Name: Jednokanałowe nagrywanie z zaciskiem krosowym dołączonym do komórki (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-06-09T14:45:00.000+00:00
Duration: 13 min 7 s
Description: Naucz się jednokanałowego nagrywania prądu jonowego z zaciskiem krosowym dołączonym do komórki. Ta metoda elektrofizjologiczna umożliwia badanie właściwości biofizycznych pojedynczych kanałów jonowych w czasie rzeczywistym.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Ta praca była wspierana przez F31NS086765 (KAC), F31NS076235 (MAP) i R01 NS052669 (GKP) oraz EIA9100012. Autorzy dziękują Eileen Kasperek za ekspertyzę i pomoc w biologii molekularnej i hodowli tkankowej; oraz Jasonowi Myersowi za udostępnienie danych uzyskanych z wczesnych neuronów kory przedczołowej.

1. Hodowla komórkowa i ekspresja białek
<ol>
	<li>Utrzymuj komórki HEK293 (numer ATCC CRL-1573) między pasażami 22 i 40, w tym pasażami wykonywanymi przez ATCC, w hodowli jednowarstwowej w DMEM uzupełnionej 10% płodową surowicą bydlęcą (FBS) i 1% mieszaniną penicyliny/streptomycyny w 5% CO2 i 37 °C. Pomiędzy eksperymentami pasażować komórki do kolb T25 w 5-20 krotnych rozcieńczeniach w końcowej objętości 10 ml. Uwaga: Wykorzystanie komórek podczas tych pasaży gwarantuje korzystne zdrowie komórek, co pozwoli na optymalne tworzenie uszczelnień i stabilność łat</li>.
	<li>Do transfekcji umieścić komórki HEK293 w szalkach o średnicy 35 mm w gęstości ~105 komórek/szalkę, co odpowiada ~0,5-0,6 ml zawiesiny komórkowej na szalkę i hodować komórki w 2 ml pożywki przez 18-24 godziny.</li>
	<li>W sterylnej probówce wirówkowej o pojemności 1,5 ml przygotuj mieszaninę transfekcji na cztery szalki o średnicy 35 mm, dodając (w tej kolejności): (1) 1 μg każdego cDNA (GluN1, GluN2A i GFP); (2) 315 μl wody podwójnie destylowanej (ddH2O); (3) 350 μl 42 mM kwasu 4-(2-hydroksyetylo)-1-piperazynoetanosulfonowego (HEPES) i (4) 35 μl 2,5 M CaCl2 kropli, który jest używany do tworzenia osadu.</li>
	<li>Wirować probówkę przez 5 sekund i dodać 175 μl zawiesiny transfekcyjnej do każdej z czterech szalek o średnicy 35 mm posianych dzień wcześniej, które teraz zawierają komórki o 50-60% konfluencji, i inkubować komórki w temperaturze 37 °C przez 2 godziny.</li>
	<li>Odessać pożywkę transfekcyjną, przemyć PBS i zastąpić 2 ml pożywki wzrostowej uzupełnionej 2 mM MgCl2 w celu zapobieżenia ekscytotoksyczności za pośrednictwem receptora NMDA9. Uwaga: Ogniwa mogą być używane do zapisów elektrofizjologicznych 24-48 godzin po transfekcji.</li>
</ol>
2. Przygotowanie elektrody
<ol>
	<li>Wygeneruj 2 symetryczne pipety rejestrujące, ciągnąc rurki ze szkła borokrzemianowego za pomocą pionowego ściągacza. W zależności od rozmiaru i geometrii powstałej końcówki należy dalej kształtować pipety za pomocą polerki. Uwaga: Rozmiar końcówki można ocenić wizualnie i elektrycznie. Wizualnie średnica zewnętrzna powinna mieścić się w zakresie 1,4-5,6 μm. Elektrycznie końcówka o optymalnym rozmiarze, po napełnieniu roztworem zewnątrzkomórkowym, powinna wytwarzać rezystancje w zakresie 12-24 MΩ (patrz rysunek 2B).</li>
	<li>Użyj roztworu pipety, który do eksperymentów z przyłączeniem komórek reprezentuje środowisko zewnątrzkomórkowe, które wytworzy maksymalną aktywność kanału i wysokie amplitudy prądu. Uwaga: W przypadku receptorów NMDA odpowiada to roztworowi zawierającemu nasycone stężenia agonistów (glutaminianu i glicyny), 1 mM EDTA, który chelatuje dwuwartościowe inhibitory kationowe i blokery, i ma fizjologiczne stężenia sodu (150 mM) jako jedynego jonu permodalnego (w mM: 1 glutaminian, 0,1 glicyna, 150 NaCl, 2,5 KCl, 1 EDTA i 10 HEPBS, buforowany w pH 8,0 z 1 N NaOH).</li>
</ol>
3. Nagrywanie z użyciem zacisku krosowego dołączonego do komórki
<ol>
	<li>Otwórz oprogramowanie do akwizycji danych QuB (www.qub.buffalo.edu) i wybierz okno akwizycji w sekcji "układ". Otwórz nowy plik danych QuB (QDF), klikając "Nowe dane" w menu rozwijanym zatytułowanym "Plik" i wprowadź następujące parametry początkowe: częstotliwość próbkowania, 40 kHz; Skalowanie A/D, 3 000; kanał wyjściowy, 1; i rozmiar danych A/D, 2. Dostosuj skalowanie amplitudy do 0,1 V/pA, klikając prawym przyciskiem myszy plik danych, wybierając właściwości i klikając zakładkę "dane". Uwaga: Parametry te można doprecyzować dla każdej konfiguracji za pomocą komórki modelu w trybie dołączonej komórki. Dodatkowe instrukcje dotyczące akwizycji danych za pomocą oprogramowania QuB i właściwości QDF są dostępne online pod adresem www.qub.buffalo.edu.</li>
	<li>Wybierz 35-milimetrową szalkę zawierającą komórki wyrażające kanał jonowy i zastąp pożywkę wzrostową 2 ml PBS zawierającej wapń i magnez; zamontuj szalkę na stoliku mikroskopu i skup się na polu komórkowym za pomocą mikroskopii z kontrastem fazowym, aby ocenić, czy komórki są zdrowe i dobrze przyczepione do szalki w sposób jednowarstwowy (ryc. 1A). Przełącz się na detekcję fluorescencji, aby sprawdzić, czy transfekcja się powiodła (ryc. 1B). Uwaga: Zakres intensywności fluorescencji może być używany jako surowa miara ekspresji białek.</li>
	<li>W przypadku nagrywania jednokanałowego należy ustawić wzmocnienie wyjściowe wzmacniacza na x10, konfigurację patcha na β = 1, filtr analogowy na 10 kHz, tryb na voltage-clamp i przyłożyć napięcie na +100 mV. Gdy polecenie utrzymania napięcia w pozycji OFF wybierz przycisk "test uszczelnienia".</li>
	<li>Na podstawie fluorescencji i zdrowia komórki wybierz komórkę do załatania. Sprawdź pod kątem kontrastu fazowego, czy komórka jest dobrze przymocowana do naczynia, ma dużą część powierzchni komórki odsłoniętą do łatania i poza tym wygląda zdrowo. Uwaga: Utrzymuj oświetlenie z kontrastem fazowym, aby uniknąć bielenia ogniwa podczas podejścia i zaciskania łatki.</li>
	<li>Napełnij świeżo wypolerowaną pipetę roztworem w takiej ilości, aby zetknęła się z elektrodą, i delikatnie potrząśnij, aby usunąć pęcherzyki powietrza, które mogą zostać uwięzione w końcówce. Przymocuj pipetę nagrywającą do amplifier headstage, dokręcając uszczelniającą uchwytu pipety i upewniając się, że srebrny drut jest zanurzony w roztworze pipety.</li>
	<li>Używając małej (5 cm³) plastikowej strzykawki, która jest połączona z uchwytem pipety za pomocą rurki, delikatnie zastosuj nadciśnienie, aby zapobiec przedostawaniu się zanieczyszczeń i zatykaniu końcówki podczas podejścia (Rysunek 2A).</li>
	<li>Za pomocą mikromanipulatora skierować pipetę do kąpieli i umieścić ją bezpośrednio nad celą wybraną do łatania (rysunek 1C), zamykając obwód elektryczny. Zwróć uwagę na oscyloskop, który powinien wskazywać prostokątny przebieg odpowiadający sygnałowi testowemu uszczelnienia wzmacniacza (rysunek 2B). Uwaga: Po wejściu do kąpieli rezystancja pipety w optymalnym zakresie wynosi 12-24 MΩ. Dla sygnału testowego 5 mV mierzony zakres prądu odpowiada ~20-40 pA.</li>
	<li>Monitorując wizualnie położenie pipety za pomocą mikroskopu i opór pipety elektrycznie na oscyloskopie, kontynuuj podejście małymi krokami, aż pipeta delikatnie uderzy w komórkę, a sygnał testowy nieznacznie spadnie, wskazując na zwiększoną rezystancję (ilustracja 2B).</li>
	<li>Aby utworzyć uszczelnienie, należy podnieść strzykawkę i zastosować lekkie podciśnienie przez boczną rurkę, pociągając za tłok strzykawki, który wciąga błonę komórkową do końcówki pipety rejestrującej i inicjuje tworzenie uszczelki rezystancyjnejGΩ 10. Zwróć uwagę na przebieg sygnału testowego na oscyloskopie, w którym tworzenie się uszczelnienia jest sygnalizowane przez jego całkowite spłaszczenie, przy czym widoczne są tylko pojemnościowe stany nieustalone (rysunek 2B). Uwaga: Jeśli sygnał nie spłaszczy się całkowicie lub linia bazowa stanie się głośna, oznacza to słabe uszczelnienie ze znacznym upływem prądu wokół uszczelki. Zapobiegnie to rozwiązywaniu prądów jednokanałowych. W takim przypadku wyjmij pipetę z kuwety i z dala od kąpieli, wyjmij ją ze stopnia głowicy i wyrzuć. Powtórz proces ze świeżo wypolerowaną pipetą, aż do uzyskania uszczelki w odpowiednim zakresie (≥ 1 GΩ).</li>
	<li>Na wzmacniaczu przełącz przełącznik poleceń zewnętrznych z "test uszczelnienia" na "wyłącz"; przełącz polecenie utrzymywania napięcia na dodatnie (które poprzednio było ustawione na "wyłączone") i zwiększ wzmocnienie do x100. Obserwuj oscyloskop pod kątem aktywności kanału, która, jeśli występuje, będzie wyświetlana jako kwadratowe odchylenia w górę od poprzednio płaskiej linii podstawowej (rysunek 2C).</li>
	<li>Jeśli na oscyloskopie wyświetlana jest aktywność kanału, należy pobrać dane do poprzednio otwartego pliku cyfrowego w QuB, naciskając przycisk "play", a następnie przycisk "record". Aby zatrzymać pobieranie danych, naciśnij przycisk stop w QuB i zapisz plik QDF w łatwej do odzyskania lokalizacji na dysku twardym komputera, wybierając opcję "Zapisz dane jako..." z rozwijanego menu zatytułowanego "Plik".</li>
</ol>
4. Wstępne przetwarzanie danych i idealizacja
Uwaga: Ważne informacje można wydobyć z nagrań jednokanałowych za pomocą analiz statystycznych, które przypisują każdy punkt danych do odpowiedniej klasy przewodności (w najprostszym przypadku zamkniętej lub otwartej). Proces ten jest określany jako idealizacja danych, a krótki opis idealizacji danych metodą segmentowych k średnich (SKM)11 w QuB opisano poniżej.
<ol>
	<li>Otwórz plik danych w QuB i wyświetl bieżące ślady w interfejsie "Pre" w sekcji "układ". Wyświetl nagrany plik bez filtrowania (usuń filtr cyfrowy), odznaczając pole oznaczone "Fc".</li>
	<li>Zeskanuj wzrokowo rekord, aby wykryć nieprawidłowości i artefakty (Rysunek 4A). Skoryguj krótkie skoki prądu, które występują w obrębie ścieżki (Rysunek 4A), wybierając sąsiedni czysty obszar o tej samej klasie przewodności, podświetlając ten obszar, klikając prawym przyciskiem myszy i wybierając opcję "ustaw bufor usuwania". Powiększ spajek, aż poszczególne punkty próbki będą widoczne, wybierz obszar do zastąpienia i wymaż podświetlając tylko ten obszar, a następnie kliknij prawym przyciskiem myszy "wymaż".</li>
	<li>Zdefiniuj zerową bieżącą linię bazową dla całego rekordu, wybierając wczesną część rekordu, w której linia bazowa jest stabilna, podświetl, kliknij prawym przyciskiem myszy i wybierz "ustaw linię bazową". Sprawdź, czy wyświetlana wytyczne, które dokładnie reprezentują poziom podstawowy (fioletowy na rysunku 4B)</li>
	<li>Zidentyfikuj punkty w rekordzie, w których linia bazowa danych pierwotnych wyraźnie odbiega od ustawionej linii bazowej. Popraw to, wybierając mały fragment linii bazowej w odbiegającym regionie, kliknij prawym przyciskiem myszy i wybierz polecenie "dodaj węzeł linii bazowej".</li>
	<li>Zidentyfikuj obszary nagrania zawierające nadmierny szum lub artefakty, których nie można łatwo skorygować (rysunek 4C). Zaznacz region, który ma zostać odrzucony, kliknij prawym przyciskiem myszy i wybierz "usuń". Uwaga: W takim przypadku informacje kinetyczne zostaną utracone: przetworzony zapis będzie krótszy, a punkty znajdujące się za punktem łączenia będą wydawały się być ciągłe z obszarem przed szumem.</li>
	<li>Aby wyidealizować rekordy za pomocą algorytmu SKM11, zaznacz część śladu zawierającą zarówno zdarzenia otwarte, jak i zamknięte i wejdź do interfejsu "Mod" w sekcji "Układ". W panelu "model" zaznacz czystą część śladu, która jest reprezentatywna dla linii bazowej w całym pliku, kliknij prawym przyciskiem myszy kwadrat (stan zamknięty) i wybierz "chwyć". Zrób to samo dla otworów kanałów, podświetlając otwartą przewodność, kliknij prawym przyciskiem myszy czerwony kwadrat w panelu "model" i wybierz "chwyć".</li>
	<li>Wykonaj idealizację dla całego rekordu, wybierając przycisk "Plik" w sekcji "Źródło danych". Kliknij prawym przyciskiem myszy zakładkę "Idealizuj" pod sekcją "Modelowanie", aby sprawdzić, czy żądane parametry analizy są poprawne, a następnie kliknij "Uruchom". Wynik idealizacji wraz z histogramem amplitudy dla całego pliku, jest nakładany na dane, aby umożliwić wizualną kontrolę idealizacji (Rysunek 5). Uwaga: Nieodpowiednia idealizacja może prowadzić do generowania "fałszywych zdarzeń", w których QuB wykrywa otwarcia i zamknięcia kanałów, które w rzeczywistości nie występują. W ramach rozdzielczości nagrywania, która jest ustawiana przez filtr analogowy wzmacniacza i częstotliwość próbkowania, rozdzielczość, z jaką SKM wykrywa zdarzenia otwarte i zamknięte, może być kontrolowana poprzez ustawienie czasu martwego dla analiz. Optymalne czasy martwe muszą być wybierane metodą prób i błędów i będą zależeć od częstotliwości próbkowania, jednak dobrą zasadą jest wybranie czasu martwego, który wynosi 2-3 próbki12.</li>
	<li>Aby sprawdzić, czy idealizacja dokładnie odzwierciedla nieprzetworzone dane, ręcznie zeskanuj wyidealizowany ślad. Po zidentyfikowaniu błędów w idealizacji, zaznacz ślad nad fałszywym zdarzeniem, kliknij prawym przyciskiem myszy i wybierz "Dołącz do Idl". Uwaga: Aby uzyskać dodatkowe opcje i szczegółowe wyjaśnienie różnych poleceń i funkcji w QuB, zapoznaj się z Podręcznikiem QuB online (www.qub.buffalo.edu).</li>
</ol>

<ol><li>Neher, E., Sakmann, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single-channel+currents+recorded+from+membrane+of+denervated+frog+muscle+fibres%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Single-channel currents recorded from membrane of denervated frog muscle fibres.</a> Nature. 260, 799-802 (1976).</li>
<li>Hamill, O. P., Marty, A., Neher, E., Sakmann, B., Sigworth, F. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Improved+patch-clamp+techniques+for+high-resolution+current+recording+from+cells+and+cell-free+membrane+patches%5BTitle%5D)+AND+%22Pflugers+Arch%22%5BJournal%5D)">Improved patch-clamp techniques for high-resolution current recording from cells and cell-free membrane patches.</a> Pflugers Arch. 391, 85-100 (1981).</li>
<li>Piccolino, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Animal+electricity+and+the+birth+of+electrophysiology%3A+the+legacy+of+Luigi+Galvani%5BTitle%5D)+AND+%22Brain+Research+Bulletin%22%5BJournal%5D)">Animal electricity and the birth of electrophysiology: the legacy of Luigi Galvani.</a> Brain Research Bulletin. 46, 381-407 (1998).</li>
<li>Albright, T. D., Jessell, T. M., Kandel, E. R., Posner, M. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neural+Science%3A+A+Century+of+Progress+and+the+Mysteries+that+Remain%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Neural Science: A Century of Progress and the Mysteries that Remain.</a> Neuron. 25, (2000).</li>
<li>Popescu, G. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Modes+of+glutamate+receptor+gating%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Physiology%22%5BJournal%5D)">Modes of glutamate receptor gating.</a> The Journal of Physiology. 590, 73-91 (2012).</li>
<li>Morimoto-Tomita, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Autoinactivation+of+Neuronal+AMPA+Receptors+via+Glutamate-Regulated+TARP+Interaction%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Autoinactivation of Neuronal AMPA Receptors via Glutamate-Regulated TARP Interaction.</a> Neuron. 61, 101-112 (2009).</li>
<li>Thomas, P., Smart, T. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((HEK293+cell+line%3A+A+vehicle+for+the+expression+of+recombinant+proteins%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Pharmacological+and+Toxicological+Methods%22%5BJournal%5D)">HEK293 cell line: A vehicle for the expression of recombinant proteins.</a> Journal of Pharmacological and Toxicological Methods. 51, 187-200 (2005).</li>
<li>Huang, Z., Li, G., Pei, W., Sosa, L. A., Niu, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Enhancing+protein+expression+in+single+HEK+293+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Neuroscience+Methods%22%5BJournal%5D)">Enhancing protein expression in single HEK 293 cells.</a> Journal of Neuroscience Methods. 142, 159-166 (2005).</li>
<li>Raymond, L. A., Moshaver, A., Tingley, W. G., Huganir, R. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Glutamate+receptor+ion+channel+properties+predict+vulnerability+to+cytotoxicity+in+a+transfected+nonneuronal+cell+line%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Cell+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Glutamate receptor ion channel properties predict vulnerability to cytotoxicity in a transfected nonneuronal cell line.</a> Mol Cell Neurosci. 7, 102-115 (1996).</li>
<li>Suchyna, T. M., Markin, V. S., Sachs, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Biophysics+and+Structure+of+the+Patch+and+the+Gigaseal%5BTitle%5D)+AND+%22Biophysical+Journal%22%5BJournal%5D)">Biophysics and Structure of the Patch and the Gigaseal.</a> Biophysical Journal. 97, 738-747 (2009).</li>
<li>Qin, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Restoration+of+single-channel+currents+using+the+segmental+k-means+method+based+on+hidden+Markov+modeling%5BTitle%5D)+AND+%22Biophys+J%22%5BJournal%5D)">Restoration of single-channel currents using the segmental k-means method based on hidden Markov modeling.</a> Biophys J. 86, 1488-1501 (2004).</li>
<li>Colquhoun, D., Sigworth, F. J. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aColquhoun%2C+D+%22chapter+in+Single-channel+recording.+2nd+edn+eds+B.+Sakmann+and+E+Neher%22">chapter in Single-channel recording. 2nd edn eds B. Sakmann and E Neher</a>. , Plenum Press. (1995).</li>
<li>Popescu, G., Auerbach, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Modal+gating+of+NMDA+receptors+and+the+shape+of+their+synaptic+response%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Modal gating of NMDA receptors and the shape of their synaptic response.</a> Nat Neurosci. 6, 476-483 (2003).</li>
<li>Colquhoun, D., Hawkes, A. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Stochastic+properties+of+ion+channel+openings+and+bursts+in+a+membrane+patch+that+contains+two+channels%3A+evidence+concerning+the+number+of+channels+present+when+a+record+containing+only+single+openings+is+observed%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+R+Soc+Lond+B+Biol+Sci%22%5BJournal%5D)">Stochastic properties of ion channel openings and bursts in a membrane patch that contains two channels: evidence concerning the number of channels present when a record containing only single openings is observed.</a> Proc R Soc Lond B Biol Sci. 240, 453-477 (1990).</li>
<li>Kussius, C. L., Kaur, N., Popescu, G. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pregnanolone+Sulfate+Promotes+Desensitization+of+Activated+NMDA+Receptors%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Pregnanolone Sulfate Promotes Desensitization of Activated NMDA Receptors.</a> J. Neurosci. 29, 6819-6827 (2009).</li>
<li>Amico-Ruvio, S., Popescu, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Stationary+gating+of+GluN1%2FGluN2B+receptors+in+intact+membrane+patches%5BTitle%5D)+AND+%22Biophysical+Journal%22%5BJournal%5D)">Stationary gating of GluN1/GluN2B receptors in intact membrane patches.</a> Biophysical Journal. 98, 1160-1169 (2010).</li>
<li>Borschel, W. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Gating+reaction+mechanism+of+neuronal+NMDA+receptors%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurophysiol%22%5BJournal%5D)">Gating reaction mechanism of neuronal NMDA receptors.</a> J Neurophysiol. 108, 3105-3115 (2012).</li>
<li>Colquhoun, D., Hatton, C. J., Hawkes, A. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+quality+of+maximum+likelihood+estimates+of+ion+channel+rate+constants%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Physiology%22%5BJournal%5D)">The quality of maximum likelihood estimates of ion channel rate constants.</a> The Journal of Physiology. 547, 699-728 (2003).</li>
<li>Kussius, C. L., Kaur, N., Popescu, G. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pregnanolone+Sulfate+Promotes+Desensitization+of+Activated+NMDA+Receptors%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Pregnanolone Sulfate Promotes Desensitization of Activated NMDA Receptors.</a> The Journal of Neuroscience. 29, 6819-6827 (2009).</li>
<li>Popescu, G., Auerbach, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Modal+gating+of+NMDA+receptors+and+the+shape+of+their+synaptic+response%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Modal gating of NMDA receptors and the shape of their synaptic response.</a> Nat Neurosci. 6, 476-483 (2003).</li>
<li>Popescu, G., Robert, A., Howe, J. R., Auerbach, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Reaction+mechanism+determines+NMDA+receptor+response+to+repetitive+stimulation%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Reaction mechanism determines NMDA receptor response to repetitive stimulation.</a> Nature. 430, 790-793 (2004).</li>
<li>Prieto, M. L., Wollmuth, L. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Gating+Modes+in+AMPA+Receptors%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Gating Modes in AMPA Receptors.</a> The Journal of Neuroscience. 30, 4449-4459 (2010).</li>
<li>Poon, K., Nowak, L. M., Oswald, R. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Characterizing+Single-Channel+Behavior+of+GluA3+Receptors%5BTitle%5D)+AND+%22Biophysical+Journal%22%5BJournal%5D)">Characterizing Single-Channel Behavior of GluA3 Receptors.</a> Biophysical Journal. 99, 1437-1446 (2010).</li>
<li>Smith, T. C., Wang, L. -Y., Howe, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Heterogeneous+Conductance+Levels+of+Native+AMPA+Receptors%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Heterogeneous Conductance Levels of Native AMPA Receptors.</a> The Journal of Neuroscience. 20, 2073-2085 (2000).</li>
<li>Coste, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Piezo1+and+Piezo2+Are+Essential+Components+of+Distinct+Mechanically+Activated+Cation+Channels%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Piezo1 and Piezo2 Are Essential Components of Distinct Mechanically Activated Cation Channels.</a> Science. 330, 55-60 (2010).</li>
<li>Coste, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Piezo+proteins+are+pore-forming+subunits+of+mechanically+activated+channels%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Piezo proteins are pore-forming subunits of mechanically activated channels.</a> Nature. 483, 176-181 (2012).</li>
<li>Benndorf, K. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aBenndorf%2C+K+%22chapter+in+Single-channel+recording.+2nd+edn+eds+B.+Sakmann+and+E+Neher%22">chapter in Single-channel recording. 2nd edn eds B. Sakmann and E Neher</a>. , Plenum Press. (1995).</li>
</ol>

Autorzy niniejszego manuskryptu oświadczają, że nie mają konkurencyjnych interesów finansowych.

W dziedzinie kanałów jonowych ważnym obszarem badań jest zrozumienie sekwencji zdarzeń, które prowadzą do otwarcia kanału lub mechanizmu bramkowania kanału. W przypadku większości kanałów proces ten jest złożony i obejmuje kilka kroków kinetycznych, których nie można wydedukować z makroskopowego sygnału wielokanałowego. W przeciwieństwie do tego, eksperymenty mogą być projektowane tak, aby obserwacja sekwencji zdarzeń otwartych/zamkniętych w rekordzie pojedynczego kanału mogła dostarczyć bardziej szczegółowych informacji...

Szybka komunikacja między błonami biologicznymi opiera się prawie wyłącznie na oligomerycznych białkach błonowych tworzących pory, powszechnie nazywanych kanałami. Białka te różnią się znacznie sygnałami aktywacji, mechanizmami bramkowania i właściwościami przewodnictwa. Białka kanałowe, których pory są selektywne dla jonów, są klasyfikowane jako kanały jonowe; Ich aktywacja wytwarza prądy jonowe w poprzek błony, a ich reakcje mogą być rejestrowane z wysoką rozdzielczością w czasie rzeczywistym przy użyciu technik elektrofizjologicznych. Sygnały aktywacji obejmują szeroki zakres danych chemicznych i fizycznych, w tym gradienty stężeń, siły mechaniczne i elektryczne oraz temperaturę; W związku z tym dalsze klasyfikowanie kanałów jonowych na typy bramkowane ligandami, mechanowrażliwe, bramkowane napięciem lub wrażliwe na ciepło. W tym artykule opisano protokoły rejestrowania jednokanałowej aktywności z kanału bramkowanego ligandem, receptora NMDA, i kanału mechanowrażliwego, PIEZO1, przy użyciu techniki patch-clamp. 
Elektrofizjologia patch-clamp jest pierwszą i najczęściej stosowaną metodą eksperymentalną, która jest wystarczająco czuła, aby umożliwić obserwację pojedynczych cząsteczek 1,2. Oprócz tej wyjątkowej czułości, znacznie rozszerzył preparaty biologiczne podatne na zapis elektrofizjologiczny, a także umożliwił obserwację kanałów jonowych w nienaruszonych błonach. Po pierwsze, ponieważ zarówno zaciskanie napięcia, jak i rejestrowanie prądu odbywa się za pomocą tej samej elektrody, może być ona używana do rejestrowania sygnałów przez małe ogniwa lub łaty membranowe. Technika ta ujawniła, że kanały jonowe nie ograniczają się do pobudliwych błon mięśni żaby, elektroblaszek węgorza lub gigantycznych aksonówkałamarnic 3,4, ale raczej, że reprezentują one wszechobecne elementy transbłonowych mechanizmów sygnalizacyjnych i są nieodłączne dla wszystkich typów błon komórkowych organizmów jedno- lub wielokomórkowych, a także dla błon wewnątrzkomórkowych. Co ważne, możliwość rejestrowania prądów transbłonowych poprzez proste przymocowanie szklanej pipety do nienaruszonej komórki zapewniła bezprecedensową możliwość rejestrowania aktywności kanałów jonowych w ich natywnych, niezakłóconych membranach. Tak więc technika patch-clamp dołączona do komórki, która jest opisana w tym protokole, pozwala na ciągłe monitorowanie aktywności kanałów jonowych przez dziesiątki minut lub dłużej w ich naturalnym środowisku.
Przy normalnych fluktuacjach termicznych, wszystkie białka, w tym białka kanałów jonowych, ulegają zmianom strukturalnym w szerokim zakresie czasu, przy czym najszybsze i najczęstsze przegrupowania są najprawdopodobniej reprezentowane przez ruchy łańcucha bocznego, a znacznie wolniejsze, rzadsze zmiany są reprezentowane przez repozycjonowanie całych domen lub podjednostek, lub w niektórych przypadkach przez modyfikacje potranslacyjne lub interakcje białko-białko5, Lokal mieszkalny Obserwacja długich okresów aktywności generowanej przez jedną cząsteczkę może pomóc w zrozumieniu funkcjonalnej dynamiki kanałów jonowych w nienaruszonych błonach fizjologicznych i dostarczyć cennych informacji na temat mechanizmu działania obserwowanej cząsteczki. 
W przeciwieństwie do rosnącego zrozumienia różnorodności kanałów jonowych w różnych typach komórek i stadiach rozwoju, wiedza na temat składu molekularnego kanałów jonowych w natywnych błonach jest nadal ograniczona. Wszystkie kanały jonowe są białkami multimerycznymi, a większość natywnych kanałów jonowych składa się z kilku typów podjednostek wytwarzających białka o szerokiej różnorodności molekularnej, której często towarzyszą różne właściwości przewodnictwa i bramkowania. Z tego powodu kanały jonowe o określonym składzie molekularnym są badane po ekspresji w układach heterologicznych. W szczególności komórki HEK293, które są klonalną linią unieśmiertelnionych ludzkich embrionalnych komórek nerkowych7, zyskały powszechną akceptację jako preferowany system heterologicznej ekspresji rekombinowanych kanałów jonowych. Wśród wielu zalet, które podniosły poziom komórek HEK293 jako systemu wyboru dla elektrofizjologii kanałów jonowych, są łatwość i przystępność cenowa hodowli i utrzymywania długowiecznych stabilnych kultur, ich zdolność do przeprowadzania potranslacyjnego fałdowania, przetwarzania i transportu białek ssaków, a w wielu przypadkach ich niski poziom lub nawet brak endogennej ekspresji dla kanału będącego przedmiotem zainteresowania7. Rozdział 8. Ekspresja rekombinowanych kanałów jonowych i badanie ich właściwości funkcjonalnych w komórkach HEK293 nadal jest cennym podejściem do uzyskiwania informacji na temat właściwości strukturalno-funkcjonalnych kanałów jonowych, a także specyficznych właściwości izoform kanałów jonowych i ich ról w tkance natywnej. Protokoły opisane w tym artykule mogą być równie dobrze stosowane do rekombinowanych kanałów jonowych ulegających ekspresji w komórkach HEK293, jak i do natywnych kanałów jonowych.
Podsumowując, technika patch-clamp, dzięki swojej bezprecedensowej zdolności do rozdzielania sygnałów z jednej cząsteczki, pozostaje jak dotąd najbardziej bezpośrednią metodą obserwacji zachowania pojedynczych molekuł. W trybie dołączonym do komórki, zapis patch-clamp pozwala na długie okresy obserwacji, które w przypadku jednej cząsteczki mogą zapewnić wyjątkowy wgląd w działanie kanałów jonowych. Poniżej przedstawiono protokół uzyskiwania wysokorozdzielczych nagrań prądowych z plastrów przyłączonych do komórek zawierających jedno białko kanału jonowego.

<table><tbody><tr><td>Chemikalia</td><td>Sigma</td><td>Różne</td><td></td></tr><tr><td>szkło borokrzemianowe</td><td>Sutter</td><td>BF-150-86-10</td><td></td></tr><tr><td>Mikroskop odwrócony jasnego pola</td><td>Olympus</td><td>1x51</td><td>Nikon ma również podobne mikroskopy</td></tr><tr><td>Pudełko fluroescencyjne</td><td>X-cite</td><td>Series 120</td><td></td></tr><tr><td>Liquid Light Guide</td><td>Mikromanipulator X-cite</td><td>OEX-LG15</td><td></td></tr><tr><td></td><td>Sutter Instruments</td><td>MP-225</td><td></td></tr><tr><td>Oscyloskop</td><td>Tektronix</td><td>TDS1001</td><td></td></tr><tr><td>Wzmacniacz</td><td>Urządzenia molekularne</td><td>Axon Axopatch 200B</td><td></td></tr><tr><td>Tabela</td><td>TMC</td><td>63561</td><td></td></tr><tr><td>Karta NIDAQ</td><td>National Instruments</td><td>776844-01</td><td></td></tr><tr><td>Ściągacz</td><td>Polerka</td><td></td> Narishige PC-10 <td></td></tr><tr><td></td><td>Narishige</td><td>Microforge MF-830</td><td></td></tr><tr><td>Klatka Faradaya</td><td>TMC</td><td>8133306</td><td></td></tr><tr><td>Zacisk ciśnieniowy o dużej prędkości</td><td>ALA Scientific Instruments</td><td>ALA HSPC</td><td></td></tr><tr><td>Pompa ciśnieniowo-próżniowa</td><td>ALA Scientific Instruments</td><td>ALA PV-PUMP</td><td>Do HSPC-1</td></tr></tbody></table>

jednokanałowe nagrywanie z zaciskiem krosowym dołączonym do komórki

One-channel Cell-attached Patch-clamp Recording

Białka kanału jonowego są uniwersalnymi urządzeniami do szybkiej komunikacji między błonami biologicznymi. Sygnatura czasowa generowanego przez nie strumienia jonowego zależy od właściwości właściwych dla każdego białka kanałowego, a także od mechanizmu, za pomocą którego jest ono generowane i kontrolowane, i stanowi ważny obszar obecnych badań. Informacje na temat dynamiki operacyjnej białek kanałów jonowych można uzyskać, obserwując długie odcinki prądu wytwarzanego przez pojedynczą cząsteczkę. Opisano tutaj protokół uzyskiwania jednokanałowych zapisów prądu patch-clamp dołączonych do komórek dla kanału jonowego bramkowanego ligandem, receptora NMDA, wyrażanego heterologicznie w komórkach HEK293 lub natywnie w neuronach korowych. Podano również instrukcję, jak dostosować metodę do innych interesujących kanałów jonowych, przedstawiając przykład mechanoczułego kanału PIEZO1. Metoda ta może dostarczyć danych dotyczących właściwości przewodnictwa kanału i czasowej sekwencji konformacji otwarty-zamkniętych, które składają się na mechanizm aktywacji kanału, pomagając w ten sposób zrozumieć ich funkcje w zdrowiu i chorobie.

Rekombinowane receptory NMDA
Receptory NMDA wiążą i reagują na jednoczesne działanie dwóch koagonistów: glutaminianu i glicyny. Składają się one z heterotetramerów obejmujących dwie podjednostki GluN1 wiążące glicynę oraz dwie podjednostki GluN2 wiążące glutaminian. Podjednostki GluN2 są kodowane przez cztery geny (A-D), z których najszerzej transkrybowanymi formami w mózgu są GluN2A u osobników dorosłych oraz GluN2B u osobników młodocianych. Ze względu na różnorodność podtypó...

Tutaj opisano procedurę uzyskiwania długich odcinków zapisu prądu z jednego kanału jonowego za pomocą techniki patch-clamp dołączonej do komórki. Metoda ta pozwala na obserwację w czasie rzeczywistym wzorca konformacji kanałów otwórz-zamknij, które leżą u podstaw sygnału biologicznego. Dane te informują o właściwościach kanałów w niezakłóconych błonach biologicznych.

Jednokanałowe nagrywanie z zaciskiem krosowym dołączonym do komórki

Ion channel proteins are universal devices for fast communication across biological membranes. The temporal signature of the ionic flux they generate ...

Ogólnym celem niniejszej procedury jest pomiar prądu elektrycznego przepływającego przez pojedynczy kanał jonowy. Osiąga się to najpierw poprzez heterologiczną ekspresję badanego kanału jonowego w komórkach, które są łatwe w obsłudze i sprzyjają realizacji celów eksperymentalnych. Drugim krokiem jest użycie wypalanej pipety w celu uzyskania szczelnego połączenia z błoną komórkową.Następnie eksperymentator powinien określić liczbę kanałów obecnych w łacie; jeśli zarejestrowano prąd pojedynczego kanału, ostatnim krokiem jest przetworzenie i analiza danych. Ostatecznie rejestracja prądu z pojedynczych kanałów jonowych służy do badania właściwości biofizycznych, dzięki którym działają te białka błonowe, co stanowi podstawę komunikacji neuronów i innych komórek pobudliwych. W przeciwieństwie do metod pozwalających na pomiar prądów przepływających przez wiele aktywnych kanałów jonowych, zaletą tego podejścia jest to, że pomiar prądów przez pojedynczy kanał jonowy umożliwia wizualizację i wyodrębnienie szerokiego zakresu wzorców odpowiedzi charakterystycznych dla konkretnego kanału.Metodę tę można wykorzystać do udzielenia odpowiedzi na kluczowe pytania w dziedzinie neuronauki, takie jak wpływ modulatorów fizjologicznych i terapeutycznych na komunikację między neuronami. Zazwyczaj osoby rozpoczynające pracę z tą techniką napotykają trudności, ponieważ trudno jest uzyskać rejestracje o niskim poziomie szumów, które obejmują tylko pojedynczy kanał jonowy. Przy pierwszej próbie zastosowania tej metody niezwykle pomocne jest obserwowanie osoby doświadczonej, ponieważ aby uzyskać naprawdę stabilne uszczelnienie (seal), co jest najważniejszym elementem tej metody, należy delikatnie zbliżać się do komórki pod odpowiednim kątem, a co najważniejsze, należy wykazać się wytrwałością w przygotowaniach do transfekcji.Komórki HEK 293 wysiewa się do szalek 35 mm z jednodniowym wyprzedzeniem, aby osiągnęły 50 do 60% konfluencji. W sterylnej probówce przygotowuje się mieszaninę do transfekcji. Dodaje się 1 µg każdego interesującego cDNA, 315 µl wody dwukrotnie destylowanej oraz 350 µl 42 mM HEPES.Na koniec, dodaj kroplami 35 µL chlorku wapnia, aby utworzyć osad. Mieszaj probówkę na wortexie przez pięć sekund, a następnie dodaj 175 µL zawiesiny do transfekcji do każdej z czterech płytek, wysianych dzień wcześniej.Inkubować komórki w temperaturze 37 °C przez dwie godziny. Po inkubacji usunąć medium i przemyć PBS. Następnie dodać 2 ml medium wzrostowego, uzupełnionego o 2 mM chlorku magnezu, aby zapobiec ekscytotoksyczności pośredniczonej przez receptory MDA.W pierwszej kolejności wyciągnij dwie symetryczne pipety rejestrujące z borokrzemianowego szkła, korzystając z pionowego wyciągacza. Następnie konieczne jest wypalanie końcówek w celu uzyskania odpowiedniej średnicy i oporu. W kolejnym kroku przygotuj stanowisko do rejestracji, uruchamiając oprogramowanie do akwizycji danych QUB i wybierając okno akwizycji.W sekcji układu (layout). Otwórz nowy plik danych QUB, klikając „new data”, i wprowadź parametry eksperymentalne, które będą wykorzystywane. Dostosuj skalowanie amplitudy do 0.1 volts per pico amp, klikając prawym przyciskiem myszy na plik danych, wybierając właściwości (properties), a następnie klikając zakładkę danych (data).Po zastąpieniu pożywki dwiema mililitrami PBS zawierającego wapń i magnez, umieść szalkę z komórkami na stole mikroskopu. Ustaw ostrość na pole z komórkami, korzystając z mikroskopii kontrastowej w fazie, aby ocenić, czy komórki są zdrowe i dobrze przylegają do szalki w formie monowarstwy. Przełącz na detekcję fluorescencyjną, aby zweryfikować, czy transfekcja przebiegła pomyślnie.Następnie należy ustawić parametry dla rejestracji z pojedynczego kanału. Za pomocą polecenia utrzymania napięcia ustaw tryb na voltage clamp, a przyłożone napięcie na +100 mV. W pozycji wyłączonej wybierz przycisk testu szczelności (seal test) w oparciu o fluorescencję i ogólny wygląd.Wybierz komórkę do patch-clampu i sprawdź w kontraście fazowym, czy komórka jest dobrze przytwierdzona do szalki, posiada duży obszar powierzchni dostępny do założenia pipety i w innym względzie wygląda na zdrową. Napełnij świeżo wypolerowaną pipetę roztworem odpowiednim dla receptorów NMDA oraz eksperymentów typu cell-attached, a następnie delikatnie potrząśnij, aby usunąć pęcherzyki powietrza. Zamocuj pipetę rejestrującą w głowicy wzmacniacza i upewnij się, że srebrny drucik jest zanurzony w roztworze pipety, aby zapobiec przedostaniu się roztworu kąpieli do wnętrza pipety.Podczas podejścia należy użyć małej plastikowej strzykawki podłączonej do uchwytu pipety, aby delikatnie przyłożyć nadciśnienie. Następnie, za pomocą mikromanipulatora, należy wprowadzić pipetę do kąpieli. Po zamknięciu obwodu elektrycznego należy ustawić ją bezpośrednio nad komórką wybraną do patchowania.Po wprowadzeniu do kąpieli należy zwrócić uwagę na oscyloskop. Opór pipety powinien mieścić się w optymalnym zakresie, podczas gdy pozycja pipety jest monitorowana wizualnie pod mikroskopem, a jej opór elektrycznie na oscyloskopie. Należy kontynuować zbliżanie w małych przyrostach, aż pipeta delikatnie dotknie komórki.Sygnał testowy nieznacznie spadnie, co będzie wskazywać na zwiększony opór. Aby utworzyć uszczelnienie, należy chwycić strzykawkę i delikatnie przyłożyć niewielkie podciśnienie poprzez boczną rurkę. Wskazaniem utworzenia uszczelnienia po pociągnięciu tłoka strzykawki jest całkowite spłaszczenie przebiegu sygnału testowego na oscyloskopie.Na wzmacniaczu przesuń przełącznik poleceń zewnętrznych z pozycji seal test na off. Przełącz polecenie podtrzymania napięcia z off na positive i zwiększ wzmocnienie z 10 x do 100 x.Obserwuj oscyloskop w celu wykrycia aktywności kanałów, która w przypadku wystąpienia będzie widoczna jako kwadratowe wychylenia w dół względem wcześniej płaskiej linii bazowej. Jeśli na oscyloskopie pojawi się aktywność kanałów, rozpocznij akwizycję danych do wcześniej otwartego pliku cyfrowego w programie QUB, naciskając przycisk play, a następnie przycisk record. Aby zatrzymać akwizycję danych, naciśnij przycisk stop w programie QUB i zapisz plik QDF; sygnał, który nie wyrównuje się całkowicie, lub linia bazowa, która staje się zaszumiona i niestabilna, mogą wskazywać na słuszną szczelność.W takim przypadku należy usunąć i wyrzucić pipetę, a następnie powtórzyć kolejne kroki z nową pipetą, aż do uzyskania odpowiedniego uszczelnienia. Aby rozpocząć proces analizy danych, otwórz plik z zapisanymi danymi w programie QUB i sprawdź aktualny ślad w interfejsie wstępnym. W sekcji układ.Usuń filtr cyfrowy, aby wyświetlić zarejestrowany ślad w pełnej szerokości pasma, odznaczając pole oznaczone jako fc. Przeskanuj wzrokowo ślad w celu zidentyfikowania nieprawidłowości i artefaktów Brief. Skoki prądu można skorygować poprzez zaznaczenie sąsiedniego, czystego obszaru tej samej klasy przewodnictwa.Klikając prawym przyciskiem myszy i wybierając najpierw opcję set erase buffer, powiększ piki, aż widoczne staną się pojedyncze punkty próbkowania. Zaznacz obszar do zastąpienia, podświetlając wyłącznie ten region. Kliknij prawym przyciskiem myszy i wybierz opcję erase, aby skorygować linię bazową dla całego zapisu.Zdefiniuj linię bazową prądu zerowego, wybierając wczesny fragment zapisu, w którym linia bazowa jest stabilna. Zaznacz ten obszar, kliknij prawym przyciskiem myszy i wybierz opcję ustaw linię bazową. Gdy pojawi się linia bazowa, potwierdź poprzez inspekcję wizualną, że dokładnie reprezentuje ona poziom linii bazowej.Zidentyfikuj w zapisie punkty, w których linia bazowa surowych danych widocznie odbiega od ustawionej linii bazowej. Skoryguj to, wybierając niewielki odcinek linii bazowej w obrębie odchylonego regionu. Kliknij prawym przyciskiem myszy i wybierz polecenie dodawania węzła linii bazowej.W przypadku wystąpienia w zapisie sporadycznych okresów z nadmiernym szumem lub artefaktami, których nie można łatwo skorygować, fragmenty te należy usunąć, ale najpierw trzeba je podzielić na następujące po sobie segmenty. Zaznacz obszar bezpośrednio przed regionem do odrzucenia. Kliknij prawym przyciskiem myszy i wybierz opcję break segment.Następnie zaznacz sekcję przeznaczoną do usunięcia, kliknij prawym przyciskiem myszy, wybierz opcję usuń i zatwierdź klawiszem enter, aby zidealizować zapisy. Przełącz się na interfejs MOD w zakładce układu. W panelu wyświetlania danych zaznacz niewielki fragment zapisu zawierający zarówno zdarzenia zamknięte, jak i otwarte.Przenieś kursor do panelu wysokiej rozdzielczości poniżej i w obrębie wybranego śladu zaznacz czysty odcinek reprezentujący linię bazową. Przenieś kursor do poniższego panelu modelu, kliknij prawym przyciskiem myszy czarny kwadrat, który reprezentuje stan zamknięty, i wybierz opcję grab. Powtórz tę procedurę dla otwarć kanału, zaznaczając fragment śladu reprezentujący przewodnictwo w stanie otwartym.Kliknij prawym przyciskiem myszy czerwony kwadrat w panelu modelu i wybierz opcję grab. Wykonaj idealizację dla wybranego fragmentu zapisu, wybierając przycisk SEL w sekcji data source. Następnie kliknij prawym przyciskiem myszy kartę idealized znajdującą się pod sekcją modeling w wysuwanym panelu.Zweryfikuj, czy pożądane parametry analizy są poprawne, a następnie kliknij run. Wynik idealizacji wraz z histogramem amplitud dla wybranego fragmentu zostanie nałożony na dane, aby umożliwić wizualną inspekcję idealizacji. W razie potrzeby dostosuj parametry idealizacji w celu uzyskania najlepszego wyniku i powtórz czynność, lub wykonaj idealizację dla całego pliku, wybierając przycisk file w sekcji data source.Następnie kliknij prawym przyciskiem myszy na zakładce idealized i wybierz run. Wyświetlone zostaną wyniki dla całego pliku. Przy nałożeniu na dane, dokładnie sprawdź zgodność między śladem idealnym a zarejestrowanymi danymi.Sporadycznie zdarza się, że błędnie zidentyfikowane zdarzenia mogą zostać wykluczone z idealizowanego śladu. Kliknij prawym przyciskiem myszy na fałszywe zdarzenie i wybierz opcję „join IDL”. Przedstawione tutaj są prądy wyłącznie jonów wapnia przepływających przez pojedynczy receptor NMDA w komórce HEK 2 93.Z zastosowaniem techniki patch-clamp w konfiguracji przytwierdzonej (cell-attached), idealizacja danych pozwala na uzyskanie histogramów amplitud, które w tej komórce dobrze dopasowują się do dwóch odrębnych klas konduktancji. Podczas rejestracji w konfiguracji przytwierdzonej z komórek HEK 2 93, jeden kanał wrażliwy na Meno zostaje aktywowany przez -20 mM rtęci podawanej przez pipetę patch podczas stałego przyłożenia napięcia.Czerwona przerywana linia wskazuje poziom prądu zerowego. Te zapisy z kanałów natywnych pokazują ciągłą aktywność receptorów NMDA zarejestrowaną z somy neuronu, który został wyizolowany z kory przedczołowej zarodka szczura i utrzymywany w hodowli przez 5 lub 27 dni. Po opanowaniu techniki procedura ta może być przeprowadzona w czasie od 30 minut do jednej godziny, w zależności od czasu trwania rejestracji.Po zastosowaniu tej procedury można przeprowadzić inne metody, takie jak analiza kinetyczna i modelowanie stanów, aby określić mechanizm bramkowania kanału oraz oszacować szybkości reakcji. Po obejrzeniu tego filmu powinni Państwo posiadać wystarczającą wiedzę na temat tego, jak rejestrować i rozpocząć analizę prądów płynących przez pojedyncze białko kanału jonowego.

one-channel-cell-attached-patch-clamp-recording

Research

JoVE Journal

Biology

Biologia

Jednokanałowe nagrywanie Patch-clamp z komórką załączoną

Niniejszy materiał stanowi wprowadzenie do rejestracji metodą patch clamp z oocytów Xenopus laevis. Obejmuje on usuwanie błony witelinowej, tworzenie uszczelnienia gigaomowego (gigaseal) oraz opcjonalną konwersję patcha do topologii outside-out.

Rejestracja metodą patch clamp kanałów jonowych ekspresowanych w oocytach Xenopus

Ten protokół opisuje technikę zwaną elektrofizjologią klamer całokomórkowych, która jest metodą badania właściwości elektrycznych neuronów Mauthnera i innych komórek siateczkowo-rdzeniowych w zarodkach danio pręgowanego.

Elektrofizjologia klamer krosowych całych komórek: metoda badania właściwości elektrycznych neuronów

Ten film demonstruje procedurę wykonywania zapisów elektrofizjologicznych w neuronach istoty żelowej (SG) wycinków rdzenia kręgowego, przy użyciu technik całokomórkowych kropek do analizy wzorców uruchamiania neuronów. Metoda ta pozwala na badanie reakcji neuronalnych na bodźce w neuronach SG rdzenia kręgowego.

Zapis klamry krosowej całej komórki w neuronie istoty żelatynowej wycinka rdzenia kręgowego

Ten film demonstruje procedurę mapowania połączeń synaptycznych poprzez zabezpieczenie wycinka mózgu, ustawienie pipet w celu uzyskania konfiguracji całych komórek i stymulowanie neuronów presynaptycznych do rejestrowania odpowiedzi postsynaptycznych, wyjaśniając w ten sposób łączność neuronalną.

Zapis sparowanych połączeń neuronalnych w ostrych wycinkach mózgu

Ten film demonstruje badanie pobudliwości neuronów czuciowych w zwojach korzenia grzbietowego za pomocą techniki zacisku łatkowego do pomiaru potencjału reozasady i błony, analizując reakcje neuronów na przyrostowe wstrzyknięcia prądu.

Nagrania klamry krosowej całej komórki na nienaruszonych zwojach korzenia grzbietowego szczura

Opracowaliśmy nienaruszony preparat mózgowo-rdzeniowy do rejestrowania i monitorowania aktywności elektrycznej za pomocą zapisu za pomocą zacisku punktowego z neuronów Mauthnera i innych komórek siateczkowo-rdzeniowych w zarodkach danio pręgowanego. W ten sposób jesteśmy w stanie rejestrować pobudzające i hamujące prądy synaptyczne, aktywność kanałów bramkowanych napięciem oraz potencjały czynnościowe z kluczowych neuronów w rozwijającym się zarodku.

Nagrania patch clamp z embrionalnych komórek Mauthnera danio pręgowanego

Ten protokół opisuje podstawowe kroki proceduralne do wykonywania nagrań z użyciem krosówek dla całej komórki. Technika ta pozwala na badanie zachowania elektrycznego neuronów, a gdy jest wykonywana w wycinkach mózgu, pozwala na ocenę różnych funkcji neuronalnych z neuronów, które są nadal zintegrowane w stosunkowo dobrze zachowanych obwodach mózgowych.

Nagrania z użyciem zacisku krosowego całych komórek w wycinkach mózgu

Ten manuskrypt opisuje, jak przygotować nienaruszone zwoje korzenia grzbietowego do nagrań z zaciskiem łatowym. Preparat ten utrzymuje mikrośrodowisko dla neuronów i satelitarnych komórek glejowych, unikając w ten sposób zmian fenotypowych i funkcjonalnych obserwowanych przy użyciu zdysocjowanych neuronów DRG.

Nagrania zacisków łatkowych na nienaruszonych zwojach korzenia grzbietowego od dorosłych szczurów

Ten artykuł opisuje, jak selektywność jonowa rodopsyny kanałowej jest określana za pomocą elektrofizjologicznych zapisów całokomórkowych z użyciem komórek HEK293. W tym miejscu przedstawiono eksperymentalną procedurę badania selektywności chlorkowej selektywnej dla anionów rodopsyny kanałowej. Procedura ta może być jednak przenoszona na inne rodopsyny kanałowe o wyraźnej selektywności.

Zapisy całokomórkowe patch-clamp do elektrofizjologicznego oznaczania selektywności jonowej w rodopsynach kanałowych

Prezentujemy podstawowe techniki rejestracji metodą patch clamp z błony presynaptycznej w kielichu Held (calyx of Held), który jest zakończeniem nerwowym w centralnym układzie nerwowym ssaków.

Metody pomiarów pojemności metodą patch-clamp w kaliksie

Naucz się jednokanałowego nagrywania prądu jonowego z zaciskiem krosowym dołączonym do komórki. Ta metoda elektrofizjologiczna umożliwia badanie właściwości biofizycznych pojedynczych kanałów jonowych w czasie rzeczywistym.

Jednokanałowe nagrywanie z zaciskiem krosowym dołączonym do komórki

Przeglądaj więcej filmów