Metoda przenikania zarodków Drosophila do oznaczania aktywności drobnocząsteczkowej
13 lipca 2014
Wprowadzenie małych cząsteczek do rozwijającego się zarodka Drosophila daje ogromne możliwości do charakteryzowania aktywności biologicznej nowych związków, leków i toksyn, a także do badania podstawowych ścieżek rozwojowych. Opisane tu metody nakreślają kroki, które pokonują naturalne bariery dla tego podejścia, rozszerzając użyteczność modelu zarodka Drosophila.
Ogólnym celem poniższego eksperymentu jest przygotowanie żywotnych zarodków drosophila z przepuszczalną skorupką jaja w celu zbadania bioaktywności wprowadzonych leków małocząsteczkowych lub toksyn. Osiąga się to poprzez najpierw potraktowanie zarodków w stadium rozwojowym rozcieńczonym wybielaczem w celu usunięcia zewnętrznych warstw skorupki jaja kosmówkowego. Drugim krokiem jest przesiąknięcie zarodków rozpuszczalnikiem, który zubaża cienką warstwę woskowej skorupki jaja, która blokuje substancje rozpuszczone w małych cząsteczkach.
Trzecim krokiem jest potraktowanie zarodków lekiem lub toksyną i barwnikiem, aby jednocześnie ocenić przepuszczalność skorupki jaja i wprowadzić interesujący związek. Po dalszym rozwoju zarodki mogą być bezpośrednio obrazowane lub przetworzone do celów immunohistochemicznych. Ostatecznie wyniki mogą wykazać aktywność leku lub toksyny na rozwój tkanek określony za pomocą mikroskopii fluorescencyjnej z odczynnikami immunologicznymi lub więzami życiowymi.
Dzisiaj przedstawię naszą metodę przenikania zarodków drosophila do oznaczania aktywności drobnocząsteczkowej. Główne zalety tej techniki w porównaniu z istniejącymi metodami, takimi jak stosowanie konwencjonalnych rozpuszczalników organicznych, takich jak heptan do perme. Skorupka jajka polega na tym, że nasz rozpuszczalnik do przenikania zarodków lub EPS jest podatny na wodę i stosunkowo nietoksyczny.
Właściwości te ułatwiają leczenie zarodków, dzięki któremu ekspozycja na rozpuszczalnik może być bardziej precyzyjnie kontrolowana i może być przeprowadzana w fizjologicznie odpowiednich podłożach, co skutkuje większą żywotnością zarodków. Po raz pierwszy wpadłem na pomysł tej metody, gdy zastanawiałem się, jak usunąć woskową warstwę skorupki jajka. Będąc narciarzem, zastanawiałem się nad powszechnym stosowaniem rozpuszczalnika cytrusowego do usuwania resztek wosku z podstawy nart.
To skłoniło mnie do przetłumaczenia tej aplikacji na skorupkę jaja zarodka muchy i po kilku próbach i błędach doprowadziło do rozwiązania kompozycji EPS, Przygotuj klatki populacyjne z co najmniej 500 muchami w wieku godowym pożądanych szczepów. Klatki powinny być wyposażone w 10-centymetrowy sok winogronowy. Napowietrza się odrobiną pasty drożdżowej.
Wymieniaj te talerze dwa razy dziennie. Po kilku dniach muchy zostaną kondycjonowane do kultury i będą składać zarodki bardziej regularnie. EPS jest wykonany ze środków powierzchniowo czynnych i ograniczających roztworów rozpuszczalników i jest dobry przez dwa miesiące.
W przypadku przechowywania w temperaturze pokojowej należy ogrzać środki powierzchniowo czynne do 37 stopni Celsjusza podczas mieszania świeżego EPS Do leczenia EPS zarodki są obsługiwane za pomocą koszy wykonanych z trzech centymetrów, a więc 50-mililitrowej rurki polipropylenowej i nylonowej siatki są szorstkie. Plastikowe krawędzie łatwiej topią się z siatką na późniejszych etapach rozwoju. Zarodki są również obsługiwane za pomocą koszy wykonanych z nakrętek 50-mililitrowych probówek.
Nasadka jest wywiercona i nacięta, a gwint między nasadką a rurką zabezpiecza siatkę. Alternatywnie stosuje się lokalnie komorę ślizgową maszyny, którą przygotowuje się z kawałkiem przepuszczalnym dla tlenu. Wykonaj błonę zabezpieczoną nad otworem za pomocą pierścienia ustalającego, aby zebrać zarodki.
Rano na kulturze ustaw świeży talerz winogronowy z pastą drożdżową. Po godzinie zmień płytkę i wyrzuć pierwszą zebraną płytkę. Pozwól drugiej płytce zbierać zarodki przez dwie godziny w temperaturze 25 stopni Celsjusza.
Następnie zbierz płytkę i przenieś ją do 18 stopni Celsjusza.Tam. Pozwól zarodkom rozwinąć się do pożądanego etapu. Gdy zarodki są gotowe, usuń je z powłoki przed zabiegiem EPS.
Spłucz je z talerza do kosza na zacier wodą i za pomocą pędzla. Po drugie, opłucz je w delikatnej bieżącej wodzie, aby usunąć wszelkie zanieczyszczenia. Po trzecie, zanurz je w 50% wybielaczu na dwie minuty z okresową cyrkulacją roztworu wybielacza.
Następnie natychmiast spłucz je bieżącą wodą. Teraz napełnij sześć 60-milimetrowych naczyń, z których każde zawiera 10 mililitrów PBS, aby działały jako kąpiele i rozcieńcz od jednego do 40 EPS w MBIM, zamieszaj mieszankę. Utworzy się biała emulsja, osusz nadmiar wody z dna kosza siatkowego za pomocą chusteczki i zanurz zarodki w rozcieńczeniu EPS ciągłym ruchem wirowym.
Po zawirowaniu zarodków w EPS przez 30 sekund usuń je i zetrzyj nadmiar roztworu. Następnie przesuń kosz między sześcioma kąpielami PBS, delikatnie spryskując, aby spłukać i przystąp do leczenia farbą i lekami. Optymalizacja przepuszczalności i żywotności jest najtrudniejszą częścią tego protokołu.
Przepuszczalność jest wrażliwa na etap rozwoju zarodka. Temperatura, w której zarodki dojrzewają, może się również znacznie różnić między poszczególnymi szczepami much. Najlepsze parametry rozcieńczenia EPS i czasu ekspozycji muszą być ustalone empirycznie.
Najpierw przygotuj 50 mikromolowy roztwór barwnika kwasu karboksylowego sci-fi w M-B-I-M-T, wystarczy jeden mililitr w probówce z mikrofiszami. Na tym etapie można dodać toksynę lub lek w celu wymieszania wiru leczenia ostrego. Przenieś zarodki do trwałej ondulacji z kosza do probówki micro fuge za pomocą pędzla.
Zakryj rurkę i odwróć ją kilka razy. Następnie załaduj probówkę do mutatora i pozwól im inkubować przez 15 minut. Po ustabilizowaniu się zarodków usuń barwnik pipetą i dodaj z powrotem jeden mililitr M-B-I-M-T do przemycia. Resus.
Zawieś zarodki, pozwól im się uspokoić i wymień M-B-I-M-T. Następnie zrób to po raz trzeci i czwarty. Po zakończeniu czwartego etapu należy usunąć wszystkie M-B-I-M-T i przenieść zarodki do koszyka rozwojowego na długie okresy rozwoju.
W przypadku kosza rozwojowego najpierw przygotuj kosz z płukanką z 70% etanolu, a następnie zanurz go w wodzie, osusz krwią chusteczką laboratoryjną. Po zakończeniu. Następnie przenieś kosz do 60-milimetrowego naczynia z sześcioma mililitrami pożywki inkubacyjnej zawierającej żądany lek lub toksynę.
Przenieś zarodki na siatkę w koszu za pomocą pędzla, delikatnie upuszczając na nie pożywkę inkubacyjną, rozprowadź zarodki w monowarstwie. Uważaj, aby nie uwięzić pęcherzyków powietrza pod siatką. Aby najpierw użyć komory suwakowej, przygotuj komorę, odwróć komorę suwaka i umieść cienką kroplę smaru próżniowego wokół krawędzi otworu.
Następnie załaduj 150 mikrolitrów żądanego medium na powierzchnię membrany do w otworze. Teraz przenieś zarodki na pożywkę za pomocą pędzla i rozprowadź je po błonie. Na koniec nałożyć okrągłe szkiełko nakrywkowe o średnicy 25 milimetrów, spłaszczając podłoże.
Lekko dociśnij na obwodzie, aby zapewnić uszczelnienie. Hodowla zarodków w temperaturze 18 stopni Celsjusza ma silny wpływ na ich zdolność do trwałej ondulacji przez EPS i wchłaniania barwnika w późnych stadiach rozwoju. Ilustruje to brak wychwytu Rumine BD w zarodkach poddanych działaniu EPS hodowanych w temperaturze 25 stopni Celsjusza, wychwyt barwnika kwasem karboksylowym w science fiction widoczny tutaj na czerwono, co ujawnia różne poziomy przepuszczalności zwykle obserwowane w zarodkach traktowanych EPS.
Dynamiczny rozkład dalekiego czerwonego barwnika science-fiction podczas rozwoju i jego konsolidacja w żółtku w rozwiniętym jelicie, obserwowana za pomocą niebieskiej autofluorescencji, ujawnia kryterium stosowane do oceny żywotności. Barwnik science-fiction może również określić wcześniejszą przepuszczalność zarodka po utrwaleniu formaldehydu i barwieniu immunologicznym. Po tym, jak zarodki EPS zostały potraktowane barwnikiem science-fiction i toksyną metylortęciową, są barwione Antifa dwa widoczne na zielono, aby oznaczyć neurony ruchowe i laboratorium anty E na czerwono, aby oznaczyć ciała komórek neuronów.
Barwnik sci-fi jest pseudo kolorowy na niebiesko. Mertęć metylowa ma wpływ na wzorzec ciał komórek neuronów kortonowych oznaczony strzałkami w zarodkach kontrolnych poddanych zabiegowi. Neurony te mają bardziej uporządkowane powięziowo, dwa pokazane tutaj na biało ilustrują normalne rozgałęzienia neuronów segmentowych w leczeniu kontrolnym, odnotowane przez groty strzałek.
Dla porównania, leczenie metylortęcią zmienia wzór rozgałęzień, jak oznaczono ciągłymi zielonymi strzałkami. Pusta zielona strzałka oznacza, gdzie rozgałęzienia zostały przemieszczone. Po opanowaniu zabiegi przenikania zarodków w tej technice można wykonać w ciągu około 30 lub 40 minut, jeśli są wykonywane prawidłowo.
Po tej procedurze można wykonać inne metody, takie jak utrwalanie i barwienie immunologiczne zarodków, aby odpowiedzieć na dodatkowe pytania, takie jak to, jakie konkretne tkanki są celem leku lub toksyny podczas rozwoju. Dziękuję za obserwowanie tej procedury i życzę powodzenia w stosowaniu tych metod w swoim laboratorium.
Wyświetl pełny transkrypt i uzyskaj dostęp do tysięcy filmów naukowych
Przegląd
W niniejszym artykule opisano metodę przygotowania żywotnych embrionów Drosophila o przepuszczalnej otoczce jajowej w celu przetestowania bioaktywności leków będących małymi cząsteczkami lub toksyn. Podejście to ma na celu zwiększenie użyteczności modelu embrionów Drosophila w badaniach biologicznych.
Kluczowe elementy badania
Dziedzina nauki
- Neuronauka
- Biologia rozwoju
- Farmakologia
Wstęp
- Zarodki Drosophila służą jako model do badania procesów rozwojowych.
- Małe cząsteczki mogą wpływać na aktywność biologiczną i szlaki rozwojowe.
- Naturalne bariery w zarodkach ograniczają wprowadzanie związków.
- Przełamanie tych barier może rozszerzyć możliwości badawcze.
Cel badania
- W celu przygotowania embrionów Drosophila do testowania małocząsteczkowych leków lub toksyn.
- W celu oceny przepuszczalności skorupki jaja dla różnych związków.
- W celu oceny wpływu wprowadzonych substancji na rozwój tkanek.
Zastosowane metody
- Opracowanie zarodków w rozcieńczonym podchlorynie sodu w celu usunięcia zewnętrznych warstw błony chorionowej.
- Zastosowanie rozpuszczalnika do usunięcia woskowej warstwy skorupki jaja.
- Wprowadzenie leków lub toksyn wraz z barwnikiem w celu oceny przepuszczalności.
- Obrazowanie lub przygotowanie zarodków do immunohistochemii po przeprowadzeniu zabiegu.
Główne wyniki
- Pomyślne przygotowanie embrionów z przepuszczalnymi skorupkami jaj.
- Wykazanie bioaktywności wprowadzonych związków w procesie rozwoju.
- Mikroskopia fluorescencyjna ujawniła wpływ na rozwój tkanek.
- Odczynniki immunologiczne potwierdziły aktywność leków lub toksyn.
Wnioski
- Metoda ta udoskonala model embrionu Drosophila do testowania leków.
- Dostarcza ona wiedzy na temat wpływu małych cząsteczek na rozwój.
- Podejście to może zostać zastosowane w różnych badaniach biologicznych.
Najczęściej zadawane pytania
Znaczenie dla przemysłu
Metoda ta umożliwia wykorzystanie embrionów Drosophila jako systemu przepuszczalnego do przesiewania małych cząsteczek, co rozwiązuje kluczowy problem w farmakologii rozwojowej. Dzięki przełamaniu nieprzepuszczalności skorupki jaja przy jednoczesnym zachowaniu żywotności, metoda ta wspiera wczesną walidację celów terapeutycznych oraz ograniczanie ryzyka mechanistycznego. Podejście to zwiększa pewność prognostyczną w ocenie wpływu związków na szlaki rozwojowe, dostarczając istotnych informacji przy podejmowaniu decyzji dotyczących portfela w procesie identyfikacji związków wiodących.
Zastosowania strategiczne w badaniach i rozwoju biofarmaceutycznym
Wczesne odkrywanie i walidacja celu
- Wartość naukowa: Umożliwia weryfikację hipotez terapeutycznych poprzez badanie aktywności małych cząsteczek w rozwijających się tkankach.
- Wartość operacyjna: Dostarcza genetycznie modyfikowalnego modelu do funkcjonalnej walidacji celów in vivo.
- Wartość prognostyczna: Wspiera redukcję ryzyka biologicznego poprzez bezpośrednią obserwację fenotypowych zmian wywołanych przez związki.
Przesiewanie i opracowanie testu
- Gotowość do analizy: Pozwala na uzyskanie ustandaryzowanych, przepuszczalnych embrionów kompatybilnych z odczytami fluorescencyjnymi do screeningu związków.
- Wynik ilościowy: Wykorzystuje pobór barwnika (np. CY5) jako wskaźnik przepuszczalności w celu normalizacji ekspozycji na związek w poszczególnych dołkach.
- Skalowalność: Kompatybilność z formatami wielodołkowymi i automatycznym obrazowaniem w zastosowaniach średnioprzepustowych.
Badania translacyjne i przedkliniczne
- Znaczenie dla chorób: Ma zastosowanie w modelach zaburzeń rozwojowych, w których ekspozycja embrionalna pozwala przewidzieć ryzyko teratogenne.
- Ciągłość translacyjna: Łączy wyniki badań in vitro z kontekstem rozwojowym zbliżonym do warunków in vivo w celu usprawnienia modelowania predykcyjnego.
- Minimalizacja ryzyka mechanistycznego: Pozwala wyjaśnić, czy obserwowane efekty wynikają z przepuszczalności związku, czy z jego wewnętrznej bioaktywności.
Integracja potoku i przepływu pracy
Metoda ta wpisuje się w wczesne etapy procesów odkrywania leków, umożliwiając ocenę związków po identyfikacji celu i przed optymalizacją związku wiodącego, w szczególności w przypadku modulatorów ścieżek rozwojowych.
- Biologia odkrywcza: Wspiera testowanie hipotez poprzez powiązanie ekspozycji na małe cząsteczki z fenotypami rozwojowymi za pomocą reporterów fluorescencyjnych.
- Przesiewanie: Zapewnia powtarzalne, ilościowe odczyty przepuszczalności i aktywności w połączeniu z barwnikami ratiometrycznymi.
- Analityka: Umożliwia normalizację efektów związków przy użyciu wskaźników przepuszczalności, co poprawia porównywalność danych w różnych warunkach.
- Badania translacyjne: Łączy wczesne przesiewanie fenotypowe z przedkliniczną oceną teratologiczną poprzez konserwowane szlaki rozwojowe.
- Ponowne wykorzystanie w przedsiębiorstwie: Tworzy platformę wielokrotnego użytku do przesiewania bibliotek związków na wielu etapach rozwoju i w różnych tłach genetycznych.
Wpływ operacyjny i przedsiębiorstwa
- Wartość naukowa: Zwiększa pewność co do celu poprzez potwierdzenie dostępu związku do tkanek embrionalnych.
- Wartość operacyjna: Poprawia powtarzalność dzięki standaryzacji etapów permeabilizacji i płukania.
- Wartość strategiczna: Redukuje liczbę wyników fałszywie ujemnych w badaniach przesiewowych poprzez zapewnienie dostarczenia związku, co zwiększa dokładność wskaźnika trafień.
- Wpływ na portfolio: Wspiera decyzje o kontynuowaniu lub przerwaniu badań (go/no-go), dostarczając wczesnych sygnałów toksyczności rozwojowej.
Wskazówki dotyczące wdrożenia
- Wymaga doświadczenia w pracy z muszkami Drosophila, określaniu stadium rozwoju zarodków oraz optymalizacji procesu permeabilizacji.
- Zależy od dostępu do rozpuszczalnika EPS, związków barwników oraz systemów obrazowania fluorescencyjnego.
- Wymaga standaryzacji wieku zarodków, temperatury oraz czasu ekspozycji na EPS dla wszystkich użytkowników.
- Wiąże się z koniecznością dostosowania procedury do różnych tła genetycznych i etapów rozwoju.
- Obejmuje ograniczenia praktyczne, takie jak zmienność zarodków oraz optymalizacja przepuszczalności dla poszczególnych szczepów.
