Statyczny test adhezyjny do badania aktywacji integryny w limfocytach T

Ogólnym celem tej procedury jest ilościowe określenie adhezji komórkowej. Osiąga się to poprzez najpierw pokrycie 96-dołkowej mikropłytki cząsteczkami adhezyjnymi w drugim etapie. Pierwotne ludzkie limfocyty T są izolowane z krwi i znakowane CFSE.

Następnie limfocyty T są stymulowane zabiegami, aby wpłynąć na ich adhezję. W ostatnim etapie leczone komórki są dodawane do mikropłytki i pozwala na wystąpienie adhezji. Ostatecznie ilość fluorescencji na studzienkę można zmierzyć, aby określić procent przylegających komórek na warunek leczenia.

Główną zaletą tej techniki w porównaniu z istniejącymi metodami, takimi jak dodawanie limfocytów T do modelu i anterium, jest to, że nie jest wymagana kohodowla komórek T i komórek erl. Ta metoda może pomóc odpowiedzieć na kluczowe pytania w dziedzinie immunologii, takie jak to, jak określone leki wpływają na adhezję limfocytów? Chociaż metoda ta może zapewnić wgląd w biologię stopy liniowej, można ją również zastosować do innych komórek maie, takich jak neutrofile.

Wizualna demonstracja tej metody ma kluczowe znaczenie, ponieważ kroki są trudne do opanowania i wymagają precyzji i umiejętności Aby zakodować mikropłytkę z cząsteczkami adhezyjnymi, zacznij od przemycia 24 dołków 96-dołkowej płytki 50 mikrolitrami roztworu do mycia, a następnie inkubuj każdą studzienkę, z wyjątkiem niepowlekanych studzienek kontrolnych, z 50 mikrolitrami roztworu powlekającego przez godzinę w temperaturze 37 stopni Celsjusza. Następnie delikatnie zassać roztwór powlekający, nie dopuszczając do tego, aby końcówka pipety dotykała dna studzienek. Następnie po umyciu studzienek 50 dodatkowymi mikrolitrami roztworu do mycia, inkubować mikropłytkę z 50 mikrolitrami roztworu adhezyjnego na studzienkę.

Ponownie, w 37 stopniach Celsjusza. Po godzinie delikatnie zassać roztwór adhezyjny i ponownie umyć studzienki 50 mikrolitrami roztworu płuczącego Aby wyizolować limfocyty T, najpierw dokładnie wymieszaj 50 mikrolitrów koktajlu wzbogacającego ludzkie limfocyty T na każdy mililitr krwi pełnej, a następnie inkubuj leczoną krew przez 20 minut w temperaturze pokojowej. Następnie dodaj sześć mililitrów traktowanej krwi i równą objętość PBS wolnego od wapnia i magnezu wzbogaconego o 1% glukozy D do 50-mililitrowej stożkowej probówki o temperaturze pokojowej i delikatnie wymieszaj roztwór.

Następnie dodaj 15 mililitrów preparatu limfatycznego do świeżej 50-mililitrowej stożkowej probówki i ostrożnie ułóż rozcieńczoną próbkę krwi na pożywce do izolacji limfocytów. Oddziel warstwy komórek na 20 minut w temperaturze 400 razy G i 20 stopni Celsjusza z odłamaniem. Następnie użyj świeżej pipety do pasty, aby usunąć górną warstwę, pozostawiając warstwę limfocytów nienaruszoną na granicy faz

Przenieś warstwę limfocytów do świeżej stożkowej probówki za pomocą nowej pipety do pestek. Dodaj dziewięć mililitrów PBS do limfocytów, a następnie równomiernie rozprowadź komórki w całej zawiesinie, delikatnie wciągając je i wyjmując. Zakręć komórki, a następnie ponownie zawieś osad w podłożu.

Następnie dozować komórki do kolby hodowlanej T 75. 20 mililitrów pożywki hodowlanej w celu stymulacji komórek po odpowiednim okresie hodowli. Najpierw dodaj pożywkę wolną od surowicy do 2,4 razy 10 do sześciu limfocytów T, a następnie surowicę zagłodzić komórki w inkubatorze o temperaturze 37 stopni Celsjusza.

Po dwóch godzinach odwiruj komórki i ponownie zawieś granulkę. W jednym mililitrze PBS oznacz komórki markerem fluorescencyjnym w ciemności przez osiem minut w temperaturze pokojowej, a następnie zatrzymaj reakcję, dodając 10 mililitrów PBS o temperaturze 37 stopni Celsjusza. Następnie, po odwirowaniu komórek, ponownie zawieś osad w 1,2 mililitra wstępnie ciepłego roztworu adhezyjnego.

Podgrzej powlekaną mikropłytkę do 37 stopni Celsjusza, a następnie podziel komórki na osiem 150 mikrolitrowych porcji w 1,5. Rurki mililitrowe stymulują jedną rurkę PMA w stężeniu 10 nanogramów na mililitr, aby służyć jako kontrola pozytywna. Pozostawić trzy probówki niepoddane obróbce, aby obsłużyć kontrolę stymulacji, kontrolę niemytego ładowania i kontrolę dla ICAM jedną powłokę i stymulować cztery probówki różnymi stężeniami przeciwciał anty CD 3.

Następnie natychmiast podajcie 50 mikrolitrów po 10 do 5 komórek na studzienkę stymulowanych mieszanin komórkowych do odpowiednich dołków w mikropłytce i inkubować płytkę w temperaturze 37 stopni Celsjusza przez 15 minut. Aby najpierw określić procent przylegających komórek, umyj każdą studzienkę 150 mikrolitrami ciepłego roztworu adhezyjnego. Delikatnie potrząsaj płytką przez kilka sekund, a następnie ostrożnie odessaj pożywkę z każdej studzienki, nie dotykając końcówkami pipet dna studzienek.

Powtórz mycie trzy razy, zmieniając kąt pipety przy każdym zasysaniu. Następnie włącz czytnik płytek i otwórz oprogramowanie do odczytu płyt w menu zadań. Kliknij przycisk Nowy, aby skonfigurować nowy protokół.

Następnie w menu akcji wybierz opcję odczytu. Kliknij natężenie fluorescencji i kliknij OK. Wprowadź długość fali wzbudzenia jako 485, a długość fali emisji jako 528.

Następnie w menu opcji optycznych wybierz dolny i kliknij OK. Następnie wróć do menu akcji i ustaw temperaturę na 37 stopni Celsjusza i kliknij OK. Na koniec załaduj mikropłytkę i kliknij uruchom.

Po wyeksportowaniu wyników do arkusza kalkulacyjnego użyj wzoru, aby obliczyć procent komórek przylegania na tych obrazach. Przedstawiono przykład testu adhezyjnego z użyciem pierwotnych limfocytów T, stymulowanych różnymi stężeniami przeciwciał anty CD 3. Niestymulowane komórki służą jako kontrola negatywna.

Komórki traktowane PMA służą jako kontrola pozytywna Dla przeciwciał anty CD three tabela przedstawia względne intensywności fluorescencji CFSE. Znakowane pierwotne limfocyty T stymulowane różnymi dawkami rozpuszczalnych przeciwciał anty CD 3 i posiane na jednym dołku pokrytym IAM. Dla każdego warunku można obliczyć średnią intensywność trzech studzienek i przeliczyć je na względny procent wszystkich załadowanych komórek.

W typowym eksperymencie odsetek przylegających komórek traktowanych PMA wynosi od 40 do 50%, podczas gdy odsetek komórek niestymulowanych wynosi od pięciu do 10%Należy zauważyć, że odsetek komórek przylegających wzrasta wraz ze wzrostem stężenia przeciwciał anty CD 3 stosowanych do stymulacji. Po opanowaniu tę technikę można wykonać w mniej niż trzy godziny, jeśli zostanie wykonana prawidłowo. Próbując wykonać tę procedurę, należy pamiętać o zmierzeniu fluorescencji nieumytej studni w celu określenia wejścia fluorescencji.

Krytyczna wartość w analizie danych. Po obejrzeniu tego filmu powinieneś dobrze zrozumieć, jak określić ilościowo statyczną adhezję komórkową. Nie zapominaj, że praca z próbkami ludzkiej krwi może być niezwykle niebezpieczna, a podczas wykonywania tej procedury należy zawsze zachować środki ostrożności, takie jak noszenie fartucha laboratoryjnego i rękawiczek.