Połączona fluorescencyjna hybrydyzacja in situ DNA-RNA (FISH) w celu zbadania inaktywacji chromosomu X w zróżnicowanych żeńskich embrionalnych komórkach macierzystych myszy

Ogólnym celem tej procedury jest zbadanie inaktywacji chromosomu X w zróżnicowanych żeńskich embrionalnych komórkach macierzystych myszy za pomocą jednocześnie połączonego fluorescencyjnego DNA i RNA w hybrydyzacji C dwóch lub rybach D-N-A-R-N-A. Osiąga się to poprzez najpierw indukcję różnicowania w żeńskich embrionalnych komórkach macierzystych myszy. Podobnie jak podczas tego procesu, który symuluje prawidłowy rozwój embrionalny po implantacji, inicjowana jest inaktywacja chromosomu X, co skutkuje zwiększoną transkrypcją i akumulacją RNA torbieli, kodującego przyszły nieaktywny chromosom X.

Drugim krokiem jest utrwalenie zróżnicowanych embrionalnych komórek macierzystych za pomocą paraldehydu. Następnie przygotuj sondy do wykrywania zarówno DNA z chromosomu X, jak i RNA torbieli poprzez znakowanie fragmentów DNA biotyną lub digogeniną. Korzystanie z tłumaczenia Nicka.

Ostatnim krokiem jest wykonanie zabiegu D-N-A-R-N-A FISH. Zróżnicowane embrionalne komórki macierzyste są perme, denaturowane i hybrydyzowane z oznakowanymi sondami rybnymi, które są następnie wykrywane za pomocą fluorescencyjnie sprzężonych przeciwciał, które wykrywają biotynę lub diggen in haps. Ostatecznie mikroskopia immunofluorescencyjna ma na celu pokazanie lokalizacji dwóch chromosomów w komórkach żeńskich i wizualizację ekspresji RNA torbieli z chromosomu X, który ulega inaktywacji.

Główną zaletą tej techniki w porównaniu z innymi metodami, takimi jak metody FISH, w których następnie wykrywane jest RNA i DNA, jest to, że przy użyciu naszego protokołu jesteśmy w stanie wykryć oba rodzaje kwasów nukleinowych jednocześnie w tej samej próbce w czasie krótszym niż dwa dni. Chociaż połączone DNA i RNA, ryby mogą być trudne do wykonania, ponieważ warunki optymalne do wykrycia DNA lub RNA znacznie się różnią. Korzystając z przedstawionego tu protokołu, jesteśmy w stanie wykryć istnienie RNA i DNA pochodzących z obu chromosomów X w praktycznie wszystkich analizowanych komórkach.

Pozwoliło nam to na zbadanie chromosomu X w trakcie aktywacji, tak jak to ma miejsce podczas różnicowania embrionalnych komórek macierzystych samic myszy lub nieprawidłowego rozwoju samic myszy. Chociaż metoda ta może dostarczyć informacji na temat X w procesie aktywacji, który jest ważnym i fascynującym procesem zachodzącym podczas wczesnego rozwoju embrionalnego myszy, prawdopodobnie może być również zastosowana do innych systemów biologicznych, w których ważne jest wykrycie transkryptów RNA, które pochodzą z natywnej chromatyny, ponieważ niekodujące RNA są coraz bardziej doceniane ze względu na znaczenie w systemach biologicznych i często podejścia jednokomórkowe są preferowane w stosunku do alternatywnych podejść w którym oceniane są całe populacje komórek. Przewidujemy, że protokół ten będzie pomocny dla szerokiego środowiska naukowego.

Samice mysich embrionalnych komórek macierzystych lub E ESL są hodowane w standardowych warunkach ESL na żelowatych szalkach hodowlanych pokrytych mysimi fibroblastami embrionalnymi ORM, aby rozpocząć procedurę indukcji różnicowania. Usunąć pożywkę ES z kultury ESL i przemyć dwukrotnie hodowlą komórkową PBS Dodaj 1,5 mililitra TRIPSIN EDTA, podgrzej do 37 stopni Celsjusza i inkubuj komórki w temperaturze 37 stopni Celsjusza przez siedem minut. Po 3,5 minuty delikatnie potrząśnij naczyniem, aby rozbić kolonie.

Dezaktywuj trypsynę EDTA, dodając 3,5 mililitra pożywki różnicującej do komórek, pipetuj komórki w górę iw dół, aby uzyskać roztwór pojedynczej komórki i zbierz je w 15-mililitrowej probówce. Wirować przez pięć minut w temperaturze 200 Gs. Po zebraniu komórek w 10 mililitrach pożywki różnicującej, dodać zawiesinę komórkową do nieżelatynizowanej 10-centymetrowej płytki hodowlanej i inkubować przez godzinę. W inkubatorze do hodowli komórkowych MES będzie mógł przylegać do nieżelatynizowanej płytki hodowlanej, podczas gdy komórki ES pozostaną w zawiesinie.

W międzyczasie umieść sterylną szklaną pokrywę w sześciu płytkach dołkowych, dodaj 0,2% żelatyny i inkubuj przez co najmniej pięć minut. W temperaturze pokojowej po godzinie zbierz resztki prepl kultury ESL, która będzie składać się głównie z nieprzylegających e ESL. Po rozcieńczeniu płytki E ESL na sześć dołków zawierających szkiełka nakrywkowe.

Procedurę tę należy rozpocząć od usunięcia pożywki różnicującej z kultur różnicujących i dwukrotnego przemycia PBS hodowli komórkowej. Pamiętaj, aby ostrożnie dodawać PBS, aby zapobiec wypłukaniu komórek. Napraw komórki, dodając 4% para formaldehydu PBS i inkubując przez 10 minut w temperaturze pokojowej.

Po 10 minutach usuń paraformaldehyd i trzykrotnie umyj szkiełka nakrywkowe 70% etanolem. Aby przygotować sondy DNA do znakowania, najpierw rozcieńczyć jeden mikrogram każdego odpowiedniego DNA w wodzie w łącznej objętości 16 mikrolitrów. Następnie dodaj cztery mikrolitry roztworu do znakowania geniny wołowej lub biotyny zmieszanego przez wirowanie i inkubuj w temperaturze 16 stopni Celsjusza przez 90 minut.

Spowoduje to włączenie biotyny lub wykopanie nukleotydów znakowanych tlenem przez translację NIC. W międzyczasie przygotuj kolumny G 50. Aby usunąć niezintegrowane nukleotydy, weź dwumililitrową strzykawkę, wyjmij stempel i dodaj wysterylizowaną bawełnę do strzykawki.

Dodać kulki G 50 i roztwór, aby napełnić strzykawkę. Następnie umieść strzykawkę w 15-mililitrowej wirówce probówkowej o temperaturze 642 GS na jedną minutę. Po odwirowaniu około 80% strzykawki należy napełnić G 50 Po 90 minutach dodać 40 mikrolitrów wody do każdej mieszaniny reakcyjnej translacji NIC i przenieść reakcję do kolumny G 50.

Dodać pustą probówkę pod kolumnę i odwirować w temperaturze 642 g przez dwie minuty. Zebrać przepływ w probówce reakcyjnej. Zmierz objętość przepływającego przepływu za pomocą pipety, a następnie dodaj wodę, aby osiągnąć całkowitą objętość 200 mikrolitrów.

Aby przyspieszyć przepływ, dodaj plemniki łososia, DNA drożdży TRNA myszy złapane 1D NA i dwa molowe octany sodu zmieszane przez wirowanie. Dodaj 533 mikrolitry lodowatego 100% etanolu i potrząsaj wirówką probówkową o temperaturze 16 200 g przez 30 minut w temperaturze czterech stopni Celsjusza. Po zakończeniu wirowania usunąć nadnatywant i dwukrotnie przemyć osad za pomocą wirówki do 70% etanolu o sile 16 200 g przez pięć minut w temperaturze czterech stopni Celsjusza i wysuszyć osad na powietrzu.

Gdy granulka wyschnie. Dodaj 50 mikrolitrów, roztwór hybrydyzacyjny 50 plus i inkubuj w temperaturze 37 stopni Celsjusza przez 30 minut. Aby ułatwić rozpuszczenie przed przenikaniem, należy ponownie nawodnić utrwalone komórki, odsłaniając złożniki, usuwając 70% etanol i dodając do komórek PBS hodowli komórkowych.

Inkubuj przez pięć minut, powtórz w sumie trzy razy, aby zmobilizować komórki. Usuń PBS z hodowli komórkowej i dodaj 0,2% pepiny do sześciu płytek dołka. Inkubować płytki w łaźni wodnej w temperaturze 37 stopni Celsjusza przez cztery minuty.

Następnie usuń pepinę i dezaktywuj wodą wolną od RNA. Po utrwaleniu komórek przez inkubację z 4% aldehydem paraform PBS przez pięć minut w temperaturze pokojowej po utrwaleniu, przemyć dwukrotnie hodowlą komórkową lub PBS przez pięć minut. Odwodnić komórki, inkubując z 70% etanolem przez trzy minuty, 90% etanolem przez trzy minuty i stuprocentowym etanolem przez trzy minuty.

Następnie przenieś pokrywę z sześciu płytek dołkowych i dodaj suche szkiełka nakrywkowe przez kilka minut. Postarzać komórki, inkubując szkiełka nakrywkowe w temperaturze 65 stopni Celsjusza przez godzinę na gorącej płycie. W międzyczasie wstępnie zhybrydyzowane sondy rybne z mysim płaszczem 1D NA, dodając do siebie dla każdego szkiełka nakrywkowego, które ma być analizowane.

25 mikrolitrów 50 plus roztwór hybrydyzacyjny. Jeden mikrolitr cysty znakowanej biotyną, sonda jeden mikrolitr tlenu digo i znakowana sonda BAC wykrywająca chromosom X i 0,5 mikrolitra mysiego płaszcza 1D NA zmieszanego przez wirowanie i w naturze w temperaturze 99 stopni Celsjusza przez pięć minut. Natychmiast inkubować w temperaturze 37 stopni Celsjusza przez 45 minut, aby umożliwić łóżeczko 1D NA hybrydyzację w celu powtórzenia sekwencji obecnych w sondzie.

Gdy komórki na szkiełkach nakrywkowych się zestarzają, umieść 50 mikrolitrów buforu do dojrzewania na szkiełku podstawowym i umieść szkiełka nakrywkowe na komórkach skierowanych w stronę buforu do dojrzewania. Inkubować w temperaturze 65 stopni Celsjusza przez dwie minuty. Po utrwaleniu komórek poprzez przeniesienie pokrywy z powrotem na sześć płytek dołkowych wstępnie wypełnionych lodowatym 70% etanolem i inkubować przez pięć minut.

Odwodnić komórki, a następnie inkubować w 70% etanolu przez trzy minuty, 90% etanolu przez trzy minuty i 100% etanolu przez trzy minuty. Usuń szkiełka nakrywkowe z sześciu płytek dołkowych i pozostaw je do wyschnięcia na powietrzu przez kilka minut. Punktowo wstępnie zhybrydyzowana sonda na szklanym szkiełku i inkubatorze szkiełko nakrywkowe na górze.

Umieść szkiełka w wilgotnej komorze wypełnionej 50 mililitrami 50% IDE two XSSC i inkubuj przez noc w temperaturze 37 stopni Celsjusza. Po całonocnej inkubacji przenieś pokrywę ze szkiełek na sześć płyt ściennych, które zostały wypełnione dwoma XSSC wstępnie rozgrzanymi do 42 stopni Celsjusza. Inkubować w temperaturze 42 stopni Celsjusza przez pięć minut.

Usuń dwa XSSC i dodaj 50% z MI dwa XSSC. Inkubować przez 10 minut w temperaturze 42 stopni Celsjusza. Umyj 50%form IDE w sumie trzy razy X-S-S-C-A przez 10 minut w temperaturze 42 stopni Celsjusza na pranie.

Po trzecim praniu usuń 50% z moich dwóch XSSC i umyj szkiełka za pomocą tris soli fizjologicznej lub TST dwa razy przez pięć minut w temperaturze pokojowej w celu zablokowania miejsca 50 mikrolitrów tris soli fizjologicznej BSA lub T-S-P-S-A. Szkiełko nakrywkowe założyć na nowe szkiełka podstawowe i umieścić szkiełka nakrywkowe do góry nogami na szkiełku podstawowym inkubować przez 30 minut w temperaturze pokojowej w wilgotnej ciemnej komorze TST. Po 30 minutach przenieść szkiełka przykrywkowe z powrotem do sześciodołkowych płytek i przemyć dwukrotnie przez pięć minut TST dla pierwszego miejsca inkubacji przeciwciał, 50 mikrolitrów antygenu owczego i przeciwciała na szkiełko nakrywkowe na nowych szkiełkach podstawowych i umieścić szkiełka nakrywkowe do góry nogami na szkiełku podstawowym inkubować przez 30 minut w temperaturze pokojowej w wilgotnej ciemnej komorze TST.

Następnie szkiełka nakrywkowe są inkubowane z serią fluorescencyjnie znakowanych przeciwciał w celu wzmocnienia oryginalnego sygnału, jak opisano w dołączonym manuskrypcie. Po inkubacji z serią fluorescencyjnie znakowanych przeciwciał, odwodnić komórki przez inkubację przez trzy minuty w 70% etanolu, 90% etanolu i 100% etanolu. Usuń szkiełka nakrywkowe z sześciu płytek dołkowych i pozostaw je do wyschnięcia na powietrzu przez kilka minut.

Na koniec dostrzeż kroplę podłoża montażowego z dappy na każdym szklanym szkiełku. Nałóż szkiełko nakrywkowe do góry nogami na wierzch i uszczelnij szkiełka lakierem do paznokci. Korzystając z tego protokołu do połączonej inaktywacji chromosomu X D-N-A-R-N-A RYB, można zwizualizować różnicowanie żeńskich komórek ES.

Rysunek ten przedstawia reprezentatywny przykład eksperymentu na rybach A-D-N-A-R-N-A, w którym jednocześnie wykrywa się zarówno RNA torbieli, jak i region chromosomu X. Torbiel, RNA to niekodujący RNA, który jest niezbędny w procesie inaktywacji chromosomu X. W różnicowaniu żeńskiej torbieli ESL RNA wykrywa się za pomocą sondy CD NA znakowanej biotyną, która jest wizualizowana za pomocą przeciwciał skoniugowanych z żwaczem i oznaczona na czerwono.

Chromosom X jest wykrywany za pomocą xigenu w znakowanej sondzie BAC, która jest wizualizowana za pomocą przeciwciał sprzężonych z FITC wskazanych na zielono jąder jest barwiony przeciwstawnie DPI oznaczonym na niebiesko. W prawie każdej komórce wykrywane są dwa chromosomy x. Wykrywane są zarówno duże nagromadzenia torbieli na nieaktywnych chromosomach X lub chmurach torbieli, jak i ekspresja torbieli podstawnej z aktywnego chromosomu X lub torbieli Pinpoints.

Punktowe torbiele nie są wykrywane w każdym jądrze, ponieważ po różnicowaniu ta podstawowa ekspresja torbieli ustaje na przyszłym aktywnym chromosomie X. Zauważ, że niektóre z precyzyjnych sygnałów pochodzących z chromosomu X znajdują się w chmurach torbieli, co pokazuje, że chmura torbieli rzeczywiście lokalizuje się wzdłuż i koduje chromosom X po opanowaniu. Tę technikę można wykonać w mniej niż dwa dni i z wiarygodnym wynikiem, jeśli zostanie wykonana prawidłowo.

Po obejrzeniu tego filmu powinieneś dobrze zrozumieć, jak indukować różnicowanie żeńskich embrionalnych komórek macierzystych myszy, jak naprawić te komórki i jak je przygotować, aby umożliwić wykonanie połączonej ryby D-N-A-R-N-A. Pamiętaj, że dla powodzenia twoich eksperymentów ważne jest utrzymanie stałej temperatury i czasu inkubacji, jak wskazano w tym protokole. Ważne jest również, aby pracować w czystym środowisku.

Jeśli używasz innego typu komórek lub badasz inny system biologiczny, może być wymagana pewna optymalizacja, aby zapewnić optymalny wynik. Powodzenia w eksperymentach.