Name: Zastosowanie Shigella flexneri do badania interakcji autofagia-cytoszkielet (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-09-09T18:00:00.000+00:00
Duration: 12 min 52 s
Description: Poznaj metody badania interakcji autofagia-cytoszkielet podczas infekcji Shigella flexneri w komórkach HeLa i larwach zebrafy. Protokoły obejmują mikroskopię fluorescencyjną i in vivo.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

Praca w laboratorium SM jest wspierana przez Wellcome Trust Research Career Development Fellowship [WT097411MA].

<ol><li>Ashida, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Shigella+are+versatile+mucosal+pathogens+that+circumvent+the+host+innate+immune+system%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Opin+Immunol%22%5BJournal%5D)">Shigella are versatile mucosal pathogens that circumvent the host innate immune system.</a> Curr Opin Immunol. 23, 448-455 (2011).</li>
<li>Phalipon, A., Sansonetti, P. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Shigella%27s+ways+of+manipulating+the+host+intestinal+innate+and+adaptive+immune+system%3A+a+tool+box+for+survival%5BTitle%5D)+AND+%22Immunol+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Shigella's ways of manipulating the host intestinal innate and adaptive immune system: a tool box for survival.</a> Immunol Cell Biol. 85, 119-129 (2007).</li>
<li>Welch, M. D., Way, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Arp2%2F3-mediated+actin-based+motility%3A+A+tail+of+pathogen+abuse%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Host+Microbe%22%5BJournal%5D)">Arp2/3-mediated actin-based motility: A tail of pathogen abuse.</a> Cell Host Microbe. 14, 242-255 (2013).</li>
<li>Haglund, C. M., Welch, M. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pathogens+and+polymers%3A+microbe-host+interactions+illuminate+the+cytoskeleton%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Pathogens and polymers: microbe-host interactions illuminate the cytoskeleton.</a> J Cell Biol. 195, 7-17 (2011).</li>
<li>Mostowy, S., Cossart, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Septins%3A+the+fourth+component+of+the+cytoskeleton%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Mol+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Septins: the fourth component of the cytoskeleton.</a> Nat Rev Mol Cell Biol. 13, 183-194 (2012).</li>
<li>Saarikangas, J., Barral, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+emerging+functions+of+septins+in+metazoans%5BTitle%5D)+AND+%22EMBO+Rep%22%5BJournal%5D)">The emerging functions of septins in metazoans.</a> EMBO Rep. 12, 1118-1126 (2011).</li>
<li>Mostowy, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Entrapment+of+intracytosolic+bacteria+by+septin+cage-like+structures%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Host+Microbe%22%5BJournal%5D)">Entrapment of intracytosolic bacteria by septin cage-like structures.</a> Cell Host Microbe. 8, 433-444 (2010).</li>
<li>Mostowy, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((p62+and+NDP52+proteins+target+intracytosolic+Shigella+and+Listeria+to+different+autophagy+pathways%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biol+Chem%22%5BJournal%5D)">p62 and NDP52 proteins target intracytosolic Shigella and Listeria to different autophagy pathways.</a> J Biol Chem. 286, 26987-26995 (2011).</li>
<li>Mostowy, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Septins+regulate+bacterial+entry+into+host+cells%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Septins regulate bacterial entry into host cells.</a> PLoS One. 4 (15), (2009).</li>
<li>Mostowy, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Septin+11+restricts+InlB-mediated+invasion+by+Listeria%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biol+Chem%22%5BJournal%5D)">Septin 11 restricts InlB-mediated invasion by Listeria.</a> J Biol Chem. 284, 11613-11621 (2009).</li>
<li>Phan, Q. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Role+of+endothelial+cell+Septin+7+in+the+endocytosis+of+Candida+albicans%5BTitle%5D)+AND+%22mBio%22%5BJournal%5D)">Role of endothelial cell Septin 7 in the endocytosis of Candida albicans.</a> mBio. 4 (e00542-13), (2013).</li>
<li>Mostowy, S., Cossart, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Septins+as+key+regulators+of+actin+based+processes+in+bacterial+infection%5BTitle%5D)+AND+%22Biol+Chem%22%5BJournal%5D)">Septins as key regulators of actin based processes in bacterial infection.</a> Biol Chem. 392, 831-835 (2011).</li>
<li>Levine, B., Mizushima, N., Virgin, H. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Autophagy+in+immunity+and+inflammation%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Autophagy in immunity and inflammation.</a> Nature. 469, 323-335 (2011).</li>
<li>Randow, F., MacMicking, J. D., James, L. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cellular+self-defense%3A+how+cell-autonomous+immunity+protects+against+pathogens%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Cellular self-defense: how cell-autonomous immunity protects against pathogens.</a> Science. 340, 701-706 (2013).</li>
<li>Mostowy, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Autophagy+and+bacterial+clearance%3A+a+not+so+clear+picture%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Autophagy and bacterial clearance: a not so clear picture.</a> Cell Microbiol. 2 (12063), (2012).</li>
<li>Mostowy, S., Cossart, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bacterial+autophagy%3A+restriction+or+promotion+of+bacterial+replication%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Bacterial autophagy: restriction or promotion of bacterial replication.</a> Trends Cell Biol. 22, 283-291 (2012).</li>
<li>Kanther, M., Rawls, J. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Host-microbe+interactions+in+the+developing+zebrafish%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Opin+Immunol%22%5BJournal%5D)">Host-microbe interactions in the developing zebrafish.</a> Curr Opin Immunol. 22, 10-19 (2010).</li>
<li>Renshaw, S. A., Trede, N. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+model+450+million+years+in+the+making%3A+zebrafish+and+vertebrate+immunity%5BTitle%5D)+AND+%22Dis+Model+Mech%22%5BJournal%5D)">A model 450 million years in the making: zebrafish and vertebrate immunity.</a> Dis Model Mech. 5, 38-47 (2012).</li>
<li>Mostowy, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+zebrafish+as+a+new+model+for+the+in+vivo+study+of+Shigella+flexneri+interaction+with+phagocytes+and+bacterial+autophagy%5BTitle%5D)+AND+%22Plos+Path%22%5BJournal%5D)">The zebrafish as a new model for the in vivo study of Shigella flexneri interaction with phagocytes and bacterial autophagy.</a> Plos Path. 9, e1003588(2013).</li>
<li>Fischer, A. H., Jacobson, K. A., Rose, J., Zeller, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fixation+and+permeabilization+of+cells+and+tissues%5BTitle%5D)+AND+%22Cold+Spring+Harb+Protoc%22%5BJournal%5D)">Fixation and permeabilization of cells and tissues.</a> Cold Spring Harb Protoc. , (2008).</li>
<li>Klionsky, D. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Guidelines+for+the+use+and+interpretation+of+assays+for+monitoring+autophagy%5BTitle%5D)+AND+%22Autophagy%22%5BJournal%5D)">Guidelines for the use and interpretation of assays for monitoring autophagy.</a> Autophagy. 8, 445-544 (2012).</li>
<li>Mizushima, N., Yoshimori, T., Levine, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Methods+in+mammalian+autophagy+research%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Methods in mammalian autophagy research.</a> Cell. 140, 313-326 (2010).</li>
<li>Westerfield, M. A guide for the laboratory use of zebrafish (Danio rerio). <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aWesterfield%2C+M+%22The+Zebrafish+Book%22">The Zebrafish Book</a>. , 4-5.2, (2000).</li>
<li>Benard, E. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Infection+of+zebrafish+embryos+with+intracellular+bacterial+pathogens%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Infection of zebrafish embryos with intracellular bacterial pathogens.</a> J Vis Exp. 61 (e3781), (2012).</li>
<li>He, C., Bartholomew, C. R., Zhou, W., Klionsky, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Assaying+autophagic+activity+in+transgenic+GFP-Lc3+and+GFP-Gabarap+zebrafish+embryos%5BTitle%5D)+AND+%22Autophagy%22%5BJournal%5D)">Assaying autophagic activity in transgenic GFP-Lc3 and GFP-Gabarap zebrafish embryos.</a> Autophagy. 5 (4), 520-526 (2009).</li>
<li>Mizushima, N., Komatsu, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Autophagy%3A+renovation+of+cells+and+tissues%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Autophagy: renovation of cells and tissues.</a> Cell. 147, 728-741 (2011).</li>
<li>Komatsu, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Homeostatic+levels+of+p62+control+cytoplasmic+inclusion+body+formation+in+autophagy-deficient+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Homeostatic levels of p62 control cytoplasmic inclusion body formation in autophagy-deficient mice.</a> Cell. 131, 1149-1163 (2007).</li>
<li>Nowicki, B., Coyne, K. E., Lublin, D. M., Nowicki, S., Hart, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Short+consensus+repeat-3+domain+of+recombinant+decay-accelerating+factor+is+recognized+by+Escherichia+coli+recombinant+Dr+adhesin+in+a+model+of+a+cell-cell+interaction%5BTitle%5D)+AND+%22J+Exp+Med%22%5BJournal%5D)">Short consensus repeat-3 domain of recombinant decay-accelerating factor is recognized by Escherichia coli recombinant Dr adhesin in a model of a cell-cell interaction.</a> J Exp Med. 178, 2115-2121 (1993).</li>
<li>Hall, C., Flores, M., Storm, T., Crosier, K., Crosier, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+zebrafish+lysozyme+C+promoter+drives+myeloid-specific+expression+in+transgenic+fish%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Developmental+Biology%22%5BJournal%5D)">The zebrafish lysozyme C promoter drives myeloid-specific expression in transgenic fish.</a> BMC Developmental Biology. 7 (42), (2007).</li>
<li>Renshaw, S. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+transgenic+zebrafish+model+of+neutrophilic+inflammation%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">A transgenic zebrafish model of neutrophilic inflammation.</a> Blood. 108, 3976-3978 (2006).</li>
<li>Ellett, F., Pase, L., Hayman, J. W., Andrianopoulos, A., Lieschke, G. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((mpeg1+promoter+transgenes+direct+macrophage-lineage+expression+in+zebrafish%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">mpeg1 promoter transgenes direct macrophage-lineage expression in zebrafish.</a> Blood. 117, 2010-2010 (2011).</li>
<li>Bill, B. R., Petzold, A. M., Clark, K. J., Schimmenti, L. A., Ekker, S. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+primer+for+morpholino+use+in+zebrafish%5BTitle%5D)+AND+%22Zebrafish%22%5BJournal%5D)">A primer for morpholino use in zebrafish.</a> Zebrafish. 6 (9), (2009).</li>
<li>He, C., Klionsky, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Analyzing+autophagy+in+zebrafish%5BTitle%5D)+AND+%22Autophagy%22%5BJournal%5D)">Analyzing autophagy in zebrafish.</a> Autophagy. 6, 642-644 (2010).</li>
<li>Howe, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+zebrafish+reference+genome+sequence+and+its+relationship+to+the+human+genome%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">The zebrafish reference genome sequence and its relationship to the human genome.</a> Nature. 25 (496 (7446)), 498-503 (2013).</li>
<li>Levraud, J. P., Colucci-Guyon, E., Redd, M. J., Lutfalla, G., Herbomel, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vivo+analysis+of+zebrafish+innate+immunity%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">In vivo analysis of zebrafish innate immunity.</a> Methods Mol Biol. 415, 337-363 (2008).</li>
</ol>

Autorzy oświadczają, że nie mają konkurencyjnych interesów finansowych.

Podczas monitorowania autofagii i cytoszkieletu in vitro przy użyciu komórek hodowli tkankowej, protokoły opisane w sekcjach 1 i 2 można zastosować do szerokiej gamy typów komórek hodowli tkankowej. Ponadto, aby śledzić dynamikę autofagii (np. autofagosomów ATG8 / LC3 + ve) i cytoszkieletu (np. ogony aktynowe, klatki septynowe) w czasie rzeczywistym podczas infekcji Shigella za pomocą obrazowania na żywo, komórki hodowli tkankowej mogą być przejściowo transfekowane przy użyciu konstruktów znakowanych GFP, RFP lub CFP, jak opisano wcześniej7,8. Aby zwiększyć odsetek komórek zakażonych Shigella (tj. ogólnie pożądane do analizy w czasie rzeczywistym, biorąc pod uwagę, że Shigella może zaatakować 5-30% komórek HeLa przy 100:1 MOI), bezpośrednio dodaj 400 μl Shigella (OD600 = 0,3-0,6) do komórek w 2 ml MEM (surowica) i odczekaj co najmniej 1,5 godziny po zakażeniu, aby uzyskać wystarczające wejście bakterii, ucieczka z fagosomu, replikacja, rozpoznawanie autofagii i klatka septynowa. Alternatywnie można użyć szczepu Shigella M90T AfaI, który wyraża adhezynę AfaE i ma znacznie wyższe zdolności inwazji w komórkach nabłonka w porównaniu ze szczepem M90T28. Warto zauważyć, że szczep M90T AfaI nie został jeszcze przetestowany in vivo na danio pręgowanym. Płytki z koloniami Shigella można przechowywać w temperaturze 4 °C przez 2-3 dni i wykorzystać do kilku eksperymentów. Jednak z biegiem czasu kolonie Shigella , które utraciły plazmid wirulencji, mogą również wchłonąć czerwień Kongo i wydaje się, że zachowały swój plazmid wirulencji. Z tego powodu zalecamy stosowanie świeżych wywarów bakteryjnych, jeśli to możliwe.
Podczas monitorowania biologii komórkowej zakażenia in vivo, w protokołach opisanych w sekcjach 3 i 4 wykorzystuje się danio pręgowanego z linii AB typu dzikiego. Do monitorowania interakcji Shigella-leukocyty można wykorzystać transgeniczne linie danio pręgowanego, np. mpx:GFP lub lyz:D sRed do wizualizacji neutrofili19,29,30 lub mpeg1:mcherry do wizualizacji makrofagów19,31. Do wizualizacji autofagii in vivo można użyć transgenicznej linii19,24 zebry pręgowanego GFP-Lc3, jak opisano w sekcji 3.8.
Aby zakłócić autofagię in vivo, skuteczna dawka oligonukleotydu morfolino musi zostać oceniona doświadczalnie na podstawie jej skuteczności w hamowaniu splicingu transkryptu lub translacji białek. Wskazane jest przeprowadzenie eksperymentu miareczkowania i potwierdzenie zubożenia za pomocą RT-PCR (dla oligonukleotydu morfolinowego splicingowego) lub SDS-PAGE (dla translacyjnego oligonukleotydu morfolino-oligonukleotydowego)32. Izolację RNA z zarodków lub larw danio pręgowanego można przeprowadzić za pomocą ekstrakcji tiocyjanianianem guanidyny, fenolem i chloroformem. Aby wyekstrahować białko z larw danio pręgowanego (8 do 15 larw na probówkę), należy przeprowadzić mechaniczną homogenizację za pomocą tłuczka w 200 μl buforu do lizy (1 M Tris, 5 M NaCl, 0,5 M EDTA, 0,01% oktylofenolu, kondensatu tlenku etylenu i inhibitor proteazy). Odwirować probówki o stężeniu 19 000 x g w temperaturze 4 ° C przez 15 minut i przenieść supernatant do nowej probówki. Dodać bufor Laemmli i podgrzewać próbkę w temperaturze 95 ° C przez 15 minut. Lizaty można przechowywać w temperaturze -80 ° C do czasu ich potrzebowania i można je ocenić za pomocą Western blot, jak opisano w sekcji 2.3.
Danio pręgowany jest doskonałym modelem do stosowania leków in vivo . Analiza z użyciem oligonukleotydów morfolino może być uzupełniona o uznane leki do manipulowania autofagią (np. rapamycynę i bafilomycynę). Niezakażone i/lub zakażone larwy można leczyć rapamycyną (1,5 μM) lub bafilomycyną (80 nM) rozcieńczonymi w E2, a strumień autofagiczny można ocenić za pomocą Western blot, jak opisano w 25,33. Wpływ manipulacji autofagią na wynik zakażenia i przeżywalność zakażonych larw można ocenić w sposób opisany w punkcie 3.5.
Oprócz badania determinantów komórek gospodarza, protokoły in vitro i in vivo mogą być stosowane do oceny determinantów bakteryjnych wymaganych do rozpoznawania autofagii, przy użyciu zmutowanych szczepów bakteryjnych, które są różnie rozpoznawane przez autofagię, np. ShigellaΔicsA (białko Shigella IcsA rekrutuje N-WASP, a następnie Arp2/3 do tworzenia ogona aktynowego i klatki septyny; w przypadku jego braku nie może być ogonów aktynowych, brak klatek septynowych) i ShigellaΔicsB (Shigella unika odpowiedzi autofagicznej poprzez bakteryjne białko efektorowe IcsB, co zapobiega rekrutacji maszynerii autofagicznej do IcsA; W przypadku jego braku może być więcej klatek septynowych, więcej autofagii)7,8.
Shigella nie jest naturalnym patogenem danio pręgowanego i rośnie optymalnie w temperaturze 37 °C. Prace wykazały jednak, że czynniki wirulencji niezbędne do inwazji Shigella , ucieczki z wakuoli fagocytarnej i replikacji w cytozolu mogą ulegać ekspresji i są funkcjonalne w larwach danio pręgowanego w temperaturze 28 °C19. 28 °C jest najczęściej stosowaną temperaturą w hodowli danio pręgowanego i standardową temperaturą zapewniającą prawidłowy rozwój danio pręgowanego23. Uderzające jest to, że główne zdarzenia chorobotwórcze, które prowadzą do shigellozy u ludzi (tj. śmierć komórek makrofagów, inwazja i namnażanie w komórkach nabłonka, rozprzestrzenianie się z komórki na komórkę, zapalne zniszczenie nabłonka gospodarza) są wiernie odtworzone w modelu zakażenia Shigella u danio pręgowanego19.
Geny autofagii i cytoszkieletu są wszechobecne i mają szeroki zakres funkcji biologicznych. Badania na myszach wykazały, że nokaut niezbędnych genów autofagii26 lub septyny5 jest śmiertelny dla embrionów i jest prawdopodobne, że niektóre z tych genów będą również niezbędne do rozwoju danio pręgowanego (chociaż problem ten może być zmniejszony przez fakt, że danio pręgowany ma wiele genów paralogicznych33). Jeśli tak, istnieje kilka alternatyw dla rozwiązania tego problemu, w tym (i) stosowanie odczynników farmakologicznych do regulacji autofagii i cytoszkieletu, (ii) morfoliny mogą być miareczkowane, (iii) nokaut genów może być zaprojektowany tylko dla określonych typów komórek i/lub (iv) geny zaangażowane w rozpoznawanie autofagiczne, które nie są niezbędne do rozwoju zwierząt (np. P62) mogą być celem ataku.
Podczas gdy danio pręgowany jest idealnym systemem modelowym do badania autofagii i cytoszkieletu podczas infekcji Shigella , obecnie brakuje narzędzi molekularnych. Naukowcy muszą wygenerować nowe narzędzia i stymulować specyficzną dla komórek ekspresję białek będących przedmiotem zainteresowania. Aby obniżyć ekspresję genów autofagii/cytoszkieletu, potrzebne są nowe sekwencje morfolino, a także można zastosować nowe metody inżynierii genomu (np. TALEN, CRISPR/Cas9). W międzyczasie kilka narzędzi opracowanych wcześniej na potrzeby badań na ludziach lub myszach może równie dobrze działać w przypadku danio pręgowanego.
Wewnątrzkomórkowa bakteria S. flexneri stała się wyjątkowym organizmem modelowym, który zajmuje się kluczowymi kwestiami w biologii, w tym zdolnością bakterii do rozpoznawania przez układ odpornościowy1,2. Komórka gospodarza wykorzystuje septyny w celu ograniczenia ruchliwości S. flexneri i skierowania ich do autofagii, krytycznego składnika autonomicznej odporności komórki7,8. Obserwacje te sugerują nowe ramy molekularne do badania autofagii i jej zdolności do degradacji bakterii cytozolowych. Głównym problemem jest obecnie pełne rozszyfrowanie leżących u ich podstaw zdarzeń molekularnych i komórkowych oraz walidacja tych zdarzeń analizowanych in vitro podczas infekcji bakteryjnej in vivo przy użyciu odpowiednich modeli zwierzęcych. W tym celu danio pręgowany został uznany za cennego nowego żywiciela do analizy infekcji S. flexneri 19. Interakcje między bakteriami a komórkami gospodarza można obrazować w wysokiej rozdzielczości, a model danio pręgowanego powinien okazać się przydatny do zrozumienia biologii komórkowej zakażenia Shigella in vivo. Larwy danio pręgowanego można wykorzystać do zbadania roli autofagii bakteryjnej w obronie gospodarza, a prace wykazały, że zaburzenia autofagii mogą niekorzystnie wpływać na przeżycie gospodarza w odpowiedzi na zakażenie Shigella 19.
Obserwacje uzyskane podczas badań nad Shigella, klatkami septynowymi i autofagią in vitro przy użyciu komórek hodowli tkankowej oraz in vivo przy użyciu larw danio pręgowanego mogą dostarczyć fundamentalnych postępów w zrozumieniu obrony gospodarza. Mogą również zasugerować opracowanie nowych strategii mających na celu zwalczanie chorób zakaźnych.
Kluczowym celem tego raportu jest zrozumienie zdarzeń molekularnych i komórkowych analizowanych in vitro (tj. autofagia, ogony aktynowe, klatki septynowe) podczas infekcji bakteryjnej in vivo w kontekście całego organizmu, z wykorzystaniem larw danio pręgowanego. Jeśli nie jesteś zaznajomiony z biologią danio pręgowanego i obchodzeniem się z nim, możesz zapoznać się ze szczegółowymi protokołami prawidłowej hodowli danio pręgowanego23 oraz analizą in vivo infekcji danio pręgowanego19,35.

Shigella flexneri, Gram-ujemna inwazyjna bakteria enteropatogenna, może uciekać z fagosomów do cytozolu i polimeryzować cytoszkielet aktynowy gospodarza, aby uniknąć cytozolowych odpowiedzi immunologicznych i promować ruch wewnątrz- i międzykomórkowy1,2. Pomimo zrozumienia ruchliwości opartej na aktynie in vitro3,4, mechanizmy ograniczające rozprzestrzenianie się bakterii in vivo nie zostały w pełni zdefiniowane. Ma to kluczowe znaczenie dla pełniejszego zrozumienia odporności wrodzonej i obrony gospodarza.
Septyny, wysoce konserwatywna rodzina białek wśród metazoan, są białkami wiążącymi trifosforan guanozyny (GTP), które łączą się w heterooligomeryczne kompleksy i tworzą niepolarne włókna, które łączą się z błonami komórkowymi i cytoszkieletem5,6. Niedawne prace wykazały, że zakażone komórki gospodarza mogą zapobiegać ruchliwości opartej na aktynie Shigella poprzez dzielenie bakterii przeznaczonych do autofagii w "klatkach septynowych", ujawniając pierwszy mechanizm komórkowy, który przeciwdziała ruchliwości opartej na aktynie7,8. Szeroko otwarte pole badań leży obecnie w "biologii septyny i infekcjach". Składanie septyny, indukowane przez różne patogeny (np. Listeria monocytogenes7,9,10, Mycobacterium marinum7,8, Candida albicans11), może okazać się kluczowym problemem w obronie gospodarza5,12.
Autofagia, wysoce konserwatywny proces degradacji wewnątrzkomórkowej, jest postrzegany jako kluczowy składnik odporności autonomicznej komórki, ze względu na jej zdolność do dostarczania bakterii cytozolowych do lizosomu13,14. Jednak rola autofagii bakteryjnej in vivo w ograniczaniu lub promowaniu replikacji bakterii pozostaje słabo poznana15,16. Danio pręgowany (Danio rerio) stał się modelem kręgowców do badania infekcji, ponieważ jest optycznie dostępny w stadiach larwalnych, kiedy wrodzony układ odpornościowy jest już funkcjonalny17,18. Niedawne prace scharakteryzowały podatność larw danio pręgowanego na S. flexneri, paradygmat autofagii bakteryjnej15, i wykorzystały model infekcji Shigella-danio pręgowany do zbadania manipulacji autofagią w terapii przeciwbakteryjnej in vivo19.
Ten raport dostarcza nowych narzędzi i testów do badania interakcji S. flexneri z autofagią i cytoszkieletem. W pierwszym etapie opisano protokoły monitorowania interakcji autofagia-cytoszkielet za pomocą zakażenia Shigella ludzkiej linii komórek nabłonkowych HeLa. Aby ocenić rolę interakcji autofagia-cytoszkielet w procesie zakażenia Shigella in vitro, przedstawiono metody manipulowania składnikami autofagii i cytoszkieletu (przy użyciu siRNA lub odczynników farmakologicznych). Nowe prace wykazały, że stosując zakażenie Shigella larw danio pręgowanego, podobne testy można zastosować do badania biologii komórkowej infekcji in vivo. Szczegółowo opisano protokoły przygotowania i zakażenia larw danio pręgowanego, a w celu oceny odpowiedzi gospodarza na zakażenie Shigella in vivo przedstawiono protokoły określające przeżywalność gospodarza i obciążenie bakteryjne zakażonych larw. Omówiono również metody monitorowania rekrutacji markerów septyny i autofagii do Shigella (przy użyciu stałych lub żywych larw danio pręgowanego) oraz metody badania roli tych procesów in vivo [przy użyciu oligonukleotydów morfolinoligonukleotydów (wstrzykiwanych do zarodków w stadium 1-4 komórek) lub odczynników farmakologicznych (dodawanych bezpośrednio do wody do kąpieli danio pręgowanego)]. Oczekuje się, że ten program prac dostarczy wglądu w mechanizmy wymagane do kontroli infekcji przez cytozolowe odpowiedzi gospodarza.

<table><tbody><tr><td>Bafilomycyna A1</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>B1793&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Blebbistatin</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>B0560</td><td></td></tr><tr><td>Mikrokapilary ze szkła borokrzemianowego&nbsp;</td><td>Harvard Apparatus</td><td>30038</td><td></td></tr><tr><td>Zgrubny manipulator ręczny&nbsp;</td><td>Narishige</td><td>M-152</td><td></td></tr><tr><td>Cytochalazyna D</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C6762</td><td></td></tr><tr><td>4',6-diamidino-2-fenyloindol (DAPI)</td><td>Sondy molekularne</td><td>D1306</td><td></td></tr><tr><td>Drobna pęseta Dumont #5</td><td>Fine Science Tools</td><td>11254-20</td><td></td></tr><tr><td>Forchlorfeneuron&nbsp;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>32974</td><td></td></tr><tr><td>Sondy molekularne</td><td>przeciwko mysim przeciwciałom IgG (H+L) przeciwko kozom</td><td>N/A&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Przeciwciało IgG (H + L) przeciwko kozi mrówkom</td> królikom <td>Sondy molekularne</td><td>Nie dotyczy</td><td></td></tr><tr><td>Odczynnik do transfekcji JetPEI</td><td>Transfekcja Polyplus Transfekcja</td><td>101-01N</td><td></td></tr><tr><td>Latrunkulina B</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>L5288</td><td></td></tr><tr><td>Przeciwciało LC3</td><td>Novus Biologicals</td><td>NB100-2220</td><td></td></tr><tr><td>Niskotopliwa agaroza</td><td>Promega</td><td>V2111</td><td></td></tr><tr><td>MatTek naczynie ze szklanym dnem</td><td>MatTek corporation</td><td>P35G-1.0-14</td><td></td></tr><tr><td>MEM plus L-alanylo-L-glutamina&nbsp;</td><td>GIBCO</td><td>41090028</td><td></td></tr><tr><td>MEM roztwór aminokwasów endogennych</td><td>GIBCO</td><td>11140-035</td><td></td></tr><tr><td>Mikrowtryskiwacz&nbsp;</td>Ściągacz do mikropipet <td>Narishige</td><td>IM-300</td><td></td></tr><tr><td>&nbsp;</td><td>Sutter Instrument Co., Novato,P-87</td><td>&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Olej mineralny</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P35G-1.0-14</td><td></td></tr><tr><td>Monoklonalna antytubulina, przeciwciało acetylowane&nbsp;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T6793</td><td></td></tr><tr><td>Nokodazol</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M1404</td><td></td></tr><tr><td>N-fenylotiomocznik&nbsp;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P7629</td><td></td></tr><tr><td>Paraformaldehyd</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>158127</td><td></td></tr><tr><td>Falloidyna&nbsp;</td><td>Sondy molekularne</td><td>A12379</td><td></td></tr><tr><td>Roztwór czerwieni fenolowej</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P0290</td><td></td></tr><tr><td>Koktajl inhibitorów proteazy</td><td>Przeciwciało Roche</td><td>4693116001</td><td></td></tr><tr><td>p62 / SQSTM1</td><td>Cliniscience</td><td>PM045</td><td></td></tr><tr><td>Rapamycyna</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>R8781</td><td></td></tr><tr><td>Pirogronian sodu</td><td>GIBCO</td><td>11360039</td><td></td></tr><tr><td>Odczynnik do transfekcji</td><td>Life Technologies</td><td>12252-011</td><td></td></tr><tr><td>Twarde podłoże montażowe Vectashield zawierające DAPI&nbsp;</td><td>Laboratoria Wektorowe</td><td>H-1500&nbsp;</td><td></td></tr></tbody></table>

zastosowanie shigella flexneri do badania interakcji autofagia-cytoszkielet

Use of Shigella flexneri to Study Autophagy-Cytoskeleton Interactions

Shigella flexneri to wewnątrzkomórkowy patogen, który może uciec z fagosomów, aby dotrzeć do cytozolu i polimeryzować cytoszkielet aktynowy gospodarza, aby promować jego ruchliwość i rozprzestrzenianie się. Nowe prace wykazały, że białka biorące udział w ruchliwości opartej na aktynie są również powiązane z autofagią, procesem degradacji wewnątrzkomórkowej kluczowym dla autonomicznej odporności komórek. Co uderzające, komórki gospodarza mogą zapobiegać ruchliwości S. flexneri opartej na aktynie poprzez dzielenie bakterii w "klatki septynowe" i kierowanie ich do autofagii. Obserwacje te wskazują, że pełniejsze zrozumienie septyn, rodziny nitkowatych białek wiążących GTP, dostarczy nowych informacji na temat procesu autofagii. W niniejszym raporcie opisano protokoły monitorowania interakcji autofagia-cytoszkielet wywołanych przez S. flexneri in vitro przy użyciu komórek hodowli tkankowej oraz in vivo przy użyciu larw danio pręgowanego. Protokoły te umożliwiają badanie mechanizmów wewnątrzkomórkowych, które kontrolują rozprzestrzenianie się bakterii na poziomie molekularnym, komórkowym i całego organizmu.

Po zakażeniu komórek hodowli tkankowych in vitro, S. flexneri mogą uciec z fagosomu i wniknąć do cytozolu. W cytozolu komórki gospodarza mogą hamować motywność Shigella opartą na aktynie poprzez zamykanie bakterii w klatkach z septyn (Ryc. 1A). Bakterie uwięzione w klatkach z septyn mogą być również znakowane markerami autofagii p62 (Ryc. 1B) i LC3 (Ryc. 1C). Obserwacje te wskazują na nowy mechanizm obrony gospodarza, który ogranicza rozprzestrzenianie się inwazyjnych patogenów, a także ujawniają nowe powiązania między autofagią a cytoszkieletem. Co uderzające, deplecja markerów autofagii znacząco redukuje zamykanie bakterii w klatkach z septyn (Ryc. 2A), a badania wykazały również, że brak klatek z septyn znacząco ogranicza rekrutację markerów autofagii8. Zatem, przynajmniej w przypadku Shigella, montaż klatek z septyn i formowanie autofagosom można uznać za procesy współzależne. Inne wymagania komórkowe dla kompartymentalizacji Shigella przez klatki z septyn obejmują polimeryzację aktyny oraz aktywność aktynomiozyny (Ryc. 2B).
Nie istnieje naturalny mysi model shigellozy, a badanie patogenezy Shigella, biologii septyn oraz bakteryjnej autofagii in vivo może przynieść korzyści dzięki nowemu modelowi zwierzęcemu infekcji – larwom danio pręgowanego19. Możliwe jest zakażenie larw danio pręgowanego poprzez wstrzykiwanie bakterii w różne miejsca anatomiczne, takie jak wstrzyknięcia dożylne w ogonie w eksperymentach dotyczących przeżywalności oraz wstrzyknięcia do mięśni ogona w celu przeprowadzenia mikroskopii in vivo (Rycina 3A). W zależności od dawki, S. flexneri wstrzyknięte larwom danio pręgowanego mogą zostać usunięte z organizmu w ciągu 48 h po zakażeniu lub mogą doprowadzić do postępującej i ostatecznie śmiertelnej infekcji (Ryciny 3B-3D). Czynniki wirulencji Shigella są eksprymowane w temperaturze 28 °C, która jest optymalną temperaturą wzrostu danio pręgowanego, a infekcja danio pręgowanego przez Shigella jest ściśle zależna od jego systemu sekrecji typu III (T3SS)19, będącego kluczowym determinantem wirulencji w chorobie u ludzi. Podsumowując, spostrzeżenia te wskazują, że larva danio pręgowanego stanowi cenny nowy model gospodarza do analizy in vivo infekcji Shigella.
Przezroczystość optyczna larw danio pręgowanego umożliwia wizualizację tworzenia klatek septynowych in vivo (Rysunek 4A), co jest osiągnięciem, którego nigdy wcześniej nie udało się zrealizować z wykorzystaniem modeli gospodarzy ssaków. Aby uzupełnić dowody wskazujące na to, że klatki septyn więżą bakterie skierowane do autofagii in vivomożna zainfekować transgeniczne larwy danio pręgowanego wykazujące ekspresję GFP-Lc3 i obserwować rekrutację markerów autofagii do Shigella (Rysunek 4B). Do analizy ultrastrukturalnej Shigella autofagosomy in vivomikroskopia elektronowa może zostać wykorzystana do wyraźnego wykazania sekwestracji bakterii w cytozolu w obrębie wakuol o podwójnej błonie19Autofagia jest uważana za kluczowy element odporności autonomicznej komórki oraz za istotny mechanizm obronny przeciwko bakteriom wewnątrzcytozolowym.14-16W celu scharakteryzowania funkcji autofagii in vivo, można wykorzystać larwy zebrafish traktowane morfolino p62. W przeciwieństwie do podstawowego mechanizmu autofagii [np.., 36 białek związanych z autofagią (ATG)26], p62 nie jest niezbędne dla rozwoju kręgowców27 i w ten sposób larwy danio pręgowanego mogą rozwijać się prawidłowo przed zakażeniem. Co uderzające, larwy z wyczerpaniem p62, którym podano S. flexneri prowadzą do znacznie zwiększonej śmiertelności oraz zwiększonego obciążenia bakteryjnego19Zgodnie z in vitro praca wykazująca, że montaż klatki septyn jest współzależny od formowania się autofagosomów7,8, rekrutacja septyn do Shigella jest wyraźnie zmniejszone w larwach z wyczerpaniem p62 (Rysunek 4C). Dane te wykazują, że przeżywalność danio pręgowanych zależy od autofagii mediowanej przez p62 w celu kontrolowania wewnątrzkomórkowej infekcji bakteryjnej.
<img alt="Mikroskopia fluorescencyjna komponentów komórkowych: DAPI, F-aktyna, SEPT9, p62, GFP-LC3; analiza nałożenia obrazów." fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/51601/51601fig1highres.jpg" width="500" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="Rycina 1"> 
Rycina 1. Klatka septyn in vitro. (A) Komórki HeLa zainfekowano S. flexneri przez 4 h 40 min, utrwalono, oznakowano przeciwciałami przeciwko SEPT9 oraz faloidyną i obrazowano za pomocą mikroskopii konfokalnej. Pasek skali, 1 µm. (B) Komórki HeLa zainfekowano S. flexneri przez 4 h 40 min, utrwalono, oznakowano przeciwciałami przeciwko p62 i SEPT2 i obrazowano za pomocą mikroskopii fluorescencyjnej. Pasek skali, 1 µm. (C) Komórki HeLa przetransfekowano GFP-ATG8/LC3, zainfekowano S. flexneri przez 4 h 40 min, utrwalono, oznakowano przeciwciałami przeciwko SEPT2 i obrazowano za pomocą mikroskopii fluorescencyjnej. Pasek skali, 1 µm. Ryciny zostały zmodyfikowane na podstawie pracy Mostowy et al7.
<img alt="Ekspresja białek, dane procentowe dotyczące Shigella w wyciszeniu siRNA, wykresy słupkowe, analiza Western blot." fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/51601/51601fig2highres.jpg" width="500" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="Rycina 2"> 
Rycina 2. Wymagania komórkowe dla tworzenia klatek septyn wokół Shigella. (A) Komórki HeLa poddano działaniu kontrolnego (CTRL) siRNA, siRNA przeciwko p62, ATG5, ATG6 lub ATG7. Lizaty całych komórek traktowanych siRNA poddano immunoblottingowi na obecność GAPDH, p62, ATG5, ATG6 lub ATG7, aby wykazać wydajność deplecji siRNA (góra). Komórki traktowane siRNA zainfekowano S. flexneri na 4 h 40 min, utrwalono i znakowano do mikroskopii ilościowej. Wykresy (dół) przedstawiają średni % ± SEM Shigella wewnątrz klatek SEPT2 z n ≥3 eksperymentów na każdą grupę traktowania. (B) Komórki HeLa zainfekowano S. flexneri, traktowano DMSO, cytochalazyną D (CytD), latrunkuliną B (LatB), nocodazolem (Noco) lub blebbistatyną (Bleb), a po 4 h 40 min utrwalono i znakowano do mikroskopii ilościowej. Wykresy przedstawiają średni % ± SEM Shigella wewnątrz klatek SEPT2 z dwóch niezależnych eksperymentów na każdą grupę traktowania. Ryciny zostały zmodyfikowane na podstawie pracy Mostowy et al7.
<img alt="Eksperyment z infekcją danio pręgowanego; wykresy przedstawiają przeżywalność w czasie; poziomy fluorescencji wskazują na infekcję." fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/51601/51601fig3highres.jpg" width="500" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="Rysunek 3"> 
Rysunek 3. Model infekcji Shigella u danio pręgowanego. (A) Obrazy ilustrujące orientację larwy danio pręgowanego pod stereomikroskopem. (Panel lewy) Larwy danio pręgowanego 72 h po zapłodnieniu zostały ułożone bocznie na płytce do iniekcji, stroną grzbietową skierowaną w stronę igły do iniekcji. (Panel środkowy) Infekcję krwiobiegu przeprowadzono poprzez wstrzyknięcie bakterii (czerwony roztwór) do żyły ogonowej, za otworem urogenitalnym. (Panel prawy) Infekcję mięśnia ogonowego przeprowadzono poprzez wstrzyknięcie bakterii (czerwony roztwór) nad somitem. (B) Krzywe przeżywalności larw 72 h po zapłodnieniu, którym wstrzyknięto różne dawki S. flexneri i inkubowano w 28 °C przez 48 h po infekcji. Skuteczne inokulum sklasyfikowano jako niskie (&lt;103 CFU, otwarte koła), średnie (~4 x 103 CFU, otwarte trójkąty) lub wysokie (~104 CFU, otwarte kwadraty). Średni % ± SEM (poziome paski) z n ≥3 eksperymentów na klasę inokulum. (C) Liczenie żywych bakterii w homogenatach z poszczególnych larw w różnych odstępach czasu po infekcji, mierzone poprzez wysiew na LB. Należy zauważyć, że do analizy liczbowej włączono tylko larwy, które przeżyły infekcję. Przedstawiono również średnią ± SEM (poziome paski). (D) Rozkład GFP-Shigella określony za pomocą obrazowania na żywo przy użyciu fluorescencyjnego stereomikroskopu w różnych odstępach czasu po infekcji z użyciem niskiej, średniej lub wysokiej dawki inokulum (iniekcje dożylne ogonowe). Nałożenie obrazu transmisyjnego (szary) i fluorescencji GFP (zielony). (B)-(D) Rysunki te zostały zmodyfikowane na podstawie pracy Mostowy et al19.
<img alt="Fluorescence microscopy, GFP-tagged Shigella, SEPT7, protein colocalization, overlay analysis." fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/51601/51601fig4highres.jpg" width="500" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="Figure 4"> 
Rysunek 4. Biologia komórki Shigella zakażenie in vivo. (A) Larwy danio pręgowanego zostały zainfekowane w mięśniu ogonowym GFP-Shigella (niska dawka) przez 24 h, utrwalone, znakowane przeciwciałami przeciwko SEPT7 (czerwony) oraz GFP (zielony) i obrazowane za pomocą mikroskopii konfokalnej. Pasek skali, 5 µm. (B) Larwy danio pręgowanego GFP-Lc3 zainfekowano mCherry-Shigella (dawka średnia) przez 4 h, utrwalone, znakowane przeciwciałami przeciwko mCherry (czerwony) i GFP (zielony) oraz obrazowane za pomocą mikroskopii konfokalnej. Pasek skali, 1.5 µm. (C) Larwy danio pręgowanego traktowane morfolinami kontrolnymi (CTRL; obraz po lewej) lub p62 (obraz po prawej) zostały zainfekowane GFP-Shigella przez 4 h (dawka średnia), utrwalone, znakowane przeciwciałami przeciwko SEPT7 (czerwony) oraz GFP (zielony) i obrazowane za pomocą mikroskopii konfokalnej. Strzałki wskazują niektóre przykłady Shigella uwięzione w klatkach septynowych (CTRL) lub nie (deplecja p62) 4 godziny po infekcji. Pasek skali, 5 µmRysunki te zostały zmodyfikowane na podstawie opracowania Mostowy i wsp.19.

Aby przeciwdziałać rozprzestrzenianiu się patogenów, komórki gospodarza reorganizują swój cytoszkielet, aby podzielić bakterie na grupy i wywołać autofagię. Za pomocą zakażenia Shigella komórek hodowli tkankowej identyfikowane i charakteryzowane są determinanty gospodarza i patogenu leżące u podstaw tego procesu. Korzystając z modeli zakażenia Shigella danio pręgowanego, bada się rolę odkrytych cząsteczek i mechanizmów in vivo.

Zastosowanie Shigella flexneri do badania interakcji autofagia-cytoszkielet

Shigella flexneri is an intracellular pathogen that can escape from phagosomes to reach the cytosol, and polymerize the host actin cytoskeleton to promote ...

Ogólnym celem niniejszej procedury jest zbadanie wewnątrzkomórkowych mechanizmów kontrolujących rozprzestrzenianie się bakterii podczas infekcji in vitro oraz in vivo, z wykorzystaniem kultur komórkowych oraz larw danio przebrzosławionego. Metoda in vitro rozpoczyna się od przygotowania Chlamydia trachomatis, gram-ujemnego i enteroinwazyjnego patogenu bakteryjnego. Następnie przeprowadzana jest infekcja, a do manipulacji mechanizmami autofagii i cytoszkieletu gospodarza podczas infekcji wykorzystuje się siRNA lub odczynniki farmakologiczne. Aby zbadać oddziaływania między autofagią a cytoszkieletem wywołane przez Chlamydia trachomatis in vivo, zarodki danio przebrzosławionego są infekowane w trzecim dniu po zapłodnieniu w obu metodach.Ostatnim krokiem jest znakowanie tkanek markerami autofagii i cytoszkieletu. Ostatecznie wyniki dostarczą informacji na temat mechanizmów niezbędnych do kontrolowania infekcji poprzez gospodarskie odpowiedzi cytozolowe. Przewagą stosowania żelu do badania autofagii bakteryjnej nad innymi bakteriami, takimi jak listeria, jest to, że autofagia celowana w żel może zostać również uwięziona w klatkach inicjujących.Metoda ta może pomóc w odpowiedzi na kluczowe pytania z zakresu autofagii, takie jak: jaka jest rola cytoszkieletu w autofagii oraz jaka jest rola autofagii w ograniczaniu lub promowaniu namnażania bakterii wewnątrzkomórkowych? Zastosowania tej techniki mogą rozciągać się na inne procesy autofagii, takie jak autofagia wirusów lub mitochondriów, a także mogą mieć znaczenie terapeutyczne w przypadku ludzkich chorób z komponentem septynowym lub autofagijnym. Przedstawiono demonstrację na rybkach danio przeżłaczkowych.Infekcja jest kluczowym etapem, ponieważ kroki obejmujące wstrzykiwanie bakterii daniowcom są trudne do opanowania, a przygotowanie igły i prawidłowe wstrzyknięcie wymagają czasu i wysokiej precyzji. Mikroskopia infekcji daniowców wymaga doświadczenia. W tym protokole należy użyć szczepu dzikiego typu Shigella flexner M9 DT z mrożonego banku glicerynowego; bakterie należy wysiać na płytki z agarem sojowym tryptonowym z czerwienią Kongo i inkubować przez noc w temperaturze 37 °C.Następnego dnia wysiej komórki HeLa na płytki sześciodołkowe w pożywce MEM z dodatkiem 10% płatowej surowicy cielęcej. Kolejnego dnia wybierz pojedynczą kolonię i hoduj ją przez noc w pożywce TCS, potrząsając w temperaturze 37 °C. Przygotuj subkultury, wykonując rozcieńczenie 1:80 w świeżej pożywce TCS.Gdy gęstość optyczna subkultur przy 600 nanometrach wynosi od 0,3 do 0,6, należy zebrać bakterie poprzez wirowanie przy 1000 G przez pięć minut. Następnie osad bakteryjny należy resuspenderować w MEM do tej samej gęstości optycznej.Witajcie, komórki powinny zostać zainfekowane bezpośrednio przy wielokrotności infekcji (MOI) wynoszącej 100:1. Dodaj rozcieńczony w MEM szczep do wysianych komórek HeLa i uzupełnij całkowitą objętość MEM do 2 mL na studzienkę. Następnie, aby zmaksymalizować przyleganie bakterii do komórek gospodarza, odwiruj płytki przy 700 ×g przez 10 minut, a następnie inkubuj płytki przez 30 minut w temperaturze pokojowej, aby bakterie mogły zainfekować komórki po okresie infekcji.Komórki należy delikatnie przemyć dwukrotnie. Aby dodatkowo usunąć bakterie z przestrzeni zewnątrzkomórkowej, należy inkubować komórki w pełnej pożywce z dodatkiem gentamycyny przez jedną do czterech godzin, zależnie od obserwacji empirycznych. Następnie należy utrwalić i znakować zainfekowane komórki.Obrazowanie należy przeprowadzić za pomocą mikroskopii epifluorescencyjnej lub konfokalnej, używając obiektywu 63x lub 100x, aby rozdzielić klatki septyny CHA znakowane DAPI; można je zwizualizować jako struktury przypominające pierścienie o średnicy około 0,6 mikronów, otaczające polimeryzującą aktynę bakterii cytozolowych. Bakterie wewnątrz klatek septynowych można również rozpoznać za pomocą markerów autofagii, takich jak P62, LC3 oraz ATG8. Koncepcyjnie najtrudniejszym aspektem tej procedury jest identyfikacja bakteryjnych autofagosomów i klatek septynowych in vivo oraz in vitro, co wymaga starannego obrazowania i analizy.Ponadto należy upewnić się, że analizowana jest odpowiednia liczba zdarzeń w kilku powtórzeniach biologicznych, aby zapewnić istotność statystyczną po zainfekowaniu komórek HeLa bakteriami Chlamydia. Najpierw należy odczekać co najmniej dwie i pół godziny, aby bakterie mogły przedostać się do cytozolu. Następnie można zastosować lek w celu potraktowania cytoszkieletu.Do każdych dwóch mililitrów pożywki z komórkami, służących jako kontrola negatywna, dodaj od jednego do pięciu mikrolitrów rozcieńczonego roztworu zapasu leku. Jedną partię komórek potraktuj DMSO w MEM, a następnie inkubuj komórki przez 30 minut, aby zmodyfikować przepływ autofagii w komórkach. Użyj 20 nM rapamycyny lub 160 nM bafimycyny.Następnie inkubuj komórki od czterech do 12 godzin po przeprowadzeniu zabiegu. Utrwal i znakuj komórki zgodnie z opisem w protokole tekstowym. Ta technika modeluje interakcje między infekcją żelową a cytoszkieletem autofagii in vivo. Aby rozpocząć subkulturę i zebrać żel zgodnie z wcześniejszym opisem, przemyj bakterie za pomocą 1x PBS i odwiruj je przy 1000 G przez 10 minut.Następnie resuspendować bakterie w 80 µL 0,1% czerwieni fenolowej w PBS. Przygotowaną zawiesinę przechowywać w lodzie. Na 72 godziny przed planowaną iniekcją stężenie powinno wynosić około 2000 bakterii na nanolitr. Zebrać zarodki z tarła danio przebronne, aby usunąć wszelkie zanieczyszczenia pozakomórkowe.Przemyj zarodki w pożywce E2 z dodatkiem 0,003% wybielacza przez 10 minut. Po 10 minutach wymień pożywkę na E2 i przemyj zarodki pięciokrotnie w pożywce E2. Następnie napełnij 10-centymetrowe płytki 50 mililitrami pożywki E2 i umieść w nich do 50 zarodków.Wyhoduj łącznie około 100 embrionów w temperaturze 28 °C, 24 godziny po zapłodnieniu. Potraktuj rozwijające się embriony roztworem 0,003% fenotrzeolu w medium E2, aby zapobiec melanogenezie, która utrudnia badanie mikroskopowe. Rozpocznij od znieczulenia 72-godzinnych larw w kąpieli z tricażainą o stężeniu 200 µg/mL w medium E2.Następnie, używając mikromanipulatora i precyzyjnej pęsety, odłam końcówkę igły do mikroiniekcji i sprawdź miejsce przełamania pod mikroskopem. Teraz przygotuj igłę: najpierw przenieś kroplę hodowli bakteryjnej na szkiełko nakrywkę na stoliku mikroskopu. Po drugie, włącz mikroinjektor oraz butlę z gazem.Po trzecie, zanurz końcówkę igły w kropli. Po czwarte, nabierz płyn do igły, aby ocenić przeżywalność rybek zebrafish podczas infekcji cha. Wykonaj delikatne wstrzyknięcie dożylne, posługując się cienkim pędzlem.Umieść znieczulone larwy bokiem na płytce do iniekcji tak, aby ich strony grzbietowe były skierowane w stronę igły. Następnie należy ustawić końcówkę igły blisko otworu urogenitalnego, celując w żyłę kądrzastą. Po tym przebij skórę i wstrzyknij bolus bakterii o objętości od jednej do pięciu nanolitrów.Prawidłowe wstrzyknięcie do żyły ogonowej potwierdza widoczność czerwieni fenolowej rozprzestrzeniającej się wzdłuż naczynia. Technicznie iniekcja do żyły ogonowej jest najtrudniejszym elementem tej procedury i wymaga praktyki na larwach zebrafish. Mikroskopia konfokalna może również stanowić wyzwanie, ponieważ larwy wymagają odpowiedniego unieruchomienia.Po wstrzyknięciu przenieś każdą zainfekowaną larwę indywidualnie do dołka płytki 24-dołkowej zawierającej jeden mililitr medium E2. Inkubuj płytkę w temperaturze 28 °C i codziennie monitoruj embriony, aby zwizualizować rekrutację septyn oraz markerów autofagii.Wstrzyknij Ella w miejsca zlokalizowane, takie jak mięsień ogonowy. Przygotuj larwy do iniekcji zgodnie z opisem w poprzedniej sekcji. Ustaw danio pręgowanego bokiem i umieść igłę nad mięśniem.Następnie pomiędzy dwa somity wprowadza się igłę i wstrzykuje około 1 nanolitra Ella. Prawidłowe wstrzyknięcie do mięśni ogona objawi się czerwonym zabarwieniem wstrzykniętego somitu. Ze względu na zastosowanie buforu z czerwienią fenolową, przygotowano niskotopiący 0,1% agarozę w medium E2 w temperaturze 37 °C.Do naczynia z szklanym dnem nanieś pojedynczo krople agarro. Przenieś wstrzyknięte larwy wraz z minimalną objętością roztworu do kropel agarro. Ustaw je w pożądanej orientacji i poczekaj, aż agarro stężeje.Następnie pokryj całą płytkę LMA, a potem E dwa z trica. Następnie pobieraj próbki Zacks co dwie minuty przez kilka godzin. W zainfekowanych komórkach hodowli tkankowej shaila ucieka z fagosomu do cytozolu, gdzie cytoszkielet gospodarza może ulec reorganizacji i odseparować bakterie wewnątrz struktur przypominających klatki z septyn.Bakterie uwięzione w klatkach septyn są rozpoznawane przez markery autofagii, takie jak P 62 i lc three. Danio przebrany stanowi cenny nowy model gospodarza do badań in vivo nad zakażeniem CHA. W zależności od dawki zakaźnej, ryby danio przebrany mogą albo zwalczyć niską dawkę w ciągu 48 godzin po zakażeniu, albo, w przypadku dawki wysokiej, ulec zakażeniu.Przezroczystość optyczna zebry fist RV umożliwia wizualizację klatek septyn in vivo; jest to osiągnięcie, którego nie zrealizowano w innych modelach kręgowców, co uzupełnia dowody na to, że klatki septyn więżą bakterie skierowane do autofagii. Transgeniczne rybki danio z GFP lc three zostały zainfekowane, aby zaobserwować rekrutację dodatnich pod względem lc three autofagosomów do wewnątrzkomórkowych chala in vivo w czasie rzeczywistym w celu charakterystyki autofagii. Larwy poddane działaniu morpho P 62 zostały wstrzyknięte chala kontrolną. Larwy z kontrolnym morpho wykazały prawidłowe struktury klatek septyn.Jednak w przypadku larw z wyciszonym genem P 62 (P 62 morpho), rekrutacja septyn do chala była ograniczona, co wskazuje, że P 62 jest niezbędnym elementem mechanizmu autofagii. Po opanowaniu techniki, zakażenie larw PHI może zostać przeprowadzone w ciągu jednego lub dwóch dni, jeśli procedura jest wykonywana prawidłowo. Do manipulacji genomem rybek danio można wykorzystać inne metody, takie jak edycja genomu za pomocą systemu CRISPR/Cas9. Dodatkowo, można opracować nowe linie rybek danio z fluorescencyjnymi znacznikami, aby w czasie rzeczywistym obserwować dynamikę cytoszkieletu autofagii podczas zakażenia żelowego przy użyciu obrazowania żywych tkanek po przeprowadzeniu odkrycia.Klatka septyn Chaga została wykorzystana do badania oddziaływań cytoszkieletu z procesem autofagii, co otworzyło przed badaczami w dziedzinie infekcji i biologii komórki drogę do wyjaśnienia nowych funkcji cytoszkieletu w autofagii. Należy pamiętać, że praca z Ella może być niezwykle niebezpieczna, dlatego podczas wykonywania tej procedury należy zawsze przestrzegać środków ostrożności, takich jak praca w laboratorium drugiego stopnia bezpieczeństwa biologicznego.

use-of-shigella-flexneri-to-study-autophagy-cytoskeleton-interactions

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Immunologia i infekcje

Zastosowanie Shigella flexneri do badania interakcji autofagii i cytoszkieletu

Autofagia to wszechobecny proces, który umożliwia komórkom degradację i recykling białek i organelli. Stosujemy zaawansowaną mikroskopię fluorescencyjną do wizualizacji i ilościowego określenia niewielkich, ale istotnych zmian fizycznych związanych z indukcją autofagii, w tym powstawania i dystrybucji autofagosomów i lizosomów oraz ich fuzji w autolizosomy.

Ilościowa analiza autofagii przy użyciu zaawansowanej mikroskopii fluorescencyjnej 3D

Opisujemy metodę śledzenia pęknięcia błony wewnętrznej wywołanego przez wewnątrzkomórkowe bakterie Shigella flexneri i Mycobacterium tuberculosis po inwazji komórek gospodarza. Nasz test wykorzystuje CCF4, cytoplazmatyczną sondę FRET gospodarza w żywych lub utrwalonych komórkach. Ten reporter jest degradowany przez aktywność enzymatyczną obecną na powierzchni bakterii.

Pomiary pojedynczych komórek pęknięcia wakuolarnego spowodowanego przez patogeny wewnątrzkomórkowe

Mikroskopia poklatkowa markerów autofagii znakowanych fluorescencyjnie umożliwia monitorowanie dynamicznej odpowiedzi autofagii z wysoką rozdzielczością czasową. Korzystając ze specyficznych markerów autofagii i organelli w kombinacji 3 różnych kolorów, możemy śledzić wkład białka w tworzenie autofagosomów w solidnym kontekście przestrzennym i czasowym.

Obrazowanie na żywych komórkach wczesnych zdarzeń autofagii: omegasomy i nie tylko

Eksperymentalna sepsa może być wywołana u myszy za pomocą metody podwiązania i nakłucia jelita ślepego (CLP). Aktualne protokoły oceny autofagii in vivo w kontekście sepsy wywołanej CLP przedstawiono tutaj: Protokół pomiaru autofagii przy użyciu myszy (GFP)-LC3 oraz protokół pomiaru tworzenia autofagosomów za pomocą mikroskopii elektronowej.

Podwiązanie jelita ślepego i sepsa wywołana nakłuciem jako model do badania autofagii u myszy

Przedstawione tutaj są dwie techniki badań interakcji białko-białko oparte na przeciwciałach: immunofluorescencja i immunoprecypitacja. Techniki te nadają się do badania fizycznych interakcji między białkami w celu odkrycia nowych składników komórkowych szlaków sygnałowych i zrozumienia dynamiki białek.<br...

Badanie interakcji białko-białko w badaniach nad autofagią

Tutaj prezentujemy protokoły wizualizacji odpowiedzi wapnia (Ca2+) wywołanych przez komórki HeLa zakażone przez Shigella. Optymalizując parametry infekcji bakteryjnej i obrazując za pomocą sond fluorescencyjnychCa2+, scharakteryzowano nietypowe globalne i lokalne sygnały Ca2+ indukowane przez bakterie w szerokim zakresie kinetyki infekcji.

Obrazowanie odpowiedzi Ca2+ podczas zakażenia komórek nabłonkowych Shigella

Przedstawiamy protokół do badania rozkładu mitochondriów i retikulum endoplazmatycznego w całych komórkach po modyfikacji genetycznej za pomocą korelacyjnej mikroskopii elektronowej światła i objętości, w tym barwienia peroksydazą askorbinianową 2 i peroksydazy chrzanowej, seryjnego cięcia komórek z i bez genu docelowego w tej samej sekcji oraz seryjnego obrazowania za pomocą mikroskopii elektronowej.

Obrazowanie mitochondriów i retikulum endoplazmatycznego za pomocą korelacyjnej mikroskopii świetlnej i objętościowej

Przedstawiono protokół obrazowania dynamicznych mikrotubul in vivo przy użyciu fluorescencyjnie znakowanego białka wiążącego End. Opisaliśmy metody znakowania, obrazowania i analizowania dynamicznych mikrotubul w neuronie tylnej bocznej mikrotubuli (PLM) C. elegans.

In vivo (in vivo) Ocena dynamiki i orientacji mikrotubul w neuronach Caenorhabditis elegans

Tutaj prezentujemy protokół do zoptymalizowanej korelacyjnej mikroskopii świetlno-elektronowej opartej na endogennym, fluorescencyjnym znakowaniu jako narzędzie do badania lokalizacji rzadkich białek w odniesieniu do ultrastruktury komórkowej. O sile tego podejścia świadczy ultrastrukturalna lokalizacja endogennego LC3 w wygłodzonych komórkach bez leczenia bafilomycyną.

Ultrastrukturalna lokalizacja endogennego LC3 za pomocą korelacyjnej mikroskopii świetlno-elektronowej na przekroju

Obecny protokół opisuje testy infekcji do badania przestrzegania Shigella, inwazji i replikacji wewnątrzkomórkowej przy użyciu linii komórkowych nabłonka in vitro.

Analizy zakażeń komórek nabłonkowych preparatem Shigella

Ten protokół opisuje mechanizm użycia światła korelacyjnego i mikroskopii elektronowej do wizualizacji interakcji mitochondriów i lizosomów znakowanych odpowiednio mEosEM i APEX2.

Dwukolorowa korelacyjna mikroskopia świetlna i elektronowa do wizualizacji interakcji między mitochondriami a lizosomami

Poznaj metody badania interakcji autofagia-cytoszkielet podczas infekcji Shigella flexneri w komórkach HeLa i larwach zebrafy. Protokoły obejmują mikroskopię fluorescencyjną i in vivo.

Zastosowanie Shigella flexneri do badania interakcji autofagia-cytoszkielet

Przeglądaj więcej filmów