Name: System hodowli ex vivo do badania rozwoju tarczycy (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-06-06T13:45:00.000+00:00
Duration: 8 min 33 s
Description: Poznaj metodę hodowli eksplantów tarczycy myszy ex vivo do badania morfogenezy i różnicowania komórek. Technika ta umożliwia analizę rozwoju gruczołu tarczowego w kontrolowanych warunkach laboratoryjnych.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Praca była wspierana przez granty z Université catholique de Louvain (Action de recherché concertées) i Funduszu Naukowych Badań Medycznych (F.R.S.-FNRS, Belgia). A.-S.D. jest doktorantem w Télévie, A.-C.H. był stypendystą Fonds pour la formation à la Recherche dans l'Industrie et dans l'Agriculture (Belgia), M.V. jest wspierany przez de Duve Institute, a C.E.P. jest starszym pracownikiem naukowym F.R.S.-FNRS (Belgia).

Myszy były hodowane i leczone zgodnie z zasadami opieki nad zwierzętami laboratoryjnymi Uniwersyteckiego Komitetu ds. Dobrostanu Zwierząt. Wszystkie procedury i protokoły zostały zatwierdzone przez ten Komitet.
1. Powlekanie mikroskopowych komór do hodowli tworzyw sztucznych
UWAGA: Wykonaj wszystkie poniższe kroki w sterylnych warunkach w okapie z przepływem laminarnym. Te dwa rodzaje powłok są funkcjonalnie równoważne.
<ol>
	<li>Plastikowe komory hodowlane należy pokryć fibronektyną na dzień przed izolacją tkanek tarczycy:
	<ol>
		<li>Rozcieńczyć sterylną fibronektynę do końcowego stężenia 50 μg/ml w pożywce M199 uzupełnionej 100 U/ml penicyliny, 100 μg/ml streptomycyny, 0,25 μg/ml fungizonu i 2 mM glutaminy12.</li>
		<li>Przykryć studzienki 200 μl rozcieńczonej fibronektyny i inkubować przez noc w lodówce o temperaturze 4 °C.</li>
		<li>W dniu sekcji należy odessać fibronektynę, przepłukać studzienki raz M199 i dodać minimalną objętość 200 μl M199 uzupełnioną antybiotykami, glutaminą i 10% płodową surowicą cielęcą.</li>
		<li>Pozostaw powlekane komory w inkubatorze, aż będą gotowe do ułożenia eksplantatów.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Pokryj plastikowe komory hodowlane kolagenem typu I na 2 godziny przed izolacją tkanek tarczycy:
	<ol>
		<li>Rozcieńczyć sterylny kolagen typu I do końcowego stężenia 50 μg/ml w 10 mM HCl. UWAGA: Roztwór podstawowy kolagenu należy przechowywać na lodzie.</li>
		<li>Przykryj studzienki 200 μl rozcieńczonego kolagenu typu I i inkubuj przez 2 godziny w temperaturze pokojowej (RT).</li>
		<li>Odessać roztwór kolagenu typu I, przepłukać studzienki raz M199 i dodać minimalną objętość 200 μl M199 uzupełnioną antybiotykami, glutaminą i 10% płodową surowicą cielęcą.</li>
		<li>Pozostaw powlekane komory w inkubatorze, aż będą gotowe do ułożenia eksplantatów.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
2. Rozwarstwienie tkanek zawierających anlagen tarczycy (e12.5) lub płatów tarczycy (e13.5-e14.5)
UWAGA: Używaj czystych narzędzi do preparowania i płytek Petriego/kulturowych. Ogólne etapy i nacięcia opisane poniżej są takie same dla zarodków e12.5 i e14.5.
<ol>
	<li>Uśmierc samice myszy w ciąży w czasie w pożądanym dniu embrionalnym (e) (od e12,5 do e14,5) i usuń macicę za pomocą narzędzi preparacyjnych.</li>
	<li>Umieść wypreparowaną macicę w 10-centymetrowej płytce zawierającej HBSS.</li>
	<li>Przytrzymaj jeden koniec macicy kleszczami i otwórz macicę małymi nożyczkami, aby stopniowo uwalniać wszystkie zarodki.</li>
	<li>Oddzielić zarodki od łożyska nożyczkami i przenieść zarodki wraz z ich błonami pozazarodkowymi na nową 10-centymetrową płytkę zawierającą HBSS.</li>
	<li>Usuń woreczek żółtkowy i owodnię. UWAGA: Od tego momentu pracuj pod mikroskopem stereoskopowym z transoświetleniem od dołu; zwiększanie powiększenia z krokami sekcji. Użyj igieł wolframowych w szklanych naczyniach włosowatych jako narzędzi preparacyjnych.</li>
	<li>Za pomocą igieł, takich jak nóż i widelec, usuń górną część głowy, w tym górną szczękę i uszy (ryc. 1A, przeciąć wzdłuż).</li>
	<li>Przytrzymaj zarodek na plecach i usuń najpierw dodatkowy kawałek cewy nerwowej (ryc. 1A, przecięty wzdłuż b), a następnie dolną część zarodka, tuż pod kończynami przednimi i powyżej serca (ryc. 1B).</li>
	<li>Przenieść wycinek zarodka zawierający język (w celu orientacji tkanki) i okolicę szyi na nową 10-centymetrową płytkę zawierającą HBSS.</li>
	<li>Usuń cewę nerwową i tkanki znajdujące się za przełykiem/tchawicą (ryc. 1C, przeciąć wzdłuż a).</li>
	<li>Delikatnie pokrój plasterek tkanki wzdłuż obu stron języka (ryc. 1C, przeciąć wzdłuż b i b').</li>
	<li>Zlokalizuj przełyk i tchawicę w przedłużeniu języka i wypreparuj język, pozostawiając obrzęk arytenoidalny (ryc. 1D, przecięty wzdłuż a) oraz tkankę po obu stronach przełyku/tchawicy (ryc. 1D, przecięty wzdłuż b i b').</li>
	<li>Usuń przełyk i umieść tchawicę brzuszną stroną skierowaną do góry.</li>
	<li>Wypreparuj niepożądane tkanki, takie jak grasica (ryc. 1E) i wszystkie tkanki znajdujące się bocznie do tętnic łuku gardłowego. W przypadku zarodków e13.5 lub e14.5 uwidocznij płaty tarczycy po obu stronach tchawicy (ryc. 1F; czerwone przerywane linie) i dalej wypreparuj płaty z tchawicy.</li>
	<li>Przenieś wyizolowany region tchawicy e12,5 lub płaty tarczycy e13,5-e14,5 na płytkę hodowlaną o średnicy 35 mm zawierającą wstępnie podgrzaną pożywkę M199 uzupełnioną antybiotykami, glutaminą i 10% płodową surowicą cielęcą. Przenieś eksplantaty za pomocą wstępnie zwilżonej końcówki filtra na mikropipecie P-200. W przypadku eksplantatów e12.5 odetnij koniec końcówki, aby poszerzyć otwór. UWAGA: Rutynowo, jeśli zarodki mają ten sam genotyp, wykonaj kroki 6 i 7 na wszystkich zarodkach, następnie 9-11, a na końcu 12 i 13.</li>
</ol>
3. Poszycie i hodowla eksplantatów tarczycy
<ol>
	<li>Umyć eksplantaty przez kolejne przeniesienie do trzech dołków 24-dołkowej płytki zawierającej 1 ml wstępnie podgrzanej pożywki hodowlanej (= M199 uzupełnionej antybiotykami, glutaminą i 10% płodową surowicą cielęcą).</li>
	<li>Posiewanie płatów tarczycy w mikroskopowych komorach hodowlanych z tworzywa sztucznego do mikroskopii powlekanej:
	<ol>
		<li>Odessać pożywkę hodowlaną M199 z powlekanych komór.</li>
		<li>Ostrożnie przenieś eksplantaty tarczycy do komór hodowlanych za pomocą mikropipety i końcówek filtrujących. Umieść jedną eksplantację na środku każdej komory.</li>
		<li>Usunąć nadmiar pożywki i umieścić komorę hodowlaną w inkubatorze do hodowli tkankowych (37 °C; 5% CO2 ) na 2 godziny, aby eksplantaty mogły przyłączyć się do matrycy.</li>
		<li>Delikatnie dodaj od 200 do 300 μl wstępnie podgrzanej pożywki hodowlanej do każdej studzienki.</li>
		<li>Inkubować w celu długotrwałej hodowli w inkubatorze do hodowli tkankowych.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Poszycie okolicy tchawicy lub płatów tarczycy na filtrach półporowatych:
	<ol>
		<li>Wypełnić wymaganą liczbę studzienek 24-dołkowej płytką 330 μl wstępnie podgrzanej pożywki hodowlanej.</li>
		<li>Umieść filtry (np. filtr miliporowy 0,4 μm) na pożywce, uważając, aby nie utknąć pęcherzyków powietrza poniżej filtra hodowlanego.</li>
		<li>Ostrożnie, za pomocą mikropipety i końcówek filtrujących, przenieś eksplantaty tarczycy z minimalną objętością pożywki na środek filtrów (maksymalnie 4/filtr).</li>
		<li>Usuń nadmiar pożywki i rozłóż eksplantaty za pomocą wolframowej igły.</li>
		<li>Inkubować w celu długotrwałej hodowli w inkubatorze do hodowli tkankowych. UWAGA: Zmieniaj pożywkę hodowlaną co drugi dzień pod okapem z przepływem laminarnym. Hoduj eksplantaty do 7 dni.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
4. Protokół barwienia immunofluorescencyjnego dla eksplantatów tarczycy
Usuń eksplantaty wyhodowane na filtrach (po kroku 2 poniżej) za pomocą igieł wolframowych lub cienkich kleszczyków i przenieś do płytki 24-dołkowej dla wszystkich etapów, z wyjątkiem pierwotnej (krok 5) i wtórnej (krok 7) inkubacji przeciwciał (płytka 96-dołkowa). W przypadku przylegających eksplantatów hodowanych w plastikowych komorach mikroskopowych, należy wykonać wszystkie czynności w komorach hodowlanych.
<ol>
	<li>Odessać pożywkę hodowlaną M199 i utrwalić eksplant lodowatym 4% paraformaldehydem (PFA) przez 20 minut (500 μl w naczyniu 24-dołkowym i 300 μl w szkiełkach mikroskopowych).</li>
	<li>Przemyć 2x 10 min w buforowanym roztworze soli fizjologicznej Tris z Tritonem (TBST; 50 mM Tris HCl pH 7,5, 150 mM NaCl, 0,1% Triton X-100) w temperaturze pokojowej.</li>
	<li>Eksplantaty należy natychmiast przetworzyć lub przechowywać w temperaturze -20 °C. UWAGA: W przypadku długotrwałego przechowywania w temperaturze -20 °C, należy odwodnić eksplantaty w metanolu, stopniowo zwiększając stężenie metanolu w TBST, aby osiągnąć 100% metanolu. Gdy będziesz gotowy do kontynuowania barwienia immunologicznego (krok 4), ponownie nawodnij eksplantaty, stopniowo dodając TBST do metanolu.</li>
	<li>Zastąp TBST roztworem blokującym (10% normalnej koziej surowicy w TBST) i inkubuj na kołysce piły morskiej przez 30-60 minut w temperaturze pokojowej.</li>
	<li>Rozcieńczyć przeciwciało pierwszorzędowe w roztworze blokującym (100-200 μl na warunek). Przenieś eksplantaty "filtrujące" z płytki 24-dołkowej do płytki 96-dołkowej. Inkubować eksplantaty z pierwszorzędowymi przeciwciałami na kołysce do piły morskiej przez noc w temperaturze 4 °C.</li>
	<li>Następnego dnia wyrzuć pierwotny roztwór przeciwciała, przenieś eksplantaty "filtrujące" z powrotem do 24-dołkowej płytki i przemyj co najmniej pięć razy TBST na kołysku piły morskiej przez 45-60 minut każdy w temperaturze pokojowej.</li>
	<li>Rozcieńczyć przeciwciało drugorzędowe (np. Goat anty-X-Alexa Fluor w rozcieńczeniu 1:2,000) w TBST zawierającym 1% normalnej surowicy koziej i inkubować eksplantaty w tym rozcieńczeniu przez noc na bujaku do piły morskiej w temperaturze 4 °C i w ciemności. W celu barwienia przeciwstawnego jądrowego należy dodać 1 μg/ml bis-benzimidu (Hoechst) razem z roztworem przeciwciała drugorzędowego.</li>
	<li>Następnego dnia wyrzuć wtórny roztwór przeciwciała i przemyj 5x TBST na kołysce piły morskiej przez 45-60 minut w temperaturze pokojowej. Podczas prania trzymaj eksplantaty w ciemności.</li>
	<li>Wykonaj dodatkowe pranie w TBST, delikatnie mieszając przez noc w temperaturze 4 °C w ciemności.</li>
	<li>Postfix wybarwione immunologicznie eksplantaty w 4% PFA w temperaturze 4 °C przez 10 min.</li>
	<li>Myć 2x 10 min z TBST.</li>
	<li>Eksplantaty należy stopniowo przenosić w 100% metanolu do długotrwałego przechowywania w temperaturze -20 °C lub natychmiast poddać analizie. W przypadku eksplantatów hodowanych na filtrach i barwionych immunologicznie na 24-dołkowej płytce, przed analizą za pomocą mikroskopu wielofotonowego lub konfokalnego należy przenieść je do komory mikroskopowej (np. LabTek lub Ibidi) z TBST lub lepszym fluorescencyjnym podłożem montażowym.</li>
</ol>
5. Ekstrakcja RNA z tarczycy
Pracuj w środowisku wolnym od RNaz. Dlatego należy używać końcówek do pipet wolnych od kwasów nukleinowych i nukleaz oraz czyścić zarówno stół, jak i sprzęt z zanieczyszczeń i RNaz. Protokół ten opiera się na fenolu / chloroformie, wykonaj pierwsze kroki (od 1 do 7) pod maską chemiczną.
<ol>
	<li>Homogenizować jeden eksplant tarczycy lub dwa płaty tarczycy za pomocą 300 μl roztworu do ekstrakcji RNA za pomocą jednorazowego tłuczka do probówki o pojemności 1,5 ml. Pomiędzy próbkami umyj tłuczek w 2% SDS, następnie w wodzie, a następnie w etanolu.</li>
	<li>Dodać kolejne 100 μl roztworu do ekstrakcji RNA, wirować przez 10 sekund i inkubować w temperaturze pokojowej przez 10 minut.</li>
	<li>Wiruj przez 30 sekund i dodaj 20 ng tRNA do każdej próbki.</li>
	<li>Wirować przez 1 minutę i dodać 80 μl chloroformu.</li>
	<li>Wirować energicznie przez 30 sekund i inkubować 15 minut w temperaturze pokojowej.</li>
	<li>Wirować przez 15 minut przy 19 000 x g w wirówce z chłodzeniem (4 °C).</li>
	<li>Ostrożnie przenieść bezbarwną górną fazę wodną do świeżej probówki zawierającej 20 μg glikogenu jako współstrącacza.</li>
	<li>Odwiruj i dodaj 200 μl 100% alkoholu izopropanolowego.</li>
	<li>Wiruj energicznie przez 15-30 sekund i pozwól RNA wytrącić się w temperaturze -20 °C przez 2-3 godziny lub w temperaturze -80 °C przez 1 godzinę.</li>
	<li>Wirować przez 30 minut w temperaturze 19 000 x g w temperaturze 4 °C i usunąć supernatant.</li>
	<li>Umyj granulat 450 μl zimnego 75% etanolu i odwiruj, aby usunąć osad.</li>
	<li>Wirować przez 10 minut w temperaturze 19 000 x g w temperaturze 4 °C i usunąć supernatant.</li>
	<li>Suszyć pellet pod maską przez 5 minut.</li>
	<li>Zawiesić osad w 10 μl wody wolnej od RNaz i inkubować przez 10 minut w temperaturze pokojowej.</li>
	<li>Oznaczenie stężenia RNA, przechowywać w temperaturze -80 °C lub dokonać odwrotnej transkrypcji w celu analizy ekspresji genów.</li>
</ol>

<ol><li>Colin, I. M., Denef, J. -F., Lengelé, B., Many, M. -C., Gérard, A. -C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Recent+insights+into+the+cell+biology+of+thyroid+angiofollicular+units%5BTitle%5D)+AND+%22Endocr.+Rev%22%5BJournal%5D)">Recent insights into the cell biology of thyroid angiofollicular units.</a> Endocr. Rev. 34 (2), 209-238 (2013).</li>
<li>Fagman, H., Andersson, L., Nilsson, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+developing+mouse+thyroid+embryonic+vessel+contacts+and+parenchymal+growth+pattern+during+specification+budding%2C+migration%2C+and+lobulation%5BTitle%5D)+AND+%22Dev.+Dyn%22%5BJournal%5D)">The developing mouse thyroid embryonic vessel contacts and parenchymal growth pattern during specification budding, migration, and lobulation.</a> Dev. Dyn. 235 (2), 444-455 (2006).</li>
<li>Fagman, H., Nilsson, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Morphogenesis+of+the+thyroid+gland%5BTitle%5D)+AND+%22Mol.+Cell.+Endocrinol%22%5BJournal%5D)">Morphogenesis of the thyroid gland.</a> Mol. Cell. Endocrinol. 323 (1), 35-54 (2010).</li>
<li>Fagman, H., Nilsson, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Morphogenetics+of+early+thyroid+development%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Mol.+Endocrinol%22%5BJournal%5D)">Morphogenetics of early thyroid development.</a> J. Mol. Endocrinol. 46 (1), (2011).</li>
<li>De Felice, M., Di Lauro, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Thyroid+development+and+its+disorders+genetics+and+molecular+mechanisms%5BTitle%5D)+AND+%22Endocr.+Rev%22%5BJournal%5D)">Thyroid development and its disorders genetics and molecular mechanisms.</a> Endocr. Rev. 25 (5), 722-746 (2004).</li>
<li>De Felice, M., Di Lauro, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Intrinsic+and+extrinsic+factors+in+thyroid+gland+development%3A+an+update%5BTitle%5D)+AND+%22Endocrinology%22%5BJournal%5D)">Intrinsic and extrinsic factors in thyroid gland development: an update.</a> Endocrinology. 152 (8), 2948-2956 (2011).</li>
<li>Hick, A. -C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Reciprocal+epithelial+paracrine+interactions+during+thyroid+development+govern+follicular+organization+and+C-cells+differentiation%5BTitle%5D)+AND+%22Dev.+Biol%22%5BJournal%5D)">Reciprocal epithelial paracrine interactions during thyroid development govern follicular organization and C-cells differentiation.</a> Dev. Biol. 381 (1), 227-240 (2013).</li>
<li>Toda, S., Koike, N., Sugihara, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cellular+integration+of+thyrocytes+and+thyroid+folliculogenesis%3A+a+perspective+for+thyroid+tissue+regeneration+and+engineering%5BTitle%5D)+AND+%22Endocr.+J%22%5BJournal%5D)">Cellular integration of thyrocytes and thyroid folliculogenesis: a perspective for thyroid tissue regeneration and engineering.</a> Endocr. J. 48, 407-425 (2001).</li>
<li>Toda, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Culture+models+for+studying+thyroid+biology+and+disorders%5BTitle%5D)+AND+%22ISRN+Endocrinol%22%5BJournal%5D)">Culture models for studying thyroid biology and disorders.</a> ISRN Endocrinol. , (2011).</li>
<li>Eggo, M. C., Quiney, V. M., Campbell, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Local+factors+regulating+growth+and+function+of+human+thyroid+cells+in+vitro+and+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22%22%5BJournal%5D)">Local factors regulating growth and function of human thyroid cells in vitro and in vivo.</a> 213, 47-58 (2003).</li>
<li>Antonica, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Generation+of+functional+thyroid+from+embryonic+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Generation of functional thyroid from embryonic stem cells.</a> Nature. 491, 66-71 (2012).</li>
<li>van Eyll, J. M., Pierreux, C. E., Lemaigre, F. P., Rousseau, G. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Shh-dependent+differentiation+of+intestinal+tissue+from+embryonic+pancreas+by+activin+A%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Cell+Sci%22%5BJournal%5D)">Shh-dependent differentiation of intestinal tissue from embryonic pancreas by activin A.</a> J. Cell Sci. 117, 2077-2086 (2004).</li>
<li>Hick, A. -C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mechanism+of+primitive+duct+formation+in+the+pancreas+and+submandibular+glands%3A+a+role+for+SDF-1%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Dev.+Biol.+9%22%5BJournal%5D)">Mechanism of primitive duct formation in the pancreas and submandibular glands: a role for SDF-1.</a> BMC Dev. Biol. 9. , (2009).</li>
<li>Pierreux, C. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Epithelial%3AEndothelial+cross-talk+regulates+exocrine+differentiation+in+developing+pancreas%5BTitle%5D)+AND+%22Dev.+Biol%22%5BJournal%5D)">Epithelial:Endothelial cross-talk regulates exocrine differentiation in developing pancreas.</a> Dev. Biol. 347, 216-227 (2010).</li>
<li>Puri, S., Hebrok, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dynamics+of+embryonic+pancreas+development+using+real-time+imaging%5BTitle%5D)+AND+%22Dev.+Biol%22%5BJournal%5D)">Dynamics of embryonic pancreas development using real-time imaging.</a> Dev. Biol. 306, 82-93 (2007).</li>
<li>Petzold, K. M., Spagnoli, F. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+system+for+ex-vivo+culturing+of+embryonic+pancreas%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Vis.+Exp%22%5BJournal%5D)">A system for ex-vivo culturing of embryonic pancreas.</a> J. Vis. Exp. , (2012).</li>
<li>Watanabe, T., Costantini, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Real-time+analysis+of+ureteric+bud+branching+morphogenesis+in+vitro%5BTitle%5D)+AND+%22Dev.+Biol%22%5BJournal%5D)">Real-time analysis of ureteric bud branching morphogenesis in vitro.</a> Dev. Biol. 271, 98-108 (2004).</li>
</ol>

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

W artykule opisano metodę preparowania i hodowli eksplantatów tarczycy (e12.5) lub płatów (e14.5) w celu zbadania i lepszego zrozumienia złożonych zdarzeń prowadzących do powstania tarczycy. Ze względu na podwójne pochodzenie anlagenu tarczycy (anlage w linii środkowej i dwa boczne ciała ultimobranchialne) oraz ich niewielkie rozmiary, mikropreparuje się fragment tkanki e12,5 zlokalizowany rostralnie do tętnic łuku gardłowego i zawierający tchawicę, ale nie przełyk. Jak pokazano, w ciągu czterech dni ten system hodowli w...

Tarczyca jest zbiorem niezależnych sfer nabłonkowych, zwanych pęcherzykami, otoczonych gęstą siecią naczyń włosowatych śródbłonka. Ta organizacja umożliwia funkcjonowanie tarczycy: naczynia włosowate śródbłonka dostarczają tyreocytom jodu, niezbędnego do syntezy hormonów T3 i T4, i rozprowadzają te ostatnie po całym ciele. Rozproszone między pęcherzykami i naczyniami włosowatymi komórki C wytwarzają hormon hipokalcemiczny, kalcytoninę1. Chociaż architektura i funkcje tarczycy u dorosłych są dobrze znane, mechanizmy komórkowe i molekularne zaangażowane w rozwój embrionalny tarczycy (tworzenie i różnicowanie pęcherzyków) są dalekie od zrozumienia.
Podczas embriogenezy, przodek tyreocytów powstaje jako zgrubienie (anlage linii środkowej) ściany brzusznej endodermy jelita przedniego w dniu embrionalnym (e) 8,5 u zarodka myszy, podczas gdy przodkowie komórek C powstają w e11,5 jako wypukłości w kształcie kropelek (ciała ultimobranchialne) czwartych woreczków gardłowych2-6. Pączek linii środkowej następnie odłącza się od endodermy, rozszerza się obustronnie, aby połączyć się w e13,5 z ciałami ultimobranchialnymi po obu stronach tchawicy. Wreszcie tyreocyty organizują się w pęcherzyki, a komórki C różnicują się.
Obecna wiedza na temat tworzenia się tarczycy pochodzi głównie z analizy histologicznej stałych tkanek, ale zdarzenia morfogenetyczne związane z tworzeniem się tarczycy są bardzo dynamiczne i obejmują komunikację i interakcje między różnymi typami komórek oraz z macierzą zewnątrzkomórkową. Niedawne prace wykazały, że komórki progenitorowe tyreocytów wytwarzają wysoki poziom VEGF w celu rekrutacji komórek śródbłonka do rozwijającej się tarczycy, a z kolei rekrutowane komórki śródbłonka sprzyjają tworzeniu pęcherzyków i różnicowaniu komórek C7.
Większość badań ex vivo nad tarczycą została przeprowadzona na izolowanych dorosłych komórkach pochodzących z tarczycy, hodowanych na plastikowych szalkach do hodowli tkanek 2D lub w matrycach 3D. Korzystając z tego typu hodowli, zróżnicowane komórki pęcherzykowe albo pozostają spolaryzowane i zorganizowane jako pęcherzyki, albo ponownie uzyskują organizację 3D8-10. Jednak te czyste komórki nabłonkowe, wyprowadzone ze środowiska fizjologicznego i hodowane w 2D, ignorują interakcje z macierzą zewnątrzkomórkową, cytokinami, czynnikami wzrostu i innymi typami komórek, takimi jak komórki śródbłonka lub nerwy, z którymi normalnie spotykają się in vivo. Bardzo fajne badanie opisało niedawno protokół różnicowania komórek ES w pęcherzyki tarczycy przy użyciu końcowego etapu hodowli w matrycy3D 11. Jednak te kultury 3D nie mają kontaktu z innymi typami komórek.
Na podstawie wcześniejszych ekspertyz na temat hodowli narządów trzustki i gruczołów ślinowych12-14, opracowano metodę preparowania mysich embrionalnych anlagenów tarczycy i hodowli eksplantatów na półporowatych filtrach lub na plastikowych szkiełkach mikroskopowych.
Podczas pracy z embrionami e12.5, podwójne pochodzenie anlagenu tarczycy (linia środkowa i dwa boczne ciała ultimobranchialne) narzuciło mikrodysekcję dużego fragmentu tkanki. Zawierał on tchawicę, ale nie przełyk i rozciągał się od tętnic łuku gardłowego aż do obrzęku arytenoidalnego. Podczas hodowli na filtrach, anlage linii środkowej rozciąga się bocznie po każdej stronie tchawicy, gdzie łączą się z ciałami ultimobranchialnymi, tworząc dwa płaty tarczycy, nadal połączone wąskim przesmykiem.
W hodowli komórki nabłonkowe namnażają się, organizują w pęcherzyki i różnicują w tyreocyty i komórki C, w zależności od ich pochodzenia. Komórki śródbłonka zawarte w mikrowypreparowanej tkance również namnażają się i atakują płaty tarczycy, aby ostatecznie ściśle związać się ze strukturą pęcherzyków nabłonkowych, niezależnie od przepływu krwi czy czynników krążących. Ponieważ rozwój eksplantatów wiernie odzwierciedla rozwój in vivo, ten system hodowli jest optymalny do badania zdarzeń morfogenetycznych i różnicowania zachodzących podczas rozwoju tarczycy.
Tkanki tarczycy mogą być uzyskane z dzikich zarodków transgenicznych, nokautujących lub fluorescencyjnych, a system hodowli jest podatny na eksperymenty z utratą i zyskiem funkcji. Wreszcie, obrazowanie poklatkowe znakowanych fluorescencyjnie eksplantatów tarczycy na plastikowych naczyniach mikroskopowych może zostać wykorzystane do lepszego zbadania kinetyki i ciągłości ruchów morfogenetycznych zachodzących in vivo. Obrazowanie poklatkowe zostało już wykorzystane do badania rozgałęzionej morfogenezy trzustki15,16 lub zawiązka moczowodu17.

<table><tbody><tr><td>&micro;-slide 8 well, ibiTreat, hodowla tkankowa poddana zabiegowi, sterylna</td><td>proxylab</td><td>80826</td><td></td></tr><tr><td>Kolagen typu I, ogon szczura</td><td>Millipore</td><td>08-115</td><td></td></tr><tr><td>Fibronektyna z ludzkiego osocza</td><td>Invitrogen</td><td># 33010-018</td><td></td></tr><tr><td>M199</td><td>Invitrogen</td><td>31150-022</td><td></td></tr><tr><td>HBSS</td><td>Invitrogen</td><td>14025-100</td><td></td></tr><tr><td>Drut wolframowy</td><td>Goodfellow</td><td>LS237450</td><td></td></tr><tr><td>wkładka do płytki hodowlanej (średnica 12 mm)</td><td>Millipore</td><td>PICM01250</td><td></td></tr><tr><td>GlycoBlue</td><td>Invitrogen</td><td>AM9516</td><td></td></tr><tr><td>E-kadheryna</td><td>BD Biosciences</td><td>610182</td><td>1/1,000</td></tr><tr><td>Ezrin</td><td>Thermo Scientific</td><td>MS-661-P1</td><td>1/400</td></tr><tr><td>PECAM</td><td>BD Biosciences</td><td>550274</td><td>1/100</td></tr><tr><td>Hoechst</td><td>Sigma</td><td>B2261</td><td></td></tr></tbody></table>

system hodowli ex vivo do badania rozwoju tarczycy

An Ex vivo Culture System to Study Thyroid Development

Tarczyca to dwuwydzielniczy gruczoł dokrewny zlokalizowany u podstawy szyi, produkujący hormony tarczycy T3, T4 i kalcytoninę. T3 i T4 są wytwarzane przez zróżnicowane tyreocyty, zorganizowane w zamknięte kule zwane pęcherzykami, podczas gdy kalcytonina jest syntetyzowana przez komórki C, przeplatane między pęcherzykami a gęstą siecią naczyń włosowatych krwi. Chociaż architektura i funkcje tarczycy u dorosłych osób zostały szeroko opisane i zbadane, tworzenie jednostek "angio-pęcherzykowych", rozmieszczenie komórek C w miąższu i komunikacja parakrynna między komórkami nabłonka i śródbłonka jest dalekie od zrozumienia.
Ta metoda opisuje sekwencyjne etapy rozwarstwiania mysiego embrionalnego anlagenu tarczycy i jego hodowli na półporowatych filtrach lub na plastikowych szkiełkach mikroskopowych. W ciągu czterech dni ten system hodowli wiernie odwzorowuje rozwój tarczycy in vivo. Rzeczywiście, (i) występuje dwupłatowość narządu (w przypadku eksplantatów e12,5), (ii) prekursory tyreocytów organizują się w pęcherzyki i polaryzują, (iii) tyreocyty i komórki C różnicują się oraz (iv) komórki śródbłonka obecne w mikrowypreparowanej tkance namnażają się, migrują do płatów tarczycy i ściśle łączą się z komórkami nabłonka, tak jak robią to in vivo.
Tkanki tarczycy można uzyskać z dzikich zarodków transgenicznych typu knockout lub fluorescencyjnego. Co więcej, kulturą eksplantatów można manipulować poprzez dodawanie inhibitorów, przeciwciał blokujących, czynników wzrostu, a nawet komórek lub kondycjonowanej pożywki. Rozwój ex vivo może być analizowany w czasie rzeczywistym lub w dowolnym momencie hodowli za pomocą barwienia immunologicznego i RT-qPCR.
Podsumowując, hodowla eksplantatów tarczycy w połączeniu z obrazowaniem całego montażu lub na odcinkach i profilowaniem ekspresji genów dostarcza potężnego systemu do manipulowania i badania morfogenetycznych i różnicujących zdarzeń organogenezy tarczycy.

Z zarodków myszy w stadiach e12.5 oraz e13.5/e14.5 wypreparowano odpowiednio zraziki tarczycy (linię środkową i UB wraz z otaczającymi tkankami) oraz płaty tarczycy (Rycina 1). Po jednym dniu hodowli na filtrze widoczny jest zrazik linii środkowej (Rycina 2A) jako wydłużona tkanka rozciągająca się na wierzchu tchawicy. Stopniowo tworzy on dwa płaty po obu stronach tchawicy. W przypadku hodowli izolowanych płatów tarczycy (e13.5 lub e14.5) ulegają one ekspansji i morfogenezie, a komórki n...

Ten protokół opisuje sekcję zarodkowego anlagenu tarczycy myszy i hodowlę eksplantatów na półporowatych filtrach lub na plastikowych szkiełkach mikroskopowych. System ten idealnie nadaje się do badania zdarzeń morfogenetycznych lub różnicowania zachodzących podczas rozwoju tarczycy zarodków typu dzikiego lub zarodków z nokautem i jest podatny na eksperymenty dotyczące przyrostu i utraty funkcji.

System hodowli ex vivo do badania rozwoju tarczycy

The thyroid is a bilobated endocrine gland localized at the base of the neck, producing the thyroid hormones T3, T4, and calcitonin. T3 and T4 are ...

Ogólnym celem tej procedury jest sekcja hodowli ex vivo, embrionalnych implantów lub płatów tarczycy myszy, aby umożliwić badanie zdarzeń morfogenetycznych i różnicowania zachodzących podczas rozwoju tarczycy. Osiąga się to poprzez najpierw usunięcie górnej szczęki i dolnej części ciała embrionów myszy z dnia embrionalnego E 12.5 do E 14.5 w celu wyizolowania regionu szyi embrionów.W drugim kroku usuwa się rurkę neuralną, tkanki boczne oraz język, aby odsłonić górną część tchawicy i przełyku. Następnie pączek tarczycy, jej regiony lub płaty są dodatkowo oczyszczane z wszelkich niepożądanych tkanek. W ostatnim kroku implanty tarczycy są wysiewane do hodowli w powlekanej mikrostudzience lub na filtrze.W końcowej fazie można przeprowadzić obrazowanie poklatkowe, barwienie immunocytochemiczne lub analizę ekspresji genów w celu zbadania trójwymiarowej organizacji morfogenezy nabłonkowej i pęcherzyków, unaczynienia implantów lub różnicowania progenitorów tarczycy. Metoda ta może pomóc w odpowiedzi na kluczowe pytania dotyczące rozwoju i różnicowania, w tym organizacji komórek nabłonkowych tarczycy w 3D, formowania światła, różnicowania komórek, polaryzacji oraz wzrostu.Procedurę zaprezentują Fidel Marcel, doktorant, oraz Myla LaCorte, stażysta podoktorski, oboje z mojego laboratorium, w warunkach sterylnych w komorze z laminarnym przepływem powietrza. Na dwie godziny przed izolacją tkanki tarczycy należy rozcieńczyć sterylny kolagen typu I do stężenia końcowego 50 µg/mL w 10 mM chlorku wodoru, a następnie umieścić kolagen w lodzie.Następnie każdy z dołków plastikowej komory hodowlanej należy pokryć 200 µL rozcieńczonego kolagenu i inkubować komorę w temperaturze pokojowej. Po dwóch godzinach należy odessać kolagen. Dołki należy przepłukać pożywką M1 99 i dodać do każdego z nich minimalną objętość 200 µL pożywki hodowlanej. Pokryte komory należy umieścić w inkubatorze, a następnie przystąpić do sekcji tarczycy.Najpierw umieść wypreparowaną macicę w płytce 10 centymetrowej zawierającej HBSS. Następnie, używając pęsety, przytrzymaj jeden koniec macicy, a następnie otwórz ją małymi nożyczkami, aby kolejno uwolnić wszystkie embriony. Za pomocą nożyczek oddziel embriony od łożyska, a następnie przenieś embriony wraz z ich błonami pozazarodkowymi do nowej płytki 10 centymetrowej zawierającej świeży HBSS.Następnie kontynuuj sekcję każdego zarodka pod mikroskopem stereoskopowym. Najpierw usuń worek żółtkowy oraz błonę owodniową. Następnie użyj igieł wolframowych w kapilarach szklanych, wykorzystując je jako nóż i widelec.Usunąć górną część głowy, w tym górną szczękę i uszy. Przytrzymać embrion na grzbiecie. Następnie usunąć dodatkowy fragment rurki neuralnej, a po tym usunąć dolną część embrionu, tuż pod kończynami przednimi i nad sercem.Aby zorientować tkankę, przenieś przekrój embrionu zawierający język oraz jego obszar szyjny do nowej płytki 10 cm zawierającej świeży roztwór HBSS, a następnie usuń rurkę neuralną oraz tkanki położone za przełykiem i tchawicą. Teraz delikatnie przetnij plaster tkanki wzdłuż obu stron języka. Następnie zlokalizuj przełyk i tchawicę, wypreparuj język, pozostawiając wybrzuszenie retinoidowe oraz tkankę po obu stronach przełyku i tchawicy.Po usunięciu języka odseparować przełyk i ułożyć tchawicę stroną brzuszną do góry. Następnie usunąć niepożądane tkanki, takie jak grasica oraz wszystkie tkanki znajdujące się bocznie w stosunku do tętnic łuku gardłowego. W przypadku embrionów w stadium E 13.5 lub E 14.5 zlokalizować płaty tarczycy po obu stronach tchawicy, a następnie oddzielić płaty od tchawicy.W przypadku zarodków w stadium E 12.5 sekcję można przeprowadzać zgodnie z powyższą demonstracją aż do momentu wycięcia języka i przełyku. Następnie, po zlokalizowaniu tętnic łuków gardzielowych, należy usunąć wszystkie tkanki boczne, analogicznie jak w przypadku zarodków w stadium od E 13.5 do 14.5. Na koniec, używając uprzednio zwilżonego końcówki filtra do mikropipety P 200, przenieść wyizolowaną tkankę do płytki hodowlanej o średnicy 35 mm zawierającej podgrzane wcześniej podłoże hodowlane.Przed wysiewaniem eksplantów tarczycy z embrionów w stadium E 13.5 do E 14.5, należy najpierw wypłukać tkankę poprzez sukcesywne przenoszenie jej do trzech dołków płytki 24-dołkowej zawierających jeden mililitr podgrzanego pożywki hodowlanej, aby następnie wysiać płaty do uprzednio pokrytych komór. Najpierw odessać pożywkę hodowlaną i za pomocą mikropipety z filtrowanymi końcówkami ostrożnie wysiać jeden płat tarczycy do każdej z komór hodowlanych.Usunąć nadmiar pożywki, a następnie umieścić komorę hodowlaną w inkubatorze do hodowli tkanek, aby umożliwić przyleganie eksplantów do macierzy. Po dwóch godzinach ostrożnie dodać od 200 do 300 µL podgrzanej pożywki do każdej studni i ponownie umieścić komory w inkubatorze, aby wysiać obszar tchawicy lub płaty tarczycy z zarodka w stadium E 12.5 na filtrach półprzepuszczalnych. Najpierw napełnić studnie płytki 24-dołkowej 130 µL podgrzanej pożywki.Umieść filtry na pożywce, uważając, aby pod filtrem hodowlanym nie uwięzły pęcherzyki powietrza. Następnie za pomocą mikropipety z końcówkami z filtrem ostrożnie przenieś wycinki lub płaty tarczycy wraz z minimalną objętością pożywki na środek każdego z filtrów, mieszcząc maksymalnie cztery wycinki na jeden filtr.Podczas przenoszenia eksplantów X na filtr ważne jest, aby przesunąć je na środek filtra, używając minimalnej ilości pożywki, aby zapobiec jej kontaktowi ze ścianką filtra i powstaniu menisku. Na koniec należy usunąć nadmiar pożywki i za pomocą igły wolframowej rozsunąć eksplanty. Następnie należy umieścić je w inkubatorze do hodowli tkankowych na okres do siedmiu dni, wymieniając pożywkę co drugi dzień pod laminarnym przepływem powietrza.Po jednym dniu hodowli na filtrze, linia środkowa na laa jest widoczna jako wydłużona tkanka rozciągająca się wzdłuż górnej części i tworząca dwa płaty po każdej stronie tchawicy. W trakcie hodowli płaty rozszerzają się, przechodząc morfogenezę, w wyniku której komórki nabłonkowe organizują się w makroskopowo widoczne struktury pęcherzykowe. Jak pokazano na tych obrazach, organizację i polaryzację spójnych, pozytywnych komórek nabłonkowych można zwizualizować za pomocą immunoznakowania ezryną.Z biegiem czasu wewnątrzkomórkowe struktury wykazujące pozytywną reakcję na ezrynę połączyły się z biegunem komórki, który stanie się biegunem apikalnym. W trakcie tego procesu komórki śródbłonka wykazujące pozytywną reakcję na pcam proliferują i organizują się wokół rozwijających się mieszków, tworząc jednostki naczyniowo-mieszkowe. Aby określić stopień różnicowania tyrocytów i komórek C, ekspresję genów można zbadać za pomocą RT-qPCR RNA wyizolowanego z hodowanych płatów tarczycy.Podczas gdy ekspresja czynnika transkrypcyjnego tarczycy, NK X 2.1 nie zmienia się w trakcie hodowli, ekspresja specyficznej dla tarczycy tyreoglobuliny oraz specyficznej dla komórek C kalcytoniny gwałtownie wzrasta, co wskazuje na różnicowanie funkcjonalne. Po obejrzeniu tego filmu powinieneś dobrze rozumieć, jak wycinać i hodować eksplanty tarczycy. Nie jesteś jeszcze przygotowany do przeprowadzenia eksperymentów z uzyskaniem i utratą funkcji z wykorzystaniem embrionów typu dzikiego lub NOCO.

an-ex-vivo-culture-system-to-study-thyroid-development

Research

JoVE Journal

Biology

Biologia

System ex vivo do badania rozwoju tarczycy

W niniejszym filmie zaprezentowano technikę wycięcia i usunięcia grasicy płodowej, a także przygotowanie kultur ex vivo grasicy traktowanej 2-dGuo. <br...

Przygotowanie hodowli organowych grasicy traktowanych 2-dGuo

W niniejszej pracy opisujemy metodę izolacji, hodowli i manipulacji embrionalną trzustką myszy. Stanowi ona doskonały system ex vivo do badania różnych aspektów rozwoju trzustki, w tym morfogenezy, różnicowania i wzrostu. Eksplanty pąka trzustki mogą być hodowane przez kilka dni i wykorzystywane w szerokim zakresie zastosowań, w tym w immunofluorescencji całych preparatów oraz obrazowaniu na żywo.

System do hodowli ex vivo trzustki embrionalnej

Ten film opisuje procedurę ortotopowej inokulacji komórek raka tarczycy do tarczycy mysich modeli, które mogą następnie służyć jako cenna platforma do oceny kancerogenezy i odkrywania potencjalnych strategii leczenia.

Ortotopowa inokulacja komórek raka tarczycy do mysiej tarczycy: procedura ustalania ortotopowego modelu myszy raka tarczycy

Generacja ortotopowego mysiego modelu anaplastycznego raka tarczycy jest opisana tutaj. Technika ta polega na chirurgicznym umieszczaniu ludzkich komórek anaplastycznego raka tarczycy w tarczycy myszy z niedoborem odporności, tworząc w ten sposób bardziej istotne klinicznie warunki do badania postępu choroby, a także do badań przesiewowych innowacyjnych interwencji terapeutycznych.

Ortotopowy mysi model anaplastycznego raka tarczycy

Badanie rdzeniastych komórek nabłonka grasicy in vitro zakończyło się w dużej mierze niepowodzeniem, ponieważ obecne systemy hodowli 2D nie naśladują scenariusza in vivo. Opisany w niniejszym dokumencie system hodowli 3D - zmodyfikowany model hodowli organotypowej skóry - okazał się doskonały w rekapitulacji proliferacji mTEC, różnicowaniu i utrzymywaniu ekspresji genów rozwiązłości.

Organotypowy model kohodowli 3D wspierający proliferację, różnicowanie i ekspresję genów rozwiązłych komórek nabłonka grasicy

Hodowla pionowych kropelek ex vivo jest alternatywą dla obecnych technik eksperymentalnych in vitro i in vivo. Protokół ten jest łatwy do wykonania i wymaga mniejszych ilości odczynnika, a jednocześnie umożliwia manipulowanie i badanie unaczynienia, morfogenezy i organogenezy płodu.

Wykorzystanie ex vivo pionowych kultur kropelkowych całych narządów płodu do badania procesów rozwojowych podczas organogenezy myszy

Ten artykuł przedstawia zaktualizowane podejście do klasycznego systemu chimery kury przepiórczej do badania formowania się narządów, poprzez połączenie nowatorskich procedur eksperymentalnych in vitro i in ovo.

Dwuetapowe podejście do badania wczesnych i późnych etapów powstawania narządów w modelu ptasim: paradygmat organogenezy grasicy i przytarczyc

Tutaj prezentujemy protokół hodowli organotypowej do hodowli embrionalnych organów kurczaka in vitro. Za pomocą tej metody można badać rozwój zarodkowej tkanki kurczaka, przy zachowaniu wysokiego stopnia kontroli nad środowiskiem hodowli.

Metoda hodowli organotypowej do badania rozwoju zarodkowych tkanek kurczaka

Mysi model wskaźnika działania hormonu tarczycy został opracowany, aby umożliwić specyficzną tkankowo kwantyfikację lokalnego działania hormonu tarczycy za pomocą jego endogennej maszynerii regulacyjnej. Ostatnio wykazano, że model ten nadaje się do charakteryzowania substancji chemicznych zaburzających gospodarkę hormonalną, oddziałujących z gospodarką hormonów tarczycy, zarówno za pomocą metodologii ex vivo, jak i in vivo.

Charakterystyka in vivo skutków chemicznych zaburzających gospodarkę hormonalną za pomocą myszy wskaźnika działania hormonów tarczycy

W tym filmie zaprezentowano New culture – metodę, dzięki której zarodki kurcząt są hodowane poza jajem przez maksymalnie 24 hr. Metoda ta umożliwia badanie wczesnego rozwoju (od pręgi pierwotnej do 14 som.), co odpowiada okresowi E7-9 u myszy. Zastosowania tej techniki obejmują elektroporację, hybrydyzację in situ oraz immunohistochemię.

Metoda hodowli wczesnych zarodków kurczaka ex vivo (nowa hodowla)

Poznaj metodę hodowli eksplantów tarczycy myszy ex vivo do badania morfogenezy i różnicowania komórek. Technika ta umożliwia analizę rozwoju gruczołu tarczowego w kontrolowanych warunkach laboratoryjnych.

System hodowli ex vivo do badania rozwoju tarczycy

Przeglądaj więcej filmów