Name: Izolacja cholangiocytów zewnątrzwątrobowych noworodków (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-06-05T13:45:00.000+00:00
Duration: 7 min 54 s
Description: Naucz się izolować cholangiocyty zewnątrzwątrobowe myszy noworodków przy użyciu precyzyjnej techniki preparacyjnej i hodowli na grubych żelach kolagenowych. Ta metoda umożliwia uzyskanie czystych populacji komórek do badań nad rozwojem i patologią dróg żółciowych.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Autorzy są wdzięczni Molekularnemu Rdzeniowi Patologii i Obrazowania Centrum Badań Molekularnych nad Chorobami Układu Pokarmowego i Wątroby UPenn NIDDK (P30 DK50306) za pomoc w obrazowaniu.
Praca ta była wspierana przez granty z National Institutes of Health (R01 DK-092111) oraz z Fred and Suzanne Biesecker Pediatric Liver Center (do R.G.W.) oraz przez stypendium z Childhood Liver Disease Research and Education Network (dla S.K.).

Cała procedura jest przeprowadzana w temperaturze pokojowej, chyba że określono inaczej. Wszystkie prace ze zwierzętami powinny być wykonywane w humanitarnych warunkach, zgodnie z protokołem zatwierdzonym przez lokalny Instytucjonalny Komitet ds. Opieki nad Zwierzętami i Ich Wykorzystywania (IACUC).
1. Przygotowanie sprzętu i rozwiązań
<ol>
	<li>Ustaw stół chirurgiczny myszy w bliskiej odległości od kaptura do hodowli tkanek i inkubatora (ryc. 1A). Uwaga: Wymagane wyposażenie obejmuje mikroskop preparacyjny, źródło światła, nożyczki do prostej tęczówki o długości 12,5 cm, 6-calowe nieząbkowane zakrzywione kleszcze z cienkimi końcówkami oraz 4-calowe ząbkowane kleszcze z zakrzywionymi końcówkami (rysunek 1B).</li>
	<li>Wysterylizowane narzędzia umieścić na stole operacyjnym w szklanej zlewce z 70% alkoholem.</li>
	<li>Napełnić trzy sterylne szalki Petriego o średnicy 60 mm sterylnymi pożywkami izolacyjnymi (Tabela 1); umieścić dwie na stole operacyjnym i jedną w kapturze, wszystkie na lodzie.</li>
	<li>Umieść kolagen z ogona szczura, sterylną sól fizjologiczną buforowaną 10 razy fosforanem (PBS), sterylną wodę, sterylne 1 N NaOH i pożywkę z komórek nabłonka żółciowego (BEC) (Tabela 1) w kapturze do hodowli tkankowej. Uwaga: Kolagen powinien być na lodzie.</li>
</ol>
2. Izolacja i posiew dróg żółciowych
<ol>
	<li>Poddać eutanazji nowonarodzone myszy między 0-3 dniem życia, poprzez wystawienie na dwutlenek węgla do utraty przytomności, a następnie zwichnięcie szyjki macicy, zgodnie z wytycznymi IACUC (ryc. 1C). 
	Uwaga: starsze myszy mogą być używane w zależności od konkretnych potrzeb eksperymentalnych.</li>
	<li>Ułóż zwierzę w pozycji leżącej na plecach i wykonaj małe poziome nacięcie przecinające linię środkową w okolicy miednicy. Rozciągnij to nacięcie na boki i po obu stronach brzucha, tworząc płat w kształcie litery U. Obróć klapę do góry, aby odsłonić narządy jamy brzusznej. Gdy brzuch jest otwarty, ostrożnie wysuń jelita z jamy brzusznej w kierunku prawej strony zwierzęcia, aby uzyskać lepszą wizualizację wątroby i wspólnego przewodu żółciowego. Uwaga: może być konieczne przedłużenie bocznych nacięć w klatce piersiowej w celu uzyskania lepszej identyfikacji wątroby.</li>
	<li>Za pomocą mikroskopu preparacyjnego zidentyfikuj wspólny przewód żółciowy, wątrobę i jelita. Najpierw zidentyfikuj wspólny przewód żółciowy (ryc. 1D), zachowując ostrożność, ponieważ struktury są bardzo delikatne. Za pomocą ząbkowanych i nieząbkowanych kleszczy skrupulatnie oczyść i usuń tkankę łączną, w tym tłuszcz otaczający żółć. Użyj jednego kleszcza do przytrzymania kanału, a drugiego do czyszczenia.</li>
	<li>Użyj podobnej techniki do czyszczenia pęcherzyka żółciowego.</li>
	<li>Umieść oczyszczone kanały i woreczek żółciowy w pierwszym naczyniu z podłożem izolacyjnym na lodzie. Delikatnie masuj struktury nieząbkowanymi kleszczami w pożywce, aby dodatkowo usunąć tkankę łączną i usunąć żółć z pęcherzyka żółciowego.</li>
	<li>Przenieś kanały i pęcherzyk żółciowy do drugiego naczynia z podłożem izolacyjnym.</li>
	<li>Po odizolowaniu przewodów i pęcherzyków żółciowych od 5 zwierząt, przenieś kawałki na trzecią szalkę Petriego, w kapturze. Uwaga: Jeśli komórki mają być izolowane od więcej niż 5 zwierząt, należy je izolować partiami, używając świeżych roztworów dla każdej grupy 5 zwierząt.</li>
	<li>Przygotuj gęste żele kolagenowe w kapturze do hodowli tkankowej: 
	Uwaga: można użyć naczynia o dowolnym rozmiarze. Dobrze sprawdza się naczynie hodowlane o średnicy 60 mm z końcową objętością 3 ml kolagenu dla każdej grupy 5 noworodków. Powinien być przygotowany na świeżo w momencie osadzania świeżo odizolowanych kanałów.
	<ol>
		<li>Umieść kolagen z ogona szczura, sterylną sól fizjologiczną 10x buforowaną fosforanem (10x PBS), sterylne dH2O i sterylne 1 N NaOH na lodzie.</li>
		<li>Obliczyć objętości dH20, 10x PBS, NaOH i kolagenu wymagane dla żeli o końcowym stężeniu 2 mg / ml kolagenu w 1x PBS, używając objętości 1 N NaOH równej 0,023 objętości dodanego kolagenu. Uwaga: Jeśli używane jest alternatywne źródło kolagenu, postępuj zgodnie z instrukcjami producenta dotyczącymi neutralizacji i tworzenia żelu.</li>
		<li>Wymieszaj ze sobą dH20, 10x PBS i 1 N NaOH, a następnie dobrze dodaj kolagen i pipetę, aby zapewnić równomierne wymieszanie.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Gdy roztwór kolagenu zgęstnieje do konsystencji żelu w temperaturze pokojowej, natychmiast zanurz kanaliki w kolagenie.</li>
	<li>Umieścić w inkubatorze w temperaturze 37 °C, 5% CO2 na 30 minut, aby kolagen mógł się zestalić.</li>
	<li>Po zestaleniu się żelu (zmiana barwy z przezroczystej na białą) nałożyć na 3,5 ml pożywki BEC (Tabela 1) i inkubować w temperaturze 37 °C, 5% CO2 .</li>
	<li>Usuwaj pożywkę BEC 3 razy w tygodniu i zastąp ją 3,5 ml świeżej pożywki.</li>
</ol>
3. Izolowanie pierwotnych cholangiocytów z gęstych żeli kolagenowych
Uwaga: w ciągu 3 tygodni arkusze cholangiocytów (komórki z dużymi jądrami wychodzącymi bezpośrednio z osadzonych przewodów) będą widoczne w gęstym kolagenie. Jeśli w naczyniu znajduje się duża liczba fibroblastów, należy je wyrzucić. Jeśli w kilku obszarach naczynia narośli narośli fibroblasty, można je wyciąć skalpelem i usunąć przed podziałem cholangiocytów.
<ol>
	<li>Przygotuj cienkie żele kolagenowe:
	<ol>
		<li>Rozcieńczyć kolagen do stężenia 1 mg/ml sterylnym PBS. Uwaga: użyć 1 ml na płytkę 100 mm; Dostosuj odpowiednio do potraw o innych rozmiarach.</li>
		<li>Roztwór kolagenu rozprowadzić równomiernie za pomocą rozsiewacza komórek (duże szalki) lub końcówki pipety (małe szalki), a następnie pozostawić w temperaturze pokojowej na 10 minut.</li>
		<li>Przykryć płytkę DMEM/F12 i inkubować w temperaturze 37 °C, 5% CO2 przez 10 minut.</li>
		<li>Wyjąć płytkę z inkubatora i umyć 1x PBS. Natychmiast zassać 1x PBS.</li>
		<li>Pokryj drugą cienką warstwą kolagenu, rozprowadzając poprzez obracanie płytki lub umieszczanie płytki na shakerze. Inkubować w temperaturze 37 °C, 5% CO2 przez 10 minut.</li>
		<li>Po zestaleniu się kolagenu przykryć płytkę DMEM/F12 i inkubować w temperaturze 37 °C, 5% CO2 przez 30 minut.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Rozszczepione komórki z gęstych żeli kolagenowych:
	<ol>
		<li>Za pomocą szpatułki do hodowli komórkowych lub skrobaka do komórek delikatnie zeskrob żel kolagenowy z płytki, aby unosił się na wodzie.</li>
		<li>Przygotować roztwór kolagenazy, rozcieńczając kolagenazę typu XI (patrz lista materiałów) do 10 mg/ml za pomocą DMEM/F12. Dobrze wymieszaj i sterylny filtr.</li>
		<li>Dodać 1 ml roztworu kolagenazy (powyżej) na 60 mm naczynie komórek w gęstym kolagenie. Nie wyjmuj pożywki BEC (która powinna mieć 3 ml). Inkubować naczynie przez 30 minut w temperaturze 37 °C, 5% CO2 .</li>
		<li>Usunąć roztwór zawierający komórki i umieścić w stożkowej probówce o pojemności 15 ml.</li>
		<li>Wirować przy 2,200 x g przez 5 minut. Wyrzucić supernatant i ponownie zawiesić osad w podobnej objętości DMEM/F12.</li>
		<li>Ponownie wirować roztwór przy 2 200 x g przez 5 minut. Usunąć supernatant.</li>
		<li>Zawiesić osad w 3 ml 0,5% trypsyny i inkubować w temperaturze 37 °C, 5% CO2 przez 5 minut. Po inkubacji pipetować roztwór w górę iw dół, aby rozbić arkusze cholangiocytów. Dodać 5 ml pożywki BEC i wirować roztwór o stężeniu 1 500 x g przez 5 min.</li>
		<li>Usunąć supernatant i ponownie zawiesić osad w DMEM/F12, a następnie wirować roztwór o stężeniu 1 500 x g przez 5 minut.</li>
		<li>Usunąć supernatant i ponownie zawiesić osad w pożywce BEC (Tabela 1). Płytki komórkowe na wcześniej przygotowanych cienkich żelach kolagenowych.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
4. Przemieszczanie i przechowywanie komórek
Uwaga: komórki na cienkich żelach kolagenowych mogą być dzielone w zależności od potrzeb.
<ol>
	<li>Umyć płytki sterylnym PBS przed inkubacją w 0,25% trypsyny w temperaturze 37 °C przez 10-15 min.</li>
	<li>Zneutralizować równą objętością pożywki BEC i granulować w ilości 1.500 x g przez 5 min. Przepłukać osad DMEM/F12, a następnie osad w 1.500 x g przez 5 min.</li>
	<li>Ponownie zawiesić komórki w pożywce BEC w celu dystrybucji do naczyń do hodowli komórkowych pokrytych kolagenem. 
	Uwaga: Alternatywnie, komórki można ponownie zawiesić na nośniku pamięci i przechowywać w zamrażarce o temperaturze -80 °C lub ciekłym azocie (tabela 1).</li>
</ol>

<ol><li>Paradis, K., Sharp, H. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vitro+duct-like+structure+formation+after+isolation+of+bile+ductular+cells+from+a+murine+model%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Lab.+Clin.+Med%22%5BJournal%5D)">In vitro duct-like structure formation after isolation of bile ductular cells from a murine model.</a> J. Lab. Clin. Med. 113 (6), 689-694 (1989).</li>
<li>Vroman, B., LaRusso, N. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Development+and+characterization+of+polarized+primary+cultures+of+rat+intrahepatic+bile+duct+epithelial+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Lab.+Invest%22%5BJournal%5D)">Development and characterization of polarized primary cultures of rat intrahepatic bile duct epithelial cells.</a> Lab. Invest. 74 (1), 303-313 (1996).</li>
<li>Kumar, U., Jordan, T. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+and+culture+of+biliary+epithelial+cells+from+the+biliary+tract+fraction+of+normal+rats%5BTitle%5D)+AND+%22Liver%22%5BJournal%5D)">Isolation and culture of biliary epithelial cells from the biliary tract fraction of normal rats.</a> Liver. 6 (6), 369-378 (1986).</li>
<li>Ishii, M., Vromen, B., LaRusso, N. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+and+morphologic+characterization+of+bile+duct+epithelial+cells+from+normal+rat+liver%5BTitle%5D)+AND+%22Gastroenterology%22%5BJournal%5D)">Isolation and morphologic characterization of bile duct epithelial cells from normal rat liver.</a> Gastroenterology. 97 (5), 1236-1247 (1989).</li>
<li>Strazzabosco, M., Fabris, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Development+of+the+bile+ducts%3A+Essentials+for+the+clinical+hepatologist%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Hepatol%22%5BJournal%5D)">Development of the bile ducts: Essentials for the clinical hepatologist.</a> J. Hepatol. 56 (5), 1159-1170 (2012).</li>
<li>Carpentier, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Embryonic+ductal+plate+cells+give+rise+to+cholangiocytes%2C+periportal+hepatocytes%2C+and+adult+liver+progenitor+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Gastroenterology%22%5BJournal%5D)">Embryonic ductal plate cells give rise to cholangiocytes, periportal hepatocytes, and adult liver progenitor cells.</a> Gastroenterology. 141 (4), 1432-1438 (2011).</li>
<li>Cho, W. K., Mennon, A., Boyer, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+of+functional+polarized+bile+duct+units+from+mouse+liver%5BTitle%5D)+AND+%22Am.+J.+Physiol.+Gastrointest.+Liver+Physiol%22%5BJournal%5D)">Isolation of functional polarized bile duct units from mouse liver.</a> Am. J. Physiol. Gastrointest. Liver Physiol. 280 (2), (2001).</li>
<li>Karjoo, S., Hand, N. J., Loarca, L., Russo, P. A., Friedman, J. R., Wells, R. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Extra-hepatic+cholangiocyte+cilia+are+abnormal+in+biliary+atresia%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Pediatr.+Gastroenterol.+Nutr%22%5BJournal%5D)">Extra-hepatic cholangiocyte cilia are abnormal in biliary atresia.</a> J. Pediatr. Gastroenterol. Nutr. 57 (1), 96-101 (2013).</li>
<li>Sutton, M. E., op den Dries, S., Koster, M. H., Lisman, T., Gouw, A. S., Porte, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Regeneration+of+human+extrahepatic+biliary+epithelium%3A+the+peribiliary+glands+as+progenitor+cell+compartment%5BTitle%5D)+AND+%22Liver+Int%22%5BJournal%5D)">Regeneration of human extrahepatic biliary epithelium: the peribiliary glands as progenitor cell compartment.</a> Liver Int. 32 (4), 554-559 (2012).</li>
<li>Cardinale, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multipotent+stem%2Fprogenitor+cells+in+human+biliary+tree+give+rise+to+hepatocytes%2C+cholangiocytes%2C+and+pancreatic+islets%5BTitle%5D)+AND+%22Hepatology%22%5BJournal%5D)">Multipotent stem/progenitor cells in human biliary tree give rise to hepatocytes, cholangiocytes, and pancreatic islets.</a> Hepatology. 54 (6), 2159-2172 (2011).</li>
</ol>

Autorzy oświadczają, że nie mają sprzecznych interesów.

Opisano tutaj technikę izolowania czystych cholangiocytów z pozawątrobowych dróg żółciowych myszy w każdym wieku, w tym noworodków. Technika ta ma tę zaletę, że cholangiocyty pozawątrobowe mogą być badane oddzielnie od cholangiocytów wewnątrzwątrobowych i mogą ułatwić badania mające na celu zidentyfikowanie kluczowych różnic między tymi populacjami komórek. Niedawno opublikowaliśmy badanie wykazujące zmniejszenie rzęsek w cholangiocytach pozawątrobowych wyizolowanych tą metodą i zakażonych rotawirusem rezus8. ...

Pochodzenie i rozwój wewnątrz- i zewnątrzwątrobowych cholangiocytów są wyraźnie różne. Wątroba rozwija się z uchyłka endodermy brzusznego jelita przedniego5. Obszar ogonowy uchyłka tworzy pozawątrobowe drzewo żółciowe, podczas gdy obszar czaszki generuje wewnątrzwątrobowe drzewo żółciowe5. Cholangiocyty przewodu wewnątrzwątrobowego pochodzą z komórek progenitorowych wokół płytki przewodowej w obszarach wrotnych okołobiegunowych6. Komórki te mają zdolność różnicowania się w hepatocyty lub cholangiocyty6. Ma to znaczące implikacje kliniczne, biorąc pod uwagę, że cholangiopatie mogą być specyficznie ukierunkowane na jedną kategorię cholangiocytów. Na przykład atrezja dróg żółciowych początkowo wpływa na przewody pozawątrobowe noworodka, podczas gdy zespół Alagille'a wpływa na przewody wewnątrzwątrobowe.
Istnieje wiele opisów izolacji wewnątrzwątrobowych cholangiocytów i jednostek dróg żółciowych od myszy i szczurów. Badacze wyizolowali pojedyncze komórki przez izolację przewodów i późniejszy wzrost lub przez trawienie wątroby i ściąganie przeciwciał w dół cholangiocytów wyrażających określone markery powierzchni komórek1-4. Funkcjonalne i spolaryzowane jednostki dróg żółciowych zostały wyizolowane przez trawienie wątroby i filtrację wielkości7. Jednostki dróg żółciowych są zdolne do reagowania na bodźce wydzielnicze i wykazują wydzielanie płynów7, podczas gdy wykazano, że izolowane cholangiocyty rozwijają struktury przewodowe in vitro1,2. Do ograniczeń tych metod należy konieczność posiadania specjalistycznej wiedzy technicznej i specjalnego sprzętu do perfuzji wątroby za pomocą enzymów trawiennych. Ponadto istnieje ryzyko zanieczyszczenia komórkami mezenchymalnymi3.
Metoda izolowania pozawątrobowych cholangiocytów dróg żółciowych, szczególnie od pozawątrobowych dróg żółciowych noworodków, nie została wcześniej opisana. W artykule przedstawiono uproszczoną technikę izolowania komórek pozawątrobowych dróg żółciowych noworodków i dorosłych przy zachowaniu wysokiego poziomu czystości. Technika ta ułatwi badanie różnic między cholangiocytami wewnątrz- i zewnątrzwątrobowymi oraz badania nad mechanizmami chorób, takich jak atrezja dróg żółciowych, które obejmują przewody pozawątrobowe.

<table><tbody><tr><td>DMEM/F12 (1:1)</td><td>Gibco/ Life technologies</td><td>11320-033</td><td>500 ml, stosowany w podłożach BEC</td></tr><tr><td>FBS</td><td>Atlanta Biologicals</td><td>S11150</td><td>25 ml, stosowany w podłożach BEC</td></tr><tr><td>MEM z aminokwasami endogennymi</td><td>Gibco/ Life technologies</td><td>11140-019</td><td>5 ml, stosowany w podłożach BEC</td></tr><tr><td>Insulina-transferyna-selen</td><td>Gibco/ Life technologies</td><td>51300-044</td><td>5 ml, stosowany w podłożach BEC</td></tr><tr><td>Na Pirogronian</td><td>Cellgro</td><td>25-000-CL</td><td>5 ml, stosowany w podłożach BEC</td></tr><tr><td>Chemicznie zdefiniowany koncentrat lipidowy</td><td>Gibco/ Life technologies</td><td>11905-031</td><td>5 ml, stosowany w pożywkach BEC</td></tr><tr><td>Penicylina-Streptomycyna</td><td>Cellgro</td><td>30-002-CI</td><td>5 ml, stosowany w podłożach BEC i 500 &#956; l w izolacji</td></tr><tr><td>Gentamycyna</td><td>Gibco/ Life technologie</td><td>15750-060</td><td>0,2 ml, stosowana w pożywkach BEC i 500 &#956; l w izolacji</td></tr><tr><td>Etanoloamina</td><td>Sigma Aldrich</td><td>E9508-100ml</td><td>0,13 ml, stosowany w pożywkach BEC</td></tr><tr><td>Roztwór witaminowy MEM</td><td>Gibco/ Life technologies</td><td>11120-052</td><td>5 ml, stosowany w pożywkach BEC</td></tr><tr><td>Inhibitor trypsyny sojowej</td><td>Biowhittaker</td><td>17-605E</td><td>5 ml, stosowany w podłożach BEC. Rozpuszczalnikiem jest PBS, wymieszać do stężenia podstawowego 5 mg/ml</td></tr><tr><td>L-glutaminy</td><td>Cellgro</td><td>25-005-CL</td><td>5 ml, stosowany w pożywkach BEC</td></tr><tr><td>Ekstrakt z przysadki bydlęcej</td><td>Gemini</td><td>500-102</td><td>1,1 ml, stosowany w pożywkach BEC</td></tr><tr><td>Deksametazon</td><td>Sigma Aldrich</td><td>D4902</td><td>0,5 ml, stosowany w podłożach BEC, Stock conc 393 &#956; g / ml rozcieńczyć etanolem</td></tr><tr><td>3 3',5-trijodo-L-tyronina</td><td>Sigma Aldrich</td><td>T6397</td><td>0,5 ml, stosowany w pożywkach BEC, Stężenie magazynowe 3,4 mg/ml rozcieńczony etanolem</td></tr><tr><td>Naskórkowy czynnik wzrostu</td><td>Millipore</td><td>01-101</td><td>0,5 ml, stosowany w podłożach BEC, 25 &#956; g/ml rozcieńczyć DMEM F12+1%BSA</td></tr><tr><td>Forskolin</td><td>Sigma Aldrich</td><td>F6886 5</td><td>ml, stosowany w podłożach BEC, stosować w stężeniu podstawowym 0,411 mg/ml i rozcieńczyć DMSO</td></tr><tr><td>Fungizone</td><td>Gibco/ Life technologies</td><td>15290-018</td><td>1 ml, stosowany w podłożach BEC i 500 &#956; l w izolacji</td></tr><tr><td>Kolagen ze szczurzego ogona</td><td>BD Biosciences</td><td>354236</td><td>zmienny w zależności od stężenia kolagenu</td></tr><tr><td>PBS 10x</td><td>USB Corporation</td><td>75889</td><td>zastosowanie przy 10x, sterlie, używany do produkcji kolagenu, ilość użyta zależy od stężenia kolagenu</td></tr><tr><td>dH2O</td><td>N/</td><td>A N/A</td><td>sterylny, używany do produkcji kolagenu, ilość użyta zależy od stężenia kolagenu</td></tr><tr><td>NaOH 10 N</td><td>Fischer Scientific</td><td>ss255-1</td><td>Rozcieńczony do 1 N, sterylny, używany do wytwarzania kolagenu, ilość użyta zależy od stężenia</td></tr><tr><td>kolagenu kolagenaza typu XI z Clostridium histolyticum</td><td>Sigma Aldrich</td><td>C7657</td><td>rozcieńczyć w DMEM i sterylnym filtrze przed użyciem</td></tr><tr><td>trypsyna-EDTA (1x) 0,25%</td><td>Gibco/ Life technologies</td><td>25200-056</td><td>3 ml, inkubować max 10 min</td></tr><tr><td>trypsyna-EDTA (10x) 0,5%</td><td>Gibco/ Life technologies</td><td>15400-054</td><td>3 ml, inkubacja max 10 min</td></tr><tr><td>Mikroskop preparacyjny</td><td>Nikon</td><td>SMZ645</td><td>Inne modele dopuszczalne</td></tr><tr><td>Źródło światła (oświetlacz światłowodowy)</td><td>Schott-Fostec</td><td>Ace EKE LR 92240</td><td>Inne modele dopuszczalne</td></tr><tr><td>12,5 cm proste nożyczki do tęczówki</td><td>Kent Scientific</td><td></td><td>Inne modele dopuszczalne</td></tr><tr><td>6-calowe nieząbkowane zakrzywione kleszcze z cienkimi końcówkami</td><td>Mikroskopia elektronowa</td><td></td> Nauki <td>Inne modele dopuszczalne</td></tr><tr><td>4-calowe ząbkowane kleszcze ze stali nierdzewnej z cienkimi końcówkami</td> Nauki <td></td> o <td>mikroskopii elektronowej</td><td>Inne modele dopuszczalne</td></tr></tbody></table>

izolacja cholangiocytów zewnątrzwątrobowych noworodków

Isolation of Neonatal Extrahepatic Cholangiocytes

Wewnątrz- i zewnątrzwątrobowe drogi żółciowe wątroby są rozwojowo odrębne i mogą być różnie dotknięte przez niektóre choroby. Jednak różnice między cholangiocytami wewnątrz- i zewnątrzwątrobowymi oraz między komórkami noworodków i dorosłych nie są dobrze poznane.
Metody izolacji cholangiocytów z wewnątrzwątrobowych dróg żółciowych są dobrze znane1-4. Izolacja pozawątrobowych komórek przewodowych, zwłaszcza od noworodka, nie została jeszcze opisana, chociaż byłoby to bardzo korzystne dla zrozumienia różnic między różnymi populacjami cholangiocytów i w badaniu chorób, takich jak atrezja dróg żółciowych, które wydają się celować w przewody pozawątrobowe. Opisano tutaj zoptymalizowaną technikę izolowania pozawątrobowych komórek dróg żółciowych zarówno noworodków, jak i dorosłych myszy. Technika ta pozwala uzyskać czystą populację komórek z minimalnym zanieczyszczeniem komórkami mezenchymalnymi, takimi jak fibroblasty.
Ta metoda opiera się na usunięciu przewodów pozawątrobowych i pęcherzyka żółciowego, a następnie na skrupulatnym rozbieraniu i skrobaniu w celu usunięcia warstw tłuszczu i fibroblastów. Struktury są osadzane w grubych warstwach kolagenu i hodowane przez około 3 tygodnie, aby umożliwić wzrost cholangiocytów w monowarstwach, które następnie można trypsynizować i ponownie posiać do użytku eksperymentalnego.

Zastosowanie niniejszego protokołu pozwala na wyizolowanie populacji noworodkowych cholangiocytów pozawatrobowych myszy o wysokiej czystości, co wykazano za pomocą barwienia immunofluorescencyjnego K19 (Ryc. 2A i 2B); podobne wyniki uzyskano podczas izolacji komórek od myszy dorosłych. Zaobserwowano, że komórki z nowo wyizolowanych dróg żółciowych potrzebują 3 tygodni na utworzenie monowarstw na grubych żelach kolagenowych. Cholangiocyty rosną liniowo w obrębie grubego kolagenu, tworząc płaty komórek poc...

Opisano technikę izolowania cholangiocytów z pozawątrobowych dróg żółciowych u noworodków myszy. Kanaliki są skrupulatnie preparowane, a następnie komórki są izolowane przez wyrost w gęstych żelach kolagenowych. Metoda ta stanowi przydatne narzędzie do badania rozwoju i patologii pozawątrobowych dróg żółciowych.

Izolacja cholangiocytów zewnątrzwątrobowych noworodków

The intra and extrahepatic bile ducts of the liver are developmentally distinct, and may be differentially affected by certain diseases. However, ...

Ogólnym celem niniejszej procedury jest izolacja i hodowla neonatalnych cholangiocytów pozawątrobowych. Osiąga się to najpierw poprzez chirurgiczne odsłonięcie narządów jamy brzusznej, aby uzyskać dostęp do wątroby i przewodów żółciowych. Drugim krokiem procedury jest staranne usunięcie tkanki łącznej i tłuszczów otaczających drogi żółciowe oraz pęcherzyk żółciowy.Oczyszczone przewody żółciowe oraz woreczek żółciowy umieszcza się następnie na grubych żelach kolagenowych i hoduje przez trzy tygodnie. Cholangiocy migrują z przewodów, a następnie są przenoszone na cienkie żele kolagenowe do dalszej hodowli. Ostatecznie wyniki, obrazowane za pomocą mikroskopii immunofluorescencyjnej, wykazują monowarstwy czystych cholangiocytów.Zazwyczaj osoby początkujące w tej technice napotykają trudności wynikające z problemów technicznych związanych z metodą sekcji, a także z oczyszczaniem małych przewodów żółciowych. Do tej procedury przygotuj stół chirurgiczny dla myszy w pobliżu komory do hodowli tkanek i inkubatora. Umieść wszystkie wysterylizowane narzędzia chirurgiczne w zlewce zawierającej 70% ethanol.Umieść trzy naczynia o średnicy 60 mm z nałożonym medium na lodzie. Dwa naczynia są potrzebne przy stole operacyjnym, natomiast pozostałe materiały należy pozostawić w komorze z laminarnym przepływem powietrza. Kolagen powinien znajdować się na lodzie.Zacznij od ułożenia uśpionego noworodka myszy w wieku od zero do trzech dni w pozycji na plecach na stole do sekcji. Wykonaj niewielkie poziome nacięcie wzdłuż linii środkowej w pobliżu miednicy. Rozszerz nacięcie na obie strony, tworząc płat w kształcie litery U, i odsłoń narządy.Teraz ostrożnie przesuń jelita na prawą stronę jamy brzusznej. Aby odsłonić wątrobę i przewód żółciowy, w razie potrzeby przedłuż nacięcia skóry, aby powiększyć płat. Pod mikroskopem sekcyjnym ostrożnie zidentyfikuj i oczyść wspólny przewód żółciowy.Usuń tkankę łączną oraz otaczającą tkankę tłuszczową. Następnie powtórz tę czynność. Aby oczyścić pęcherzyk żółciowy, wyizoluj przewód żółciowy oraz pęcherzyk żółciowy i umieść je w jednej z przygotowanych szalek.Masować struktury za pomocą pincety nieostrej, aby usunąć pozostałą tkankę łączną i wypchnąć żółć. Następnie przenieść oczyszczone tkanki do drugiej szalki. Powtarzać tę procedurę, aż do momentu zebrania tkanki od dokładnie pięciu noworodków.Zacznij od przygotowania gęstego żelu kolagenowego. Zawsze przygotowuj go jako pierwszy, bezpośrednio przed użyciem. Zbierz wszystkie sterylizowane roztwory i umieść je w lodzie.Oblicz objętości potrzebne do uzyskania stężenia dwóch miligramów kolagenu na mililitr 1XPBS. Do każdej części kolagenu dodaj 0,023 części wodorotlenku sodu. Wymieszaj alikwoty w temperaturze pokojowej poprzez pipetowanie.Niezbędne jest wymieszanie PBS, wodorotlenku sodu i wody destylowanej przed dodaniem kolagenu. Roztwór zapasu kolagenu musi być ostatnim składnikiem dodanym do żelu, a końcowy roztwór należy nanieść pipetą. Zapobiega to grudkowaniu kolagenu.Gdy roztwór zacznie przybierać konsystencję żelu, natychmiast zatop w nim wyizolowane tkanki, a następnie przenieś zatopione tkanki do inkubatora na 30 minut w celu utwardzenia. Po utwardzeniu pokryj żel 3,5 mililitrami pożywki BEC i kontynuuj inkubację. Wymieniaj pożywkę BEC trzy razy w tygodniu. W ciągu trzech tygodni utworzą się arkusze komórek z dużymi jądrami, rozrastające się z zatopionych przewodów.Są to cholangiocyty. Jeśli w naczyniu znajduje się znaczna populacja fibroblastów, których nie można wyciąć, naczynie należy odrzucić. Teraz należy przygotować cienkie żele kolagenowe, używając 1 mg kolagenu na 1 ml PBS; nanieść 1 ml na płytkę 100 mm, równomiernie rozprowadzić kolagen i odczekać 10 minut.Po 10 minutach pokryj płytkę siedmioma mililitrami DM EMF 12 i inkubuj przez 10 minut. Po krótkiej inkubacji szybko przemyj kolagen raz za pomocą XPBS. Usuń cały PBS poprzez aspirację, a następnie dodaj drugą warstwę kolagenu w taki sam sposób, w jaki przygotowano pierwszą warstwę.Po zestaleniu pokryj płytkę roztworem DMF 12 i inkubuj przez 30 minut. Następnie oddziel komórki od grubych żeli. Najpierw, używając szpatułki lub skrobaka, delikatnie odspaj kolagen od płytki, tak aby swobodnie pływał.Następnie przygotuj przefiltrowany roztwór kolagenazy i dodaj 1 ml do każdej płytki 60 mm zawierającej gęsty kolagen. Następnie przenieś płytki do inkubatora. Po 30 minutach inkubacji usuń cały roztwór zawierający komórki i przenieś go do probówki 15 ml.Odwirować probówkę i usunąć supernatant poprzez aspirację. Resuspender osad w 4,5 milliliters medium DM F 12 i ponownie odwirować. Resuspender osad w trzech milliliters 0,5% Trypsyny i inkubować komórki w temperaturze 37 °C przez pięć minut, podczas których płaty komórek ulegną rozluźnieniu.Po pięciu minutach przepuść agregaty przez pipetę o pojemności 5 lub 10 ml, aż zostaną rozbite. Następnie dodaj 5 ml pożywki BEC i odwiruj komórki. Ponownie resuspenduj próbkę po raz trzeci.Resuspender osad w medium DMM F 12 w ramach etapu płukania, a następnie ponownie odwirować komórki. Teraz resuspender komórki w medium BEC i wysiać je na przygotowaną cienką warstwę. Żele kolagenowe umożliwiają wzrost komórek; w razie potrzeby przeprowadzić pasaż komórek na żele kolagenowe.Stosując opisany protokół, wyizolowano populację pozawątrobowych cholangiocytów mysich z okresu noworodkowego o wysokim stopniu czystości, a następnie poddano je barwieniu immunofluorescencyjnemu na K 19. Po obejrzeniu tego filmu powinni Państwo posiadać rzetelną wiedzę na temat izolacji czystej populacji pozawątrobowych cholangiocytów mysich z okresu noworodkowego poprzez połączenie precyzyjnej dyssekcji przewodów oraz hodowli na grubych żelach kolagenowych.

isolation-of-neonatal-extrahepatic-cholangiocytes

Research

JoVE Journal

Biology

Biologia

Izolacja komórek dróg żółciowych poza wątrobowo-neonatologicznych

Opisujemy tutaj izolację wykazujących ekspresję CD133 komórek macierzystych wątroby oraz nowotworowych komórek macierzystych z całej wątroby mysiej, co jest procesem wymagającym trawienia tkanki, wzbogacania frakcji komórkowej oraz izolacji metodą cytometrii przepływowej. Przedstawiamy metody zaawansowanej izolacji pojedynczych komórek oraz ekspansji klonalnej.

Izolacja komórek macierzystych wątroby CD133+ do ekspansji klonalnej

Opisano technikę izolowania ludzkich hepatocytów i niemiąższowych komórek wątroby od tego samego dawcy. Różne typy komórek wątroby stanowią podstawę funkcjonalnych modeli wątroby i inżynierii tkankowej. Ta nowa metoda ma na celu wyizolowanie komórek wątroby w celu uzyskania wysokiej wydajności i żywotności.

Protokół izolacji pierwotnych ludzkich hepatocytów i odpowiadających im głównych populacji niemiąższowych komórek wątroby

Opisujemy tutaj protokół izolowania nienaruszonych wysepek od nowonarodzonych myszy. Trzustkę częściowo trawiono kolagenazą, a następnie myto i zbierano ręcznie. Od nowo narodzonych myszy można uzyskać od 20 do 80 klastrów wysp trzustkowych na trzustkę, które nadają się do kilku badań na wyspach trzustkowych.

Skuteczna izolacja funkcjonalnych wysp trzustkowych z trzustki noworodka myszy

Urazom wątroby towarzyszy ekspansja komórek progenitorowych, które reprezentują niejednorodną populację komórek. Nowatorska klasyfikacja tego przedziału komórkowego pozwala na rozróżnienie wielu podzbiorów. Opisana tutaj metoda ilustruje analizę cytometrii przepływowej i izolację różnych podzbiorów o wysokiej czystości, które można wykorzystać do dalszych testów.

Izolacja i wzbogacenie podzbiorów progenitorów wątroby zidentyfikowanych za pomocą nowej kombinacji markerów powierzchniowych

Ten protokół opisuje produkcję mysiego pozawątrobowego przewodu żółciowego 3-wymiarowego systemu organoidowego. Te organoidy żółciowe można utrzymywać w kulturze w celu badania biologii cholangiocytów. Organoidy żółciowe wyrażają markery zarówno komórek progenitorowych, jak i żółciowych i składają się ze spolaryzowanych komórek nabłonka.

Wytwarzanie organoidów z pozawątrobowych dróg żółciowych myszy

Prezentowany tutaj jest protokół izolacji hepatocytów myszy z wątroby dorosłych myszy przy użyciu zmodyfikowanej techniki perfuzji kolagenazy. Opisano również długoterminową hodowlę hepatocytów w warstwie kolagenowej 3D, a także znakowanie immunologiczne składników cytoszkieletu w celu zbadania tworzenia kanałów żółciowych i ich odpowiedzi na leczenie.

Izolacja i hodowla kanapkowa kolagenu 3D pierwotnych hepatocytów myszy w celu zbadania roli cytoszkieletu w tworzeniu kanałów żółciowych in vitro

Ten protokół szczegółowo opisuje użycie specjalnego cewnika dożylnego, standaryzowanego sterylnego jednorazowego wężyka, kontroli temperatury uzupełnionej monitorowaniem w czasie rzeczywistym, oraz systemu alarmowego dla dwuetapowej procedury perfuzji kolagenazy w celu poprawy spójności żywotności, wydajności i funkcjonalności izolowanych pierwotnych hepatocytów szczurów.

Izolacja pierwotnych hepatocytów szczura z wieloparametrową kontrolą perfuzji

Tutaj przedstawiamy i demonstrujemy protokół izolacji pierwotnych komórek śródbłonka sinusoidalnego wątroby myszy (LSEC). Protokół opiera się na perfuzji kolagenazy wątrobowej, oczyszczaniu komórek niemiąższowych przez wirowanie z niską prędkością oraz selekcji kulek magnetycznych CD146. Zajmujemy się również fenotypowaniem i charakteryzacją tych izolowanych LSEC za pomocą cytometrii przepływowej i skaningowej mikroskopii elektronowej.

Izolacja i charakterystyka pierwotnych sinusoidalnych komórek śródbłonka wątroby myszy

Do obserwacji zaburzeń dróg żółciowych u noworodków u myszy, niezbędny jest nienaruszony przewód żółciowy i skuteczne przygotowanie. W związku z tym z powodzeniem opracowano nowe podejście do izolowania całego pozawątrobowego układu dróg żółciowych u mysich noworodków przy zachowaniu integralności przewodu żółciowego.

Rozwarstwienie pozawątrobowego przewodu żółciowego i pęcherzyka żółciowego u dziewięciodniowych noworodków myszy

Hepatocyty bogate w lipidy są nieodłącznym elementem regeneracji wątroby, ale zazwyczaj są tracone po odwirowaniu w gradiance gęstości. W tym miejscu przedstawiamy zoptymalizowany protokół izolacji komórek, który zachowuje stłuszczeniowe hepatocyty, uzyskując reprezentatywne populacje regenerujących się hepatocytów po częściowej hepatektomii u myszy.

Izolacja regenerujących się hepatocytów po częściowej hepatektomii u myszy

Naucz się izolować cholangiocyty zewnątrzwątrobowe myszy noworodków przy użyciu precyzyjnej techniki preparacyjnej i hodowli na grubych żelach kolagenowych. Ta metoda umożliwia uzyskanie czystych populacji komórek do badań nad rozwojem i patologią dróg żółciowych.

Izolacja cholangiocytów zewnątrzwątrobowych noworodków

Przeglądaj więcej filmów