Name: Transfer protonów i dynamika konformacji białek w białkach światłoczułych za pomocą spektroskopii w podczerwieni z transformacją Fouriera ze skanowaniem czasowym i transformacją Fouriera (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-06-27T14:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 3 s
Description: Poznaj dynamikę transferu protonów i zmian konformacyjnych w białkach światłoczułych przy użyciu spektroskopii FTIR ze skanowaniem czasowym. Ta metoda umożliwia obserwację szybkich procesów białkowych w skali mikro- i milisekundowej.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Ta praca była wspierana przez granty z Deutsche Forschungsgemeinschaft dla J.H. (FOR-1279, SFB-1078, B3). Dziękujemy Tomowi Reslerowi i Björk Süss za pomocne komentarze.

1. Ogólne aspekty przygotowania próbek i instrumentów
<ol>
	<li>Użyj komercyjnego spektrometru FT-IR wyposażonego w pomiary krokowe z rozdzielczością czasową. Aby uzyskać najlepsze wyniki, umieść spektrometr FT-IR na stole z odsprzęgnięciem drgań.</li>
	<li>Opróżnij komorę optyki do kilku mbar. Przedmuchnąć komorę próbki suchym powietrzem lub azotem.</li>
	<li>Umieść przezroczysty materiał IR nieprzezroczysty dla promieniowania widzialnego przed detektorem MCT spektrometru FT-IR. Ten środek ostrożności jest niezbędny, aby zapobiec artefaktom pochodzącym z wzbudzającego impulsu laserowego podczas eksperymentów ze skanowaniem krokowym. Uwaga: Używamy okna germanowego (Ge) o średnicy 25 mm. Jego wysoki współczynnik załamania światła powoduje niepożądane straty intensywności, których w dużej mierze uniknięto stosując filtr Ge z powłoką antyrefleksyjną.</li>
	<li>Schłodzić detektor MCT dewara ciekłym azotem. Uwaga: Stosowanie fotowoltaicznych detektorów MCT jest preferowane w stosunku do fotoprzewodzących ze względu na ich liniową odpowiedź, a tym samym lepszą dokładność fotometryczną i niezawodność bazową31,53.</li>
	<li>Próbkę użytą do eksperymentów należy wstępnie zagęścić do co najmniej 2 mg białka/ml w buforze o niskiej (<20 mM) sile jonowej, aby zapobiec tworzeniu się kryształów soli podczas suszenia zawiesiny białkowej w celu utworzenia jednorodnego filmu białkowego. W przypadku próbek, które osadzają się, należy je przemyć/zagęścić, stosując ultrawirowanie (np. białka błonowe w liposomach lub w łatach błony komórkowej). Używaj centrikonów o odpowiednim odcięciu dla białek, które nie osadzają się (np. białka błonowe rozpuszczone w detergentach).</li>
	<li>W celu uzyskania optymalnych rezultatów należy stosować: a) preparaty białkowe tak czyste i aktywne, jak to tylko możliwe; b) stosunek lipidów do białek ≤ 3 w masie dla białek w płatach błony komórkowej lub odtworzonych w liposomach; c) Stosunek detergentu do białka ≤ 1 w masie dla białek rozpuszczalnych w detergentach. Unikaj stosowania detergentów lub lipidów, których pasma drgań pokrywają się z pasmami białka (np. CHAPS).</li>
</ol>
2. Przygotowanie eksperymentów z całkowitym odbiciem przy użyciu bakteriorodopsyny
<ol>
	<li>Zamontuj akcesorium ATR w komorze na próbkę spektrometru FT-IR. Uwaga: Używamy ZnSe/diamentowego ATR z 5 aktywnymi odbiciami. Unikaj materiałów półprzewodnikowych, takich jak german lub krzem, jako wewnętrznego elementu odbijającego (IRE) akcesorium ATR, ponieważ na ich właściwości optyczne wpływa wzbudzający laser widzialny.</li>
	<li>Zmierz szerokie spektrum energii (ok. 4 000-800 cm-1) o rozdzielczości 4 cm-1 czystej powierzchni IRE za pomocą konwencjonalnej szybkiej spektroskopii FT-IR. Użyj tego widma jako widma odniesienia do obliczenia widm absorpcyjnych na późniejszym etapie.</li>
	<li>Pokryć powierzchnię IRE ATR 20 μl buforu użytego później do ponownego uwodnienia próbki (np. 4 M NaCl i 100 mM NaPi przy pH 7,4). Zmierz absorpcję podczerwieni przez bufor.</li>
	<li>Usuń bufor i spłucz powierzchnię IRE wodą. Unikaj dotykania powierzchni. Usuń resztki cieczy z powierzchni IRE za pomocą intensywnego przepływu powietrza.</li>
	<li>Rozprowadź ~3 μl bakteriorodopsyny (bR) w fioletowych błonach (~6 mg białka/ml w wodzie dejonizowanej) na powierzchni IRE (obszar ~0,2 cm2). Wysuszyć zawiesinę białkową pod delikatnym strumieniem suchego powietrza, aż do uzyskania filmu.</li>
	<li>Zmierzyć widmo absorpcyjne suchej warstwy (patrz rysunek 1).</li>
	<li>Delikatnie dodaj 20-40 μl buforu o wysokiej sile jonowej, aby ponownie nawodnić suchą warstwę (np. 4 M NaCl i 100 mM NaPi przy pH 7,4). Uwaga: Wysoka siła jonowa zapobiega nadmiernemu pęcznieniu błony membranowej, co pozwala na zatrzymanie jak największej ilości białka blisko badanej powierzchni (ryc. 2).</li>
	<li>Przykryj uchwyt ATR pokrywką, aby zapobiec parowaniu wody. Opcjonalnie należy umieścić osłonę podłączoną do kąpieli cyrkulacyjnej ustawionej na 25 °C w celu kontroli temperatury. W przypadku białek o długich cyklach fotocyklicznych (>sekund) kontrola temperatury może zwiększyć stabilność linii podstawowej.</li>
	<li>Zmierzyć widmo absorbancji. Oszacuj procent próbki pozostałej w pobliżu powierzchni po ponownym uwodnieniu filmu, odejmując widmo absorpcyjne buforu (rysunek 3).</li>
	<li>Potwierdź stabilizację pęcznienia filmu, rejestrując widma absorpcyjne w odstępach 5-20 minut po ponownym nawodnieniu (ryc. 4). Ten krok jest opcjonalny, ale zalecany.</li>
</ol>
3. Przeprowadzanie eksperymentów transmisyjnych na rodopsynie kanałowej solubionej w detergentach-2
<ol>
	<li>Dodać 10 μl ChR2 (~10 mg białka/ml) rozpuszczonego w 5 mM NaCl, 5 mM HEPES (pH 7,4) i decylomaltozydzie (DM) w środku okienka BaF2 o średnicy 20 mm. Rozprowadzić go za pomocą końcówki mikropipety do średnicy 6-8 mm (gęstość powierzchni białka ~ 200 μg/cm2).</li>
	<li>Uformuj film za pomocą delikatnego przepływu suchego powietrza. Aby uzyskać najlepsze wyniki, upewnij się, że folia jest jednorodna i ma średnicę mniej więcej odpowiadającą rozmiarowi wiązki podczerwieni przy największej aperturze.</li>
	<li>Uwodnić folię, dodając 3-5 μl mieszaniny glicerolu/wody rozprowadzonej w 3-5 kroplach wokół suchej folii i szczelnie zamknąć ją drugim okienkiem za pomocą płaskiego silikonowego O-ringu o grubości ≥1 mm. Uwaga: Stosunek mieszaniny glicerolu i wody kontroluje wilgotność względną między oknami54. W przypadku próbek higroskopijnych należy zastosować stosunek 3/7 lub 2/8 glicerolu do wody (w/w). Krople glicerolu/wody nigdy nie powinny mieć bezpośredniego kontaktu z filmem białkowym.</li>
	<li>Włóż okna warstwowe BaF2 do uchwytu. Zapobiegaj przedostawaniu się światła prostego do detektora, zakrywając okienko próbki nieprzezroczystym materiałem w podczerwieni, takim jak papier, z otworem dopasowanym do rozmiaru uwodnionej folii. Umieścić uchwyt w komorze na próbki.</li>
	<li>Regulować temperaturę uchwytu do 25 °C za pomocą płaszcza termostatycznego podłączonego do łaźni cyrkulacyjnej o kontrolowanej temperaturze.</li>
	<li>Zmierz widmo absorpcyjne. Upewnij się, że maksymalna absorpcja w obszarze amidu I (~1,700-1,620 cm-1) mieści się w zakresie 0,6-1,0.</li>
	<li>Oszacuj masę i stosunek molowy białka/detergentu/wody z widma absorpcji uwodnionego filmu (Rysunek 5) przy użyciu referencyjnych widm współczynnika ekstynkcji dla wody, DM i reprezentatywnych białek błonowych (Rysunek 6).</li>
	<li>Poczekaj, aż poziom nawodnienia ustabilizuje się przed wykonaniem eksperymentów skanowania krokowego (≥1 godzina).</li>
</ol>
4. Regulacja i synchronizacja ekscytującego lasera
Do eksperymentów na bR użyj drugiej harmonicznej emisji impulsowego lasera Nd:YAG (λ = 532 nm), aby uruchomić fotocykl. W przypadku eksperymentów z udziałem ChR2 należy użyć wzbudzenia λ = 450 nm, jak zapewnia optyczny oscylator parametryczny (OPO) napędzany trzecią harmoniczną (λ = 355 nm) lasera Nd:YAG. Upewnij się, że impuls laserowy jest wystarczająco krótki (~10 nsec), aby zminimalizować wtórne wzbudzenie foto. Uwaga: Energia impulsów laserowych powinna być jak najbardziej stała. W naszej konfiguracji intensywność lasera waha się o ≤10% wokół wartości średniej, co potwierdza pomiar odbicia lasera za pomocą fotodiody podłączonej do rejestratora stanów nieustalonych i całkującej odpowiedź (ilustracja 8).
<ol>
	<li>Sprzęgnij laser z próbką. Dostosuj gęstość energii lasera na próbce do 2-3 mJ/cm2 na impuls za pomocą miernika mocy.
	<ol>
		<li>Do konfiguracji ATR użyj światłowodu umieszczonego na górze pokrywy ATR.</li>
		<li>W przypadku eksperymentów transmisyjnych należy użyć luster, aby sprowadzić laser do próbki i, jeśli to konieczne, soczewek do kolimacji lub dywersacji wiązki laserowej do średnicy nieco większej niż rozmiar warstwy próbki.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Zsynchronizuj impuls laserowy z rejestracją danych przez spektrometr. Użyj impulsu TTL synchronizacji Q-switch elektroniki lasera Nd:YAG, aby wyzwolić spektrometr. Ustaw szybkość wzbudzenia lasera Nd:YAG odpowiednio na 10 Hz dla bR i 0.25 Hz dla ChR2.</li>
	<li>Użyj generatora opóźnienia impulsów (PDG), aby kontrolować szybkość wzbudzenia lasera, jeśli częstotliwość powtarzania lasera Nd:YAG nie jest łatwa do regulacji.
	<ol>
		<li>Podłącz lampę synchronizacyjną lasera Nd:YAG do wejścia zewnętrznego wyzwalacza PDG. PDG zapewnia opóźniony impuls wyjściowy TTL o ~190 μs do wejścia synchronizacji przełącznika Q lasera Nd:YAG w celu wyzwolenia lasera. Bramkuje PDG, aby akceptować wyzwalacz zewnętrzny dopiero po upływie określonego czasu od ostatniego zaakceptowanego wyzwalacza (100 ms dla bR lub 4 s dla ChR2).</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
5. Przygotowania i ustawienia skanowania krokowego z rozdzielczością czasową
<ol>
	<li>Umieść dolnoprzepustowy filtr optyczny w ścieżce optycznej. Aby wykonać pomiary krokowe z rozdzielczością w czasie w zakresie spektralnym 1,800-850 cm-1, należy użyć filtra nieprzezroczystego powyżej 1,950 cm-1 i z dobrą transmisją (>50-80%) poniżej 1,800 cm-1 (rysunek 7).</li>
	<li>Zmień detektor z trybu sprzężonego AC na DC. Uwaga: Po tej regulacji sygnał interferogramu nie będzie już oscylował wokół zera, ale wokół wartości znanej jako poziom DC.</li>
	<li>Użyj największej możliwej apertury wiązki spektrometru, aby uzyskać wyższy strumień fotonów, a tym samym lepszy stosunek sygnału do szumu, ale w granicach liniowości detektora.</li>
	<li>Zmniejsz poziom prądu stałego interferogramu do zera i ponownie wyreguluj wzmocnienie elektroniczne, aby lepiej wykorzystać zakres dynamiki analogowego przetwornika cyfrowego (ADC). Osiągnij przesunięcie poziomu DC, stosując polaryzację napięcia do sygnału dostarczanego przez przedwzmacniacz. Uwaga: Ta opcja jest dostępna w nowoczesnych spektrometrach FT-IR. W przeciwnym razie można zamiast tego użyć domowego urządzenia zewnętrznego, umieszczonego między przedwzmacniaczem a ADC 38. Należy wtedy zadbać o to, aby elektronika takiego urządzenia była szybka i liniowa.</li>
	<li>Uruchom menu skanowania krokowego spektrometru FT-IR. Ustaw docelowe pasmo spektralne dla pomiaru step-scan na 1,975.3-0 cm-1. Dostosuj szerokość pasma spektralnego do ułamka liczby falowej lasera He-Ne (1/8th w tym przypadku), nieznacznie przekraczając granicę odcięcia filtra optycznego.</li>
	<li>Wyłącz wszelkie górnoprzepustowe filtry elektroniczne, aby zapobiec zniekształceniom kinetyki w późniejszym czasie. Dolnoprzepustowy filtr elektroniczny może być korzystny, gdy jego częstotliwość odcięcia jest w kolejności lub powyżej częstotliwości próbkowania przetwornika ADC (zmniejsza aliasing szumów).</li>
	<li>Ustaw rozdzielczość spektralną i fazową odpowiednio na 8 cm-1 i 64 cm-1. Ustaw tryb akwizycji interferogramu na jednostronny do przodu. Przy tych opcjach jeden interferogram wymaga około 500 punktów.</li>
	<li>Ustaw częstotliwość próbkowania przetwornika ADC na najwyższą dostępną w spektrometrze (np. 160 kHz lub 6,25 μs). Ustaw "spust eksperymentu" na "Zewnętrzny", tj. laser jest mistrzem. Ustaw liczbę punktów danych rozmieszczonych liniowo, które mają być rejestrowane: 7 000 dla bR (do 42 ms) i 20 000 dla ChR2 (do 125 ms). Uwaga: Dłuższe skale czasowe mogą być pokryte bez przepełniania pamięci ADC za pomocą quasi-logarytmicznie rozmieszczonych w czasie zewnętrznych impulsów TTL z generatora fal w celu wyzwolenia akwizycji danych 38 lub przy użyciu dwóch równoległych rejestratorów stanów przejściowych jako substytutów wewnętrznego ADC31,32.</li>
	<li>Zapisz około 100 punktów przed wyzwoleniem jako odniesienie dla ciemnego stanu próbki. Uwaga: W milisekundowej skali czasowej jakość danych jest często ograniczona przez wahania w mobilnym lustrze. W związku z tym nie oczekuje się, że zwiększenie punktów przed wyzwoleniem powyżej 100 znacząco poprawi jakość danych.</li>
	<li>Ustaw liczbę koaddycji, tj. liczbę średnich wyników fotoreakcji na pozycję lustra. W przypadku bR należy użyć 20 koaddycji (20 minut czasu pomiaru przy współczynniku wzbudzenia 10 Hz). Dla ChR2 użyj 2 koaddycji (70 min czasu pomiaru przy szybkości wzbudzenia 0,25 Hz)</li>
	<li>Powtórz eksperyment 10 razy dla bR i 35 razy na trzech różnych foliach próbek dla ChR2, aby ostatecznie uzyskać ~200 koaddycji na pozycję lustra.</li>
</ol>
6. Przetwarzanie danych
<ol>
	<li>Potwierdź stan próbki, porównując widmo różnicowe podczerwieni wywołane światłem uzyskane z pierwszego i ostatniego pomiaru. Rozważ odrzucenie wszelkich pomiarów, w których intensywność widma różnicowego spadnie poniżej 60% pierwszego pomiaru.</li>
	<li>Uśrednić zarejestrowane interferogramy.
	<ol>
		<li>Za pomocą oprogramowania OPUS ze spektrometru FTIR wybierz interferogramy czasowo-rozdzielcze do uśrednienia i dodaj je do "Kalkulatora widma".</li>
		<li>Kliknij "=", aby uzyskać średnią z interferogramów. 
		Uwaga: Gdy faza interferogramu jest stała podczas pomiaru, jest ona obojętna dla średnich interferogramów lub widm jednokanałowych. Fazę stałą można potwierdzić poprzez obliczenie i porównanie widma fazowego dla pierwszego i ostatniego zarejestrowanego interferogramu.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Wykonać transformację Fouriera uśrednionych interferogramów czasowo-rozdzielczych, aby uzyskać uśrednione czasowo rozdzielcze widma jednokanałowe.
	<ol>
		<li>Korzystając z tego samego oprogramowania, co w kroku 6.2.1, wybierz uśredniony interferogram czasowo-rozdzielczy i kliknij ikonę "interferogram do widm". Użyj metody korekcji fazy Mertza, zerowego współczynnika wypełnienia wynoszącego 2 (dwa punkty cyfrowe na rozdzielczość instrumentalną) i funkcji apodyzacji (np. trójkąt, 3-wyrazy Blackmanna-Harrisa itp.).</li>
		<li>Kliknij dolny przycisk "konwertuj", aby przekształcić interferogram czasowo-rozdzielczy w widma czasowo-rozdzielcze.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Eksportuj dane jednokanałowe z rozdzielczością czasową jako "tabelę punktów danych" lub plik "matlab" za pomocą ikony "zapisz jako" w oprogramowaniu OPUS. Kontynuuj przetwarzanie danych w zewnętrznym programie.
	<ol>
		<li>Uśrednij widma jednokanałowe przed laserem i przekształć dane jednokanałowe rozdzielcze w czasie na widma różnic absorpcji w czasie.</li>
		<li>Oblicz wektor oczekiwanego odchylenia standardowego szumu w widmach różnicowych w funkcji liczby falowej (rysunek 12), używając odchylenia standardowego szumu, ε i średniej, S0(ν), ze 100 widm jednokanałowych poprzedzających laser: ε / S0(ν). Wartość ε jest szacowana poprzez odjęcie kolejnych widm jednokanałowych i obliczenie odchylenia standardowego skorygowanego o √2.</li>
		<li>Usuń obszary widmowe zbyt hałaśliwe, aby były użyteczne (np. powyżej 1,825 cm-1 i poniżej 850 cm-1).</li>
		<li>Przeprowadzić uśrednianie quasi-logarytmiczne (np. 20 widm/dekadę czasu). Wygląd danych ulegnie poprawie, a liczba widm zostanie zmniejszona z ~104 do ~102 bez utraty jakichkolwiek istotnych informacji (Rysunek 9).</li>
		<li>Zwiększ czterokrotnie gęstość widmową punktów (do 1 punktu/cm-1) za pomocą interpolacji Fouriera (po wypełnieniu zerem). 
		Uwaga: Wykonujemy kroki od 6.4.1 do 6.4.4 w domowym programie działającym w MATLAB.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Przetwarzaj uzyskane widma czasowo-rozdzielcze (rysunek 10A) z dekompozycją wartości osobliwych, SVD, (rysunek 13). Odszumianie danych odbywa się poprzez rekonstrukcję danych przy użyciu ograniczonej liczby istotnych składników SVD (Rysunek 10B). Uwaga: SVD wykonujemy w MATLAB, korzystając z wbudowanej funkcji "svd".</li>
</ol>

Autorzy deklarują brak konkurencyjnych interesów finansowych.

Jednym z pierwszych aspektów, który należy wziąć pod uwagę podczas wykonywania czasowo-rozdzielczych eksperymentów FT-IR na białku jest przygotowanie próbki w odpowiedniej formie do spektroskopii w podczerwieni. Absorpcja podczerwieni przez substancje inne niż białko będące przedmiotem zainteresowania musi zostać zmniejszona, zwłaszcza przez wodę. Najczęstszym podejściem jest odparowanie wody w próbce w celu utworzenia filmu. Folię można ponownie nawodnić, dodając kilka kropel roztworu wodnego lub wystawiając folię na działanie atmosfery o kontrolowanej wilgotności. Pokazaliśmy, jak w obu przypadkach możliwe jest oszacowanie poziomu hydratacji uzyskanego za pomocą spektroskopii absorpcyjnej w podczerwieni (patrz rysunek 3 i rysunek 5). Chociaż uzyskane poziomy nawodnienia mogą wydawać się niskie w porównaniu z tymi w roztworze, w rzeczywistości są one zbliżone do tych znajdujących się w żywych komórkach70, co sprawia, że badanie uwodnionych warstw białek jest funkcjonalnie istotne. Oprócz wody ważne jest również, aby znać i kontrolować ilość lipidów lub detergentów w próbce. Oba powinny być utrzymywane na tyle niskim, aby mieć zmniejszony wpływ spektroskopowy na absorpcję podczerwieni, ale wystarczająco wysokim, aby zachować integralność i funkcjonalność białka będącego przedmiotem zainteresowania.
Czasowo-rozdzielcza spektroskopia skanowania krokowego ma bezpośrednie zastosowanie tylko do białek wykazujących odwracalne reakcje, które mogą być wywołane w sposób powtarzalny przez światło (ale zobacz postęp w sprzężeniu skanowania krokowego z szybką wymianą)71. W skanowaniu krokowym reakcja musi być powtarzalna przez co najmniej ~500x, co jest minimalną liczbą, aby ukończyć interferogram obejmujący obszar 1,800-850 cm-1 z rozdzielczością 8 cm-1 . W praktyce jednak zazwyczaj wymagane jest dodatkowe uśrednianie danych, aby obniżyć poziom hałasu. Dla 200 koaddycji/pozycji lustra (10,5 powtórzeń reakcji) widmo różnicy absorbancji o rozdzielczości 6,25 μs może wyświetlać odchylenie standardowe szumu między 2 x 10-5 i 2 x 10-4 dla ATR oraz między 5 x 10-6 a 3 x 10-5 dla eksperymentu transmisyjnego (rysunek 15). Dzięki wyższej przepustowości fotonów, transmisja pozwala na ~7 niższy poziom szumów niż ATR, co jest kluczowym aspektem dla pomyślnego badania próbek dających słabe zmiany absorpcyjne, takie jak ChR2. Z drugiej strony, ATR wymaga od 5 do 25 razy mniej próbki niż eksperyment transmisyjny.
Zastosowanie spektroskopii FT-IR z funkcją skanowania krokowego w czasie jest problematyczne w przypadku białek wykazujących powolne cykle fotocyklowe: rejestracja interferogramu za pomocą skanowania krokowego może stać się niepraktyczna przez długi czas. Przedstawiono pewne rozwiązania postępowania w takich przypadkach72,73, często oparte na użyciu wielu wymiennych próbek w celu przyspieszenia pomiarów kosztem zwiększonego zużycia białka i złożoności eksperymentalnej27,74. W niektórych przypadkach możliwe jest obejście tego problemu poprzez wzbudzenie próbki przed ścisłym zakończeniem fotocyklu. W przypadku ChR2, przy fotocyklu wymagającym po fotowzbudzeniu 60 sekund do 99% odzysku, odzysk po 4 sekundach wynosi już 80%48. Przy wydajności wzbudzenia wynoszącej 10% na impuls laserowy, 98% cząsteczek ChR2 znajduje się w stanie ciemnym 4 sekundy po fotowzbudzeniu, co umożliwia przeprowadzanie eksperymentów z częstotliwością powtarzania lasera do 0,25 Hz.
Przetwarzanie danych jest ostatnim aspektem technicznym wymaganym do osiągnięcia najlepszych możliwych wyników. Uśrednianie logarytmiczne zmniejsza szum i, co równie ważne, zmniejsza rozmiar danych bez zniekształceń, co jest cechą niezbędną do późniejszej analizy danych przy użyciu dekompozycji wartości pojedynczych lub dopasowania globalnego. Uśrednianie logarytmiczne nie jest jednak zbyt skuteczne w uśrednianiu fluktuacji śladów czasowych spowodowanych oscylacjami w ruchomym zwierciadle i innymi źródłami szumu 1/f podczas pomiarów (rysunek 9). Te wahania linii bazowej mogą przekroczyć szum w zakresie milisekund i pogorszyć jakość danych. Dekompozycja wartości osobliwych wykorzystuje nadmiarowość danych w celu zmniejszenia szumu, a przy pewnych modyfikacjach57 może również zredukować wahania linii bazowej.
Wreszcie, trudniejsza i najbardziej czasochłonna część eksperymentu FT-IR ze skanowaniem krokowym odpowiada przypisaniu pasm oraz spektralnej i kinetycznej interpretacji danych. W przypadku bakteriorodopsyny wiele pasm pojawiających się w widmach różnicowych IR zostało przypisanych lub zinterpretowanych dzięki skumulowanej pracy wielu grup badawczych na przestrzeni dziesięcioleci. W przypadku znacznie mniej zbadanego białka, takiego jak rodopsyna kanałowa-2, przedstawionym powyżej eksperymentom w podczerwieni z rozdzielczością czasową muszą towarzyszyć równoległe eksperymenty na mutantach skierowanych na miejsce i połączone z informacjami z technik komplementarnych, aby osiągnąć interpretację mechanistyczną48.

Aby w pełni wyjaśnić, jak białka pełnią swoją funkcję, konieczne jest mierzenie ich w trakcie pracy, tj. wzdłuż ścieżki reakcji, która często obejmuje szereg produktów pośrednich i rozciąga się na kilka rzędów czasu. Kluczowe etapy funkcjonowania białek często zachodzą w zakresie od mikrosekund do milisekund1, w szczególności zmiany konformacyjne szkieletu i reakcje transferu protonów w białkach błonowych. Krystalografia rentgenowska, prawdopodobnie filar biologii strukturalnej, zapewnia statyczne (uśrednione w czasie) gęstości elektronów z dobrze dyfrakcyjnych kryształów białek, notorycznie trudnych do wyhodowania w przypadku białek błonowych2. Model atomowy 3D można zbudować na podstawie gęstości elektronów, choć rzadko uwzględnia lokalizację atomów wodoru. Niezwykły postęp w czasowo-rozdzielczej krystalografii rentgenowskiej, opierający się na dyfrakcji Laue'a3 lub femtosekundowych impulsach rentgenowskich4, dodaje wymiar czasowy do wysokiej informacji strukturalnej nieodłącznie związanej z krystalografią rentgenowską5. Pomijając jednak wyzwania techniczne i analityczne, sieć krystaliczna może zaburzać zmiany konformacyjne w szkielecie i zmieniać dynamikę białek, co jest nieuniknioną wadą metod opartych nakryształach białek5. W związku z tym dynamiczne aspekty białek są nadal najlepiej ujęte za pomocą metod optycznych, takich jak fotoliza błyskawiczna6,7, chociaż z ogólną wadą w postaci ograniczonego wglądu w strukturę.
Spektroskopia w podczerwieni z transformacją Fouriera (FT-IR) łączy rozdzielczość czasową spektroskopii optycznej z cenną wrażliwością na strukturę białka, ostatnią cechę wykorzystywaną w niezliczonych statycznych badaniach strukturalnych i funkcjonalnych białek błonowych8-11. W szczególności spektroskopia różnicowa FT-IR okazała się idealnym narzędziem do badania niewielkich zmian spektralnych, gdy białko przechodzi z jednego stanu metastabilnego do drugiego12-19.
Badania nad dynamiką białek, inne niż na poziomie pojedynczej cząsteczki20,21, wymagają procesu wyzwalającego do synchronizacji. Reakcja jest dogodnie inicjowana szybko i nieinwazyjnie, przy użyciu światła jako wyzwalacza, jak to ma miejsce w badaniu białek z cyklicznymi fotoreakcjami. Dużym wyzwaniem związanym z badaniami czasowo-rozdzielczymi jest osiągnięcie wystarczającej rozdzielczości czasowej przy zachowaniu dobrej rozdzielczości spektralnej i odpowiedniego stosunku sygnału do szumu. Istotne jest również pokrycie odpowiednio szerokiego zakresu spektralnego i czasowego. Spektroskopia FT-IR ze skanowaniem krokowym w czasie przoduje we wszystkich tych aspektach22, z opublikowanymi przykładami obejmującymi zakresy spektralne tak szerokie, jak 3,900-850 cm-1 i dynamikę rozciągającą się ~9 rzędów czasu, z rozdzielczością spektralną do 3,5 cm-1 i rozdzielczością czasową30 nsec 23-28.
Spektrometry IR z transformacją Fouriera wykazują zredukowany szum i lepszą dokładność fotometryczną w porównaniu z spektrometrami dyspersyjnymi29. Jednak w normalnym trybie zapisu szybkiego skanowania spektrometry FT-IR mają rozdzielczość czasową ograniczoną do ≥5-10 ms, co wynika z minimalnego czasu wymaganego przez ruchome lustro interferometru do zakończenia skanowania. Z kolei w technice skanowania krokowego zależność czasowa zdarzenia dynamicznego jest oddzielona od czasu trwania skanowania interferometru. Krótko mówiąc, mobilne lustro porusza się w dyskretnych krokach, a nie w sposób ciągły skanowania w celu zakończenia skanowania. Na każdym z tych etapów (ruchome) lustro jest utrzymywane nieruchomo i rejestrowany jest stan nieustalony. W związku z tym rozdzielczość czasowa jest ograniczona czasem narastania detektora rtęciowo-kadmowo-tellurkowego (MCT), który zwykle mieści się w zakresie 10-100 nsec. W praktyce duży zakres dynamiki interferogramu (zawierający intensywny sygnał w rozbłysku centralnym i małe sygnały w skrzydłach), wymaga do prawidłowej digitalizacji przetwornika analogowo-cyfrowego (ADC) o aż 16-24 bitach, co prowadzi do częstotliwości próbkowania nie wyższych niż ~200 kHz (5 μs)30. Nanosekundową rozdzielczość czasową można osiągnąć, mierząc tylko zmiany w interferogramie, dla których wystarczy 8-12 bitowy przetwornik ADC23,31-33. Aspekty techniczne30,34,35 oraz zastosowania36-38 skanowania krokowego z rozdzielczością czasową zostały szczegółowo omówione w innym miejscu.
Celem obecnego wkładu jest dostarczenie protokołu opisującego praktyczne aspekty czasowo-rozdzielczej spektroskopii FT-IR metodą skanowania krokowego na światłoczułych białkach błonowych. W tym miejscu przedstawiono wydajność tej techniki dla dwóch metod próbkowania: transmisji i całkowitego odbicia tłumionego (ATR). Zastosowanie ATR pozwala na pracę w obecności nadmiaru wody, co nie tylko zapewnia pełne warunki nawodnienia białka, ale także pozwala na dokładną kontrolę pH próbki i siły jonowej49,50. Eksperymenty step-scan zilustrowano na dwóch wybranych systemach: bakteriorodopsyny i rodopsyny kanałowej-2.
Bakteriorodopsyna pompy protonowej (bR) napędzana światłem jest przedmiotem licznych badań biofizycznych od ponad czterdziestu lat39,40, co czyni ją najlepiej poznanym białkiem błonowym do tej pory. Spośród licznych technik stosowanych do badania funkcjonalności bR, spektroskopia FT-IR wywarła prawdopodobnie jeden z największych wpływów. Mianowicie, spektroskopia FT-IR była kluczem do rozdzielenia grup zaangażowanych w transfer protonów przez błonę, jak opisano w innym miejscu13,41,51.
Rodopsyna kanałowa (ChR) jest pierwszym kanałem jonowym bramkowanym światłem znalezionym w przyrodzie42,43. Wzbudzenie świetlne ChR prowadzi do przejściowego otwarcia kanału jonowego. Jego odkrycie utorowało drogę do rozwoju optogenetyki, w której procesy molekularne są kontrolowane przez światło44,45. ChR należy, podobnie jak bR, do rodziny rodopsyn drobnoustrojów, ale w przeciwieństwie do bR znacznie mniej wiadomo o jego mechanizmie funkcjonalnym52. ChR2 łączy swoją funkcję kanału jonowego z aktywnością pompowania protonów46,47. Niedawno zastosowaliśmy spektroskopię FT-IR z funkcją skanowania krokowego w czasie, aby rozwiązać reakcje transferu protonów wewnątrz białka i dynamikę zmian konformacji szkieletu białka w ChR2 48.

<table><tbody><tr><td>Spektrometr FT-IR</td><td>Bruker</td><td>Vertex 80v</td><td>Wyposażony w detektor fotowoltaiczny MCT, zewnętrzny globalny i pompę bezolejową. Oprogramowanie układowe 2.3.</td></tr><tr><td>Okna BaF2</td><td>korth Kristalle</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Diamond ATR akcesorium</td><td>Smiths Detekcja</td><td></td><td>Dziewięciorefleksyjny DuraDisk</td></tr><tr><td>Łaźnia termostatyczna</td><td>Julabo</td><td>F25</td><td></td></tr><tr><td>Stół z odsprzęgnięciem drgań</td><td>OPTA</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Impulsowy laser Nd:YAG z generatorem drugiej harmonicznej</td><td>Elektrooptyka Continuum</td><td>Minilite&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Optyczny oscylator parametryczny (OPO)</td><td>OPTA</td><td>BBO-355-VIS/IR S/N 1009</td><td></td></tr><tr><td>Cyfrowy generator opóźnień/impulsów&nbsp;</td><td>Stanford Research Systems</td><td>DG535</td><td></td></tr><tr><td>Impulsowy laser Nd:YAG z generatorem trzeciej harmonicznej</td><td>Spectra-Physics</td><td>Quanta-Ray</td><td></td></tr><tr><td>Różne lustra i soczewki optyczne</td><td>ThorLabs</td> OPUS 7.0 Bruker Oprogramowanie do sterowania spektrometrem <td></td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td>Vertex 80v</td>Czas pracy MATLAB Mathworks Służy do uruchamiania domowych programów wykonywalnych do <td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td> Wstępne przetwarzanie danych</td></tr></tbody></table>

transfer protonów i dynamika konformacji białek w białkach światłoczułych za pomocą spektroskopii w podczerwieni z transformacją fouriera ze skanowaniem czasowym i transformacją fouriera

Proton Transfer and Protein Conformation Dynamics in Photosensitive Proteins by Time-resolved Step-scan Fourier-transform Infrared Spectroscopy

Monitorowanie dynamiki protonacji i zmian konformacji szkieletu białka podczas funkcji białka jest niezbędnym krokiem w kierunku zrozumienia jego mechanizmu. Protonacja i zmiany konformacyjne wpływają odpowiednio na wzorzec drgań łańcuchów bocznych aminokwasów i wiązania peptydowego, które można badać za pomocą spektroskopii różnicowej w podczerwieni (IR). W przypadku białek, których funkcja może być powtarzalnie i powtarzalnie wyzwalana przez światło, możliwe jest uzyskanie widm różnicowych w podczerwieni z rozdzielczością (sub)mikrosekundową w szerokim zakresie spektralnym przy użyciu techniki podczerwieni z transformacją Fouriera w trybie step-scan. Przy ~102-10 3 powtórzeniach fotoreakcji, minimalnej liczbie potrzebnej do wykonania skanu w rozsądnej rozdzielczości widmowej i szerokości pasma, poziom szumu w widmach różnicy absorpcji może być nawet ~10-4, wystarczający do śledzenia kinetyki zmian protonacji pojedynczego aminokwasu. Niższy poziom szumów można osiągnąć poprzez większą liczbę uśredniania danych i/lub przetwarzania matematycznego. Ilość białka wymagana do uzyskania optymalnych wyników wynosi od 5 do 100 μg, w zależności od zastosowanej techniki pobierania próbek. Jeśli chodzi o dodatkowe wymagania, białko musi być najpierw skoncentrowane w buforze o niskiej sile jonowej, a następnie wysuszone w celu utworzenia filmu. Film białkowy jest nawadniany przed eksperymentem, albo małymi kropelkami wody, albo w kontrolowanej wilgotności powietrza. Osiągnięty poziom nawodnienia (g wody / g białka) mierzy się na podstawie widma absorpcji IR. Aby zaprezentować tę technikę, zbadaliśmy fotocykl sterowanej światłem bakteriorodopsyny pompy protonowej w jej natywnym środowisku purpurowej błony oraz bramkowanej światłem kanałowej rodopsyny-2 rozpuszczonej w detergencie.

Kluczowe etapy funkcjonowania białka, w szczególności zmiany konformacyjne szkieletu i reakcje transferu protonów, często odbywają się w skali od mikrosekund do milisekund. Te dynamiczne procesy można badać za pomocą spektroskopii w podczerwieni z transformacją Fouriera ze skanowaniem czasowo-rozdzielczym, w szczególności w przypadku białek, których funkcja jest wyzwalana przez światło.

Transfer protonów i dynamika konformacji białek w białkach światłoczułych za pomocą spektroskopii w podczerwieni z transformacją Fouriera ze skanowaniem czasowym i transformacją Fouriera

Monitoring the dynamics of protonation and protein backbone conformation changes during the function of a protein is an essential step towards ...

Ogólnym celem tej procedury jest zbadanie dynamiki protonowania i zmian konformacyjnych dwóch światłoczułych białek błonowych przy użyciu spektroskopii FTIR w trybie skanowania STEP z rozdzielczością czasową. Osiąga się to poprzez uprzednie utworzenie uwodnionego filmu białkowego, którego absorpcja w podczerwieni będzie badana albo w konfiguracji całkowitego wewnętrznego odbicia (ATR) dla bakteriopsiny, albo w konfiguracji transmisyjnej dla kanału Rodin 2. Drugim krokiem jest wzbudzenie próbki nanosekundowym impulsem lasera o odpowiedniej długości fali w celu zainicjowania reakcji fotocyklicznej w białku, przy jednoczesnym wykrywaniu rozdzielczych w czasie zmian natężenia światła podczerwonego oddziałującego z próbką.Następnie powyższy proces powtarza się w określonych pozycjach ruchomego lustra interferometru, który kontroluje różnicę dróg optycznych między dwiema rozdzielonymi wiązkami, aż do zarejestrowania pełnego interferogramu rozdzielczego w czasie. Ostatnim krokiem jest przekształcenie interferogramu rozdzielczego w czasie w widma różnicowego pochłaniania IR rozdzielcze w czasie, z wykorzystaniem transformaty Fouriera oraz prawa Lamberta-Beera. Ostatecznie analizuje się ewolucję czasową pasm, szczególnie w obszarze MI oraz wiązań podwójnych CO grup karboksylowych, aby zbadać dynamikę zmian konformacyjnych i protonowania w białku.Główną zaletą tej techniki w porównaniu z większością istniejących metod eksperymentalnych jest to, że pozwala ona rozdzielić przejściowe zmiany protonacji w białkach. Co więcej, dzieje się to w skalach czasowych mikro- i milisekundowych, które są najbardziej istotnym zakresem czasowym dla badania funkcjonalności białek. Metoda ta może pomóc w odpowiedzi na kluczowe pytania z dziedziny biofizyki molekularnej i nauki o białkach, takie jak to, które reszty ulegają protonacji i kiedy dzieje się to podczas mechanizmu funkcjonalnego białka lub kiedy następują główne zmiany w strukturze białek.Procedurę zademonstruje Victor Ria, pracownik naukowy z mojego laboratorium. W pierwszej kolejności zamontuj akcesorium tłumionego całkowitego odbicia (ATR) w komorze próbkowej spektrometru FTIR. Zmierz szerokie spektrum energii przy rozdzielczości 4 cm⁻¹ dla czystej powierzchni elementu wewnętrznego odbicia, stosując konwencjonalną szybką spektroskopię FTIR. Przykryj powierzchnię ATR 20 µL buforu o wysokiej sile jonowej, który zostanie użyty później do rehydratacji próbki.Następnie zmierz absorpcję IR buforu. Potem usuń bufor i opłucz powierzchnię wodą, nie dotykając jej. Usuń pozostałą ciecz za pomocą intensywnego strumienia powietrza i roznieś około 3 µL roztworu białka bakterii Rodin w błonie purpurowej o stężeniu 6 mg/mL na powierzchni.Suspenzję białkową suszyć pod łagodnym strumieniem suchego powietrza aż do powstania filmu. Następnie zmierzyć widmo absorpcyjne suchego filmu. Po tym delikatnie dodać od 20 do 40 µL buforu o wysokiej sile jonowej, aby rehydratować suchy film.Przykryj uchwyt A TR pokrywką, aby zapobiec parowaniu wody podczas pomiaru widma absorpcyjnego. Oszacuj procent próbki pozostałej w pobliżu powierzchni po rehydratacji filmu poprzez odjęcie widma absorpcyjnego buforu. W tym momencie nanieś 10 µL channel opsin two rozpuszczonego w dec alside w buforze o niskiej sile jonowej na środek okna z fluorku baru o średnicy 20 mm.Rozprowadź roztwór za pomocą końcówki mikropipety do średnicy od sześciu do ośmiu milimetrów, wykorzystując delikatny strumień suchego powietrza, aby uzyskać jednorodną ciepłą warstwę o średnicy odpowiadającej mniej więcej rozmiarowi wiązki IR przy największej aperturze. Następnie zastosuj płaski pierścień uszczelniający z silikonu o grubości jednego milimetra. Nawilż warstwę, dodając od trzech do pięciu µL mieszaniny glicerolu i wody, rozprowadzonej w trzech do pięciu kroplach wokół suchej warstwy, i szczelnie zamknij ją drugim okienkiem.Wstaw okna z fluorku baru w układzie kanapkowym do uchwytu. Następnie umieść uchwyt w komorze pomiarowej. Zmierz widmo absorpcyjne.Potwierdź, że maksymalne pochłanianie w obszarze amidu I mieści się w zakresie od 0,6 do 1,0 dla układu A TR. Użyj światłowodu umieszczonego na pokrywie A TR, aby sprzęgnąć laser z próbką. Dostosuj gęstość energii lasera w miejscu próbki do wartości od dwóch do trzech mJ/cm² na impuls.Używając watomierza lub eksperymentów transmisyjnych, wykorzystaj lustra, aby skierować wiązkę lasera na próbkę, a w razie potrzeby soczewki, aby skolimować lub rozproszyć wiązkę lasera do średnicy nieco większej niż rozmiar filmu próbki. Zsynchronizuj impuls laserowy z rejestracją danych za pomocą przełącznika Q. Wykorzystaj sygnał wyjściowy TTL z elektroniki lasera neodymowego typu Nd:YAG w celu wyzwolenia przetwornika analogowo-cyfrowego spektrometru.Ustaw częstotliwość wzbudzenia lasera w celu przeprowadzenia pomiarów czasowo rozdzielczych w trybie skanowania skokowego w zakresie widmowym od 1800 do 850 cm⁻¹. W torze optycznym umieść filtr dolnoprzepustowy, który jest nieprzezroczysty powyżej 1950 cm⁻¹ i wykazuje dobrą transmitancję poniżej 1800 cm⁻¹.Następnie zmień tryb sprzężenia detektora z AC na DC. W tym momencie sprowadź poziom DC INTERFEROGRAMU do zera, przyłożając do detektora prąd polaryzujący. Ponownie dostosuj wzmocnienie elektroniczne, aby lepiej wykorzystać zakres dynamiczny przetwornika analogowo-cyfrowego.Następnie uruchom menu skanowania skokowego (step scan) spektrometru FTIR. Ustaw docelową szerokość pasma widma dla pomiaru w trybie skanowania skokowego na jedną ósmą liczby falowej lasera helowo-neonowego. Ustaw rozdzielczość widmową na 8 cm⁻¹ oraz rozdzielczość fazową na 64 cm⁻¹.Wybierz funkcję appe. Następnie ustaw tryb akwizycji INTERFEROGRAM na pojedynczą stronę do przodu (single side forward). Ustaw częstotliwość próbkowania przetwornika analogowo-cyfrowego na najwyższą dostępną w spektrometrze.Ustaw wyzwalacz eksperymentu na zewnętrzny. Następnie określ liczbę liniowo rozmieszczonych punktów danych do zapisu, w tym 100 punktów przed wyzwalaczem. W następnej kolejności ustaw liczbę koincydencji lub liczbę uśrednień fotoreakcji dla każdego położenia lustra i rozpocznij eksperyment.Na koniec powtórz eksperyment 10 razy dla bakterii redsin oraz 35 razy na trzech różnych próbkach filmów dla kanału redsin dwa, aby uzyskać około 200 współdodań na pozycję lustra. Charakterystyczne pasma z wibracji amidowych wiązań peptydowych są rozróżnialne w widmie absorpcyjnym suchej pianki bakterii redsin. Przy zastosowaniu buforów o niskiej sile jonowej film ulega nadmiernemu rozszerzeniu, co zmniejsza ilość białka badanego przez pole ewanescencyjne. Dokładna zależność między pęcznieniem filmu a siłą jonową buforu będzie zależeć, między innymi, od rodzaju lipidów.Pęcznienie błony po hydratacji wymaga czasu w celu osiągnięcia stabilizacji dla bakterii dosin. W błonie purpurowej proces ten jest monoeksponencjalny ze stałą czasową wynoszącą 12 minut. Wykres 3D z typowego eksperymentu FDIR z rozdzielczością czasową i skanowaniem skokowym przeprowadzonym na bakteriach.Przedstawiono tutaj Redsin. Widma mogą być ekstrahowane w określonych punktach czasowych, na przykład w momentach, w których spodziewane jest osiągnięcie najwyższej populacji stanów pośrednich w fotocyklu redsinu w bakteriach.W cyklach fotochemicznych bakterii rod Dossin ślady czasowe zmian absorbancji przy 1 762 cm⁻¹ informują o dynamice protonowania i deprotonowania aspartanianu 85, a przy 1 741 cm⁻¹ o zmianach w wiązaniach wodorowych oraz dynamice deprotonowania i reprotonowania kwasu asparaginowego 96. Ślady czasowe przy 1 670 i 1 555 cm⁻¹.Raportuj zmiany w wibracjach MI jeden i dwa, które obie są wrażliwe na konformację szkieletu peptydowego. Zgodnie z tą metodą, po jej opracowaniu można zastosować inne techniki, takie jak neurogeneza ukierunkowana na miejsce lub spektroskopia enzymatyczna siatkówki, aby przypisać pasmo wibracyjne do konkretnych reszt w białku. Technika ta utorowała drogę badaczom w dziedzinie biofizyki molekularnej do zgłębienia mechanizmów funkcjonalnych wielu różnych białek sterowanych światłem.

proton-transfer-protein-conformation-dynamics-photosensitive-proteins

Research

JoVE Journal

Engineering

Inżynieria

Dynamika transferu protonów i konformacji białka w białkach fotoczułych z wykorzystaniem spektroskopii Fouriera o przemianie czasowej w skanowaniu krokowym

Ten film demonstruje samoorganizację peptydów amyloidowych w bogatą w warstwy beta strukturę supramolekularną za pomocą spektroskopii w podczerwieni z transformacją Fouriera. Wiązka podczerwieni jest przepuszczana przez kryształ o wysokim współczynniku załamania światła i rejestrowana jest absorpcja energii przez granicę kryształu i próbki. Drugorzędowe struktury białek próbki są identyfikowane poprzez analizę ich charakterystycznych pików absorpcji w określonych regionach widma podczerwonego,...

Technika spektroskopii w podczerwieni z transformacją Fouriera do badania samoorganizacji peptydów

Tutaj opisujemy zastosowanie techniki odchylania wiązki fototermicznej w połączeniu z umieszczonym w klatce związkiem wapnia, DM-nitrofenem, do monitorowania dynamiki mikrosekund i milisekund oraz energetyki zmian strukturalnych związanych ze związkiem wapnia z neuronalnym czujnikiem wapnia, Modulatorem Antagonisty Elementu Regulatorowego.

Submilisekundowe zmiany konformacyjne w białkach rozwiązane przez odchylenie wiązki fototermicznej

Elastyczność konformacyjna odgrywa kluczową rolę w funkcjonowaniu białek. W tym artykule opisujemy zastosowanie czasowo-rozdzielczej spektrometrii mas z jonizacją elektronrozpylającą sprzężoną z wymianą wodorowo-deuterową do badania szybkich zmian strukturalnych, które napędzają funkcję w uporządkowanych i nieuporządkowanych białkach.

Spektrometria mas z jonizacją wodorowo-deuterową z jonizacją elektrorozpylającą do badania struktury i dynamiki białek

Tutaj prezentujemy protokół do uzyskiwania trójkolorowych danych smFRET i ich analizy za pomocą 3D zespołowego modelu Ukrytego Markowa. Dzięki takiemu podejściu naukowcy mogą wyodrębnić informacje kinetyczne ze złożonych systemów białkowych, w tym kooperatywność lub skorelowane interakcje.

Wykorzystanie trójkolorowego jednocząsteczkowego FRET do badania korelacji oddziaływań białek

Interakcje białko-białko są kluczowe dla systemów biologicznych, a badania kinetyki wiązania dostarczają wglądu w dynamikę i funkcję kompleksów białkowych. Opisujemy metodę, która określa ilościowo parametry kinetyczne kompleksu białkowego za pomocą rezonansu fluorescencyjnego, transferu energii i techniki zatrzymanego przepływu.

Wykorzystanie transferu energii rezonansu fluorescencyjnego in vitro do badania dynamiki kompleksów białkowych w milisekundowej skali czasowej

Opisano szczegóły generowania i optymalizacji sygnału, pomiaru, akwizycji danych i obsługi danych dla femtosekundowego, czasowo rozdzielczego, stymulowanego spektrometrem Ramana w bliskiej podczerwieni. Jako reprezentatywne zastosowanie pokazano badanie Ramana stymulowane bliską podczerwienią dynamiki stanu wzbudzonego β-karotenu w toluenie.

Ultraszybkie, czasowo-rozdzielcze, stymulowane bliską podczerwienią pomiary ramanowskie funkcjonalnych układów π-sprzężonych

Szybkie fotochemiczne utlenianie białek to nowa technika strukturalnej charakterystyki białek. Różne dodatki rozpuszczalnikowe i ligandy mają różne właściwości wymiatania rodników hydroksylowych. Aby porównać strukturę białka w różnych warunkach, wymagana jest kompensacja w czasie rzeczywistym rodników hydroksylowych powstających w reakcji w celu normalizacji warunków reakcji.

Umożliwienie kompensacji w czasie rzeczywistym w szybkim utlenianiu fotochemicznym białek w celu określenia zmian topografii białek

Obecny protokół opisuje metody badania struktury i dynamiki dwóch modelowych białek, które odgrywają ważną rolę w zdrowiu człowieka. Technika ta łączy laboratoryjną charakterystykę biofizyczną ze spektroskopią echa spinowego neutronów, aby uzyskać dostęp do dynamiki w skalach czasu i długości istotnych dla ruchów międzydomenowych białek.

Badanie dynamiki białek za pomocą spektroskopii neutronowego echa spinowego

Czasowo-rozdzielcze wzmocnienie fluorescencji pojedynczej cząsteczki jest użytecznym czujnikiem zbliżeniowym spektroskopowym fluorescencji, wrażliwym na lokalne zmiany strukturalne w białkach. Tutaj pokazujemy, że można go użyć do odkrycia stabilnych lokalnych konformacji w α-synukleinie, która jest inaczej znana jako kulisto nieustrukturyzowana i niestabilna, gdy jest mierzona za pomocą linijki FRET o większym zasięgu.

Wykorzystanie czasowo rozdzielczego wzmocnienia fluorescencji indukowanego białkiem w celu identyfikacji stabilnych lokalnych konformacji po jednym monomerze α-synukleiny na raz

Spektroskopia wstecznego rozpraszania neutronów oferuje nieniszczący i wolny od znaczników dostęp do dynamiki ps-ns białek i wody do ich hydratacji. Przebieg pracy przedstawiono w dwóch badaniach nad białkami amyloidowymi: nad czasowo-rozdzielczą dynamiką lizozymu podczas agregacji oraz nad dynamiką wody hydratacyjnej tau po tworzeniu włókien.

Spektroskopia neutronów o wysokiej rozdzielczości do badania dynamiki pikosekund-nanosekund białek i wody hydratacyjnej

Spektroskopia magnetycznego rezonansu jądrowego (NMR) może scharakteryzować dynamikę strukturalną białka w sposób specyficzny dla reszt. Udostępniamy praktyczny protokół do rejestrowania eksperymentów z relaksacją NMR 15N R1 i R2 oraz eksperymentów z heterojądrowym efektem Overhausera (hetNOE) {1H}-15N, wrażliwych na skalę czasową od pikosekund do nanosekund.

NMR 15N Eksperymenty relaksacyjne do badania dynamiki strukturalnej białek z pikosekundy na nanosekundy

Poznaj dynamikę transferu protonów i zmian konformacyjnych w białkach światłoczułych przy użyciu spektroskopii FTIR ze skanowaniem czasowym. Ta metoda umożliwia obserwację szybkich procesów białkowych w skali mikro- i milisekundowej.

Transfer protonów i dynamika konformacji białek w białkach światłoczułych za pomocą spektroskopii w podczerwieni z transformacją Fouriera ze skanowaniem czasowym i transformacją Fouriera (Wideo) | JoVE Journal

Transfer protonów i dynamika konformacji białek w białkach światłoczułych za pomocą spektroskopii w podczerwieni z transformacją Fouriera ze skanowaniem czasowym i transformacją Fouriera

Przeglądaj więcej filmów