<li>Po 1,0 godzinnej inkubacji odessać nadmiar DMEM/F12.</li>
	<li>Dodać 0,5 ml pożywki mTeSR1, aby uniknąć wysuszenia. Płytki pokryte matriżelem są teraz gotowe do użycia.</li>
</ol>
2. Kultura iPS
<ol>
	<li>Przed wysiewem komórek iPS należy przygotować wszystkie probówki, pożywkę mTESR1 do temperatury pokojowej i płytki pokryte matriżelem.</li>
	<li>Szybko rozmrozić ogniwa IMR90-4 iPS w łaźni wodnej o temperaturze 37 °C. Następnie wyjmij kriowial z łaźni wodnej i wysterylizuj przy użyciu 70% etanolu.</li>
	<li>Przenieś komórki do stożkowej probówki o pojemności 15 ml za pomocą pipety o pojemności 2 ml, aby zminimalizować pękanie agregatów komórkowych.</li>
	<li>Kroplami dodaj 5 ml ciepłej pożywki mTeSR1 do komórek i delikatnie wymieszaj. Odwirować komórki o sile 300 x g przez 5 minut w temperaturze pokojowej i usunąć supernatant.</li>
	<li>Ostrożnie zawiesić agregaty komórkowe w 2 ml pożywki mTeSR1 i umieścić komórki w jednym dołku na płytce sześciodołkowej.</li>
	<li>Umieścić płytkę w inkubatorze o temperaturze 37 °C i przeprowadzić hodowlę o wilgotności 5% CO2 i wilgotności 95%.</li>
	<li>Codziennie zmieniaj pożywkę do hodowli komórek iPS. Niezróżnicowane kolonie pojawią się 5-7 dni po wysianiu. Sprawdź, czy nie ma niezróżnicowanych kolonii, które są gotowe do przejścia (kolonie o gęstym środku).</li>
</ol>
3. Pasażowanie komórek iPS
<ol>
	<li>Przed rozpoczęciem pasażu komórek iPS należy ogrzać wszystkie probówki, roztwór dyspazy, pożywki DMEM/F12 i mTERS1 do temperatury pokojowej, a następnie przygotować płytki pokryte matryżelem.</li>
	<li>Przed pasażowaniem komórek iPS należy usunąć wszelkie obszary różnicowania, zeskrobując obszar i odsysając pożywkę. W przypadku kultur wysokiej jakości zróżnicowanie powinno pozostać poniżej 20 % studni. Ostrożnie przepłukać studzienkę zawierającą komórki iPS 2 ml DMEM/F12 i dodać 1 ml 1 mg/ml dispazy do każdej studzienki.</li>
	<li>Inkubować w temperaturze 37 °C przez 7 minut. Odessać depazę i delikatnie przepłukać kolonie komórkowe dwukrotnie 2 ml DMEM/F12.</li>
	<li>Po wypłukaniu dodać 2 ml mTSER1 do każdego dołka.</li>
	<li>Za pomocą pipety o pojemności 5 ml delikatnie zeskrobać kolonie płytki, aby utworzyć agregaty.</li>
	<li>Przenieść oderwane kolonie do stożkowej probówki o pojemności 15 ml. Dodaj wystarczającą ilość pożywki mTeSR1, aby zasiać następne przejście komórek.</li>
</ol>
4. Różnicowanie komórek iPS do iPS-RPE
<ol>
	<li>Umieść komórki iPS na nowo pokrytej płytce w pożywce mTESR1.</li>
	<li>Pozwól koloniom komórek iPS rozwijać się przez 4-5 dni w hodowli.</li>
	<li>Zastąp pożywkę mTeSR1 4 ml pożywką różnicującą. Zmieniaj połowę nośnika co 3 dni.</li>
	<li>Pozwól, aby pigmentowane ogniska urosły na tyle duże, aby można je było ręcznie wyciąć z kultury (40-50 dni).</li>
	<li>Użyj końcówki pipety o pojemności 200 μl, aby przeciąć i podnieść pigmentowane kolonie.</li>
	<li>Zbierz i połącz wypreparowane kolonie w stożkowej probówce o pojemności 15 ml.</li>
	<li>Następnie dodać 5 ml DMEM/F12 do połączonych komórek RPE i dwukrotnie odwirować przy 300 x g przez 5 minut.</li>
	<li>Przygotuj roztwór jednokomórkowy, inkubując połączony iPS-RPE z 0,25% trypsyną EDTA.</li>
	<li>Przepłukać komórki iPS-RPE pożywką iPS-RPE i umieścić zebrane komórki na świeżej pożywce pokrytej matrycą w 4 ml pożywki iPS-RPE.</li>
	<li>Hoduj komórki przez 3 tygodnie przed pasażem. Zmieniaj nośnik co 3 dni. W eksperymencie płytka iPS-RPE na 100 000 komórek/cm2. Zbierz komórki w dniu 17. Policz dzień wysiewu jako dzień 0.</li>
</ol>
5. Pobieranie próbek
<ol>
	<li>Kolekcja iPS Cell
	<ol>
		<li>Hoduj komórki iPS do momentu, gdy zaobserwujesz, że niezróżnicowane kolonie są gęste w środku.</li>
		<li>Opłucz kolonie w DMEM/F12.</li>
		<li>Dysocjuj na pojedyncze komórki za pomocą akutazy. Zebrać komórki do stożkowej probówki o pojemności 15 ml i wirować przy sile 300 x g przez 5 minut. Aspirat supernatantu. Zawiesić w 2 ml DMEM/F12.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Kolekcja RPE dla płodu
	<ol>
		<li>Przepłucz hodowle komórek płodu RPE za pomocą DMEM/F12 i dysocjuj na pojedyncze komórki za pomocą 0,25% trypsyny EDTA.</li>
		<li>Zebrać komórki w stożkowej probówce o pojemności 15 ml. Wirować przy 300 x g przez 5 minut. Odsysać supernatant. Zawiesić w 2 ml DMEM/F12.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Kolekcja komórek iPS-RPE
	<ol>
		<li>Gdy iPS-RPE dotrą do przejścia 3 i przejścia 5, zbierz komórki w 17 dniu po pasażu. Przepłukać iPS-RPE dwukrotnie w PBS i przygotować zawiesinę jednokomórkową przez inkubację z 1,0 ml 0,25% trypsyny.</li>
		<li>Zneutralizuj trypsynę za pomocą 2 ml lodowatej pożywki iPS-RPE.</li>
		<li>Zebrać komórki do stożkowej probówki o pojemności 15 ml i odwirować przy 300 x g przez 5 minut. Aspirat supernatantu.</li>
		<li>Zawiesić zawiesinę komórkową w 3 ml buforu barwiącego z zestawu mikrogranulek.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
6. Negatywny wybór iPS-RPE w celu usunięcia niezróżnicowanych komórek
<ol>
	<li>Przechowywać wszystkie odczynniki w temperaturze 4 °C do momentu użycia, ale nie pracować z lodem. Odwirować zawiesinę komórek z etapu 5.3.4 przy 300 x g przez 5 min. Aspirować supernatant.</li>
	<li>Ponownie zawiesić komórki w 100 μl buforu barwiącego z zestawu mikrokulek na 2 x 106 komórek.</li>
	<li>Dodać 10 μl przeciwciała anty-TRA-1-60-PE na 2 x 106 komórek.</li>
	<li>Dobrze wymieszać i inkubować w temperaturze 4 °C przez 10 minut.</li>
	<li>Umyj komórki w 1-2 ml buforu na 2 x 106 komórek. Wirować przez 10 minut przy 300 x g. Aspirować supernatant.</li>
	<li>Zawieś komórki w 80 μl buforu barwiącego na 2 x 106 komórek. Dodaj 20 μl mikrogranulek znakowanych anty-PE (z zestawu) na 2 x 106 komórek. Dobrze wymieszaj. Inkubować przez 15 minut w temperaturze 4 °C.</li>
	<li>Dodać 1-2 ml buforu barwiącego na 2 x 106 komórek. Wirować przez 10 minut przy 300 x g. Aspirować supernatant.</li>
	<li>Ponownie zawiesić komórki w 500 μl buforu barwiącego.</li>
	<li>Magnetyczna separacja komórek:
	<ol>
		<li>Umieść kolumnę w magnetycznym sortowniku komórek. Przepłukać kolumnę 3 ml buforu barwiącego.</li>
		<li>Zastosuj zawieszenie komórki od 6.8 do kolumny.</li>
		<li>Umieść rurkę w porcie ujemnym, aby zebrać ogniwa ujemne TRA-1-60.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
7. Całkowita ekstrakcja RNA
<ol>
	<li>Poddać komórki lizie, przepuszczając próbki przez dostępną na rynku mini kolumnę wirową homogenizatora z mikrowirówką, przeznaczoną do minipreparatów kwasów nukleinowych.</li>
	<li>Ekstrahuj całkowite RNA z komórek iPS, iPS-RPE i płodowego RPE za pomocą dostępnego na rynku zestawu do ekstrakcji RNA zaprojektowanego do zachowania małych cząsteczek RNA27.</li>
	<li>Określ całkowite stężenia RNA za pomocą spektrofotometru Nanodrop.</li>
</ol>
8. Bioanalizator i test mikromacierzy
<ol>
	<li>Sprawdź integralność RNA za pomocą Bioanalyzera w połączeniu z dostępnym na rynku zestawem do kontroli jakości RNA.</li>
	<li>Inkubować 100 ng całkowitego RNA z fosfatazą jelitową cieląt w temperaturze 37 °C przez 30 minut</li>
	<li>Denaturacja RNA za pomocą 100% DMSO w temperaturze 100 °C przez 5 min.</li>
	<li>Oznaczyć próbki za pomocą pCp-Cy3 przy użyciu ligazy T4 przez inkubację w temperaturze 16 °C przez 1 godzinę.</li>
	<li>Hybrydyzacja na ludzkiej macierzy miRNA w formacie 8_x_15K.</li>
	<li>Umyj matryce zgodnie z instrukcjami producenta i zeskanuj w rozdzielczości 5 μm za pomocą skanera.</li>
	<li>Pozyskiwanie danych za pomocą oprogramowania do ekstrakcji cech mikromacierzy kompatybilnego z mikromacierzą miRNA.</li>
	<li>Przetwarzaj sygnały miRNA, aby określić względny poziom ekspresji w każdej próbce.</li>
	<li>Porównaj poziomy ekspresji każdego miRNA między grupami próbek. Wybierz miRNA z co najmniej dwukrotną ekspresją różnicową do dalszej analizy.</li>
	<li>Korzystając z dostępnego na rynku oprogramowania do analizy danych, postępuj zgodnie z instrukcjami, aby wygenerować mapy ciepła w celu wizualizacji miRNA o zróżnicowanej ekspresji28.</li>
</ol>
9. Analiza ścieżek
<ol>
	<li>Zapisz dane z miRNA wybranych w 8.9 w formacie Excel.</li>
	<li>Zaloguj się do internetowego programu do analizy szlaków RNA. Prześlij plik Excel. Wybierz "Elastyczny format" jako format pliku i wybierz "Agilent" z listy rozwijanej jako typ identyfikatora.</li>
	<li>Pod nagłówkiem surowych danych przypisz "ID" do kolumny ID sondy i przypisz "Obserwacja 1" i "współczynnik logarytmu" do kolumny racji logarytmicznej. Wybierz opcję "ignoruj" dla wszystkich innych kolumn.</li>
	<li>Należy wybrać parametry do analizy w następujący sposób: Ufność: tylko obserwowane doświadczalnie; obejmują bezpośrednie i pośrednie relacje; oraz obejmują endogenne substancje chemiczne; Wybierz bazę wiedzy Ingenuity jako zestaw referencyjny. Wybierz bazę danych cząsteczek referencyjnych, która zawiera dane ze wszystkich gatunków, wszystkich linii komórkowych i tkanek oraz wszystkich mutacji.</li>
	<li>Przeprowadzanie analiz sieci i ścieżek.</li>
</ol>

<ol><li>Yu, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((miRNAs+regulate+stem+cell+self-renewal+and+differentiation%5BTitle%5D)+AND+%22Front+Genet%22%5BJournal%5D)">miRNAs regulate stem cell self-renewal and differentiation.</a> Front Genet. 3, 191 (2012).</li>
<li>Romano, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+commentary+on+iPS+cell+biology%3A+Potential+applications+in+autologous+tissue+and+cell+transplantation%2C+development+of+new+models+for+the+study+of+human+pathological+conditions+and+drug+screening%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cell+Physiol%22%5BJournal%5D)">A commentary on iPS cell biology: Potential applications in autologous tissue and cell transplantation, development of new models for the study of human pathological conditions and drug screening.</a> J Cell Physiol. 229, 148-152 (2014).</li>
<li>Almeida, P. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Immunogenicity+of+pluripotent+stem+cells+and+their+derivatives%5BTitle%5D)+AND+%22Circ+Res%22%5BJournal%5D)">Immunogenicity of pluripotent stem cells and their derivatives.</a> Circ Res. 112, 549-561 (2013).</li>
<li>Buchholz, D. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Derivation+of+functional+retinal+pigmented+epithelium+from+induced+pluripotent+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cells%22%5BJournal%5D)">Derivation of functional retinal pigmented epithelium from induced pluripotent stem cells.</a> Stem Cells. 27, 2427-2434 (2009).</li>
<li>Kokkinaki, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+induced+pluripotent+stem-derived+retinal+pigment+epithelium+%28RPE%29+cells+exhibit+ion+transport%2C+membrane+potential%2C+polarized+vascular+endothelial+growth+factor+secretion%2C+and+gene+expression+pattern+similar+to+native+RPE%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cells%22%5BJournal%5D)">Human induced pluripotent stem-derived retinal pigment epithelium (RPE) cells exhibit ion transport, membrane potential, polarized vascular endothelial growth factor secretion, and gene expression pattern similar to native RPE.</a> Stem Cells. 29, 825-835 (2011).</li>
<li>Bharti, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+new+paradigm%3A+retinal+pigment+epithelium+cells+generated+from+embryonic+or+induced+pluripotent+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Pigment+Cell+Melanoma+Res%22%5BJournal%5D)">The new paradigm: retinal pigment epithelium cells generated from embryonic or induced pluripotent stem cells.</a> Pigment Cell Melanoma Res. 24, 21-34 (2011).</li>
<li>Park, I. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Reprogramming+of+human+somatic+cells+to+pluripotency+with+defined+factors%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Reprogramming of human somatic cells to pluripotency with defined factors.</a> Nature. 451, 141-146 (2008).</li>
<li>Pera, M. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Stem+cells.+A+new+year+and+a+new+era%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Stem cells. A new year and a new era.</a> Nature. 451, 135-136 (2008).</li>
<li>Subba Rao, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Thinking+outside+the+liver%3A+Induced+pluripotent+stem+cells+for+hepatic+applications%5BTitle%5D)+AND+%22World+J+Gastroenterol%22%5BJournal%5D)">Thinking outside the liver: Induced pluripotent stem cells for hepatic applications.</a> World J Gastroenterol. 19, 3385-3396 (2013).</li>
<li>Yoshida, Y., Yamanaka, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((iPS+cells%3A+a+source+of+cardiac+regeneration%5BTitle%5D)+AND+%22J+Mol+Cell+Cardiol%22%5BJournal%5D)">iPS cells: a source of cardiac regeneration.</a> J Mol Cell Cardiol. 50, 327-332 (2011).</li>
<li>Lee, K. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+sensory+neurons+derived+from+induced+pluripotent+stem+cells+support+varicella-zoster+virus+infection%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Human sensory neurons derived from induced pluripotent stem cells support varicella-zoster virus infection.</a> PLoS One. 7, (2012).</li>
<li>Alipio, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Reversal+of+hyperglycemia+in+diabetic+mouse+models+using+induced-pluripotent+stem+%28iPS%29-derived+pancreatic+beta-like+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Reversal of hyperglycemia in diabetic mouse models using induced-pluripotent stem (iPS)-derived pancreatic beta-like cells.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 107, 13426-13431 (2010).</li>
<li>la Cour, M., Tezel, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+retinal+pigment+epithelium%5BTitle%5D)+AND+%22Adv+Organ+Biol%22%5BJournal%5D)">The retinal pigment epithelium.</a> Adv Organ Biol. 10, 253-272 (2005).</li>
<li>Carr, A. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Protective+effects+of+human+iPS-derived+retinal+pigment+epithelium+cell+transplantation+in+the+retinal+dystrophic+rat%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Protective effects of human iPS-derived retinal pigment epithelium cell transplantation in the retinal dystrophic rat.</a> PLoS One. 4, (2009).</li>
<li>Schwartz, S. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Embryonic+stem+cell+trials+for+macular+degeneration%3A+a+preliminary+report%5BTitle%5D)+AND+%22Lancet%22%5BJournal%5D)">Embryonic stem cell trials for macular degeneration: a preliminary report.</a> Lancet. 379, 713-720 (2012).</li>
<li>Muniz, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Retinoid+uptake%2C+processing+and+secretion+in+human+iPS-RPE+support+the+visual+cycle%5BTitle%5D)+AND+%22Invest+Ophthalmol+Vis+Sci%22%5BJournal%5D)">Retinoid uptake, processing and secretion in human iPS-RPE support the visual cycle.</a> Invest Ophthalmol Vis Sci. 55, 198-209 (2014).</li>
<li>Leonardo, T. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+functions+of+microRNAs+in+pluripotency+and+reprogramming%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">The functions of microRNAs in pluripotency and reprogramming.</a> Nat Cell Biol. 14, 1114-1121 (2012).</li>
<li>Arora, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Prediction+of+microRNAs+affecting+mRNA+expression+during+retinal+development%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Dev+Biol%22%5BJournal%5D)">Prediction of microRNAs affecting mRNA expression during retinal development.</a> BMC Dev Biol. 10, (2010).</li>
<li>Huntzinger, E., Izaurralde, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Gene+silencing+by+microRNAs%3A+contributions+of+translational+repression+and+mRNA+decay%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Genet%22%5BJournal%5D)">Gene silencing by microRNAs: contributions of translational repression and mRNA decay.</a> Nat Rev Genet. 12, 99-110 (2011).</li>
<li>Mallanna, S. K., Rizzino, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Emerging+roles+of+microRNAs+in+the+control+of+embryonic+stem+cells+and+the+generation+of+induced+pluripotent+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Dev+Biol%22%5BJournal%5D)">Emerging roles of microRNAs in the control of embryonic stem cells and the generation of induced pluripotent stem cells.</a> Dev Biol. 344, 16-25 (2010).</li>
<li>Guo, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mammalian+microRNAs+predominantly+act+to+decrease+target+mRNA+levels%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Mammalian microRNAs predominantly act to decrease target mRNA levels.</a> Nature. 466, 835-840 (2010).</li>
<li>Adijanto, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microphthalmia-associated+transcription+factor+%28MITF%29+promotes+differentiation+of+human+retinal+pigment+epithelium+%28RPE%29+by+regulating+microRNAs-204%2F211+expression%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biol+Chem%22%5BJournal%5D)">Microphthalmia-associated transcription factor (MITF) promotes differentiation of human retinal pigment epithelium (RPE) by regulating microRNAs-204/211 expression.</a> J Biol Chem. 287, 20491-20503 (2012).</li>
<li>Hu, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+of+miRNA+signatures+during+the+differentiation+of+hESCs+into+retinal+pigment+epithelial+cells%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Identification of miRNA signatures during the differentiation of hESCs into retinal pigment epithelial cells.</a> PLoS One. 7, (2012).</li>
<li>Wilson, K. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((MicroRNA+profiling+of+human-induced+pluripotent+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cells+Dev%22%5BJournal%5D)">MicroRNA profiling of human-induced pluripotent stem cells.</a> Stem Cells Dev. 18, 749-758 (2009).</li>
<li>Neveu, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((MicroRNA+profiling+reveals+two+distinct+p53-related+human+pluripotent+stem+cell+states%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Stem+Cell%22%5BJournal%5D)">MicroRNA profiling reveals two distinct p53-related human pluripotent stem cell states.</a> Cell Stem Cell. 7, 671-681 (2010).</li>
<li>Maminishkis, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Confluent+monolayers+of+cultured+human+fetal+retinal+pigment+epithelium+exhibit+morphology+and+physiology+of+native+tissue%5BTitle%5D)+AND+%22Invest+Ophthalmol+Vis+Sci%22%5BJournal%5D)">Confluent monolayers of cultured human fetal retinal pigment epithelium exhibit morphology and physiology of native tissue.</a> Invest Ophthalmol Vis Sci. 47, 3612-3624 (2006).</li>
<li>Qiagen, <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((miRNeasy+Mini+Handbook%5BTitle%5D)+AND+%22Sample+and+Assay+Technologies%22%5BJournal%5D)">miRNeasy Mini Handbook.</a> Sample and Assay Technologies. , (2013).</li>
<li><a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microarray+System+with+miRNA+Complete+Labeling+and+Hyb+Kit%5BTitle%5D)+AND+%22Agilent+Technologies%22%5BJournal%5D)">Microarray System with miRNA Complete Labeling and Hyb Kit.</a> Agilent Technologies. , (2011).</li>
<li><a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Maintenance+of+hESCs+and+hiPSCs+in+mTESR1+and+mTESR2%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cell+Technologies%22%5BJournal%5D)">Maintenance of hESCs and hiPSCs in mTESR1 and mTESR2.</a> Stem Cell Technologies. , (2010).</li>
<li><a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Analysis+of+DNA+or+RNA+using+its+wavelengths%3A+230+nm%2C+260+nm%2C+280+nm%5BTitle%5D)+AND+%22About+Biotechnology%22%5BJournal%5D)">The Analysis of DNA or RNA using its wavelengths: 230 nm, 260 nm, 280 nm.</a> About Biotechnology. , (2013).</li>
</ol>

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Podsumowując, w niniejszym raporcie opisano metody stosowane do hodowli komórek iPS, iPS-RPE i płodowego RPE. RPE pochodzące z iPS są morfologicznie i funkcjonalnie podobne do RPE płodu. iPS-RPE wykazuje również ekspresję charakterystycznych genów RPE, w tym RPE65, CRALBP, PEDF i LRAT16. Aby dokładniej scharakteryzować te komórki, wyekstrahowano RNA i wykorzystano je do przeprowadzenia analizy mikromacierzy w celu zidentyfikowania miRNA o zróżnicowanej ekspresji. Analiza intensywności sygnału wykazała, że najw...

Komórki macierzyste mają zdolność do replikacji bez ograniczeń i potencjał do różnicowania się w dowolny typ komórek somatycznych. Rozwój technik przeprogramowywania komórek somatycznych w pluripotencjalne komórki macierzyste wywołał wielkie emocje w społeczności naukowej i wśród klinicystów, ponieważ na horyzoncie pojawia się spersonalizowana regeneracja tkanek1. Indukowane pluripotencjalne komórki macierzyste (iPS) wykazują te same cechy nieograniczonego potencjału replikacyjnego i pluripotencji, co embrionalne komórki macierzyste (ES), przy jednoczesnym obejściu dylematów etycznych związanych z ESC. Ponadto komórki macierzyste pochodzące od pacjenta nie będą stymulować odpowiedzi immunologicznej, co znacznie zwiększa prawdopodobieństwo udanych zastosowań terapeutycznych2-3. Wykazano, że w określonych warunkach hodowli komórki iPS różnicują się w kilka różnych typów komórek in vitro, w tym kardiomiocyty, neurony, komórki beta trzustki, hepatocyty i barwnikowy nabłonek siatkówki (RPE)4-12.
RPE to wyspecjalizowana warstwa pigmentowanych komórek nabłonkowych znajdujących się z tyłu siatkówki, która spełnia kilka funkcji, które są niezbędne dla zdrowia wzroku i funkcji, takich jak absorpcja światła rozproszonego, fagocytoza zewnętrznych segmentów fotoreceptora i przetwarzanie retinoidów do produkcji chromoforu wizualnego. Dysfunkcja RPE spowodowana uszkodzeniem lub chorobą głęboko wpływa na zdrowie fotoreceptorów i funkcje wzrokowe, o czym świadczą choroby powodujące ślepotę, które są wynikiem podstawowej patologii RPE, takie jak zwyrodnienie plamki żółtej związane z wiekiem (AMD), choroba Stargardta i barwnikowe zwyrodnienie siatkówki (RP)13. Naprawdę skuteczne metody leczenia, które mogą przywrócić wzrok, nie zostały osiągnięte, a zastąpienie chorego RPE zdrowym RPE może być najlepszą opcją, aby zapobiec utracie wzroku14-15. RPE pochodzące z iPS (iPS-RPE) jest możliwym źródłem komórek, które zastępują uszkodzone RPE. iPS-RPE ulega ekspresji charakterystycznych białek RPE LRAT, CRALBP, PEDF i RPE65; wykazuje klasyczną, wysoce pigmentowaną sześciokątną morfologię RPE; i wykonuje funkcje RPE, takie jak fagocytoza, przetwarzanie retinoidów i wydzielanie 11-cis siatkówki5,16. Zanim jednak iPS-RPE będzie mógł być stosowany terapeutycznie, iPS-RPE musi zostać dokładnie scharakteryzowany. Zrozumienie czynników rządzących różnicowaniem RPE jest niezbędne do poprawy wydajności i czystości komórek, które mają być wykorzystywane do zastosowań klinicznych.
Różnicowanie komórek jest wynikiem wysoce regulowanej ekspresji genów. Epigenetyczna przebudowa genomu i koordynacja czynników transkrypcyjnych są niezbędne do podejmowania decyzji dotyczących losu komórki, które zachodzą podczas różnicowania i rozwoju17. Regulacja translacji RNA wiadomości (mRNA) przez mikroRNA (miRNA) stanowi kolejny poziom regulacji, który wpływa na los komórki1. MiRNA to krótkie, ~22 nt, długości nukleotydów, które albo hamują translację poprzez wiązanie się z 3' UTR mRNA, albo kierują mRNA do degradacji. MiRNA zostały wykryte praktycznie we wszystkich tkankach i do tej pory w bazie danych miRBazy zarejestrowano ponad 2000 unikalnych ludzkich mikroRNA. Ponieważ miRNA wymagają tylko częściowej komplementarności, aby związać się z docelowym mRNA, pojedyncze miRNA może potencjalnie wiązać się z dziesiątkami lub setkami celów i odwrotnie; tj. pojedyncze mRNA może być celem kilku różnych miRNA. Ta cecha rozwiązłego wiązania znacznie zwiększa poziom złożoności regulacji, a także poziom trudności w określeniu funkcji poszczególnych miRNA i roli, jaką każdy z nich odgrywa w funkcjach komórkowych18-21. Niemniej jednak badania wykazały, że miRNA udoskonala ekspresję genów podczas różnicowania, wpływając na stan metylacji DNA17. W badaniu bardziej specyficznym dla RPE wykazano, że miR-204/211 promuje fenotyp nabłonkowy RPE22. Inna grupa przeanalizowała profil miRNA RPE podczas różnicowania z komórek ES i ujawniła, że podczas procesu różnicowania ulegają ekspresji odrębne zestawy miRNA23. W rzeczywistości profile miRNA mogą jednoznacznie rozróżniać typy komórek, w tym komórki ES, komórki prekursorowe i komórki ostatecznie zróżnicowane24,25. W siatkówce dochodzi do ekspresji ponad 250 miRNA. Na podstawie tych badań stawiamy hipotezę, że miRNA odgrywają ważną rolę podczas różnicowania RPE od iPS.
Celem tego raportu jest opisanie protokołów różnicowania komórek iPS IMR90-4, zbierania RNA do analizy za pomocą mikromacierzy oraz analizy danych z mikromacierzy w celu identyfikacji miRNA, które są różnie wyrażane między trzema typami komórek, komórkami iPS, iPS-RPE i RPE płodu. Całkowite RNA wyekstrahowano z kultur każdego typu komórek i zhybrydyzowano z mikromacierzą miRNA, zawierającą sondy specyficzne dla 1,205 ludzkich miRNA i 144 wirusowych miRNA. Wyniki mikromacierzy porównano w celu określenia, które miRNA ulegały zróżnicowanej ekspresji między różnymi typami komórek. Do dalszej analizy wybrano miRNA z 2-krotną lub większą zmianą ekspresji. Wykorzystano oprogramowanie do analizy miRNA w celu zidentyfikowania potencjalnych celów miRNA o zróżnicowanej ekspresji oraz do wygenerowania sieci komórkowych regulowanych przez wybrane miRNA.

<table><tbody><tr><td>Pożywka mTeSR1 + suplement 5X</td><td>Stem Cell Technologies</td><td>5850</td><td></td></tr><tr><td>DMEM/F12</td><td>Life Technologies</td><td>11330-032</td><td></td></tr><tr><td>2-&beta;-merkaptoetanol</td><td>Sigma</td><td>M-7154</td><td></td></tr><tr><td>Aminokwasy endogenne</td><td>Hyklon (Fisher)</td><td>SH30853.01</td><td></td></tr><tr><td>Zamiennik surowicy nokautującej</td><td>Life Technologies</td><td>10828-028</td><td></td></tr><tr><td>Gentamycyna&nbsp;</td><td>Life Technologies</td><td>15750-060</td><td></td></tr><tr><td>Media MEM</td><td>Life Technologies</td><td>10370-021</td><td></td></tr><tr><td>Suplement N1</td><td>Sigma</td><td>N-6530-5ML</td><td></td></tr><tr><td>Tauryna</td><td>Sigma</td><td>T-8691-25G</td><td></td></tr><tr><td>Hydrokortyzon</td><td>Sigma</td><td>H0888-1G</td><td></td></tr><tr><td>Surowica bydlęca</td><td>płodu Hyklon (Fisher)</td><td>SH3008803HI</td><td></td></tr><tr><td>Sól sodowa trijodo-l-tyroniny</td><td>Sigma</td><td>T6397</td><td></td></tr><tr><td>Wodorotlenek sodu</td><td>Sigma</td><td>S5881</td><td></td></tr><tr><td>Pożywka dla płodu Zestaw RTEGM</td><td>Life Technologies</td><td>195406</td><td></td></tr><tr><td>Dispase</td><td>Life Technologies</td><td>17105-041</td><td></td></tr><tr><td>Matrigel</td><td>BD Biosciences</td><td>354277</td><td></td></tr><tr><td>Sól fizjologiczna buforowana fosforanami</td><td>Hyklon (Fisher)</td><td>10010-023</td><td></td></tr><tr><td>Hyklon trypsyny</td><td>(Fisher)</td><td>25200-072</td><td></td></tr><tr><td>Bufor myjący Miltenyi Biotec</td><td>StemGent</td><td>130-092-987</td><td></td></tr><tr><td>Bufor płuczący Miltenyi Biotec</td><td>StemGent</td><td>130-092-222</td><td></td></tr><tr><td>Zestaw mikrokulek Anti-TRA-1-60</td><td>StemGent</td><td>130-095-816</td><td></td></tr><tr><td>Kolumna sortera komórek Miltenyi Biotec</td><td>StemGent</td><td>130-021-101</td><td></td></tr><tr><td>Mikrozestaw RNeasy</td><td>Niszczarka Qiagen</td><td>74004</td><td></td></tr><tr><td>QIA</td><td>Qiagen</td><td>79654</td><td></td></tr><tr><td>RNA 6000 Zestaw Pico LabChip</td><td>Agilent</td><td>G2938-90046</td><td></td></tr><tr><td>Ludzka mikromatryca miRNA v16</td><td>Agilent</td><td>G4471A</td><td></td></tr></tbody></table>

profile ekspresji mikrorna ludzkich komórek ips, nabłonka barwnikowego siatkówki pochodzącego z ips oraz nabłonka barwnikowego siatkówki płodu

MicroRNA Expression Profiles of Human iPS Cells, Retinal Pigment Epithelium Derived From iPS, and Fetal Retinal Pigment Epithelium

Celem tego raportu jest opisanie protokołów porównywania profili mikroRNA (miRNA) ludzkich indukowanych pluripotencjalnych komórek macierzystych (iPS), nabłonka barwnikowego siatkówki (RPE) pochodzącego z ludzkich komórek iPS (iPS-RPE) oraz płodowego RPE. Protokoły obejmują zbieranie RNA do analizy za pomocą mikromacierzy oraz analizę danych z mikromacierzy w celu identyfikacji miRNA, które są różnie wyrażane między trzema typami komórek. Wyjaśniono metody hodowli komórek iPS i RPE płodu. Opisano również protokół stosowany do różnicowania RPE od ludzkiego iPS. Opisana przez nas technika ekstrakcji RNA została dobrana tak, aby umożliwić maksymalne odzyskanie bardzo małego RNA do zastosowania w mikromacierzy miRNA. Na koniec wyjaśniono ścieżkę komórkową i analizę sieciową danych z mikromacierzy. Techniki te ułatwią porównanie profili miRNA trzech różnych typów komórek.

Komórki iPS (Rysunek 1A) hodowano w warunkach różnicowania, aby indukować ich różnicowanie w komórki iPS-RPE. Komórki iPS-RPE wykazywały klasyczny fenotyp RPE w postaci heksagonalnej morfologii pigmentowanych komórek (Rysunek 1B), podobnej do płodowego RPE (Rysunek 1C).
Aby lepiej zrozumieć rolę, jaką miRNA mogą odgrywać w procesie różnicowania iPS w iPS-RPE, przeprowadzono analizę ekspresji miRNA za pomocą mikromacierzy. Całkowite RNA pobrano...

Porównano profile mikroRNA (miRNA) ludzkich indukowanych pluripotencjalnych komórek macierzystych (iPS), nabłonka barwnikowego siatkówki (RPE) pochodzącego z ludzkich indukowanych pluripotencjalnych komórek macierzystych (iPS-RPE) oraz płodowego RPE.

Profile ekspresji mikroRNA ludzkich komórek iPS, nabłonka barwnikowego siatkówki pochodzącego z iPS oraz nabłonka barwnikowego siatkówki płodu

The objective of this report is to describe the protocols for comparing the microRNA (miRNA) profiles of human induced-pluripotent stem (iPS) cells, ...

Ogólnym celem niniejszej procedury jest porównanie ekspresji mikro RNA w indukowanych pluripotencjalnych komórkach macierzystych, komórkach nabłonka barwnikowego siatkówki pochodzących z indukowanych pluripotencjalnych komórek macierzystych oraz płodowych komórkach nabłonka barwnikowego siatkówki. Cel ten zostaje osiągnięty poprzez uprzednią hodowlę i ekspansję komórek iPSC oraz płodowych RPE.Drugim krokiem jest zróżnicowanie komórek iPS w komórki RPE. Następnie z komórek iPS, komórek iPS-RPE oraz płodowych komórek RPE ekstrahuje się RNA. Ostatnim krokiem jest przeprowadzenie analizy mikroarray miRNA na próbkach RNA i analiza uzyskanych danych.Ostatecznie analiza szlaków i sieci jest wykorzystywana do identyfikacji różnicowo ekspresywnych microRNA, które biorą udział w wielu sieciach komórkowych, w tym w proliferacji i progresji cyklu komórkowego. Metoda ta może pomóc w udzieleniu odpowiedzi na kluczowe pytania w dziedzinie badań nad wzrokiem, takie jak rola micro RNA w regulacji różnicowania w dojrzałe komórki RPE, progresji cyklu komórkowego, proliferacji oraz starzenia się komórek. Zastosowanie tej techniki rozciąga się na terapie wykorzystujące nabłonek barwnika siatkówki pochodzenia komórek macierzystych do zastąpienia chorych lub uszkodzonych komórek RPE, ponieważ pozwala ona na określenie optymalnego numeru pasażu komórek wykorzystywanych w terapii.Choć metoda ta może dostarczyć wglądu w czynniki regulujące różnicowanie RRP z IPS, można ją również zastosować do innych układów narządowych, np. do różnicowania innych typów komórek specyficznych dla TC z IPS. Aby rozpocząć tę procedurę, wysiej indukowane pluripotencjalne komórki macierzyste w zagęszczeniu około 350 kolonii komórek na studzienkę na nowo powlekaną płytkę w pożywce M tester one i pozwól koloniom IPSL rozwijać się w hodowli przez cztery do pięciu dni.Następnie co trzy dni wymieniaj pożywkę M tesser one na 4 mL pożywki różnicującej oraz wymieniaj połowę pożywki na świeżą pożywkę różnicującą. Pozostaw pigmentowane ogniska do momentu, aż urosną na tyle duże, by można je było ręcznie wyciąć z hodowli, co trwa od 40 do 50 dni. Następnie za pomocą końcówki do pipety 200 µL wytnij i podnieś pigmentowane kolonie.Zebrane i połączone wyizolowane kolonie przenieś do stożkowej probówki o pojemności 15 ml. Do połączonych komórek RPE dodaj 5 ml pożywki DMMF 12 i wiruj przy 300 GS przez 5 minut. Następnie usuń pożywkę, resuspenduj osad komórkowy w 5 ml pożywki i powtórz wirowanie.Usunąć medium z osadu komórkowego. Następnie przygotować zawiesinę pojedynczych komórek, inkubując połączone I-P-S-R-P-E z 0,25% TRIPSIN EDTA przez 5 do 10 minut w 37 °C, aż skupiska komórek rozpadną się na pojedyncze komórki. Przepłukać komórki I-P-S-R-P-E medium I-P-S-R-P-E, a następnie wysiać zebrane komórki na świeżą płytkę pokrytą Matrigelem w 4 mL medium hodowlanego I-P-S-R-P-E; hodować komórki przez trzy tygodnie przed pasażowaniem i wymieniać medium na świeże medium I-P-S-R-P-E co trzy dni na potrzeby eksperymentu.Wysiej komórki I-P-S-R-P-E w zagęszczeniu 100, 000 cells per square centimeter, a następnie zbierz komórki 17 dni po wysianiu w celu uzyskania niezróżnicowanych komórek IPS. Hoduj komórki do momentu, aż niezróżnicowane kolonie staną się gęste w centrum. Po zaobserwowaniu tego stanu przemyj kolonie pożywką D-M-E-M-F 12, a następnie zdysocjuj komórki IPS do pojedynczych komórek przy użyciu Accutane.Zebrać komórki do konicznej probówki o pojemności 15 ml i wirować z prędkością 300 G przez pięć minut. Odessać nadsącz i resuspendować osad komórkowy w dwóch mililitrach pożywki D-M-E-M-F 12. Aby zebrać płodowe RPE, najpierw przepłukać hodowle komórek płodowego RPE pożywką D-M-E-M-F 12. Następnie dysocjować hodowle do pojedynczych komórek, używając 0,25% TRIPSIN EDTA przez okres od pięciu do 10 minut w temperaturze 37 °C.Zebrać płodowe komórki RPE do 15 mililitrowej probówki stożkowej i wirować z prędkością 300 GS przez pięć minut. Następnie odessać nadsącz i resuspender osad komórkowy w 2 mililitrach pożywki D-M-E-M-F 12.Zebierz komórki I-P-S-R-P-E w 17. dniu. Po trzecim i piątym pasażu przepłucz komórki I-P-S-R-P-E dwukrotnie w PBS i przygotuj zawiesinę pojedynczych komórek poprzez inkubację z 1 ml 0,25% trypsyny przez 5 do 10 minut w temperaturze 37 °C. Następnie zneutralizuj trypsynę za pomocą 2 ml schłodzonego do temperatury lodu medium I-P-S-R-P-E i zbierz komórki do 15 ml probówki stożkowej.Wiruj probówkę przez pięć minut przy 300 G, a następnie odessij supernatant. Resuspender osad komórkowy w trzech mililitrach buforu barwiącego z zestawu do kulek mikro Magnetycznych; wiruj zawiesinę komórkową I-P-S-R-P-E w buforze barwiącym przy 300 G przez pięć minut. Następnie odessij supernatant i resuspender.Resuspender osad komórkowy do stężenia 2 × 10⁶ komórek na 100 µL buforu barwiącego z zestawu do mikrokulek. Dodać 10 µL przeciwciała anty-TRA1-60 PE na każde 2 × 10⁶ komórek. Dokładnie wymieszać, a następnie inkubować w temperaturze 4 °C przez 10 minut.Przemyć komórki w 1 mL buforu barwiącego na każde 2 × 10⁶ komórek. Następnie odwiruj zawiesinę komórkową przez 10 minut przy 300 ×g. Potem odessaj nadsącz i resuspender osad komórkowy w 80 µL buforu barwiącego na każde 2 × 10⁶ komórek.Następnie należy dodać 20 µL mikrokulek znakowanych anty-PE na 2×10⁶ komórek. Dobrze wymieszać i inkubować przez 15 minut w temperaturze 4 °C. Dodać 1 mL buforu barwiącego na 2×10⁶ komórek, wirować przez 10 minut przy 300 ×g, a następnie odessać nadsącz.Następnie ponownie zawiesić pellet komórkowy w 500 µL buforu barwiącego i wyselekcjonować komórki TRA-1-60-ujemne za pomocą magnetycznego separatora komórek, zgodnie z opisem w towarzyszącym protokole tekstowym. Następnie poddać komórki lizie, przepuszczając każdą próbkę przez komercyjnie dostępną kolumnę homogenizującą do mikrocentryfugi (mini spin column), przeznaczoną do mini-preparatyki kwasów nukleowych. Następnie wyekstrahować całkowity RNA z komórek iPS, iPS-RPE oraz płodowego RPE przy użyciu komercyjnie dostępnego zestawu do ekstrakcji RNA, zaprojektowanego w celu zachowania małych cząsteczek RNA.Do oznaczenia całkowitego stężenia RNA należy użyć spektrofotometru NanoDrop, a następnie utworzyć plik Excel z listą mikroRNA, w których stwierdzono co najmniej dwukrotną różnicę w poziomach ekspresji pomiędzy grupami próbek. Następnie należy zalogować się do internetowego programu do analizy szlaków RNA i przesłać plik Excel. W polu formatu pliku należy wybrać „flexible format”, a z listy rozwijanej w polu identyfikatora wybrać „Agilent”.Wpisz dane pod nagłówkiem danych surowych (raw data). Przypisz ID do kolumny probe ID oraz observation one i log ratio do kolumny log ratio. Wybierz opcję ignore dla wszystkich pozostałych kolumn.Wybierz parametry analizy w następujący sposób: w sekcji confidence zaznacz jedynie „experimentally observed”, uwzględnij zależności bezpośrednie i pośrednie (direct and indirect relationships) oraz włącz substancje endogenne (endogenous chemicals). Jako zestaw referencyjny wybierz bazę wiedzy Ingenuity. Następnie wybierz bazę danych cząsteczek referencyjnych.Obejmuje to dane ze wszystkich gatunków, wszystkich linii komórkowych i tkanek oraz wszystkich mutacji. Po wybraniu wszystkich parametrów uruchom analizę sieciową, wybierając opcję sieci (networks). Następnie wybierz nakładające się sieci (overlapping networks), a potem kliknij interesującą Cię sieć, aby zobaczyć wyniki.Komórki IPS, które zróżnicowano do komórek I-P-S-R-P-E, wykazywały klasyczny fenotyp RPE w postaci sześciobokowej morfologii pigmentowanych komórek, co jest podobne do płodowych komórek RPE. Porównanie profilu ekspresji microRNA niedróżnicowanych komórek IPS z komórkami I-P-S-R-P-E wykazało nadekspresję 47 microRNA i niedoekspresję 36 microRNA, podczas gdy w płodowych komórkach RPE stwierdzono nadekspresję 61 microRNA w porównaniu z komórkami I-P-S-R-P-E oraz niedoekspresję 49 microRNA. Analiza szlaków z użyciem oprogramowania ingenuity IPA wskazała, że geny docelowe różnicowo eksponowanych microRNA były zaangażowane w procesy komórkowe, w tym rozwój, wzrost i cykl komórkowy. Analiza ta wykazała również, że microRNA eksponowane in vivo w tkankach oka były wzbogacone w I-P-S-R-P-E i płodowym RPE w porównaniu z komórkami IPS. Podczas przeprowadzania tej procedury ważne jest, aby zapobiegać kontaminacji i degradacji próbek RNA po zakończeniu procesu.W celu potwierdzenia poziomu ekspresji mikroRNA w każdym typie komórek po ich wdrożeniu można zastosować inne metody, takie jak RT-PCR. Technika ta utorowała drogę badaczom w dziedzinie badań nad wzrokiem do zgłębienia roli mikroRNA w różnicowaniu i progresji cyklu komórkowego w rrp. Po obejrzeniu tego filmu powinni Państwo posiadać gruntowną wiedzę na temat tego, jak pozyskiwać RPE z iPS oraz jak porównywać profil ekspresji mikroRNA w iPS-RPE z komórkami iPS oraz płodowym RPE.

microrna-expression-profiles-human-ips-cells-retinal-pigment

Research

JoVE Journal

Biology

Biologia

Profile ekspresji mikroRNA komórek iPS człowieka, nabłonka barwnikowego siatkówki pochodzącego z iPS i płodowego nabłonka barwnikowego siatkówki

Przedstawiamy powtarzalną metodę hodowli konfluentnych monowarstw ludzkich płodowych komórek nabłonka pigmentowego siatkówki (hfRPE), które wykazują morfologię, fizjologię, polarność oraz wzorce ekspresji białek i genów charakterystyczne dla natywnej tkanki dorosłego organizmu. Praca ta została rozszerzona o model zwierzęcy kilku chorób oczu.

Modele eksperymentalne do badania fizjologii i patofizjologii nabłonka pigmentowego siatkówki

Opisano metodę izolacji pojedynczych komórek siatkówki oraz następującej po niej amplifikacji ich cDNA. Transkryptomika pojedynczych komórek pozwala określić stopień heterogeniczności komórkowej występującej w tkance oraz odkryć nowe geny markerowe dla rzadkich populacji komórek. Dołączony protokół można dostosować do wielu różnych typów komórek.

Profilowanie pojedynczych komórek rozwijających się i dojrzałych neuronów siatkówki

Komórki nabłonka barwnikowego siatkówki (RPE) pochodzące z komórek macierzystych mogą być wykorzystywane do wielu zastosowań, w tym do terapii komórkowych w celu zwyrodnienia siatkówki, modelowania chorób i badań nad lekami. Poniżej przedstawiamy prosty protokół umożliwiający powtarzalne pozyskiwanie RPE z komórek macierzystych.

Efektywne pozyskiwanie komórek nabłonka barwnikowego siatkówki z komórek macierzystych

Tutaj prezentujemy akceptowany przez społeczność protokół w formacie multimedialnym do podsiatkówkowego wstrzykiwania bolusa komórek RPE szczurom i myszom. Podejście to można wykorzystać do określenia potencjałów ratunkowych, profili bezpieczeństwa i zdolności przeżycia przeszczepionych komórek RPE po implantacji w zwierzęcych modelach zwyrodnienia siatkówki.

Wykonywanie iniekcji podsiatkówkowych u gryzoni w celu dostarczenia komórek nabłonka barwnikowego siatkówki w zawiesinie

Celem tego raportu jest opisanie protokołów pozyskiwania nabłonka barwnikowego siatkówki (RPE) z indukowanych pluripotencjalnych komórek macierzystych (iPS) przy użyciu różnych rozmiarów ciał embrionalnych.

Otrzymywanie nabłonka barwnikowego siatkówki (RPE) z indukowanych pluripotencjalnych komórek macierzystych (iPS) za pomocą różnych rozmiarów ciał zarodkowych

Ten protokół opisuje, jak wytwarzać komórki nabłonka barwnikowego siatkówki (RPE) z pluripotencjalnych komórek macierzystych. Metoda wykorzystuje kombinację czynników wzrostu i małych cząsteczek do skierowania różnicowania komórek macierzystych w niedojrzałe RPE w ciągu czternastu dni i dojrzałe, funkcjonalne RPE po trzech miesiącach.

Szybkie, ukierunkowane różnicowanie komórek nabłonka barwnikowego siatkówki z ludzkich embrionalnych lub indukowanych pluripotencjalnych komórek macierzystych

Produkcja wyspecjalizowanych komórek siatkówki z pluripotencjalnych komórek macierzystych jest punktem zwrotnym w rozwoju terapii chorób siatkówki opartej na komórkach macierzystych. W niniejszej pracy opisano prostą metodę wydajnego generowania organoidów siatkówki i nabłonka barwnikowego siatkówki do badań podstawowych, translacyjnych i klinicznych.

Zdefiniowano warunki hodowli wolnej od ksenotypów i karmówek w celu wytworzenia modeli ludzkich komórek siatkówki pochodzących z iPSC

Ten protokół, który pierwotnie został zgłoszony przez Fernandez-Godino et al. w 2016 roku1, opisuje metodę efektywnego izolowania i hodowli mysich komórek RPE, które tworzą funkcjonalną i spolaryzowaną monowarstwę RPE w ciągu jednego tygodnia na płytkach Transwell. Zabieg trwa około 3 godzin.

Skuteczna dyssekcja i hodowla pierwotnych komórek nabłonka barwnikowego siatkówki myszy

Tutaj opisujemy zoptymalizowany system indukcji organoidów siatkówki, który jest odpowiedni dla różnych linii ludzkich pluripotencjalnych komórek macierzystych do generowania tkanek siatkówki o wysokiej powtarzalności i wydajności.

System indukcji organoidów siatkówki do wyprowadzania tkanek siatkówki 3D z ludzkich pluripotencjalnych komórek macierzystych

Ten protokół opisuje efektywną metodę różnicowania hiPSC w klastry pola gałkowego i generowania organoidów neuro-siatkówkowych przy użyciu uproszczonych warunków hodowli obejmujących zarówno systemy hodowli adherentnych, jak i zawiesinowych. Inne typy komórek oka, takie jak RPE i nabłonek rogówki, można również wyizolować z dojrzałych pól ocznych w hodowlach siatkówki.

Wytwarzanie organoidów siatkówki ze zdrowych i specyficznych dla choroby siatkówki pluripotencjalnych komórek macierzystych indukowanych przez człowieka

Poznaj profilowanie ekspresji mikroRNA w ludzkich komórkach iPS i nabłonku barwnikowym siatkówki. Ta metoda pozwala porównać komórki iPS-RPE z płodowym RPE, ujawniając różnice w regulacji genów.

Profile ekspresji mikroRNA ludzkich komórek iPS, nabłonka barwnikowego siatkówki pochodzącego z iPS oraz nabłonka barwnikowego siatkówki płodu (Wideo) | JoVE Journal

Profile ekspresji mikroRNA ludzkich komórek iPS, nabłonka barwnikowego siatkówki pochodzącego z iPS oraz nabłonka barwnikowego siatkówki płodu

Przeglądaj więcej filmów