Jednokanałowe nagrywanie z zaciskiem krosowym dołączonym do komórki
9 czerwca 2014
Tutaj opisano procedurę uzyskiwania długich odcinków zapisu prądu z jednego kanału jonowego za pomocą techniki patch-clamp dołączonej do komórki. Metoda ta pozwala na obserwację w czasie rzeczywistym wzorca konformacji kanałów otwórz-zamknij, które leżą u podstaw sygnału biologicznego. Dane te informują o właściwościach kanałów w niezakłóconych błonach biologicznych.
Ogólnym celem tej procedury jest pomiar prądu elektrycznego przez pojedynczy kanał jonowy. Osiąga się to poprzez pierwszą heterologiczną ekspresję kanału jonowego będącego przedmiotem zainteresowania w komórkach, które są łatwe w obsłudze i sprzyjają celom eksperymentalnym. Drugim krokiem jest użycie pipety polerowanej ogniowo, aby uzyskać stabilne uszczelnienie na błonie komórkowej.
Następnie eksperymentator powinien określić liczbę kanałów obecnych w łacie, a jeśli jest to prąd pojedynczego kanału nagrywania, ostatnim krokiem jest przetworzenie i analiza danych. Ostatecznie rejestrowanie prądu z pojedynczych kanałów jonowych jest wykorzystywane do badania właściwości biofizycznych, dzięki którym działają te białka błonowe, co stanowi podstawę komunikacji neuronów i innych pobudliwych komórek. W przeciwieństwie do metod, które pozwalają na pomiar prądów przez wiele aktywnych kanałów jonowych, zaletą tego podejścia jest to, że pomiar prądów przez pojedynczy kanał jonowy pozwala na wizualizację i oddzielenie szerokiego zakresu wzorców odpowiedzi właściwych dla danego kanału.
Metoda ta może być wykorzystana do udzielenia odpowiedzi na kluczowe pytania w dziedzinie neuronauki, takie jak wpływ modulatorów fizjologicznych i terapeutycznych na komunikację między neuronami. Ogólnie rzecz biorąc, osoby, które są nowe w tej technice, będą miały trudności, ponieważ trudno jest uzyskać nagrania o niskim poziomie szumów, które zawierają tylko jeden kanał jonowy. Kiedy po raz pierwszy próbujesz tej metody, naprawdę warto zobaczyć, jak ktoś to robi, ponieważ aby uzyskać naprawdę stabilne uszczelnienie, co jest najważniejsze w tej metodzie, musisz delikatnie podejść do komórki pod określonym kątem, a co najważniejsze, musisz być wytrwały, aby przygotować się do transfekcji.
Komórki HEK 2 93 są siane w 35-milimetrowych szalkach z jednodniowym wyprzedzeniem, aby doprowadzić je do 50 do 60% zbiegu w sterylnej probówce. Przygotować mieszaninę transfekcyjną. Dodaj jeden mikrogram każdego interesującego nas CDNA, 315 mikrolitrów podwójnie destylowanej wody i 350 mikrolitrów 42 milimolowych hałd
.Na koniec dodaj kroplami 35 mikrolitrów chlorku wapnia, aby utworzyć osad. Wiruj probówkę przez pięć sekund i dodaj 175 mikrolitrów zawiesiny transfekcji do każdej z czterech naczyń. Platerowane dzień wcześniej.
Inkubuj komórki w temperaturze 37 stopni Celsjusza przez dwie godziny. Po inkubacji usunąć pożywkę i przemyć PBS. Następnie dodaj dwa mililitry pożywki wzrostowej, uzupełnionej dwumilimolowym chlorkiem magnezu, aby zapobiec ekscytotoksyczności za pośrednictwem receptora MDA.
Najpierw wyciągnij dwie symetryczne pipety rejestrujące ze szkła krzemianowego dla chłopców za pomocą pionowego ściągacza. Następnie konieczne jest polerowanie ogniowe w celu uzyskania odpowiedniej średnicy i odporności. Następnie skonfiguruj do nagrywania, otwierając oprogramowanie do akwizycji danych QUB i wybierając okno akwizycji.
W obszarze układu. Otwórz nowy plik danych QUB, klikając nowe dane i wprowadź parametry eksperymentalne, które mają zostać użyte. Dostosuj skalowanie amplitudy do 0,1 V na pico amper, klikając prawym przyciskiem myszy plik danych, wybierając właściwości i klikając kartę danych.
Po zastąpieniu pożywki dwoma mililitrami PBS zawierającymi wapń i magnez, zamontuj miskę z komórkami na stoliku mikroskopu. Skoncentruj się na polu komórkowym za pomocą mikroskopii kontrastu fazowego, aby ocenić, czy komórki są zdrowe i dobrze przylegają do naczynia w sposób jednowarstwowy. Przełącz się na detekcję fluorescencji, aby sprawdzić, czy transfekcja się powiodła.
Następnie ustaw parametry nagrywania jednokanałowego. Ustaw tryb na napięcie clamp i przyłoż napięcie do plus 100 miliwoltów za pomocą polecenia utrzymania napięcia. W pozycji wyłączonej wybierz przycisk testu uszczelnienia na podstawie fluorescencji i ogólnego wyglądu.
Wybierz komórkę do załatania, sprawdź pod kątem kontrastu fazowego, czy komórka jest dobrze przymocowana do naczynia, ma dużą część powierzchni komórki odsłoniętą do łatania i poza tym wygląda zdrowo. Napełnij świeżo wypolerowaną pipetę roztworem odpowiednim dla receptorów NMDA i eksperymentów z przyłączonymi komórkami, a następnie delikatnie strzepnij, aby usunąć wszelkie pęcherzyki powietrza. Przymocuj pipetę nagrywającą do amplifier głowica stage i upewnij się, że srebrny drut jest zanurzony w roztworze pipety, aby zapobiec przedostawaniu się roztworu do kąpieli do pipety.
Podczas podejścia użyj małej plastikowej strzykawki podłączonej do uchwytu na pipetę, aby delikatnie wywrzeć nadciśnienie. Następnie za pomocą mikromanipulatora skieruj pipetę do kąpieli. Zamykając obwód elektryczny, umieść go bezpośrednio nad ogniwem wybranym do łatania.
Zwróć uwagę na oscyloskop po wejściu do wanny. Rezystancja pipety powinna mieścić się w optymalnym zakresie, jednocześnie monitorując wizualnie położenie rurki w mikroskopie i jej rezystancję elektryczną na oscyloskopie. Kontynuuj podejście małymi krokami, aż pipeta delikatnie uderzy w komórkę.
Sygnał testowy nieznacznie się zmniejszy, aby wskazać zwiększoną rezystancję. Aby utworzyć uszczelnienie, podnieś strzykawkę i delikatnie przyłóż lekkie podciśnienie przez boczną rurkę. Pociągnięcie tłoka strzykawki powoduje powstanie uszczelnienia tłoka sygnalizowane całkowitym spłaszczeniem przebiegu sygnału testowego na oscyloskopie.
Na wzmacniaczu. Przełącz przełącznik poleceń zewnętrznych z testu uszczelnienia na wyłączony. Przełącz polecenie utrzymywania napięcia z wyłączonego na dodatnie i zwiększ wzmocnienie od 10 x do 100 x.
Obserwuj oscyloskop pod kątem aktywności kanału, która, jeśli jest obecna, będzie wyświetlana jako kwadrat odchyleń w dół od poprzednio płaskiej linii bazowej. Jeśli aktywność kanału jest wyświetlana na oscyloskopie, rozpocznij pobieranie danych do poprzednio otwartego pliku cyfrowego w QUB, naciskając przycisk odtwarzania, a następnie przycisk nagrywania. Aby zatrzymać pobieranie danych, naciśnij przycisk stop w QUB i zapisz plik QDF sygnał, który nie spłaszcza się całkowicie lub linia bazowa, która staje się hałaśliwa i niestabilna, może wskazywać na słabe uszczelnienie.
W takim przypadku należy wyjąć i wyrzucić pipetę, a następnie powtórzyć kolejne czynności z nową pipetą, aż do uzyskania odpowiedniego uszczelnienia. Aby rozpocząć proces analizy danych, otwórz plik z nagranymi danymi w QUB i sprawdź bieżący ślad w interfejsie wstępnym. W obszarze układu.
Usuń filtr cyfrowy, aby wyświetlić nagrany ślad w pełnym paśmie, odznaczając pole oznaczone fc. Wizualnie zeskanuj ślad, aby wykryć nieprawidłowości i artefakty Krótki. Skoki prądu można skorygować, podświetlając sąsiedni czysty obszar o tej samej klasie przewodności.
Klikając prawym przyciskiem myszy i wybierając opcję ustaw bufor usuwania, najpierw powiększ spajek, aż poszczególne punkty próbkowania będą widoczne. Wybierz region, który ma zostać zastąpiony, podświetlając tylko ten region. Kliknij prawym przyciskiem myszy i wybierz opcję Wymaż, aby skorygować linię bazową dla całego rekordu.
Zdefiniuj zerową bieżącą linię bazową, wybierając wczesną część rekordu, w której linia bazowa jest stabilna. Podświetl prawy przycisk myszy i wybierz opcję ustaw linię bazową. Gdy pojawi się podstawowa wytyczna, potwierdź przez oględziny, że dokładnie odzwierciedla ona poziom linii bazowej.
Zidentyfikuj punkty w rekordzie, w których linia bazowa danych pierwotnych wyraźnie odbiega od ustawionej linii bazowej. Popraw to, wybierając mały odcinek linii bazowej w odbiegającym obszarze. Kliknij prawym przyciskiem myszy i wybierz polecenie dodaj węzeł linii bazowej.
W przypadku, gdy zapis zawiera sporadyczne okresy z nadmiarem szumu lub artefaktów, których nie można łatwo skorygować, fragmenty te powinny zostać usunięte, ale najpierw muszą zostać podzielone na kolejne segmenty. Podświetl bezpośrednio przed regionem, który ma zostać odrzucony. Kliknij prawym przyciskiem myszy i wybierz opcję Przerwij segment.
Następnie zaznacz sekcję, która ma zostać odrzucona, kliknij prawym przyciskiem myszy, wybierz, usuń i naciśnij Enter, aby idealizować rekordy. Przełącz się na interfejs MOD w układzie. W panelu wyświetlania danych wybierz niewielką część rekordu zawierającą zarówno zdarzenia zamknięte, jak i otwarte.
Przesuń kursor do znajdującego się poniżej panelu o wysokiej rozdzielczości i w obrębie wybranego śladu podświetl czysty segment reprezentatywny dla linii bazowej. Przesuń kursor do panelu modelu poniżej, kliknij prawym przyciskiem myszy kwadrat, który będzie reprezentował stan zamknięty i wybierz chwyć. Powtórz procedurę dla otworów kanałów, podkreślając część cech reprezentujących przewodnictwo otwarte.
Kliknij prawym przyciskiem myszy czerwony kwadrat w panelu modelu i wybierz opcję chwyć. Wykonaj idealizację dla wybranej części rekordu, wybierając przycisk SEL w obszarze źródła danych. Następnie kliknij prawym przyciskiem myszy wyidealizowaną zakładkę pod sekcją modelowania w wyskakującym panelu.
Sprawdź, czy żądane parametry analizy są poprawne, a następnie kliknij przycisk Uruchom. Wynik idealizacji wraz z histogramem amplitudy dla wybranej części jest nakładany na dane, aby umożliwić wizualną kontrolę idealizacji. W razie potrzeby dostosuj parametry idealizacji, aby uzyskać najlepszy wynik i powtórz tę czynność, wykonaj idealizację dla całego pliku, wybierając przycisk pliku w obszarze źródło danych.
Następnie kliknij prawym przyciskiem myszy wyidealizowaną kartę i kliknij uruchom. Zostaną wyświetlone wyniki dla całego pliku. Nałożony na dane dokładnie sprawdź zgodność między wyidealizowanym śladem a zarejestrowanymi danymi.
Zdarza się, że zdarzenia są fałszywie identyfikowane, które można wykluczyć z wyidealizowanego śladu. Wybierz fałszywe zdarzenie, kliknij prawym przyciskiem myszy i wybierz dołącz do IDL. Pokazano tutaj tylko prądy jonów wapnia przepływające przez pojedynczy receptor NMDA w komórce HEK 2 93.
Wykorzystując technikę patch clamp dołączonych do komórek, idealizacja danych tworzy histogramy amplitudy, które dobrze pasują do dwóch różnych klas przewodności w tej komórce. Załączone nagranie z komórek HEK 2 93, jeden kanał wrażliwy na Meno jest aktywowany o minus 20 milimetrów. Ciśnienie rtęci w pipecie plastra podczas stałego przyłożenia napięcia.
Czerwona przerywana linia wskazuje zerowy poziom prądu. Te nagrania z natywnych kanałów pokazują ciągłą aktywność receptora NMDA zarejestrowaną z somy neuronu, który został oddzielony od kory przedczołowej zarodka szczura i utrzymywany w hodowli przez pięć lub 27 dni. Po opanowaniu tę procedurę można wykonać w ciągu 30 minut do jednej godziny, w zależności od czasu trwania nagrania.
Po tej procedurze można przeprowadzić inne metody, takie jak analiza kinetyczna i modelowanie stanu, w celu określenia mechanizmu bramkowania kanału i oszacowania szybkości reakcji. Po obejrzeniu tego filmu powinieneś mieć całkiem dobre zrozumienie, jak nagrywać i zacząć analizować prądy przepływające przez jedno białko kanału jonowego.
Wyświetl pełny transkrypt i uzyskaj dostęp do tysięcy filmów naukowych
Przegląd
Niniejszy artykuł opisuje procedurę pomiaru prądu elektrycznego przez pojedynczy kanał jonowy z wykorzystaniem techniki patch-clamp w konfiguracji cell-attached. Metoda ta umożliwia obserwację konformacji kanałów w czasie rzeczywistym, dostarczając informacji na temat ich właściwości biofizycznych.
Kluczowe elementy badania
Dziedzina nauki
- Elektrofizjologia
- Neuronauka
- Biologia komórki
Wstęp
- Kanały jonowe są kluczowe dla komunikacji komórkowej.
- Zrozumienie zachowania pojedynczego kanału pomaga wyjaśnić sygnalizację neuronalną.
- Technika patch-clamp w konfiguracji cell-attached pozwala na szczegółowe pomiary prądu.
- Rejestracje z pojedynczych kanałów mogą ujawnić unikalne wzorce odpowiedzi kanałów jonowych.
Cel badania
- Pomiar prądu elektrycznego przepływającego przez pojedynczy kanał jonowy.
- Badanie właściwości biofizycznych kanałów jonowych.
- Pogłębienie zrozumienia roli kanałów jonowych w komunikacji komórkowej.
Zastosowane metody
- Heterologiczna ekspresja kanału jonowego w odpowiednich komórkach.
- Użycie wypalanej pipety do stworzenia szczelnego połączenia z błoną komórkową.
- Wyznaczenie liczby kanałów w obszarze patcha.
- Rejestracja prądów pojedynczego kanału i następująca po niej analiza danych.
Główne wyniki
- Pomyślny pomiar prądu przepływającego przez pojedynczy kanał jonowy.
- Wizualizacja konformacji otwarcia i zamknięcia kanału.
- Wgląd w unikalne wzorce odpowiedzi poszczególnych kanałów jonowych.
- Pogłębione zrozumienie roli kanałów jonowych w komunikacji neuronalnej.
Wnioski
- Technika patch-clamp w konfiguracji cell-attached jest skuteczna w badaniu pojedynczych kanałów jonowych.
- Metoda ta dostarcza cennych danych na temat właściwości kanałów w błonach biologicznych.
- Uzyskane wyniki przyczyniają się do szerszego zrozumienia mechanizmów sygnalizacji neuronalnej.
Najczęściej zadawane pytania
Zastosowanie w przemyśle
Elektrofizjologia jednokanałowa umożliwia bezpośredni pomiar właściwości biofizycznych kanałów jonowych, co pozwala na mechanistyczną weryfikację ryzyka w odniesieniu do celów terapeutycznych w neuronauce oraz w procesie odkrywania leków na kanalopatie. Poprzez rozstrzyganie dynamiki konformacyjnej i mechanizmów bramkowania z rozdzielczością molekularną, metoda ta wspiera walidację celów i identyfikację związków wiodących dzięki ilościowej ocenie funkcjonalnej. Zwiększa ona pewność prognostyczną na wczesnym etapie odkrywania leków, odróżniając specyficzną modulację kanałów od efektów niespecyficznych, co dostarcza informacji niezbędnych do podejmowania decyzji o kontynuowaniu lub przerwaniu prac w ramach priorytetyzacji portfolio.
Strategiczne zastosowania w badaniach i rozwoju biofarmaceutycznym
Wczesne etapy odkrywania i walidacja celu
- Wartość naukowa: Weryfikacja hipotez terapeutycznych poprzez pomiar indukowanych ligandem zmian konformacyjnych w kanałach NMDA i PIEZO1.
- Wartość operacyjna: Umożliwia funkcjonalną walidację celu poprzez bezpośrednią obserwację kinetyki otwarcia i zamknięcia pojedynczych kanałów.
- Wartość naukowa: Wspiera mechanistyczną minimalizację ryzyka poprzez wyizolowanie odpowiedzi specyficznych dla kanałów z szumu tła komórkowego.
Przesiewy i opracowywanie testów
- Wartość naukowa: Przygotowuje zwalidowane układy biologiczne (HEK293, natywne neurony) do późniejszego screeningu ligandów i profilowania modulatorów.
- Wartość operacyjna: Dostarcza zestandaryzowane, powtarzalne rejestracje jednokanałowe z mierzalnymi wskaźnikami przewodności i prawdopodobieństwa otwarcia.
- Wartość naukowa: Umożliwia rzetelną ocenę związków poprzez rozróżnianie profili farmakologicznych specyficznych dla podtypu oraz zależnych od stanu.
Badania translacyjne i przedkliniczne
- Wartość naukowa: Łączy wyniki odkryć z istotnością chorobową poprzez pomiary aktywności receptora NMDA w natywnych neuronach kory mózgu.
- Wartość operacyjna: Zapewnia ciągłość translacyjną dzięki zastosowaniu identycznych parametrów pomiarowych w systemach heterologicznych i natywnych.
- Wartość naukowa: Wspiera decyzje o rozwoju projektu z uwzględnieniem ryzyka poprzez zdefiniowanie punktów odniesienia biofizycznych dla optymalizacji wiodących związków.
Integracja potoków i przepływów pracy
Metoda ta integruje się z kontinuum procesu odkrywania leków, od walidacji celu po identyfikację związku wiodącego, dostarczając informacji mechanistycznych, które pomagają w projektowaniu testów i charakterystyce związków.
- Biologia odkrywcza: Wspiera testowanie hipotez i wyjaśnianie szlaków sygnałowych poprzez analizę mechanizmów bramkowania kanałów jonowych w warunkach fizjologicznych i farmakologicznych.
- Przesiewanie: Zapewnia gotowość do przeprowadzania testów dzięki stabilnemu tworzeniu uszczelnienia oraz rejestracji pojedynczych kanałów z niskim poziomem szumów, co umożliwia wykrycie efektów modulatorów.
- Analityka: Generuje pomiary ilościowe (histogramy amplitudy, czasy przebywania w stanie otwartym i zamkniętym), umożliwiając obiektywne porównanie warunków testowych w różnych grupach eksperymentalnych.
- Badania translacyjne: Zapewnia ciągłość przedkliniczną dzięki rejestracjom z natywnych neuronów, które odzwierciedlają wyniki uzyskane w systemach heterologicznych, co zwiększa pewność co do wybranego celu terapeutycznego.
- Ponowne wykorzystanie w przedsiębiorstwie: Ustanawia platformę elektrofizjologiczną możliwą do ponownego wykorzystania w badaniach nad różnymi kanałami jonowymi (NMDA, PIEZO1) oraz w obszarach różnych jednostek chorobowych.
Wpływ operacyjny i przedsiębiorstwowy
- Wartość naukowa: Zapewnia pewność prognostyczną poprzez bezpośredni pomiar przewodnictwa kanałów i kinetyki bramkowania, co zmniejsza niejednoznaczność mechanistyczną w walidacji celu.
- Wartość operacyjna: Zapewnia standaryzację i powtarzalność dzięki technice pipet polerowanych ogniowo oraz spójnym parametrom zaciskania napięcia (voltage-clamp) w różnych laboratoriach.
- Wartość strategiczna: Usprawnia podejmowanie decyzji o kontynuacji lub przerwaniu badań (go/no-go) poprzez dostarczanie jednoznacznych profili farmakologicznych pojedynczych cząsteczek, co redukuje liczbę wyników fałszywie dodatnich w identyfikacji związków wiodących.
- Wpływ na portfolio: Umożliwia priorytetyzację skorygowaną o ryzyko poprzez określenie ilościowych progów biofizycznych dla modulacji kanałów, co stanowi podstawę do rozwoju badań przedklinicznych.
Wskazówki dotyczące wdrożenia
- Wymaga doświadczenia w zakresie elektrofizjologii, techniki patch-clamp oraz biologii kanałów jonowych.
- Zależne od specjalistycznej aparatury, w tym mikromanipulatorów, wzmacniaczy i oprogramowania do akwizycji danych (QUB).
- Wymaga standaryzacji kryteriów jakości uszczelnienia (seal) oraz protokołów korekcji linii bazowej pomiędzy zespołami w celu zapewnienia porównywalności danych.
- Obejmuje kwestie adaptacji do różnych typów komórek (HEK293, neurony pierwotne) oraz rodzajów kanałów (sterowane ligandami, mechanosensytywne).
- Ograniczone przez trudności techniczne związane z uzyskaniem stabilnych, wysokoomowych uszczelnień oraz utrzymaniem niskiego poziomu szumów podczas długotrwałych pomiarów.
