Ekstrakcja jadu i mikrodysekcji gruczołów jadowych od pająków do analiz proteomicznych i transkryptomicznych

Ogólnym celem tej procedury jest ekstrakcja jadu i wypreparowanie gruczołów jadowych od pająków do badań transkryptomicznych i proteomicznych, osiąga się to poprzez uprzednie przygotowanie sprzętu i odczynników potrzebnych do pobrania jadu za pomocą stymulacji elektrycznej. Drugim krokiem jest unieruchomienie pająka znieczulającego kleszczami pod mikroskopem preparacyjnym. Następnie pająk jest pulsowany prądem, a uwolniony jad jest zbierany za pomocą mikrorurki kapilarnej.

Ostatnim krokiem jest wypreparowanie gruczołów jadowych pająka dwa do trzech dni później. Ostatecznie spektrometria mas lub inne analizy proteomiczne jadu są wykorzystywane do pokazania sekwencji składowych białek jadu. Wizualna demonstracja tej metody ma kluczowe znaczenie, ponieważ etapy zbierania jadu są trudne do nauczenia, ponieważ obejmują sekwencję skoordynowanych działań, które należy wykonać szybko, ale ostrożnie.

Aby rozpocząć, podłącz przewód zasilający elektrostymulatora do gniazdka i podłącz zewnętrzny pedał nożny do zewnętrznego wejścia sygnałowego. Następnie upewnij się, że przełącznik polaryzacji jest w trybie normalnym i podłącz elektrodę dodatnią do czerwonego zacisku wyjściowego elektrostymulatora i podłącz elektrodę ujemną do czarnego zacisku wyjściowego. Następnie ustaw stymulator na następujące zalecane ustawienia początkowe.

Przetestuj wyjście elektrody, podłączając zaciski krokodylkowe do przewodów pomiarowych woltomierza dodatniego i ujemnego. Następnie włącz wyłącznik zasilania stymulatora i dostarczaj prąd za pomocą pedału nożnego. Przygotuj szczypce do wagi piórkowej, pokrywając jeden bolec płynnym plastikiem i odczekaj cztery godziny, aż powłoka wyschnie, po wyschnięciu plastiku szczelnie owiń 15 milimetrów przeciwległej końcówki zęba AP pojedynczą warstwą bawełnianej nici do szycia i zabezpiecz nić, wiążąc koniec w węzeł.

Następnie ostrymi nożyczkami odetnij końcówkę igły podskórnej, wystarczająco małej, aby nie zaszkodzić pająkowi, ale wystarczająco dużej, aby uniknąć zatkania. Wygładź otwór papierem ściernym i przymocuj igłę do syfonu próżniowego. Następnie ustaw szczypce do piórek poziomo w szczelnie zamkniętej pozycji za pomocą dwuzębnego zacisku pokrytego winylem przymocowanego do podstawy magnetycznej pod polem widzenia mikroskopu preparacyjnego z bolcem pokrytym tworzywem sztucznym na górze i bolcem pokrytym gwintem na dole.

Następnie przymocuj zacisk krokodylkowy z elektrodą dodatnią do dolnego bolca przed gwintem i przymocuj ujemny zacisk krokodylkowy do metalowej igły próżniowej. Następnie umieść dodatni przewód na bolcu kleszczy między gwintem a zaciskiem krokodylkowym, a ujemny przewód na igle próżniowej. Aby przetestować prąd obwodu woltomierza, naciśnij pedał nożny, aby upewnić się, że wykryty jest wystarczający prąd, i odłącz przewody podczas noszenia okularów ochronnych.

Przygotuj kilka mikro probówek kapilarnych do pobrania jadu. Następnie umieść pasek szpachli montażowej na szalce Petriego i oprzyj mikrokapilary na pasku. Ręką w rękawiczce przytrzymaj pojedynczą rurkę mikrokapilarną na jednym końcu, a drugi koniec przytrzymaj sterylnymi metalowymi kleszczami nad płomieniem palnika Bunsena i odciągnij koniec od płomienia, aby utworzyć wydłużoną końcówkę, trzymając drugi koniec w pozycji stacjonarnej, zbadaj końce mikrokapilar pod mikroskopem preparacyjnym i utwórz mały skośny otwór na wyciągniętym końcu za pomocą wysterylizowanych metalowych kleszczy.

Zamknij probówki i umieść je na lodzie. Aby rozpocząć unieruchomienie pająka, włącz gaz w komorze CO2. Następnie przenieś pająka długimi metalowymi kleszczami z zamkniętej plastikowej fiolki zbiorczej do komory CO2.

Trzymaj pająka w komorze przez pięć do 10 minut i sprawdź, czy pająk już się nie porusza. Delikatnie szturchając go długimi kleszczami. Następnie użyj pipety transferowej z roztworem soli fizjologicznej, aby zwilżyć nić na kleszczach.

Następnie wyjmij znieczulonego pająka z komory CO2, podnosząc go za przednie nogi. Za pomocą kleszczy preparacyjnych i dłoni w rękawiczkach przenieś znieczulonego pająka do aparatu kleszczy do wagi piórkowej. Następnie oddziel zęby zamkniętych kleszczy o wadze piórkowej i umieść pająki głowowe thax między zębami.

Pozwól, aby zęby się zamknęły, aby upewnić się, że pająk jest mocno trzymany na miejscu, ale nie jest zgniatany Szybko upewnij się, że pająk jest umieszczony grzbietem samochodu stroną do dołu, spoczywając na bolcu pokrytym gwintem, a brzuszna strona samochodu jest skierowana w stronę plastikowej powłoki, podczas gdy elektroda dodatnia pozostaje przymocowana do dolnego bolca. Następnie dostosuj ostrość powiększenia mikroskopu preparacyjnego i źródło światła, aż pająki i kły będą wyraźnie widoczne. Aby rozpocząć zbieranie jadu, włącz odkurzacz i spryskaj kopalnię pająków wodą.

Za pomocą drugiej igły strzykawki z końcówką odessuj wodę za pomocą igły próżniowej, aby usunąć zanieczyszczenia. Następnie przyłóż igłę próżniową z elektrodą ujemną do mównicy pająka i dostarcz impuls za pomocą pedału nożnego. Nogi pająka będą się kurczyć, a jad będzie widoczny jako przezroczyste kropelki wyłaniające się z kłów.

W razie potrzeby odkurzyć, zwrócić zwracanie. Następnie zbierz kropelki jadu za pomocą końcówki mikrokapilarnej i przenieś końcówkę kapilary do 0,5 mililitrowej rurki z wodą, która zostanie zassana do kapilary. Unikaj nakłuwania pająka kapilarną i zanieczyszczenia naczyń włosowatych jedwabiem i klejem z przędz

Następnie przymocuj strzykawkę do przenoszenia z adapterem rurki do mikrokapilary na końcu przeciwległym do końcówki zbiorczej i dozuj roztwór jadu z powrotem do probówki i umieść probówkę na rurkach zawierających jad do przechowywania lodu w temperaturze minus 80 stopni Celsjusza. Po zakończeniu, po zakończeniu zbierania jadu, umieść otwartą plastikową fiolkę do zbierania wraz z nakrętką blisko pająka. Aby szybko przenieść, ostrożnie chwyć nogi pająka kleszczami preparacyjnymi trzymanymi w jednej ręce i ostrożnie otwórz kleszcze piórkowe drugą ręką.

Następnie wsuń pająka do fiolki zbiorczej za pomocą kleszczy. I szybko zamknij nakrętkę dwa do trzech dni po pobraniu jadu, znieczul pająka w komorze CO2, a następnie napełnij nośnik ciekłego azotu i umieść go obok mikroskopu preparacyjnego. Oczyść obszar sekcji i kleszcze z dala od RNA.

Następnie napełnij małą szalkę Petriego jednym x soli fizjologicznej cytrynianu sodu i umieść ją pod mikroskopem preparacyjnym. Następnie przenieś pająka z komory CO2 na szalkę Petriego i za pomocą kleszczy szybko oddziel głowowy thax od brzucha. Następnie przytrzymaj thax głowowy pod mikroskopem preparacyjnym za pomocą kleszczy i ustaw kopalnię w polu widzenia.

Użyj ostrych końców drugiej pary kleszczy, aby przeciąć naskórek łączący karbazę z bocznymi aspektami kopalni. Chwyć kopalnię drugą parą kleszczy i delikatnie szarp w przód iw tył, aż gruczoły jadowe zostaną wyciągnięte. Zajmuje to nie więcej niż 15 minut.

Oddziel gruczoły od kopalni i przenieś je do bezpiecznej kriogenicznie probówki o pojemności 0,5 mililitra. Umieść zamkniętą probówkę w ciekłym azocie, integrując techniki spektrometrii mas z bazami danych sekwencji wygenerowanymi z gruczołu jadowego CD NA. Biblioteki umożliwiły identyfikację białek jadowych. Nieudolny peptyd Laro był jednym z 36 białek zidentyfikowanych z jadu czarnej wdowy za pomocą spektrometrii mas.

Nie zapominaj, że praca z pająkami, takimi jak czarne wdowy, może być niezwykle niebezpieczna, a podczas wykonywania tej procedury należy zawsze zachować środki ostrożności, takie jak noszenie rękawic ochronnych.