Metody charakteryzowania spontanicznej i indukowanej przez odstraszenie lokomocji w modelu choroby Parkinsona wywołanym rotenonem Drosophila

Ogólnym celem poniższego eksperymentu jest określenie spontanicznej lokomocji wywołanej przez przerażenie i długotrwałej spontanicznej lokomocji w modelu choroby Parkinsona wywołanej rotenonem u drosophila, osiąga się to poprzez hodowlę drosophila na żywności uzupełnionej rotenonem w celu wywołania fenotypu. W drugim etapie muchy są poddawane testowi reakcji na przestraszenie i aparatowi z podwójną fiolką oraz długotrwałemu testowi spontanicznej lokomocji. Wyniki badania w monitorze aktywności drosophila pokazują, że narażenie na rotenon powoduje wady lokomocji u drosophila w oparciu o kwantyfikację zaskoczenia i długotrwałej spontanicznej lokomocji.

Metody te mogą pomóc odpowiedzieć na kluczowe pytania z zakresu drosophila, modeli zaburzeń neurodegeneracyjnych i lokomocyjnych, takich jak defekty lokomocji wywołanej przestraszeniem oraz długotrwała lokomocja spontaniczna. Na początek dodaj 1,5 grama pożywki instant Drosophila. W standardowej fiolce muchowej należy umieścić podłoże z pięcioma mililitrami wody dejonizowanej zawierającej odpowiednią dawkę rotenonu.

Następnie uspokaja, od ośmiu do 12 samców much w wieku od jednego do trzech dni za pomocą dwutlenku węgla i transportuje je do fiolek zawierających lek. Uzupełniony pokarm pozwala muszkom dojść do siebie po sedacji przez 20 minut z fiolką w pozycji poziomej. Następnie umieść fiolkę pionowo w 12-godzinnym inkubatorze w ciemności w temperaturze 25 stopni Celsjusza na pozostałą część eksperymentu.

Następnie odwróć standardową fiolkę z muchami na wierzchu innej fiolki i uszczelnij szew taśmą, aby utworzyć aparat z podwójną fiolką. Następnie podzielić podwójną fiolkę na trzy równe części po 6,33 centymetra, zaznaczając kółka wokół fiolek trwałym markerem. Po trzech dniach ekspozycji na lek transfer leci do aparatu z podwójną fiolką.

Wymiana taśmy na szwie pozwala muchom zaaklimatyzować się w nowym środowisku przez 15 minut. Następnie umieść fiolki na białym tle i ustaw aparat cyfrowy. Upewnij się, że cała aparatura jest widoczna w jednej ramce obrazu i że aparat z podwójną fiolką i timer są w zasięgu wzroku, a wszystkie muchy są ostre.

Zaznacz położenie kamery i fiolki, aby zachować spójne klatki między badaniami, wyraźnie wyświetlaj numer badania i leczenie lekiem w widoku z kamery. Następnie mocno postukaj podwójną fiolką o blat trzy razy i upewnij się, że wszystkie muchy spadną na dno fiolki i natychmiast uruchom stoper. Rób zdjęcie aparatu co pięć sekund przez jedną minutę.

Następnie pozwól muchom spokojnie dojść do siebie przez jedną minutę. Powtórz test jeszcze dwa razy z jednominutowym czasem odzyskiwania między każdą próbą. Przejrzyj zdjęcia i zapisz liczbę much w każdej sekcji w czasie, aby dokonać obliczeń i odtworzyć trzy gramy natychmiastowego oph, pożywki z 15 mililitrami wody dejonizowanej i odpowiednią dawką rotenonu.

Po pięciu minutach ostrożnie umieść probówki pionowo w przezroczystych fiolkach i załaduj twardy pokarm na wysokość jednego centymetra, przekręcając probówkę. Następnie delikatnie dociśnij plastikową nasadkę na końcu tuby, unikając tworzenia się pęcherzyków powietrza Spokojny. Pewnego dnia stary samiec muchuje dwutlenkiem węgla i ostrożnie wkłada jedną muchę do każdej rurki za pomocą pędzla.

Następnie zatkaj koniec rurki małym wacikiem. Pozwól muchom odzyskać siły z dwutlenku węgla z rurkami w pozycji poziomej przez 15 minut i upewnij się, że wszystkie muchy są żywe i aktywne. Włóż probówki do monitora aktywności drosophila lub DAM i sprawdź, czy wszystkie rurki są w tej samej pozycji względem DAM.

Umieść DAM w 12-godzinnym inkubatorze o jasności i ciemności w temperaturze 25 stopni Celsjusza. Następnie podłącz DAM do systemu zbierania danych. Następnie otwórz oprogramowanie DAM w preferencjach.

Wybierz 10-minutowy przedział o długości rozpoczęcia zbierania danych i zezwól programowi na zbieranie danych przez siedem dni. Następnie otwórz program do skanowania plików DAM i uzyskaj dostęp do danych monitora, klikając wybierz dane wejściowe. Następnie wybierz odpowiedni zakres monitorów i ustaw długość przedziału na 10-minutowe interwały.

Następnie w typie pliku wyjściowego wybierz pliki kanału i pozostaw wszystkie inne opcje domyślne. Następnie kliknij skanuj dane i zapisz pliki w wyznaczonym folderze. Na koniec zaimportuj dane do oprogramowania do analizy danych okołodobowych, aby uzyskać liczbę danych na minutę.

Po trzech dniach ekspozycji na różne dawki dzikiego typu roone, muchy kantońskie wystawione na zwiększone dawki wykazały niedobór reakcji na przerażenie. Niższy odsetek much znajdował się w górnej części, a wyższy odsetek w dolnej części aparatu po 30 sekundach, co wskazuje na niedobór odpowiedzi saralnej, podobny trend zaobserwowano w przypadku much w teście spontanicznej lokomocji. Liczby na minutę mierzono w monitorze aktywności drosophila lub DAM.

Czwartego dnia po ekspozycji muchy wystawione na działanie 250 mikromolów i 500 mikromolów rotenonu wykazują znaczne zmniejszenie liczby na minutę. Testy te można wygodnie dostosować do charakterystyki wad lokomocji w innych modelach choroby przełyku i skuteczności środków terapeutycznych.