Transfer protonów i dynamika konformacji białek w białkach światłoczułych za pomocą spektroskopii w podczerwieni z transformacją Fouriera ze skanowaniem czasowym i transformacją Fouriera

Ogólnym celem tej procedury jest zbadanie dynamiki protonacji i zmian konfirmacyjnych dwóch światłoczułych białek błonowych przy użyciu oskopii spektroskopii FTIR ze skanem czasowo-rozdzielczym STEP. Osiąga się to poprzez uprzednie utworzenie uwodnionej warstwy białkowej, której absorpcja w podczerwieni będzie badana albo w konfiguracji osłabionego całkowitego odbicia dla opsyny bakteryjnej, albo w konfiguracji transmisyjnej dla kanału Rodin 2. Drugim krokiem jest wzbudzenie próbki za pomocą nanosekundowego błysku lasera o odpowiedniej długości fali, aby zainicjować reakcję fotocykliczną w białku, wykrywając w czasie rozwiązane zmiany intensywności światła podczerwonego oddziałującego z próbką.

Następnie powyższy proces jest powtarzany w dyskretnych pozycjach ruchomego zwierciadła interferometru, który kontroluje różnicę toru optycznego między dwiema rozdzielonymi wiązkami, aż do zarejestrowania pełnego interferogramu z rozdzielczością czasową. Ostatnim krokiem jest przekształcenie interferogramu czasowo-rozdzielczego w czasowo-rozdzielcze widma absorpcji różnic w podczerwieni przy użyciu transformaty Fouriera i prawa Lamberta-beera. Ostatecznie bada się ewolucję banów w czasie, zwłaszcza w regionie karboksylowym z podwójnym wiązaniem CO i w regionie karboksylowym z podwójnym wiązaniem CO, aby uzyskać dynamikę zmian potwierdzających i protonujących w białku.

Główną zaletą techniki większości istniejących metod eksperymentalnych jest to, że rozwiązuje ona przejściowe zmiany protonacji w białkach. Co więcej, robi to w skali czasowej mikro i milisekundowej, czyli w najbardziej odpowiednim zakresie czasowym do badania funkcjonalności białek. Metoda ta może pomóc odpowiedzieć na kluczowe pytania w dziedzinie biofizyki molekularnej i nauki o białkach, takie jak to, jakie reszty protonat i kiedy to robią podczas mechanizmu funkcjonalnego białka lub kiedy zachodzą poważne zmiany w białkach.

Demonstracja procedury zostanie wykonana przez pracownika naukowego Victora Ria z mojego laboratorium Pierwsze mocowanie, tłumiony całkowity współczynnik odbicia lub akcesorium TR do komory próbki spektrometru FTIR. Zmierz szeroki zakres widma energii na czterech odwrotnych centymetrach. Rozdzielczość czystej wewnętrznej powierzchni elementu refleksyjnego za pomocą konwencjonalnej spektroskopii FTIR z szybkim skanowaniem Pokryj powierzchnię A TR 20 mikrolitrami buforu o wysokiej sile jonowej, używanego później do ponownego uwodnienia próbki.

Następnie zmierz absorpcję podczerwieni przez bufor. Następnie usuń bufor i spłucz powierzchnię wodą, nie dotykając jej. Usuń pozostałą ciecz za pomocą intensywnego przepływu powietrza, rozprowadź około trzech mikrolitrów sześciomiligramowego na mililitr roztworu białkowego bakterii Rodin w fioletowej membranie na powierzchni.

Wysuszyć zawiesinę białkową pod delikatnym strumieniem suchego powietrza, aż do uzyskania filmu. Następnie zmierz widmo absorpcji suchej folii. Następnie delikatnie dodaj od 20 do 40 mikrolitrów buforu o wysokiej sile jonowej, aby ponownie nawodnić suchą powłokę.

Przykryj uchwyt A TR pokrywką, aby zapobiec parowaniu wody, środek i widmo absorpcyjne. Oszacować procent próbki pozostałej w pobliżu powierzchni po ponownym uwodnieniu filmu, odejmując widmo absorpcyjne buforu. W tym momencie dodaj 10 mikrolitrów opsyny kanałowej dwa rozpuszczone w dec alside w buforze o niskiej sile jonowej w środku okienka fluorku baru o średnicy 20 milimetrów.

Rozprowadź roztwór za pomocą końcówki mikropipety do średnicy od sześciu do ośmiu milimetrów, używając delikatnego przepływu ciepłego, jednorodnego filmu suchego powietrza, którego średnica jest mniej więcej dopasowana do wielkości wiązki podczerwieni w największym otworze. Następnie użyj płaskiego silikonowego O-ringu o grubości jednego milimetra. Uwodnić folię, dodając od trzech do pięciu mikrolitrów mieszaniny glicerolu i wody rozprowadzonej w trzech do pięciu kroplach wokół suchej folii i szczelnie zamknąć ją drugim okienkiem.

Włóż okienka warstwowe z fluorkiem baru do uchwytu. Następnie umieść uchwyt w komorze na próbki. Zmierz widmo absorpcyjne.

Upewnij się, że maksymalna absorpcja w regionie amidu jednego mieści się w zakresie od 0,6 do 1,0 dla konfiguracji A TR. Użyj światłowodu umieszczonego na górze pokrywy A TR, aby połączyć laser z próbką. Dostosuj gęstość energii lasera na próbce do dwóch do trzech milidżuli na centymetr kwadratowy na impuls.

Korzystając z miernika mocy lub eksperymentów transmisyjnych, użyj luster, aby doprowadzić laser do próbki i, jeśli to konieczne, soczewek do zestawienia lub przekierowania wiązki laserowej na średnicę nieco większą niż rozmiar warstwy próbki. Zsynchronizuj impuls laserowy z zapisem danych za pomocą przełącznika Q. Zsynchronizuj impuls TTL elektroniki neodymowego atrium aluminiowego granatowego lasera, aby wyzwolić spektrometr przetwornik analogowo-cyfrowy.

Ustaw szybkość wzbudzenia lasera, aby wykonać czas rozwiązany. Pomiary krokowe w zakresie spektralnym od 1800 do 850 odwrotnych centymetrów. Umieść dolnoprzepustowy filtr optyczny w ścieżce optycznej, która jest nieprzezroczysta powyżej 1 950 centymetrów odwrotnych i z dobrą transmisją poniżej 1800 centymetrów odwrotnych.

Następnie zmień detektor z trybu sprzężonego AC na DC. W tym momencie sprowadź poziom prądu stałego interferogramu do zera, przykładając polaryzację prądu do detektora. Dostosuj wzmocnienie elektroniczne, aby lepiej wykorzystać zakres dynamiki przetwornika analogowo-cyfrowego.

Następnie uruchom menu skanowania krokowego spektrometru FTIR. Ustaw docelowe pasmo widmowe dla pomiaru skanowania krokowego na jedną ósmą liczby fali lasera helowo-neonowego. Ustaw rozdzielczość spektralną i fazową odpowiednio na osiem centymetrów odwrotnych i 64 centymetry odwrotne.

Wybierz funkcję aplikacji. Następnie ustaw tryb akwizycji INTERFEROGRAMU na jedną stronę do przodu. Ustaw częstotliwość próbkowania przetwornika analogowo-cyfrowego na najwyższą dostępną w spektrometrze.

Ustaw wyzwalacz eksperymentu na zewnętrzny. Następnie ustaw liczbę liniowo rozmieszczonych punktów danych do zarejestrowania, w tym 100 punktów wyzwalania pret. Następnie ustaw liczbę wspólnych edycji lub liczbę średnich reakcji foto na pozycję lustra i rozpocznij eksperyment.

Na koniec powtórz eksperyment 10 razy dla bakterii, redsin i 35 razy na trzech różnych foliach próbki dla kanału redsin dwa, aby uzyskać około 200 dodatków co na pozycję lustra charakterystyczne zakazy drgań amitu wiązania peptydowego są rozróżnialne w widmie absorpcji suchej piany bakterii redsin. Podczas stosowania o niskiej sile jonowej film nadmiernie się rozszerza, zmniejszając ilość białka badanego przez ulotne pole. Dokładna zależność między pęcznieniem filmu a siłą jonów buforowych będzie zależeć między innymi od charakteru lipidów.

Pęcznienie filmu po uwodnieniu wymaga czasu, aby osiągnąć stabilizację dla bakterii dawki. W przypadku fioletowej membrany proces jest monowykładniczy ze stałą czasową wynoszącą 12 minut. Wykres 3D z typowego skanu krokowego z rozdzielczością czasową, eksperyment FDIR na bakteriach.

Redsin jest pokazany tutaj. Widma można wyodrębnić w określonych godzinach. Na przykład, gdy oczekuje się, że stany pośrednie w cyklu fotograficznym bakterii redsin osiągną najwyższą populację.

W pręciku bakteryjnym Dossin czas cyklu fotograficznego ślady absorbancji zmienia się na 1 762 centymetry odwrotne. Raporty na temat dynamiki deprotonacji protonacji asparaginianu 85 i przy 1 741 centymetrach odwrotnych na temat zmian wiązań wodorowych i dynamiki reprotonacji deprotonacji kwasu asparaginowego.96. Czas śledzi się na 1 670 i 1 555 centymetrów odwrotnych.

Raport o zmianach w wibracjach MI jeden i dwa, które są wrażliwe na potwierdzenie szkieletu peptydowego. Zgodnie z tą metodą można wykonać inne techniki, takie jak neurogeneza ukierunkowana na miejsce lub spektroskopia enzymów siatkówki, w celu przypisania pasma drgań do określonych reszt w białku po jego rozwoju. Technika ta utorowała drogę naukowcom zajmującym się biofizyką molekularną do zbadania mechanizmu funkcjonalnego wielu różnych białek sterowanych światłem.