Name: Statyczny test adhezyjny do badania aktywacji integryny w limfocytach T (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-06-13T14:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 14 s
Description: Poznaj statyczny test adhezyjny do badania aktywacji integryny w limfocytach T. Ta metoda umożliwia ilościową analizę adhezji komórkowej przy użyciu ludzkich limfocytów T i pomiaru fluorescencji CFSE.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Hirschil Trust, Michael Saperstein Medical Scholars Research Funds i stypendium NYU Whitehead wspierały tę pracę.

1. Powlekanie studzienek mikropłytek
Uwaga: Celem tego kroku jest pokrycie powierzchni polistyrenowych ICAM-1, które mają służyć jako ligandy dla limfocytów T LFA-1.
<ol>
	<li>Przygotuj następujące rozwiązania:
	<ol>
		<li>Przygotować roztwór powlekający, ponownie zawieszając rekombinowany ICAM-1 z roztworem soli fizjologicznej buforowanym fosforanem (PBS) (137 mM NaCl, 2,7 mM KCl, 10 mM Na2HPO4, 2 mM KH2PO4, pH 7,4) wzbogaconym w wapń (1 mM CaCl2) i magnez (2 nM MgCl2). Upewnij się, że końcowe stężenie ICAM-1 wynosi 10 μg/ml, sporządzony z roztworu podstawowego o stężeniu 0,7 mg/ml i przechowywany w zamrażarce o temperaturze -80 °C.</li>
		<li>Przygotować roztwór adhezyjny, wzbogacając PBS w 0,5% albuminę surowicy ludzkiej (lub bydlęcej) (HSA/BSA), 2 mM MgCl2 i 1 mM CaCl2.</li>
		<li>Przygotować roztwór do płukania, dodając 2 mM MgCl2 i 1 mM CaCl2 do PBS. Przed użyciem podgrzać wszystkie roztwory do temperatury 37 °C.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Przemyć 24 studzienki 50 μl roztworu myjącego. Obejmuje to nieumyte studnie, kontrole dodatnie (komórki poddane działaniu PMA) i ujemne (studzienki niepowlekane). Dla każdego warunku należy ustawić co najmniej trzy studzienki (potrójne).</li>
	<li>Do każdej studzienki dodać 50 μl roztworu powlekającego. Nie dodawać do niepowlekanych studzienek kontrolnych. Inkubować przez godzinę w inkubatorze w temperaturze 37 °C.</li>
	<li>Delikatnie zassać roztwór powlekający, nie dopuszczając do tego, aby końcówka dotykała dna studzienek. Przemyć raz 50 μl roztworu myjącego.</li>
	<li>Dodać 50 μl roztworu adhezyjnego i inkubować mikropłytkę przez jedną godzinę w inkubatorze o temperaturze 37 °C.</li>
	<li>Delikatnie odessać i przemyć raz 50 μl roztworu myjącego. Płytkę należy zużyć tego samego dnia, jednak możliwe jest przechowywanie jej w temperaturze 4 °C przez noc i użycie jej następnego dnia.</li>
</ol>
2. Izolacja limfocytów T z krwi
<ol>
	<li>Dodać koktajl wzbogacający ludzkie limfocyty T w stężeniu 50 μl/ml krwi pełnej (np. na 3 ml krwi pełnej z antykoagulantem (heparyną, EDTA lub cytrynianem) dodać 150 μl koktajlu). Dobrze wymieszaj.</li>
	<li>Inkubować 20 minut w temperaturze pokojowej.</li>
	<li>Do probówki wirówkowej o pojemności 50 ml dodać 3 ml krwi poddanej działaniu substancji i równą objętość PBS (bez wapnia i magnezu) wzbogaconego o 1% D-glukozę w temperaturze pokojowej. Delikatnie wymieszaj pipetą Pasteura.</li>
	<li>Dodać 15 ml Ficoll-Paque PLUS do probówki wirówkowej.</li>
	<li>Ostrożnie nałożyć 6 ml rozcieńczonej próbki krwi na podłoże do izolacji limfocytów.</li>
	<li>Wirować przy 400 x g przez 20 minut w temperaturze 20 °C z odrywaniem.</li>
	<li>Odciągnij górną warstwę za pomocą czystej pipety Pasteura, pozostawiając warstwę limfocytów nienaruszoną na granicy faz. Górna warstwa plazmy może zostać zachowana do późniejszego wykorzystania. Za pomocą czystej pipety Pasteura przenieś warstwę limfocytów do czystej probówki wirówkowej.</li>
	<li>Dodać 3 objętości (9 ml) PBS do limfocytów. Zawieś komórki, delikatnie wciągając je i wyjmując z pipety Pasteura.</li>
	<li>Wirować przy 400 x g przez 5 minut w temperaturze 20 °C.</li>
	<li>Usunąć supernatant. Limfocyty należy teraz zawiesić w pożywce odpowiedniej do zastosowania. Przenieść komórki do kolby hodowlanej T-75 w 20 ml pożywki RPMI 1640 zawierającej 10% FBS, 1% penicyliny/streptomycyny.</li>
</ol>
3. Przygotowanie komórek
Uwaga: Warunkiem wstępnym jest oznaczenie komórek odczynnikiem fluorescencyjnym. W tym protokole należy stosować ester sukcynimidylowy karboksylu fluoresceiny (CFSE), jednak dopuszczalną alternatywą są komórki eksprymujące białko zielonej fluorescencji (GFP).
<ol>
	<li>Policz 2,4 x 106 limfocytów T (1 x 105 dla każdej studzienki) za pomocą hemocytometru.</li>
	<li>Zawiesić komórki w pożywce hodowlanej pozbawionej surowicy (głód surowicy). Inkubować komórki przez 2 godziny w inkubatorze w temperaturze 37 °C.</li>
	<li>Odwirowywać komórki przez 5 minut (400 x g). Odessać pożywkę i ponownie zawiesić w 1 ml PBS.</li>
	<li>Dodać CFSE w rozcieńczeniu 1:1,000 (zapas do 5 mM). Przykryj światłem i inkubuj przez 8 minut w temperaturze pokojowej.</li>
	<li>Zatrzymać reakcję, dodając 10 ml PBS o temperaturze 37 °C i wirować w temperaturze 400 x g przez 5 minut.</li>
	<li>Ponownie zawiesić osad komórkowy za pomocą 1,2 ml wstępnie podgrzanego roztworu adhezyjnego (1 x 105 komórek na 50 μl).</li>
</ol>
4. Stymulacja komórek
Uwaga: Aby zainicjować adhezję, komórki muszą być stymulowane. W poniższym eksperymencie komórki są stymulowane przez TCR za pomocą przeciwciał sieciujących anty-CD3, jednak alternatywą może być rozpuszczalny SDF-1. W zależności od celu eksperymentów, przed lub w trakcie stymulacji można dodać różne odczynniki farmakologiczne, aby zbadać wpływ na adhezję komórkową. Octan mirystynianu forbolu (PMA) jest estrem forbolu, który jest strukturalnie podobny do drugiego przekaźnika diacyloglicerolu (DAG) i dlatego aktywuje wiele kinaz za TCR (głównie kinazą białkową C); Tutaj jest używany jako kontrola pozytywna.
<ol>
	<li>Podgrzać mikropłytkę do temperatury 37 °C.</li>
	<li>Podziel komórki na 8 pustych probówek o pojemności 1,5 ml (po 150 μl w każdej probówce), po jednej probówce na każdy warunek.</li>
	<li>Traktuj komórki odpowiednio:
	<ol>
		<li>Stymulować jedną probówkę PMA w stężeniu 10 ng/ml, aby służyła jako kontrola pozytywna. Utrzymuj trzy probówki w stanie niepoddanym obróbce, aby służyły jako kontrola stymulacji ("bez stymulacji"), kontrola niemytego ładowania ("bez mycia") i kontrola powłoki ICAM-1 ("niepowlekana").</li>
		<li>Stymuluj cztery probówki o różnych stężeniach przeciwciał anty-CD3 (0,1, 1, 5 i 10 μg/ml). Przejdź do następnego kroku bez opóźnień.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Podwielokrotność 50 μl stymulowanej komórki miesza się do każdej pustej studzienki. Ostateczna liczba komórek na studzienkę to 1 x 105.</li>
	<li>Umieścić mikropłytkę w inkubatorze w temperaturze 37 °C na 15 min. 
	Uwaga: Niektóre linie limfocytów T wymagają krótszego czasu stymulacji. W tym czasie komórki osiądą na dnie studzienek i przylgną do docelowych ligandów.</li>
</ol>
5. Wypłukiwanie nieprzylegających komórek
Uwaga: Celem tego kroku jest usunięcie komórek, które nie były w stanie nawiązać ścisłego kontaktu z powierzchniami pokrytymi ligandem. Na tym etapie należy użyć pipety wielokanałowej, aby upewnić się, że do wszystkich studzienek przyłożone są te same siły fizyczne. Ważne jest, aby wskazane studzienki kontrolne nie były myte, aby pomóc w obliczeniu procentu przylegających komórek.
<ol>
	<li>Do każdej studzienki dodać 150 μl ciepłego roztworu adhezyjnego. Delikatnie potrząsaj płytką przez kilka sekund przed wyjęciem pożywki z dołków. Nie dotykaj końcówkami dna studzienek.</li>
	<li>Powtórz ten krok trzy razy. Zmień kierunek pipety podczas pipetowania buforu do wewnątrz i na zewnątrz.</li>
</ol>
6. Określanie procentu przylegających komórek
Uwaga: W tym kroku używany jest czytnik płytek fluorescencyjnych do pomiaru intensywności fluorescencji w każdym dołku. Intensywność jest bezpośrednio skorelowana z liczbą przylegających komórek.
<ol>
	<li>Włącz czytnik płytek. Otwórz oprogramowanie czytnika płyt, klikając ikonę skrótu na pulpicie.
	<ol>
		<li>W menu "Zadanie" kliknij "Nowy", aby skonfigurować nowy protokół.</li>
		<li>Z menu "Akcje" wybierz opcję "Przeczytaj". Kliknij "Intensywność fluorescencji" i kliknij zakładkę "OK".</li>
		<li>Z menu rozwijanego wybierz "Długość fali wzbudzenia 485" i "Długość fali emisji 528". Kliknij zakładkę "OK".</li>
		<li>W menu opcji "Optyka" wybierz "Dół" i kliknij zakładkę "OK". Wróć do menu "Akcje" i ustaw temperaturę na 37 °C i kliknij "OK".</li>
		<li>Włóż mikropłytkę do czytnika płytek i kliknij "Uruchom". Wynik zostanie wyeksportowany do arkusza kalkulacyjnego Excel.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Obliczyć procent przylegających komórek, korzystając z następującego wzoru: Procent przylegających komórek = (średnia intensywność fluorescencji odczytana w umytych studzienkach)/(średnia intensywność fluorescencji odczytana w nieumytych komórkach) x 100%.</li>
</ol>

<ol><li>Dustin, M. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Membranes+as+messengers+in+T+cell+adhesion+signaling%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Immunol%22%5BJournal%5D)">Membranes as messengers in T cell adhesion signaling.</a> Nat Immunol. 5 (4), 363-372 (2004).</li>
<li>Mor, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((GTPases+and+LFA-1+reciprocally+modulate+adhesion+and+signaling%5BTitle%5D)+AND+%22Immunol+Rev%22%5BJournal%5D)">GTPases and LFA-1 reciprocally modulate adhesion and signaling.</a> Immunol Rev. 218, 114-125 (2007).</li>
<li>Rose, D. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Integrin+modulation+and+signaling+in+leukocyte+adhesion+and+migration%5BTitle%5D)+AND+%22Immunol+Rev%22%5BJournal%5D)">Integrin modulation and signaling in leukocyte adhesion and migration.</a> Immunol Rev. 218, 126-134 (2007).</li>
<li>Alon, R., Feigelson, S. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chemokine-triggered+leukocyte+arrest%3A+force-regulated+bi-directional+integrin+activation+in+quantal+adhesive+contacts%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Opin+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Chemokine-triggered leukocyte arrest: force-regulated bi-directional integrin activation in quantal adhesive contacts.</a> Curr Opin Cell Biol. 24 (5), 670-676 (2012).</li>
<li>Griffith, J. W., Luster, A. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Targeting+cells+in+motion%3A+migrating+toward+improved+therapies%5BTitle%5D)+AND+%22Eur+J+Immunol%22%5BJournal%5D)">Targeting cells in motion: migrating toward improved therapies.</a> Eur J Immunol. 43 (6), 1430-1435 (2013).</li>
<li>Dustin, M. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell+adhesion+molecules+and+actin+cytoskeleton+at+immune+synapses+and+kinapses%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Opin+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Cell adhesion molecules and actin cytoskeleton at immune synapses and kinapses.</a> Curr Opin Cell Biol. 19 (5), 529-533 (2007).</li>
<li>Springer, T. A., Dustin, M. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Integrin+inside-out+signaling+and+the+immunological+synapse%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Opin+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Integrin inside-out signaling and the immunological synapse.</a> Curr Opin Cell Biol. 24 (1), 107-115 (2012).</li>
<li>Mor, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((D1+regulates+lymphocyte+adhesion+via+upregulation+of+Rap1+at+the+plasma+membrane%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">D1 regulates lymphocyte adhesion via upregulation of Rap1 at the plasma membrane.</a> Mol Cell Biol. 29 (12), 3297-3306 (2009).</li>
<li>Bivona, T. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rap1+up-regulation+and+activation+on+plasma+membrane+regulates+T+cell+adhesion%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Rap1 up-regulation and activation on plasma membrane regulates T cell adhesion.</a> J Cell Biol. 164 (3), 461-470 (2004).</li>
<li>Zeltzer, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Diminished+adhesion+of+CD4%2B+T+cells+from+dialysis+patients+to+extracellular+matrix+and+its+components+fibronectin+and+laminin%5BTitle%5D)+AND+%22Nephrol+Dial+Transplant%22%5BJournal%5D)">Diminished adhesion of CD4+ T cells from dialysis patients to extracellular matrix and its components fibronectin and laminin.</a> Nephrol Dial Transplant. 12 (12), 2618-2622 (1997).</li>
<li>Bhattacharyya, S. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Both+adhesion+to+immobilized+vitronectin+and+Fc+epsilon+RI+cross-linking+cause+enhanced+focal+adhesion+kinase+phosphorylation+in+murine+mast+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Immunology%22%5BJournal%5D)">Both adhesion to immobilized vitronectin and Fc epsilon RI cross-linking cause enhanced focal adhesion kinase phosphorylation in murine mast cells.</a> Immunology. 98 (3), 357-362 (1999).</li>
<li>Dustin, M. L., Groves, J. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Receptor+signaling+clusters+in+the+immune+synapse%5BTitle%5D)+AND+%22Annu+Rev+Biophys%22%5BJournal%5D)">Receptor signaling clusters in the immune synapse.</a> Annu Rev Biophys. 41, 543-556 (2012).</li>
</ol>

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Istnieje kilka testów do badania sygnałów aktywacji LFA-1 i adhezji limfocytów T12. Cytometria przepływowa służy do pomiaru stanów powinowactwa LFA-1 w żywych komórkach przy użyciu przeciwciał monoklonalnych, które wiążą się selektywnie z zgiętym lub wydłużonym LFA-1. Jednym z ograniczeń tej metody jest to, że nie bierze ona pod uwagę zachłanności integryn. Testy migracji są przydatnymi narzędziami, ale mierzą migrację, a nie nędzną adhezję w określonym punkcie czasowym. Modele mysie do badania migracji limfoc...

T jest podstawowym procesem odpowiedzi immunologicznej1. Jest niezbędny do interakcji limfocytów T z komórkami śródbłonka zdobiącymi ściany naczyń włosowatych, do skanowania komórek prezentujących antygen (APC) w węzłach chłonnych oraz do tworzenia synaps immunologicznych (IS) z komórkami docelowymi2. Wymagania te różnią się funkcjonalnie i kinetycznie. Proces wynaczynienia limfocytów składa się z chemoprzyciągania, rolowania, mocnej adhezji i transmigracji. Przejście od zwijania do twardej adhezji wymaga od limfocytów T szybkiej reakcji na sygnał receptora sprzężonego z białkiem G. Ta odpowiedź daje interakcję liganda integrynowego, która spowalnia i zatrzymuje toczącą się komórkę3. Natychmiastowa zmiana awidności integryny pośredniczy w tym procesie. Migracja wymaga dynamicznych interakcji między komórkami T a komórkami śródbłonka z powstawaniem zrostów na "przednim końcu" i pękaniem zrostów na "tylnym końcu" w odstępie około minuty między powstaniem a zerwaniem4. IS tworzy się w ciągu kilku minut, ale musi pozostać nienaruszony przez6 godzin.
Interesujące, jedna cząsteczka adhezyjna, antygen LFA-1 (LFA)-1, członek rodziny integryn, jest niezbędna dla wszystkich tych procesów5. LFA-1 pośredniczy w adhezji poprzez interakcje z kilkoma członkami nadrodziny immunoglobulin. Najszerzej przebadanym ligandem o najwyższym powinowactwie do LFA-1 jest międzykomórkowa cząsteczka adhezyjna (ICAM)-1. Nieaktywowane krążące limfocyty wyrażają LFA-1 o niskim powinowactwie na powierzchni komórki, a zatem nie są w stanie przylegać do powierzchni pokrytych ICAM-1. Powinowactwo LFA-1 jest zmienne i regulowane przez kilka zdarzeń sygnalizacyjnych, takich jak aktywacja receptora sprzężonego z białkiem G, stymulacja cytokin i sygnały, w których pośredniczą receptory komórek T (TCR). Uzyskana w ten sposób forma LFA-1 o wysokim powinowactwie przenosi aktywację wewnątrzkomórkową do przestrzeni zewnątrzkomórkowej poprzez interakcje z ICAM-1. Ten szlak jest określany jako sygnalizacja wewnętrzna-zewnętrzna7. Podobnie sygnalizacja przez LFA-1 z przestrzeni zewnątrzkomórkowej nazywana jest sygnalizacją zewnętrzną.
Wewnątrzkomórkowe kaskady sygnalizacyjne zaangażowane w sygnalizację wewnętrzną i zewnętrzną są głównym przedmiotem obecnych badań. Mała GTPaza Rap1 stała się ostatnio kluczowym składnikiem sygnalizacji inside-out, która jest wspólna zarówno dla ligacji TCR, jak i sygnalizacji cytokin8. Kluczową rolę Rap1 w aktywacji integryny podkreśla odkrycie, że nadekspresja Rap1 stymuluje zależną od integryny adhezję limfocytów T, podczas gdy adhezja limfocytów T jest blokowana przez ekspresję dominującego ujemnego Rap19. Te postępy w naszym zrozumieniu regulacji integryny przez Rap1 zostały osiągnięte przy użyciu narzędzi in vitro. Wśród nich znajduje się opisany tutaj test adhezji statycznej.
Ogólnym celem tej metody jest zbadanie przyczepności limfocytów T do powierzchni pokrytych ICAM-1. Mówiąc dokładniej, służy do obiektywnego pomiaru i ilościowego określania powinowactwa LFA-1 do jego przeciwligandów w żywych komórkach w czasie rzeczywistym, w różnych warunkach. Technika ta wykorzystuje studzienki polistyrenowe pokryte ICAM-1 do naśladowania powierzchni komórkowych, z którymi oddziałują limfocyty T. Wiele wcześniej opisanych statycznych testów adhezji limfocytów T było eksperymentalnie złożonych. Testy te często wymagały znakowania radioaktywnie limfocytów T, wykorzystywały hodowane bydlęce komórki rogówki do stworzenia macierzy zewnątrzkomórkowej jako substratu do adhezji limfocytów T lub wymagały niefizjologicznej stymulacji limfocytów T przez dłuższy czas w celu promowania adhezji komórek T10. Zastosowanie pomiarów fluorometrycznych do ilościowego oznaczania limfocytów T po inkubacji adhezyjnej jest bardziej czułą i dokładną metodą oznaczania ilościowego w porównaniu z cytometrią przepływową i mikroskopią, które są stosowane w wielu innych systemach testowych11. Dodatkowo, analiza mikroskopowa lokalizacji integryny w pojedynczych komórkach nie pozwala na szeroką analizę populacyjną w taki sam sposób, jak pomiar fluorometryczny. Chociaż przeciwciała LFA-1 specyficzne dla stanu aktywacji są dostępne na rynku, przeciwciała te oferują niską czułość w porównaniu z opisaną tutaj metodą. Główną przewagą nad technikami alternatywnymi jest ich prostota i możliwość jednoczesnego badania wielu warunków eksperymentalnych. Rozważając tę metodę dla konkretnego zastosowania, należy wziąć pod uwagę, że limfocyty T powinny być wyselekcjonowane negatywnie, świeżo wyizolowane i oznaczone markerem fluorescencyjnym.

<table><tbody><tr><td>Czytnik płytek</td><td>BioTek</td><td>Synergy H1 Hybrydowa</td><td></td></tr><tr><td>pipeta wielokanałowa</td><td>Fisher</td><td>21-377-829</td><td></td></tr><tr><td>96-dołkowa mikropłytka z dnem optycznym</td><td>Corning Costar</td><td>3603</td><td></td></tr><tr><td>Rekombinowany ICAM-1</td><td>R& D Systems</td><td>ADP4-050</td><td></td></tr><tr><td>Przeciwciała anty-CD3</td><td>Ancell</td><td>144-020</td><td></td></tr><tr><td>PMA</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>79346</td><td></td></tr><tr><td>BSA</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A2058</td><td></td></tr><tr><td>Sondy molekularne</td><td>CFSE</td><td>C1157</td><td></td></tr><tr><td>RPMI</td><td>Gibco</td><td>11875-093</td><td></td></tr><tr><td>DPBS zawierające wapń i magnez</td><td>Gibco</td><td></td><td></td>14190250</tr><tr><td>Limfocyty obwodowe</td><td>np. mysz lub człowiek</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Chlorek magnezu</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M8266</td><td></td></tr><tr><td>Chlorek wapnia</td><td>Oprogramowanie Sigma-Aldrich</td><td>499609</td><td></td></tr><tr><td>Open Gen 5</td><td>BioTek</td><td>Wersja 2.01</td><td></td></tr><tr><td>Ficoll-Paque PLUS</td><td>GE Healthcare</td><td>71-7167-00</td><td></td></tr><tr><td>Probówki wirówkowe o pojemności 15 i 50 ml</td><td>Fisher</td><td>352099, 352070</td><td></td></tr><tr><td>Jednorazowe plastikowe pipety Pasteura</td><td>Kolby</td> hodowlane Fisher <td>13-711-7M</td><td></td></tr><tr><td>T-75</td><td>Fisher</td><td>50-754-1366</td><td></td></tr><tr><td>Zestaw do wzbogacania limfocytów T RosetteSep</td><td>StemCell Technologies</td><td>15061</td><td></td></tr></tbody></table>

statyczny test adhezyjny do badania aktywacji integryny w limfocytach t

Static Adhesion Assay for the Study of Integrin Activation in T Lymphocytes

jest wymagana do wielu funkcji limfocytów T, w tym migracji do miejsc zapalnych i tworzenia synaps immunologicznych z komórkami prezentującymi antygen. Limfocyty T osiągają regulowaną adhezję poprzez kontrolowanie właściwości adhezyjnych integryn, klasy cząsteczek adhezyjnych komórek składającej się z heterodimerycznych par białek transbłonowych, które oddziałują z cząsteczkami docelowymi na komórkach partnerskich lub macierzy zewnątrzkomórkowej. Najbardziej znaną integryną limfocytów T jest antygen związany z funkcją limfocytów (LFA)-1, składający się z podjednostek αL i β2, którego celem jest wewnątrzkomórkowa cząsteczka adhezyjna (ICAM)-1. Zdolność limfocytów T do kontrolowania adhezji wynika ze zdolności do regulowania stanów powinowactwa poszczególnych integryn. Sygnalizacja wewnętrzna na zewnątrz opisuje proces, w którym sygnały wewnątrz komórki powodują, że zewnętrzne domeny integryn przyjmują stan aktywowany. Znaczna część naszej wiedzy na temat tych złożonych zjawisk opiera się na badaniach mechanistycznych przeprowadzonych w uproszczonych systemach modelowych in vitro. Opisany tutaj test adhezji limfocytów T jest doskonałym narzędziem, które pozwala limfocytom T przylegać do cząsteczek docelowych w warunkach statycznych, a następnie wykorzystuje czytnik płytek fluorescencyjnych do ilościowego określenia adhezji. Test ten okazał się przydatny w definiowaniu substancji stymulujących adhezję lub hamujących, które działają na limfocyty, a także w charakteryzowaniu zaangażowanych zdarzeń sygnalizacyjnych. Chociaż opisano tutaj dla LFA-1 - adhezji za pośrednictwem ICAM-1; test ten można łatwo dostosować, aby umożliwić badanie innych oddziaływań adhezyjnych (np. VLA-4 - fibronektyna).

Poniżej przedstawiono przykład testu adhezji z wykorzystaniem pierwotnych limfocytów T stymulowanych różnymi stężeniami przeciwciał anty-CD3. Przydatne jest określenie fluorescencji niepłukanych komórek (t.j. całkowitego obciążenia). Komórki niestymulowane służą jako kontrola negatywna, natomiast komórki traktowane PMA stanowią kontrolę pozytywną dla przeciwciał anty-CD3. Komórki wysiane do studzienek niepowlekanych służą jako kontrola dla ICAM-1. W typowym eksperymencie procent adherentnych komórek traktowanych...

Statyczny test adhezji to potężne narzędzie, które może być użyte do modelowania interakcji między limfocytami T a innymi typami komórek. Interakcje są generowane przez wstrzykiwanie znakowanych limfocytów T do studzienek pokrytych cząsteczkami adhezyjnymi, podczas gdy czytnik płytek służy do ilościowego określania liczby przylegających komórek po seryjnym płukaniu.

Statyczny test adhezyjny do badania aktywacji integryny w limfocytach T

T lymphocyte adhesion is required for multiple T cell functions, including migration to sites of inflammation and formation of immunological synapses with ...

Ogólnym celem tej procedury jest ilościowe określenie adhezji komórkowej. Zostaje to osiągnięte poprzez uprzednie pokrycie mikroplatek 96-dołkowych cząsteczkami adhezyjnymi w drugim kroku. Pierwotne ludzkie limfocyty T są izolowane z krwi i znakowane barwnikiem CFSE.Następnie limfocyty T są stymulowane preparatami w celu wpłynięcia na ich zdolność do adhezji. W ostatnim kroku potraktowane komórki przenosi się na mikropłytkę, umożliwiając zajście adhezji. Ostatecznie można zmierzyć poziom fluorescencji w każdej studzience, aby określić procent komórek adherentnych dla każdego warunku traktowania.Główną zaletą tej techniki w porównaniu z istniejącymi metodami, takimi jak dodawanie limfocytów T do modelu i anterium, jest brak konieczności kokultury limfocytów T i komórek erl. Metoda ta może pomóc w odpowiedzi na kluczowe pytania z dziedziny immunologii, takie jak: w jaki sposób konkretne leki wpływają na adhezję limfocytów? Chociaż metoda ta może dostarczyć wiedzy na temat biologii linii stóp, można ją również zastosować do innych komórek maie, takich jak neutrofile.Wizualna demonstracja tej metody jest kluczowa, ponieważ poszczególne kroki są trudne do opanowania i wymagają precyzji oraz umiejętności. Aby pokryć mikropłytkę cząsteczkami adhezyjnymi, należy najpierw przemyć 24 studzienki płytki 96-dołkowej przy użyciu 50 µL roztworu piorzącego, a następnie inkubować każdą studzienkę, z wyjątkiem niepowlekanych studzienek kontrolnych, z 50 µL roztworu powlekającego przez jedną godzinę w temperaturze 37 °C. Następnie należy delikatnie odessać roztwór powlekający, dbając, aby końcówka pipety nie dotknęła dna studzienek. Po ponownym przemyciu studzienek kolejnymi 50 µL roztworu piorzącego, mikropłytkę inkubuje się z 50 µL roztworu adhezyjnego na każdą studzienkę.Ponownie inkubować w temperaturze 37°C. Po jednej godzinie delikatnie odessać roztwór adhezyjny i ponownie przemyć dołki 50 µL roztworu do mycia. Aby wyizolować limfocyty T, najpierw dokładnie wymieszać 50 µL koktajlu do wzbogacania ludzkich limfocytów T na każdy mililitr krwi pełnej, a następnie inkubować tak przygotowaną krew przez 20 minut w temperaturze pokojowej. Następnie dodać 6 ml przetworzonej krwi oraz równą objętość PBS pozbawionego wapnia i magnezu, wzbogaconego o 1%D glukozy, do probówki stożkowej o pojemności 50 ml w temperaturze pokojowej i delikatnie wymieszać roztwór.Następnie dodaj 15 ml lympho prep do nowej probówki stożkowej o pojemności 50 ml i ostrożnie nanieś rozcieńczoną próbkę krwi na medium do izolacji limfocytów. Rozdziel warstwy komórkowe przez 20 minut przy 400 ×g i 20 °C z wyłączonym hamowaniem. Następnie za pomocą nowej pipety Pasteura usuń górną warstwę, nie naruszając warstwy limfocytów znajdującej się na styku faz.Przenieś warstwę limfocytów do nowej probówki stożkowej za pomocą nowej pipety Pasteura. Dodaj dziewięć mililitrów PBS do limfocytów, a następnie równomiernie rozprowadź komórki w zawiesinie, delikatnie je odsysając i wypuszczając. Odwiruj komórki, a następnie zresuspenduj osad w medium.Następnie przenieś komórki do kolby hodowlanej T 75. Do stymulacji komórek po odpowiednim okresie hodowli należy użyć 20 ml pożywki hodowlanej. Najpierw dodaj pożywkę bezsurowiczą do 2,4 × 10⁶ komórek T, a następnie poddaj komórki głodzeniu surowiczemu w inkubatorze w temperaturze 37 °C.Po dwóch godzinach odwiruj komórki i zresuspenduj osad. W 1 ml PBS znakuj komórki markerem fluorescencyjnym w ciemności przez osiem minut w temperaturze pokojowej, a następnie zatrzymaj reakcję, dodając 10 ml PBS o temperaturze 37°C. Po ponownym odwirowaniu komórek zresuspenduj osad w 1,2 ml podgrzanego wcześniej roztworu adhezyjnego.Ogrzać powleczoną mikropłytkę do 37 °C, następnie podzielić komórki na osiem aliquotów po 150 µL w probówkach o pojemności 1,5 ml. Jedną probówkę stymulować PMA w stężeniu 10 ng/ml, aby służyła jako kontrola pozytywna. Pozostawić trzy probówki niestymulowane, które będą służyć jako kontrola stymulacji, niepłukana kontrola ładowania oraz kontrola powlekania ICAM 1, a cztery pozostałe probówki stymulować różnymi stężeniami przeciwciał anty-CD3.Następnie niezwłocznie odnieś 50 µL mieszanin pobudzonych komórek o stężeniu 1×10⁵ komórek na studnię do odpowiednich studni mikropłytki i inkubuj płytkę w temperaturze 37 °C przez 15 minut. Aby określić procent komórek przylegających, najpierw przemyj każdą studnię 150 µL ciepłego roztworu adhezyjnego. Delikatnie wstrząśnij płytką przez kilka sekund, a następnie ostrożnie odessij medium z każdej studni, nie dotykając końcówkami pipety dna studni.Powtórz płukanie trzykrotnie, zmieniając kąt nachylenia pipety przy każdym zasysaniu. Następnie włącz czytnik płytek i uruchom oprogramowanie do odczytu płytek z menu zadań. Kliknij „New”, aby skonfigurować nowy protokół.Następnie w menu akcji wybierz opcję odczytu. Kliknij fluorescencyjną intensywność (fluorescent intensity), a następnie zatwierdź przyciskiem OK. Wprowadź długość fali wzbudzenia jako 485 oraz długość fali emisji jako 528.Następnie w menu opcji optycznych (optic option menu) wybierz dno (bottom) i kliknij OK. Następnie wróć do menu akcji (actions menu), ustaw temperaturę na 37 °C i kliknij OK. Na koniec wsuń mikropłytkę i kliknij uruchom (run).Po wyeksportowaniu wyników do arkusza kalkulacyjnego należy użyć formuły do obliczenia procentowej zawartości komórek przylegających na tych obrazach. Przedstawiono przykład testu adhezji z użyciem pierwotnych limfocytów T stymulowanych różnymi stężeniami przeciwciał anty-CD3. Niestymulowane komórki służą jako kontrola negatywna.Komórki traktowane PMA służą jako kontrola pozytywna. W przypadku przeciwciał anty-CD3 tabela przedstawia względne intensywności fluorescencji CFSE dla pierwotnych limfocytów T, znakowanych i stymulowanych różnymi dawkami rozpuszczalnych przeciwciał anty-CD3, a następnie wysianych do studni pokrytych IAM1. Dla każdego wariantu można obliczyć średnią intensywność z trzech powtórzeń i przeliczyć ją na względny procent w stosunku do całkowitej liczby naniesionych komórek.W typowym eksperymencie odsetek komórek przylegających po traktowaniu PMA wynosi od 40 do 50%, podczas gdy odsetek komórek niestymulowanych wynosi od 5 do 10%. Należy zauważyć, że odsetek komórek przylegających wzrasta wraz ze wzrostem stężenia przeciwciał anty-CD3 stosowanych do stymulacji. Po opanowaniu tej techniki można ją przeprowadzić w czasie krótszym niż trzy godziny, pod warunkiem właściwego wykonania. Podczas przeprowadzania tej procedury ważne jest, aby zmierzyć fluorescencję niepłukanej studzienki w celu określenia poziomu fluorescencji wejściowej.Kluczowa wartość w analizie danych. Po obejrzeniu tego filmu powinieneś dobrze rozumieć, jak ilościowo określić statyczną adhezję komórkową. Pamiętaj, że praca z próbkami ludzkiej krwi może być niezwykle niebezpieczna i podczas wykonywania tej procedury należy zawsze przestrzegać środków ostrożności, takich jak noszenie fartucha laboratoryjnego i rękawiczek.

static-adhesion-assay-for-study-integrin-activation-t

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Immunologia i infekcje

Statyczne badanie adhezji do badania aktywacji integrin w limfocytach T

Migracja limfocytów T zachodzi podczas homingu do organów limfatycznych, opuszczania naczyń krwionośnych i wnikania do tkanek obwodowych. W niniejszym artykule opisujemy protokół, który może być wykorzystany do analizy migracji limfocytów T in vitro.

Izolacja, hodowla i analiza migracji ludzkich limfocytów T in vitro

Opisano test częstotliwości adhezji służący do pomiaru kinetyki oddziaływań receptor-ligand w sytuacjach, gdy obie cząsteczki są zakotwiczone na powierzchniach oddziałujących komórek. Ten oparty na mechanice test został zilustrowany z wykorzystaniem ludzkiego erytrocyta poddanego ciśnieniu za pomocą mikropipety jako sensora adhezji oraz integryny αLβ2 i cząsteczki adhezyjnej międzykomórkowej 1 jako oddziałujących receptorów i ligandów.

Analiza częstotliwości adhezji w celu badania kinetyki in situ międzykomórkowych oddziaływań molekularnych w obrębie złączy komórkowych

Tutaj prezentujemy prostą, szybką metodę charakteryzowania wewnętrznych właściwości adhezyjnych domniemanych cząsteczek adhezyjnych komórek.  Wydzielana, znakowana epitopem ektodomena cząsteczki adhezyjnej komórki jest wychwytywana z pożywki hodowlanej na małych, jednorodnych funkcjonalizowanych kulkach.  Kulki te można następnie natychmiast wykorzystać w prostych testach agregacji kulek.

Testy agregacji kulek w celu scharakteryzowania przypuszczalnych cząsteczek adhezyjnych komórek

Ten test adhezji przepływu dostarcza prostego, bardzo efektownego modelu interakcji limfocytów T z komórkami nabłonkowymi. Pompa strzykawkowa służy do generowania naprężeń ścinających, a mikroskopia konfokalna rejestruje obrazy w celu określenia ilościowego. Celem tych badań jest skuteczne ilościowe określenie adhezji limfocytów T przy użyciu warunków przepływu.

Test adhezji pod wpływem naprężenia ścinającego do badania oddziaływań cząsteczki adhezyjnej limfocytów T

Dynamiczne przyleganie komórek odpornościowych do ściany naczynia jest warunkiem wstępnym dla naprowadzania jelit. W tym miejscu przedstawiamy protokół funkcjonalnego testu in vitro do analizy wpływu przeciwciał antyintegrynowych, chemokin lub innych czynników na dynamiczną adhezję komórek ludzkich za pomocą naczyń włosowatych pokrytych adresiną.

Dynamiczny test adhezyjny do analizy funkcjonalnej terapii przeciwadhezyjnych w nieswoistych zapaleniach jelit

Zaprezentowany zostanie zaawansowany mikroskop, który pozwala na szybkie i wysokorozdzielcze obrazowanie zarówno izolowanej błony plazmatycznej, jak i otaczającej jej objętości wewnątrzkomórkowej. Integracja mikroskopii fluorescencyjnej z wirującym dyskiem i całkowitym odbiciem wewnętrznym w jednym zestawieniu umożliwia eksperymenty obrazowania na żywo z dużą szybkością akwizycji do 3,5 s na stos obrazów.

Wizualizacja powstawania adhezji w komórkach za pomocą zaawansowanej mikroskopii fluorescencyjnej z całkowitym odbiciem wewnętrznym

Napięcie integryny odgrywa ważną rolę w różnych funkcjach komórki. Dzięki zintegrowanemu czujnikowi naprężenia, napięcie integryny jest kalibrowane z czułością pikoNewtona (pN) i obrazowane w rozdzielczości submikronowej.

Obrazowanie napięcia integryny i siły komórkowej w rozdzielczości submikronowej za pomocą zintegrowanego czujnika napięcia

Powierzchnia TGT to innowacyjna platforma do badania przesłuchów czynnika wzrostu z integryną. Elastyczna konstrukcja sondy, specyficzność liganda adhezyjnego i precyzyjna modulacja warunków stymulacji pozwalają na solidną ocenę ilościową wzajemnych oddziaływań EGFR-integryna. Wyniki wskazują, że EGFR jest "mechano-organizatorem" dostrajającym mechanikę integryny, wpływającym na ogniskowy montaż adhezyjny i rozprzestrzenianie się komórek.

Sondy mocujące do pomiaru naprężenia do ilościowego określania mechaniki integryny i adhezji za pośrednictwem czynnika wzrostu

Ten protokół opisuje opartą na cytometrii przepływowej, wysokoprzepustową metodę przesiewową w celu identyfikacji małocząsteczkowych leków, które hamują aktywację integryny β2 na ludzkich neutrofilach.

Wysokoprzepustowa technika oparta na cytometrii przepływowej do badań przesiewowych leków hamujących integryny

Szczegółowy protokół obrazowania pojedynczych migrujących płytek krwi za pomocą funkcjonalizowanych RGD uwięzi awidyna-biotyna o regulowanej gęstości jest dostarczony, ujawniając, że płytki krwi generują wystarczającą siłę, aby zerwać wiązanie awidyna-biotyna.

Test in vitro do badania migracji płytek krwi przy użyciu funkcjonalizowanych RGD tetherów awidyna-biotyna

Poznaj statyczny test adhezyjny do badania aktywacji integryny w limfocytach T. Ta metoda umożliwia ilościową analizę adhezji komórkowej przy użyciu ludzkich limfocytów T i pomiaru fluorescencji CFSE.

Statyczny test adhezyjny do badania aktywacji integryny w limfocytach T

Przeglądaj więcej filmów