Wykorzystanie białek fluorescencyjnych do monitorowania dynamiki glikosomów w afrykańskim trypanosomie

Ogólnym celem poniższego eksperymentu jest obserwacja zmian w składzie glikologicznym w żywych komórkach w czasie rzeczywistym. Osiąga się to poprzez ekspresję białka fluorescencyjnego połączonego z sekwencją celującą w Pero Somal PTs dwa. Białko fuzyjne jest importowane do dojrzałych stref glikologicznych, które stają się organellami fluorescencyjnymi.

Degradacja i recykling prowadzą do utraty fluorescencji, którą można monitorować za pomocą przepływu Komórki cytometryczne są wystawione na działanie różnych warunków środowiskowych w celu zidentyfikowania czynników, które wywołują przebudowę glikosteroidy. Wyniki pokazują, że skład glikoaktywny zmienia się w odpowiedzi na zmiany środowiskowe w oparciu o zmiany fluorescencji komórkowej po przejściu komórek z pożywki ubogiej w składniki odżywcze do pożywki bogatej w składniki odżywcze. Tak więc główną przewagą tej techniki nad istniejącymi metodami, takimi jak mikroskopia elektronowa i fluorescencyjna, jest to, że pozwala na analizę tysięcy komórek w czasie rzeczywistym.

Procedurę zademonstrują Sarah Bauer, doktorantka i Megan Conlan, studentka studiów licencjackich z mojego laboratorium. Forma procykliczna owadów lub pasożyty PCF do tej procedury są hodowane w kolbie do hodowli komórkowej o powierzchni 25 centymetrów kwadratowych z 10 mililitrami odpowiedniej pożywki w temperaturze 27 stopni Celsjusza i 5% CO2. Przygotowanie DNA osocza nie zostanie pokazane w tym filmie, ale protokół jest dostępny w dołączonym manuskrypcie.

Aby rozpocząć tę procedurę, dodaj 10 mikrolitrów sterylnego, oczyszczonego, zlinearyzowanego DNA do 400 mikrolitrów wysterylizowanych z filtrem komórek zliczających cyto za pomocą cytometru przepływowego i zbierz od 50 do stu milionów komórek przez odwirowanie w temperaturze 800 G przez 15 minut. W temperaturze pokojowej odlać supernatant za pomocą jednomililitrowej pipety serologicznej ponownie zawiesić osad komórkowy w 450 mikrolitrach mieszanki DNA i Cyt. Przenieś roztwór zawierający komórki, DNA i cyto do sterylnej szczeliny o wielkości czterech mililitrów.

Qve i umieść qve w komorze elektroporacji. Wybierz opcję Rozkład wykładniczy i ręcznie wprowadź następujące ustawienia. Napięcie: 1,5 kilowolta, pojemność, rezystancja 25 mili, nieskończona omega i weterynarz cztery milimetry.

Naciśnij puls po zakończeniu impulsu. Wyjmij weterynarza z komory elektroporacyjnej i wróć do szafy bezpieczeństwa biologicznego. Odpipetować 10 mililitrów pożywki SDM 79 do nowej sterylnej kolby.

Przenieść przekształcone komórki do kolby z SDM 79. Inkubuj komórki bez wyboru leku przez 24 godziny. W 27 stopniach Celsjusza 5% CO2.

Po 24 godzinach przechodzi G 4 1 8 higromycyna i blastina. Jeden mililitr przekształconych komórek z lekiem w dziewięć mililitrów SDM 79 z lekiem zwraca komórki do inkubatora. Następnie komórki są codziennie analizowane za pomocą cytometrii przepływowej, która zostanie zademonstrowana w dalszej części tego filmu.

S do długotrwałego przechowywania są wytwarzane, gdy komórki są fluorescencyjne i osiągnęły gęstość komórek 10 milionów komórek na mililitr. Najpierw przygotuj pożywkę do zamrażania, dodając równą objętość 100% glicerolu do cyto mix i przefiltruj, sterylizując roztwór. Następnie dodaj 200 mikrolitrów pożywki do zamrażania do 800 mikrolitrów komórek w fiolce kriogenicznej i delikatnie wymieszaj przez inwersję.

Umieść kriofiolkę między dwoma styropianowymi stojakami i zamrażaj w temperaturze minus 80 stopni Celsjusza przez około 24 godziny. Po zamrożeniu przenieś komórki do ciekłego azotu, ważne jest, aby przenieść komórki do ciekłego azotu Po 24 godzinach, ponieważ dłuższe przechowywanie w temperaturze minus 80 stopni Celsjusza prowadzi do spadku żywotności komórek Aby rozmrozić zamrożony bulion. Wyjmij zamrożoną fiolkę z zamrażarki o temperaturze minus 80 stopni Celsjusza i rozmrażaj w temperaturze pokojowej przez około 10 minut.

Odpipetować dziewięć mililitrów pożywki SDM 79 z lekiem do nowej sterylnej kolby. Dodać rozmrożone komórki do tej kolby, przejść do komórek od 1 do 10, dodając jeden mililitr tej kultury do dziewięciu mililitrów SDM 79 w nowej kolbie, aby przygotować kulturę do przejścia testu rozcieńczenia do komórek do gęstości 100 000 komórek na mililitr w trzech mililitrach SDM 79. W kolbie hodowlanej o pojemności 25 mililitrów fluorescencyjną mierzy się natychmiast po pasażu, a następnie po trzech godzinach i po 24 godzinach.

Kiedy komórki są hodowane dłużej niż dwa przejścia, przebudowa lizosomów staje się nieprzewidywalna. Przed uruchomieniem jakichkolwiek próbek, fluidyki należy ponownie przepłukać i przepłukać, jak pokazano. Tutaj włącz cytometr przepływowy i otwórz program C Flow plus.

Wymień probówkę z nano czystą wodą, w której przechowywany jest SIP, pustą probówką. Wybierz przycisk płukania wstecznego. Po zakończeniu płukania wstecznego.

Wyjmij rurkę mikrowirówki z łyka i wyrzuć ją. Umieść nową probówkę mikrowirówki zawierającą jeden mililitr nowej nano czystej wody na łyku. Wybierz nową studnię w programie C Flow w obszarze Limity uruchamiania.

Ustaw czas na dwie minuty. W obszarze Fluidics wybierz pozycję fast (szybki) i run (uruchom). Po upływie dwuminutowego limitu czasu kliknij przycisk usuwania przykładowych danych.

Po ustawieniu cytometru przepływowego komórki można policzyć. Zastąp wodę na SIP próbką, która ma zostać policzona. Ustaw limity przebiegów na 30 sekund, płyny na szybkie, a następnie wybierz pozycję uruchom po osiągnięciu 32. limitu czasu.

C Flow plus dostarczy zdarzenia na mikrolitr w ostatnim uruchomieniu. Aby zmierzyć fluorescencję, ustaw limity przebiegu na 10 000 zdarzeń i płynów. Aby zwolnić, wybierz ustaw próg.

W obszarze próg podstawowy wybierz pozycję trwale wyeliminuj zdarzenia w usłudze FSCH i wprowadź mniej niż 30 000. Kliknij zastosuj, a następnie zamknij, wybierz przycisk histogramu w jednym z nowych okien wykresu i wybierz FSCA Z listy rozwijanej wybierz FL one A, który mierzy fluorescencję. W długości fali 530 nanometrów wybierz bieg.

Po ocenie wszystkich kultur pod kątem fluorescencji, przepuść roztwór czyszczący przez linię fluidyczną przez dwie minuty i wodę przez dwie minuty. Aby rozpocząć analizę danych, wybierz kartę Analiza w programie C Flow plus. Kliknij przycisk histogramu poniżej, utwórz nowy wykres.

Wybierz opcję FSEA. Pojawi się lista rozwijana. Wybierz kanał FFL jeden a.

Zaznacz studnię do analizy, wybierz przycisk bramy i ręcznie narysuj bramę dla interesującej Cię populacji. C Flow plus zapewni liczbę komórek w tej bramce i procent tej analizy cytometrii przepływowej tej powierzchni komórek PCF hodowanych w pożywkach zawierających glukozę. SDM 79 ujawnił dwie populacje, jedną jasną i jedną przyćmioną.

Przyciemnione komórki zawierają niedojrzałe strefy gliko, które nie zaimportowały fluorescencyjnego reportera. Podczas gdy jasne komórki zawierają bardziej dojrzałe strefy gliko, gdy glukoza jest obecna w pożywce, lokalizacja białek glikologicznych jest śmiertelna, a ekspresja i import białka gly muszą być ściśle kontrolowane. Znajduje to odzwierciedlenie w braku komórek o pośredniej intensywności fluorescencji.

W pożywkach SDM 80 Bez glukozy tolerowana jest lokalizacja mis białek glikowych. Bimodalny rozkład populacji zostaje utracony i obserwuje się komórki o pośredniej fluorescencji. System ten może być używany do identyfikacji warunków, które wywołują przebudowę glikoterapii.

Gdy hodowle o dużej gęstości zawierają około 10% przyciemnionych komórek lub przechodzą do świeżej pożywki, następuje wzrost odsetka przyciemnionych komórek z niedojrzałymi strefami gliko mieszczącymi się w lewej bramce. W ciągu 24 godzin pierwotny rozkład populacji jest przywracany. Ponieważ niedojrzałe pianki glicograficzne zawierają teraz białka peroksysomów niezbędne do importu białka fluorescencyjnego.

Próbując wykonać tę procedurę, należy pamiętać, aby unikać ekstensywnego hodowania. Po dwóch przejściach kultury należy wyrzucić i użyć nowych stabilnych ósemek. Protokół ten pozwala na identyfikację odczynników i warunków, które uruchamiają modelowanie glikologiczne.

Po tej procedurze można wykonać inne leki, takie jak analiza zachodnia oraz mikroskopia fluorescencyjna i elektronowa. Aby dokładniej odpowiedzieć na zmiany w ekspresji, lokalizacji i morfologii białek glikologicznych.