System hodowli ex vivo do badania rozwoju tarczycy

Ogólnym celem tej procedury jest przeanalizowanie hodowli ex vivo, myszy, embrionalnych implantów tarczycy lub płatów, aby umożliwić badanie zdarzeń morfogenetycznych i różnicujących zachodzących podczas rozwoju tarczycy. Osiąga się to poprzez usunięcie najpierw górnej szczęki i dolnej części ciała dnia embrionalnego. E 12,5 do E 14,5 zarodki myszy w celu wyizolowania okolicy szyi zarodków.

W drugim etapie usuwa się cewę nerwową, tkanki boczne i język w celu odsłonięcia górnej części tchawicy i przełyku. Następnie pączek tarczycy, regiony lub płaty są dalej oczyszczane z wszelkich niepożądanych tkanek. W ostatnim etapie implanty tarczycy są platerowane w celu hodowli na powlekanej mikrostudzience lub na filtrze.

Ostatecznie obrazowanie poklatkowe, barwienie immunologiczne lub analiza ekspresji genów mogą być wykonane w celu zbadania trójwymiarowej organizacji morfogenezy nabłonka i pęcherzyków, unaczynienia implantów lub różnicowania progenitorów tarczycy. Ta metoda może pomóc odpowiedzieć na kluczowe pytania dotyczące rozwoju i różnicowania. Pytanie o organizację komórek nabłonka tarczycy w 3D, tworzenie światła, różnicowanie komórek, polaryzację i wzrost.

Procedurę zademonstrują Fidel Marcel, doktorant, i Myla LaCorte, doktorantka z mojego laboratorium, obie w sterylnych warunkach w okapie z przepływem laminarnym. Dwie godziny przed izolacją tkanki tarczycy rozcieńczyć sterylny kolagen typu pierwszego do 50 mikrogramów na mililitr. Końcowe stężenie w 10 milimolowym chlorowodorze i umieść kolagen na lodzie.

Następnie przykryj każdy z dołków plastikowej komory hodowlanej 200 mikrolitrami rozcieńczonego kolagenu i inkubuj komorę w temperaturze pokojowej Po dwóch godzinach odessać kolagen. Przepłukać studzienki pożywką M1 99 i dodać do każdej z nich minimalną objętość 200 mikrolitrów pożywki hodowlanej. Dobrze umieść powlekane komory w inkubatorze, a następnie przystąp do rozwarstwienia tarczycy.

Najpierw umieść wypreparowaną macicę w 10-centymetrowej płytce zawierającej HBSS. Następnie użyj kleszczy, aby przytrzymać jeden koniec macicy, a następnie otwórz macicę małymi nożyczkami, aby kolejno uwolnić każdy z zarodków. Użyj nożyczek, aby oddzielić zarodki od łożyska, a następnie przenieś zarodki w obrębie ich dodatkowych błon zarodkowych na nową 10-centymetrową płytkę zawierającą świeży HBSS.

Następnie kontynuuj sekcję pod mikroskopem stereoskopowym dla każdego zarodka. Najpierw wyjmij worek z żółtkiem i owodnię. Następnie trzymanie igieł wolframowych w szklanych naczyniach włosowatych jako nóż i widelec.

Zdejmij górną część głowy, w tym górną szczękę i uszy. Trzymaj zarodek na plecach. Następnie usuń dodatkowy kawałek cewy nerwowej, a następnie usuń dolną część zarodka tuż pod kończynami przednimi i nad sercem.

Aby zorientować tkankę, przenieś wycinek zarodka zawierający język i okolicę szyi na nową 10-centymetrową płytkę zawierającą świeży HBSS i usuń cewę nerwową i tkanki za przełykiem i tchawicą. Teraz delikatnie pokrój plasterek tkanki wzdłuż obu stron języka. Następnie zlokalizuj przełyk i tchawicę, odetnij język, pozostawiając obrzęk retinoidu i tkankę po obu stronach przełyku i tchawicy.

Po usunięciu języka należy odciąć przełyk i umieścić tchawicę brzuszną stroną do góry. Następnie należy wypreparować niepożądane tkanki, takie jak grasica i wszystkie tkanki znajdujące się bocznie do tętnic łuku gardłowego. Następnie w przypadku zarodków E 13,5 lub E 14,5 uwidocznij płaty tarczycy po obu stronach tchawicy i dalej wypreparuj płaty z tchawicy.

W przypadku zarodków E 12,5 sekcję można przeprowadzić, jak pokazano poniżej, aż do momentu wycięcia języka i przełyku. Następnie, po zlokalizowaniu tętnic łukowatych gardła, należy usunąć wszystkie tkanki boczne jak w przypadku zarodków E 13,5 do 14,5. Na koniec, używając wstępnie zwilżonej końcówki filtra na mikropipecie P 200, przenieś izolowaną tkankę na 35-milimetrową płytkę hodowlaną zawierającą wstępnie ogrzaną pożywkę hodowlaną.

Przed posiewem tarczycy od E 13.5 do E 14.5 należy wykonać X. Najpierw umyj tkankę, kolejno przenosząc ją do trzech dołków 24-dołkowej płytki zawierającej jeden mililitr wstępnie podgrzanej pożywki hodowlanej, aby umieścić płaty na wstępnie powlekanych komorach. Najpierw odessać pożywkę hodowlaną i za pomocą mikropipety z przefiltrowanymi końcówkami ostrożnie umieścić jeden płatek tarczycy w każdej z komór hodowlanych.

Usuń nadmiar pożywki, a następnie umieść komorę hodowlaną w inkubatorze do hodowli tkankowych, aby umożliwić eksplantatom przyczepienie się do matrycy. Następnie po dwóch godzinach delikatnie dodaj od 200 do 300 mikrolitrów wstępnie podgrzanej pożywki hodowlanej do każdej studzienki i umieść komory z powrotem w inkubatorze, aby pokryć obszar tchawicy E 12,5 lub płaty tarczycy na półporowatych filtrach. Najpierw napełnij studzienki 24-dołkowej płytki stu 30 mikrolitrami kultury Prewarm.

Medium umieścić filtry na pożywce. Należy uważać, aby nie utknąć pęcherzyków powietrza poniżej filtra hodowlanego. Następnie użyj mikropipety z końcówkami z filtrem, aby ostrożnie przenieść eksplan lub płatki tarczycy oraz minimalną objętość pożywki na środek każdego z filtrów, maksymalnie do czterech x explan na filtr.

Po nałożeniu X explan na filtr ważne jest, aby przenieść je do środka filtra z minimalną ilością medium, aby uniknąć kontaktu medium i utworzenia menisku ze ścianką filtra. Na koniec usuń nadmiar pożywki i użyj igły wolframowej, aby rozmieścić je. Następnie umieść je w inkubatorze do hodowli tkankowych na okres do siedmiu dni, zmieniając pożywkę hodowlaną co drugi dzień pod okapem z przepływem laminarnym.

Po jednym dniu w hodowli na filtrze, linia środkowa na laa jest widoczna jako wydłużona tkanka rozciągająca się na górnej długości i tworząca dwa płaty po każdej stronie tchawicy. Wraz z hodowlą płaty rozszerzają się, ulegając organizacji morfogenezy komórek nabłonka w makroskopowo widoczne struktury pęcherzykowe. Jak pokazano na tych obrazach, organizację i polaryzację spójnych, dodatnich komórek nabłonka e można uwidocznić za pomocą znakowania immunologicznego ezrin.

Z biegiem czasu struktury wewnątrzkomórkowe ezrin dodatnie połączyły się z biegunem komórki, który stanie się biegunem wierzchołkowym. Podczas tego procesu komórki śródbłonka dodatnie cztery pcam namnażają się i organizują wokół rozwijających się pęcherzyków, tworząc jednostki pęcherzykowe angio. Aby określić ilościowo różnicowanie thro, cytów i komórek C, ekspresję genów można oznaczyć za pomocą R-T-Q-P-C-R RNA, wyizolowanego z hodowanych płatów tarczycy.

Podczas gdy ekspresja czynnika transkrypcyjnego tarczycy, NK X 2,1, nie zmienia się podczas hodowli, ekspresja specyficznej tyreoglobuliny i kalcytoniny specyficznej dla komórek C dramatycznie wzrasta, co wskazuje na funkcjonalne różnicowanie. Po obejrzeniu tego filmu powinieneś dobrze zrozumieć, jak przeprowadzić sekcję i wyhodować plan tarczycy. Nie jesteś gotowy do przeprowadzenia eksperymentu z przyrostem i utratą funkcji przy użyciu zarodków typu dzikiego lub NOCO.