Statyczny test adhezyjny do badania aktywacji integryny w limfocytach T
June 13th, 2014
Statyczny test adhezji to potężne narzędzie, które może być użyte do modelowania interakcji między limfocytami T a innymi typami komórek. Interakcje są generowane przez wstrzykiwanie znakowanych limfocytów T do studzienek pokrytych cząsteczkami adhezyjnymi, podczas gdy czytnik płytek służy do ilościowego określania liczby przylegających komórek po seryjnym płukaniu.
Ogólnym celem tej procedury jest ilościowe określenie adhezji komórkowej. Osiąga się to poprzez najpierw pokrycie 96-dołkowej mikropłytki cząsteczkami adhezyjnymi w drugim etapie. Pierwotne ludzkie limfocyty T są izolowane z krwi i znakowane CFSE.
Następnie limfocyty T są stymulowane zabiegami, aby wpłynąć na ich adhezję. W ostatnim etapie leczone komórki są dodawane do mikropłytki i pozwala na wystąpienie adhezji. Ostatecznie ilość fluorescencji na studzienkę można zmierzyć, aby określić procent przylegających komórek na warunek leczenia.
Główną zaletą tej techniki w porównaniu z istniejącymi metodami, takimi jak dodawanie limfocytów T do modelu i anterium, jest to, że nie jest wymagana kohodowla komórek T i komórek erl. Ta metoda może pomóc odpowiedzieć na kluczowe pytania w dziedzinie immunologii, takie jak to, jak określone leki wpływają na adhezję limfocytów? Chociaż metoda ta może zapewnić wgląd w biologię stopy liniowej, można ją również zastosować do innych komórek maie, takich jak neutrofile.
Wizualna demonstracja tej metody ma kluczowe znaczenie, ponieważ kroki są trudne do opanowania i wymagają precyzji i umiejętności Aby zakodować mikropłytkę z cząsteczkami adhezyjnymi, zacznij od przemycia 24 dołków 96-dołkowej płytki 50 mikrolitrami roztworu do mycia, a następnie inkubuj każdą studzienkę, z wyjątkiem niepowlekanych studzienek kontrolnych, z 50 mikrolitrami roztworu powlekającego przez godzinę w temperaturze 37 stopni Celsjusza. Następnie delikatnie zassać roztwór powlekający, nie dopuszczając do tego, aby końcówka pipety dotykała dna studzienek. Następnie po umyciu studzienek 50 dodatkowymi mikrolitrami roztworu do mycia, inkubować mikropłytkę z 50 mikrolitrami roztworu adhezyjnego na studzienkę.
Ponownie, w 37 stopniach Celsjusza. Po godzinie delikatnie zassać roztwór adhezyjny i ponownie umyć studzienki 50 mikrolitrami roztworu płuczącego Aby wyizolować limfocyty T, najpierw dokładnie wymieszaj 50 mikrolitrów koktajlu wzbogacającego ludzkie limfocyty T na każdy mililitr krwi pełnej, a następnie inkubuj leczoną krew przez 20 minut w temperaturze pokojowej. Następnie dodaj sześć mililitrów traktowanej krwi i równą objętość PBS wolnego od wapnia i magnezu wzbogaconego o 1% glukozy D do 50-mililitrowej stożkowej probówki o temperaturze pokojowej i delikatnie wymieszaj roztwór.
Następnie dodaj 15 mililitrów preparatu limfatycznego do świeżej 50-mililitrowej stożkowej probówki i ostrożnie ułóż rozcieńczoną próbkę krwi na pożywce do izolacji limfocytów. Oddziel warstwy komórek na 20 minut w temperaturze 400 razy G i 20 stopni Celsjusza z odłamaniem. Następnie użyj świeżej pipety do pasty, aby usunąć górną warstwę, pozostawiając warstwę limfocytów nienaruszoną na granicy faz
.Przenieś warstwę limfocytów do świeżej stożkowej probówki za pomocą nowej pipety do pestek. Dodaj dziewięć mililitrów PBS do limfocytów, a następnie równomiernie rozprowadź komórki w całej zawiesinie, delikatnie wciągając je i wyjmując. Zakręć komórki, a następnie ponownie zawieś osad w podłożu.
Następnie dozować komórki do kolby hodowlanej T 75. 20 mililitrów pożywki hodowlanej w celu stymulacji komórek po odpowiednim okresie hodowli. Najpierw dodaj pożywkę wolną od surowicy do 2,4 razy 10 do sześciu limfocytów T, a następnie surowicę zagłodzić komórki w inkubatorze o temperaturze 37 stopni Celsjusza.
Po dwóch godzinach odwiruj komórki i ponownie zawieś granulkę. W jednym mililitrze PBS oznacz komórki markerem fluorescencyjnym w ciemności przez osiem minut w temperaturze pokojowej, a następnie zatrzymaj reakcję, dodając 10 mililitrów PBS o temperaturze 37 stopni Celsjusza. Następnie, po odwirowaniu komórek, ponownie zawieś osad w 1,2 mililitra wstępnie ciepłego roztworu adhezyjnego.
Podgrzej powlekaną mikropłytkę do 37 stopni Celsjusza, a następnie podziel komórki na osiem 150 mikrolitrowych porcji w 1,5. Rurki mililitrowe stymulują jedną rurkę PMA w stężeniu 10 nanogramów na mililitr, aby służyć jako kontrola pozytywna. Pozostawić trzy probówki niepoddane obróbce, aby obsłużyć kontrolę stymulacji, kontrolę niemytego ładowania i kontrolę dla ICAM jedną powłokę i stymulować cztery probówki różnymi stężeniami przeciwciał anty CD 3.
Następnie natychmiast podajcie 50 mikrolitrów po 10 do 5 komórek na studzienkę stymulowanych mieszanin komórkowych do odpowiednich dołków w mikropłytce i inkubować płytkę w temperaturze 37 stopni Celsjusza przez 15 minut. Aby najpierw określić procent przylegających komórek, umyj każdą studzienkę 150 mikrolitrami ciepłego roztworu adhezyjnego. Delikatnie potrząsaj płytką przez kilka sekund, a następnie ostrożnie odessaj pożywkę z każdej studzienki, nie dotykając końcówkami pipet dna studzienek.
Powtórz mycie trzy razy, zmieniając kąt pipety przy każdym zasysaniu. Następnie włącz czytnik płytek i otwórz oprogramowanie do odczytu płyt w menu zadań. Kliknij przycisk Nowy, aby skonfigurować nowy protokół.
Następnie w menu akcji wybierz opcję odczytu. Kliknij natężenie fluorescencji i kliknij OK. Wprowadź długość fali wzbudzenia jako 485, a długość fali emisji jako 528.
Następnie w menu opcji optycznych wybierz dolny i kliknij OK. Następnie wróć do menu akcji i ustaw temperaturę na 37 stopni Celsjusza i kliknij OK. Na koniec załaduj mikropłytkę i kliknij uruchom.
Po wyeksportowaniu wyników do arkusza kalkulacyjnego użyj wzoru, aby obliczyć procent komórek przylegania na tych obrazach. Przedstawiono przykład testu adhezyjnego z użyciem pierwotnych limfocytów T, stymulowanych różnymi stężeniami przeciwciał anty CD 3. Niestymulowane komórki służą jako kontrola negatywna.
Komórki traktowane PMA służą jako kontrola pozytywna Dla przeciwciał anty CD three tabela przedstawia względne intensywności fluorescencji CFSE. Znakowane pierwotne limfocyty T stymulowane różnymi dawkami rozpuszczalnych przeciwciał anty CD 3 i posiane na jednym dołku pokrytym IAM. Dla każdego warunku można obliczyć średnią intensywność trzech studzienek i przeliczyć je na względny procent wszystkich załadowanych komórek.
W typowym eksperymencie odsetek przylegających komórek traktowanych PMA wynosi od 40 do 50%, podczas gdy odsetek komórek niestymulowanych wynosi od pięciu do 10%Należy zauważyć, że odsetek komórek przylegających wzrasta wraz ze wzrostem stężenia przeciwciał anty CD 3 stosowanych do stymulacji. Po opanowaniu tę technikę można wykonać w mniej niż trzy godziny, jeśli zostanie wykonana prawidłowo. Próbując wykonać tę procedurę, należy pamiętać o zmierzeniu fluorescencji nieumytej studni w celu określenia wejścia fluorescencji.
Krytyczna wartość w analizie danych. Po obejrzeniu tego filmu powinieneś dobrze zrozumieć, jak określić ilościowo statyczną adhezję komórkową. Nie zapominaj, że praca z próbkami ludzkiej krwi może być niezwykle niebezpieczna, a podczas wykonywania tej procedury należy zawsze zachować środki ostrożności, takie jak noszenie fartucha laboratoryjnego i rękawiczek.
View the full transcript and gain access to thousands of scientific videos
Przegląd
Statyczne badanie adhezji jest metodą stosowaną do badania interakcji między limfocytami T a innymi typami komórek. Polega ona na pokryciu mikroplatek cząsteczkami adhezji i ilościowym określeniu adhezji komórek T za pomocą pomiaru fluorescencji.
Kluczowe elementy badania
Obszar nauki
- Adhezja komórkowa
- Immunologia
- Biologia komórki
Tło
- Zrozumienie interakcji komórek T jest kluczowe dla badań immunologicznych.
- Cząsteczki adhezji odgrywają istotną rolę w interakcjach międzykomórkowych.
- Ilościowa ocena adhezji może dostarczyć wglądu w zachowanie komórek T.
- To badanie można dostosować do różnych warunków eksperymentalnych.
Cel badania
- Ilościowa ocena adhezji komórkowej limfocytów T.
- Ocena wpływu różnych traktowań na adhezję komórek T.
- Dostarczenie niezawodnej metody do badania interakcji komórek T.
Stosowane metody
- Pokrycie mikroplatek 96-well cząsteczkami adhezji.
- Izolowanie pierwotnych ludzkich komórek T z krwi.
- Oznaczanie komórek T CFSE do pomiaru fluorescencji.
- Stymulowanie komórek T różnymi traktowaniami w celu modyfikacji ich adhezji.
Główne wyniki
- Pomiar fluorescencji wskazuje procent adhezji komórek.
- Różne traktowania wpływają na poziom adhezji komórek T.
- Badanie dostarcza ilościowych danych na temat interakcji komórek T.
- Wyniki mogą posłużyć jako podstawa dalszych badań nad reakcjami immunologicznymi.
Wnioski
- Statyczne badanie adhezji jest skuteczną metodą do badania interakcji komórek T.
- Ilościowa analiza adhezji może ujawniać ważne biologiczne wnioski.
- Ta metoda może być wykorzystywana w różnych kontekstach badań immunologicznych.
Często zadawane pytania
Executive Industry Relevance
Quantifying integrin-mediated adhesion in T lymphocytes provides a mechanistic readout for evaluating immunomodulatory compounds that influence immune cell trafficking and synapse formation. This static adhesion assay enables target validation by linking intracellular signaling events to functional adhesive outputs, supporting de-risking of immunomodulator candidates in early discovery. The assay’s adaptability to other integrin-ligand pairs (e.g., VLA-4/fibronectin) extends its utility across inflammatory and autoimmune disease areas.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Interrogates inside-out signaling pathways that regulate integrin affinity states, enabling mechanistic de-risking of targets involved in T cell activation.
- Operational Value: Provides a quantitative, fluorescence-based readout to compare adhesion levels across treatment conditions, supporting hypothesis testing in immunomodulator screening.
Screening & Assay Development
- Scientific Value: Generates dose-response data for compounds affecting lymphocyte adhesion, such as anti-CD3 antibodies or PMA, enabling lead identification based on functional immunomodulation.
- Operational Value: Uses a standardized 96-well format with CFSE labeling and plate reader compatibility, supporting assay reproducibility and scalability for medium-throughput screening.
Translational & Preclinical Research
- Scientific Value: Connects molecular mechanisms of integrin activation to cellular phenotypes relevant to immune cell migration and immunological synapse formation.
- Operational Value: Enables evaluation of adhesion-modulating substances in a disease-relevant system using primary human T cells, supporting translational biomarker alignment.
Pipeline & Workflow Integration
The assay fits within the discovery continuum from target validation to lead identification, where quantitative adhesion measurements help prioritize immunomodulators based on functional impact on T cell behavior.
- Discovery Biology: Supports hypothesis testing of inside-out signaling pathways by measuring changes in integrin-mediated adhesion under controlled stimulation.
- Screening: Delivers standardized, quantitative fluorescence outputs that allow comparison of compound effects on T cell adhesiveness across replicates.
- Analytics: Enables calculation of percent adherent cells relative to controls, providing a normalized metric for structure-activity relationship analysis.
- Translational Research: Uses primary human T cells coated with physiological ligands (e.g., ICAM-1), enhancing relevance to human immune responses.
- Enterprise Reuse: Adaptable to alternative integrin-ligand pairs, allowing reuse across multiple immunology projects without redeveloping core methodology.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Reduces mechanistic ambiguity by linking receptor stimulation to functional adhesion outcomes, increasing predictive confidence in immunomodulator mechanisms.
- Operational Value: Eliminates need for co-culture systems, simplifying workflow and reducing variability compared to cell-based adhesion assays requiring APCs.
- Strategic Value: Enables earlier go/no-go decisions by identifying compounds that fail to modulate T cell adhesion, reducing investment in mechanistically inactive candidates.
- Portfolio Impact: Supports risk-adjusted prioritization of immunomodulators based on quantitative adhesion profiles, improving capital efficiency in preclinical development.
Implementation Considerations
- Requires expertise in primary human T cell isolation and fluorescence-based assay techniques.
- Dependent on access to a fluorescence plate reader capable of CFSE excitation (485 nm) and emission (528 nm) detection.
- Necessitates standardization of coating, stimulation, and washing steps to ensure reproducible adhesion measurements across wells and experiments.
- Adaptation to other integrin-ligand pairs (e.g., VLA-4/fibronectin) requires validation of coating efficiency and ligand specificity.
- Limitations include static conditions that may not fully replicate shear-dependent adhesion observed in vivo.
