Name: Wykorzystanie białek fluorescencyjnych do monitorowania dynamiki glikosomów w afrykańskim trypanosomie (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-08-19T13:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 4 s
Description: Poznaj metodę cytometrii przepływowej do monitorowania dynamiki glikosomów w żywych komórkach afrykańskiego trypanosoma. Technika fluorescencyjna umożliwia analizę tysięcy komórek w czasie rzeczywistym.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Ta praca została sfinansowana przez Creative Inquiry Program for Undergraduate Research oraz Calhoun Honors College na Uniwersytecie Clemson.

1. Ogólna hodowla trypanosomów
<ol>
	<li>Zważyć ciała stałe do przygotowania pożywek SDM79 (Tabela 1).</li>
	<li>Przechowywać w temperaturze 4 °C w 50 ml stożkowym opakowaniu lub woreczku Ziploc. UWAGA: Odczynniki są stabilne przez co najmniej 6 miesięcy.</li>
	<li>Rozmrozić płodową surowicę bydlęcą (FBS) w łaźni wodnej o temperaturze 37 °C i okresowo mieszać przez inwersję. UWAGA: FBS jest otrzymywany od dostawcy w postaci sterylnego roztworu. Sterylizacja filtra FBS zmniejsza jego zdolność do wspierania wzrostu pasożytów.</li>
	<li>Po rozmrożeniu całej butelki podgrzewać surowicę dezaktywującą przez 30 minut w łaźni wodnej o temperaturze 56 °C, mieszając okresowo, aby zminimalizować wytrącanie się składników surowicy.</li>
	<li>Rozmrozić roztwór penicyliny/streptomycyny (pióro/paciorkowiec), heminę (2 mg/ml w 50 mM NaOH) i podstawowy roztwór witaminy orła w temperaturze pokojowej.</li>
	<li>Do cylindra z podziałką o pojemności 1 000 ml dodać 20,2 g substancji stałych SDM79 (Tabela 1) do składników płynnych (Tabela 2) i dobrze wymieszać na płytce mieszającej.</li>
	<li>Dostosuj pH do 7,35 i dodaj objętość do 850 ml wodą.</li>
	<li>Filtruj media sterylizacyjne, podłączając wąż próżniowy do dna butelki z filtrem. Zastosuj próżnię, aż roztwór zostanie przefiltrowany.</li>
	<li>Zdejmij pokrywę filtra w komorze bezpieczeństwa biologicznego i dodaj 150 ml inaktywowanego termicznie FBS. Usuń plastikową osłonę ze sterylnej nakrętki i zamknij butelkę z pożywką.</li>
	<li>Przygotuj pożywkę SDM80 w taki sam sposób jak SDM79 z następującymi wyjątkami: nie dodawaj glukozy ani glukozaminy i używaj MEM bez glutaminy. W miejsce 150 ml FBS inaktywowanego termicznie dodać 135 ml dializowanego, inaktywowanego termicznie FBS i 15 ml FBS inaktywowanego termicznie.</li>
	<li>Hodowla pasożytów PCF w kolbie o średnicy 25cm2 z 10 ml odpowiedniej pożywki w temperaturze 27 °C i 5%CO2. UWAGA: Komórki należy liczyć codziennie za pomocą hemocytometru lub cytometru przepływowego (patrz punkt 6), a hodowle należy utrzymywać w gęstości między 1 x 105 a 5 x 106 komórek/ml.</li>
</ol>
2. Transfekcja pasożytów PCF za pomocą fluorescencyjnego konstruktu reporterowego
UWAGA: Aby śledzić dynamikę glikosomów, w pasożytach ulega ekspresji białko reporterowe zawierające peroksysomalną sekwencję celującą (PTS2) aldolazy połączonej ze wzmocnionym białkiem fluorescencyjnym na żółto. Sekwencja kodująca białko fuzyjne jest klonowana do pXS2bla12, który zawiera promotor procykliny i regiony międzygenowe tubuliny, które kierują rekombinację homologiczną do genomu i genu oporności na blasticydynę w celu selekcji. Procykliczne linie komórkowe zawierające geny kodujące polimerazę T7 i represor tetracykliny (PF29-13) są przekształcane za pomocą konstruktu celującego, pXS2:PTS2eYFP.
<ol>
	<li>Przygotować cytomiks, mieszając składniki wymienione w Tabeli 3. Filtruj, sterylizuj i przechowuj w RT.</li>
	<li>Linearyzuj plazmidowe DNA za pomocą MluI, pipetując 10 μl DNA (1 μg/μl), 5 μl buforu enzymu restrykcyjnego, 33 μl wody i 2 μl enzymu MluI do probówki mikrowirówkowej. Inkubować w temperaturze 37 °C przez 1 godzinę.</li>
	<li>Oczyść trawienie restrykcyjne przez dodanie 1 objętości buforu wiążącego do trawienia enzymu restrykcyjnego. Wymieszaj bufor wiążący i strawione DNA przez wirowanie. Krótko odwirować, aby pobrać próbkę na dno probówki.</li>
	<li>Włożyć kolumnę wiążącą DNA do probówki zbiorczej o pojemności 2 ml i przenieść strawione DNA/roztwór buforowy do kolumny.</li>
	<li>Wirować przez 10 000 x g przez 1 min. Po odwirowaniu należy wyrzucić filtrat z probówki zbiorczej i umieścić kolumnę z powrotem w probówce zbiorczej.</li>
	<li>Dodać 700 μl buforu do płukania SPW i odwirować przy 10 000 x g przez 1 min.</li>
	<li>Wyrzuć filtrat z probówki zbiorczej, włóż kolumnę z powrotem do probówki zbiorczej i powtórz etap płukania SPW i odwirowania.</li>
	<li>Wyrzucić przesąc, wwrócić kolumnę do probówki zbiorczej i odwirować pustą kolumnę przez 3 minuty przy 10 000 x g w celu usunięcia pozostałości etanolu.</li>
	<li>W komorze bezpieczeństwa biologicznego wyrzuć probówkę zbiorczą i umieść kolumnę w sterylnej probówce do mikrowirówki.</li>
	<li>Aby wymyć DNA, dodaj 25 μl sterylnej wody do kolumny i inkubuj w temperaturze pokojowej przez 2 minuty. Wirować przy 10 000 x g przez 1 min.</li>
	<li>Dodać kolejne 25 μl sterylnej wody w kapturze bezpieczeństwa biologicznego do kolumny i inkubować w temperaturze pokojowej przez 2 minuty.</li>
	<li>Wirować z prędkością 10 000 x g przez 1 min.</li>
	<li>W komorze bezpieczeństwa biologicznego przenieś całą objętość DNA do nowej sterylnej probówki do mikrowirówki. UWAGA: Ten krok zapobiega zanieczyszczeniu z otwartej pokrywy podczas wirowania.</li>
	<li>Dodać sterylne, oczyszczone, zlinearyzowane DNA (10 μg) do 400 μl cytomiksu sterylizowanego filtrem.</li>
	<li>Policzyć komórki zgodnie z opisem w sekcji 6 i zebrać 5 x107-10 8 komórek przez odwirowanie przy 800 x g przez 15 minut w temperaturze pokojowej.</li>
	<li>Odlać supernatant i ponownie zawiesić osad komórkowy w 450 μl DNA + cytomiks za pomocą pipety serologicznej o pojemności 1 ml.</li>
	<li>Przenieś roztwór zawierający komórki, DNA i cytomiks do sterylnej kuwety z odstępem 4 mm i umieść kuwetę w komorze do elektroporacji.</li>
	<li>Wybierz "Zanik wykładniczy" i ręcznie wprowadź następujące ustawienia: Napięcie: 1,5 kV, Pojemność: 25 mF, Rezystancja: Ω i Kuweta: 4 mm. Naciśnij impuls. Po zakończeniu impulsu wyjmij kuwetę z komory elektroporacyjnej i wróć do komory bezpieczeństwa biologicznego.</li>
	<li>Do nowej sterylnej kolby odpipetować 10 ml SDM79. Przenieść przekształcone komórki do kolby z 10 ml SDM79.</li>
	<li>Inkubować BEZ wyboru leku przez 24 godziny w temperaturze 27 °C, 5% CO2 . Po 24 godzinach dodać G418 (15 μg/ml), higromycynę (50 μg/ml) i blastycydynę (10 μg/ml). Przepuścić 1 ml przekształconych komórek z lekiem do 9 ml SDM79 z lekiem.</li>
	<li>Analizuj komórki codziennie, jak opisano w sekcjach 6 i 7. Gdy komórki są fluorescencyjne i osiągnęły gęstość komórek 1 x 107/ml, należy przygotować stabilaty do długotrwałego przechowywania (3.1-3.3).</li>
</ol>
3. Stabilizacja
<ol>
	<li>Aby zrobić pożywkę do zamrażania, dodaj równą objętość 100% glicerolu do cytomiksu i sterylizacji filtra.</li>
	<li>Dodać 200 μl środka zamrażającego do 800 μl komórek (1 x 107) w kriowiale, delikatnie wymieszać przez odwrócenie i umieścić między dwoma styropianowymi stojakami i zamrozić w temperaturze -80 °C.</li>
	<li>Po zamrożeniu (~24 godziny) przenieś komórki do ciekłego azotu. UWAGA: Ważne jest, aby przenieść komórki do LN2 po 24 godzinach, ponieważ dłuższe przechowywanie w temperaturze -80 °C prowadzi do spadku żywotności komórek.</li>
</ol>
4. Rozmrażanie mrożonych zapasów
<ol>
	<li>Wyjąć zamrożoną fiolkę z temperatury -80 °C i rozmrażać w temperaturze pokojowej przez około 10 minut.</li>
	<li>Odpipetować 9 ml SDM79 z lekiem do nowej sterylnej kolby. Dodać rozmrożone komórki do tej kolby. Przepuścić komórki w stosunku 1:10, dodając 1 ml tej kultury do 9 ml SDM79 w nowej kolbie (końcowe stężenie 1 x 105/ml).</li>
	<li>Zanim komórki osiągną gęstość 107 / ml, rozpocznij ustawianie cytometru i testy rozcieńczania.</li>
</ol>
5. Konfiguracja cytometru
<ol>
	<li>Włącz cytometr przepływowy i otwórz program CFlow Plus. UWAGA: Przed uruchomieniem jakichkolwiek próbek, fluidyki należy przepłukać wstecznie i przepłukać zgodnie z krokami 5.2-5.7.</li>
	<li>Zastąp probówkę z wodą nanoczystą, w której przechowywany jest łyk, pustą probówką.</li>
	<li>Wybierz przycisk "płukanie wsteczne".</li>
	<li>Po zakończeniu płukania wstecznego wyjmij probówkę mikrowirówki z łyka i wyrzuć.</li>
	<li>Umieścić nową probówkę do mikrowirówki zawierającą 1 ml nowej wody nanoczystej na łyku.</li>
	<li>Wybierz nową studnię w programie CFlow. W sekcji "Limity biegu" ustaw czas na 2 min. W sekcji "Fluidics" wybierz "szybki" i "Uruchom".</li>
	<li>Po upływie 2-minutowego limitu czasu kliknij przycisk "Usuń przykładowe dane".</li>
</ol>
6. Zliczanie komórek za pomocą cytometru przepływowego
<ol>
	<li>Zastąp wodę próbką, która ma zostać policzona. Ustaw "Run Limits" na 30 s, "Fluidics" na "fast", a następnie wybierz "Run".</li>
	<li>Po upływie 30-sekundowego limitu czasu CFlow plus poda zdarzenia/μl w polu "Ostatnie uruchomienie". Powtórz liczbę dla każdej kultury. UWAGA: Zanim komórki osiągną 1 x 107 komórek/ml, przystąp do testu rozcieńczania. Komórki należy przerwać po zakończeniu jednego testu rozcieńczania. Komórki hodowane przez dłuższy czas tracą zdolność reagowania na warunki środowiskowe.</li>
</ol>
7. Pomiar fluorescencji za pomocą cytometru przepływowego
<ol>
	<li>Aby ocenić fluorescencję, ustaw "Limity przebiegu" na 10 000 zdarzeń, a "Fluidyka" na "wolne". Wybierz "Ustaw próg". W sekcji "Próg podstawowy" wybierz "Trwale wyeliminuj zdarzenia na", "FSC-H" (w polu rozwijanym) i wprowadź mniej niż 30 000. Kliknij "zastosuj", a następnie "zamknij".</li>
	<li>Wybierz przycisk "Histogram" w jednym z nowych okien wykresu i wybierz "FSC-A" Z listy rozwijanej wybierz "FL1-A". UWAGA: FL1-A mierzy fluorescencję w długości fali 530 nm.</li>
	<li>Wybierz "Uruchom" i powtórz dla wszystkich kultur.</li>
	<li>Przepuścić roztwór czyszczący przez przewód fluidyczny przez 2 minuty i wodę przez 2 minuty.</li>
</ol>
8. Testy rozcieńczania
<ol>
	<li>Przepuścić komórki do gęstości 1 x 105 komórek/ml w 3 ml SDM79 w kolbie hodowlanej o średnicy 25cm2 i zmierzyć kwiatostan natychmiast po pasażowaniu, a następnie po 3 godzinach i 24 godzinach.</li>
</ol>
9. Analiza danych
<ol>
	<li>Wybierz zakładkę "Analizuj" w CFlow Plus.</li>
	<li>Kliknij przycisk "Histogram" w sekcji "Utwórz nowy wykres". Wybierz "FSC-A", a pojawi się lista rozwijana. Wybierz kanał "FL1-A".</li>
	<li>Zaznacz studnię do analizy. Wybierz przycisk "Brama" i ręcznie narysuj bramę dla interesującej Cię populacji.</li>
	<li>Flow Plus dostarczy komórkę "Liczba" w tej bramce i "% tej działki".</li>
</ol>

<ol><li>Stuart, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Kinetoplastids%3A+related+protozoan+pathogens%2C+different+diseases%5BTitle%5D)+AND+%22J+Clin+Invest%22%5BJournal%5D)">Kinetoplastids: related protozoan pathogens, different diseases.</a> J Clin Invest. 118, 1301-1310 (2008).</li>
<li>Herman, M., Perez-Morga, D., Schtickzelle, N., Michels, P. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Turnover+of+glycosomes+during+life-cycle+differentiation+of+Trypanosoma+brucei%5BTitle%5D)+AND+%22Autophagy%22%5BJournal%5D)">Turnover of glycosomes during life-cycle differentiation of Trypanosoma brucei.</a> Autophagy. 4, 294-308 (2008).</li>
<li>Herman, M., Gillies, S., Michels, P. A., Rigden, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Autophagy+and+related+processes+in+trypanosomatids%3A+insights+from+genomic+and+bioinformatic+analyses%5BTitle%5D)+AND+%22Autophagy%22%5BJournal%5D)">Autophagy and related processes in trypanosomatids: insights from genomic and bioinformatic analyses.</a> Autophagy. 2, 107-118 (2006).</li>
<li>Michels, P. A., Bringaud, F., Herman, M., Hannaert, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Metabolic+functions+of+glycosomes+in+trypanosomatids%5BTitle%5D)+AND+%22Biochim+Biophys+Acta%22%5BJournal%5D)">Metabolic functions of glycosomes in trypanosomatids.</a> Biochim Biophys Acta. 1763, 1463-1477 (2006).</li>
<li>Michels, P. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Peroxisomes%2C+glyoxysomes+and+glycosomes+%28review%29%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Membr+Biol%22%5BJournal%5D)">Peroxisomes, glyoxysomes and glycosomes (review).</a> Mol Membr Biol. 22, 133-145 (2005).</li>
<li>Moyersoen, J., Choe, J., Fan, E., Hol, W. G., Michels, P. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Biogenesis+of+peroxisomes+and+glycosomes%3A+trypanosomatid+glycosome+assembly+is+a+promising+new+drug+target%5BTitle%5D)+AND+%22FEMS+Microbiol+Rev%22%5BJournal%5D)">Biogenesis of peroxisomes and glycosomes: trypanosomatid glycosome assembly is a promising new drug target.</a> FEMS Microbiol Rev. 28, 603-643 (2004).</li>
<li>Parsons, M., Furuya, T., Pal, S., Kessler, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Biogenesis+and+function+of+peroxisomes+and+glycosomes%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+and+biochemical+parasitology%22%5BJournal%5D)">Biogenesis and function of peroxisomes and glycosomes.</a> Molecular and biochemical parasitology. 115, 19-28 (2001).</li>
<li>Parsons, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Glycosomes%3A+parasites+and+the+divergence+of+peroxisomal+purpose%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Glycosomes: parasites and the divergence of peroxisomal purpose.</a> Mol Microbiol. 53, 717-724 (2004).</li>
<li>Michels, P. A., Hannaert, V., Bringaud, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Metabolic+aspects+of+glycosomes+in+trypanosomatidae+-+new+data+and+views%5BTitle%5D)+AND+%22Parasitol+Today%22%5BJournal%5D)">Metabolic aspects of glycosomes in trypanosomatidae - new data and views.</a> Parasitol Today. 16, 482-489 (2000).</li>
<li>Michels, P. A., Hannaert, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+evolution+of+kinetoplastid+glycosomes%5BTitle%5D)+AND+%22J+Bioenerg+Biomembr%22%5BJournal%5D)">The evolution of kinetoplastid glycosomes.</a> J Bioenerg Biomembr. 26, 213-219 (1994).</li>
<li>Hannaert, V., Michels, P. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Structure+function%2C+and+biogenesis+of+glycosomes+in+kinetoplastida%5BTitle%5D)+AND+%22J+Bioenerg+Biomembr%22%5BJournal%5D)">Structure function, and biogenesis of glycosomes in kinetoplastida.</a> J Bioenerg Biomembr. 26, 205-212 (1994).</li>
<li>Bauer, S., Morris, J. C., Morris, M. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Environmentally+regulated+glycosome+protein+composition+in+the+african+trypanosome%5BTitle%5D)+AND+%22Eukaryot+Cell%22%5BJournal%5D)">Environmentally regulated glycosome protein composition in the african trypanosome.</a> Eukaryot Cell. 12, 1072-1079 (2013).</li>
<li>Colasante, C., Ellis, M., Ruppert, T., Voncken, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comparative+proteomics+of+glycosomes+from+bloodstream+form+and+procyclic+culture+form+Trypanosoma+brucei+brucei%5BTitle%5D)+AND+%22Proteomics%22%5BJournal%5D)">Comparative proteomics of glycosomes from bloodstream form and procyclic culture form Trypanosoma brucei brucei.</a> Proteomics. 6, 3275-3293 (2006).</li>
<li>Opperdoes, F. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Compartmentation+of+carbohydrate+metabolism+in+trypanosomes%5BTitle%5D)+AND+%22Annu+Rev+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Compartmentation of carbohydrate metabolism in trypanosomes.</a> Annu Rev Microbiol. 41, 127-151 (1987).</li>
<li>Kessler, P. S., Parsons, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Probing+the+role+of+compartmentation+of+glycolysis+in+procyclic+form+Trypanosoma+brucei%3A+RNA+interference+studies+of+PEX14%2C+hexokinase%2C+and+phosphofructokinase%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+biological+chemistry%22%5BJournal%5D)">Probing the role of compartmentation of glycolysis in procyclic form Trypanosoma brucei: RNA interference studies of PEX14, hexokinase, and phosphofructokinase.</a> The Journal of biological chemistry. 280, 9030-9036 (2005).</li>
<li>Bringaud, F., Riviere, L., Coustou, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Energy+metabolism+of+trypanosomatids%3A+adaptation+to+available+carbon+sources%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+and+biochemical+parasitology%22%5BJournal%5D)">Energy metabolism of trypanosomatids: adaptation to available carbon sources.</a> Molecular and biochemical parasitology. 149, 1-9 (2006).</li>
<li>Coustou, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Glucose-induced+remodeling+of+intermediary+and+energy+metabolism+in+procyclic+Trypanosoma+brucei%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+biological+chemistry%22%5BJournal%5D)">Glucose-induced remodeling of intermediary and energy metabolism in procyclic Trypanosoma brucei.</a> The Journal of biological chemistry. 283, 16342-16354 (2008).</li>
<li>Lamour, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Proline+metabolism+in+procyclic+Trypanosoma+brucei+is+down-regulated+in+the+presence+of+glucose%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+biological+chemistry%22%5BJournal%5D)">Proline metabolism in procyclic Trypanosoma brucei is down-regulated in the presence of glucose.</a> The Journal of biological chemistry. 280, 11902-11910 (2005).</li>
<li>Vertommen, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Differential+expression+of+glycosomal+and+mitochondrial+proteins+in+the+two+major+life-cycle+stages+of+Trypanosoma+brucei%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+and+biochemical+parasitology%22%5BJournal%5D)">Differential expression of glycosomal and mitochondrial proteins in the two major life-cycle stages of Trypanosoma brucei.</a> Molecular and biochemical parasitology. 158, 189-201 (2008).</li>
<li>Vickerman, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Developmental+cycles+and+biology+of+pathogenic+trypanosomes%5BTitle%5D)+AND+%22British+medical+bulletin%22%5BJournal%5D)">Developmental cycles and biology of pathogenic trypanosomes.</a> British medical bulletin. 41, 105-114 (1985).</li>
<li>Lorenz, P., Maier, A. G., Baumgart, E., Erdmann, R., Clayton, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Elongation+and+clustering+of+glycosomes+in+Trypanosoma+brucei+overexpressing+the+glycosomal+Pex11p%5BTitle%5D)+AND+%22The+EMBO+journal%22%5BJournal%5D)">Elongation and clustering of glycosomes in Trypanosoma brucei overexpressing the glycosomal Pex11p.</a> The EMBO journal. 17, 3542-3555 (1998).</li>
<li>Saveria, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Conservation+of+PEX19-binding+motifs+required+for+protein+targeting+to+mammalian+peroxisomal+and+trypanosome+glycosomal+membranes%5BTitle%5D)+AND+%22Eukaryot+Cell%22%5BJournal%5D)">Conservation of PEX19-binding motifs required for protein targeting to mammalian peroxisomal and trypanosome glycosomal membranes.</a> Eukaryot Cell. 6, 1439-1449 (2007).</li>
<li>Banerjee, S. K., Kessler, P. S., Saveria, T., Parsons, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+of+trypanosomatid+PEX19%3A+functional+characterization+reveals+impact+on+cell+growth+and+glycosome+size+and+number%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+and+biochemical+parasitology%22%5BJournal%5D)">Identification of trypanosomatid PEX19: functional characterization reveals impact on cell growth and glycosome size and number.</a> Molecular and biochemical parasitology. 142, 47-55 (2005).</li>
<li>Milagros Camara Mde, L., Bouvier, L. A., Miranda, M. R., Pereira, C. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+and+validation+of+Trypanosoma+cruzi%27s+glycosomal+adenylate+kinase+containing+a+peroxisomal+targeting+signal%5BTitle%5D)+AND+%22Experimental+parasitology%22%5BJournal%5D)">Identification and validation of Trypanosoma cruzi's glycosomal adenylate kinase containing a peroxisomal targeting signal.</a> Experimental parasitology. 130, 408-411 (2012).</li>
<li>Wiemer, E. A., Wenzel, T., Deerinck, T. J., Ellisman, M. H., Subramani, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Visualization+of+the+peroxisomal+compartment+in+living+mammalian+cells%3A+dynamic+behavior+and+association+with+microtubules%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+cell+biology%22%5BJournal%5D)">Visualization of the peroxisomal compartment in living mammalian cells: dynamic behavior and association with microtubules.</a> The Journal of cell biology. 136, 71-80 (1997).</li>
<li>Kim, P. K., Mullen, R. T., Schumann, U., Lippincott-Schwartz, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+origin+and+maintenance+of+mammalian+peroxisomes+involves+a+de+novo+PEX16-dependent+pathway+from+the+ER%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+cell+biology%22%5BJournal%5D)">The origin and maintenance of mammalian peroxisomes involves a de novo PEX16-dependent pathway from the ER.</a> The Journal of cell biology. 173, 521-532 (2006).</li>
<li>Hoepfner, D., Schildknegt, D., Braakman, I., Philippsen, P., Tabak, H. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Contribution+of+the+endoplasmic+reticulum+to+peroxisome+formation%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Contribution of the endoplasmic reticulum to peroxisome formation.</a> Cell. 122, 85-95 (2005).</li>
<li>Furuya, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Glucose+is+toxic+to+glycosome-deficient+trypanosomes%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Glucose is toxic to glycosome-deficient trypanosomes.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 99, 14177-14182 (2002).</li>
</ol>

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Glikosomy są niezbędnymi, dynamicznymi, specyficznymi dla pasożytów organellami. Procesy regulujące biogenezę, utrzymanie, proliferację i przebudowę tych organelli prawdopodobnie obejmują cele leków, które można wykorzystać do celów terapeutycznych. Pomimo potencjalnie dużej liczby takich celów terapeutycznych, biogeneza glikosomów pozostaje w tyle za badaniami nad podobnymi procesami w innych organizmach, głównie z powodu braku elastycznego, wysokowydajnego systemu, za pomocą którego można by monitorować szybkie, dynami...

Trypanosoma brucei powoduje śpiączkę afrykańską u ludzi i chorobę wyniszczającą, nagana, u bydła. Leki stosowane w leczeniu tych chorób są przestarzałe i niezwykle toksyczne, szczepionki nie są dostępne, a potencjał rozwoju lekooporności wymaga poszukiwania nowych celów terapeutycznych1.
Podczas swojego cyklu życia, T. brucei, na przemian jest nosicielem owada i ssaka; dwoma gospodarzami, którzy prezentują bardzo różne środowiska, w których pasożyt musi przetrwać. Szereg zmian metabolicznych i morfologicznych zachodzi, gdy pasożyt jest narażony na różne warunki środowiskowe. Niektóre z najbardziej dramatycznych zmian obserwuje się w mikrociałach specyficznych dla pasożytów ograniczonych pojedynczą błoną, zwanych glikosomami13.
Poziom glukozy jest stosunkowo wysoki (~5 mM) w krwiobiegu, a pasożyty krwiobiegu (BSF) generują ATP wyłącznie poprzez glikolizę, podczas gdy metabolizm mitochondriów jest hamowany14. W przeciwieństwie do innych eukariontów, u których glikoliza zachodzi w cytoplazmie, T. brucei dzieli większość enzymów glikolitycznych w glikosomy14,15. Pasożyty są wychwytywane przez muchę tse-tse podczas posiłku z krwi i doświadczają spadku glukozy, która spada do niewykrywalnego poziomu w ciągu 15 minut od spożycia przez muchę. Metabolizm owadów, formy procyklicznej (PCF), pasożytów jest bardziej elastyczny, a glukoza, a także aminokwasy, takie jak prolina, mogą być wykorzystywane w syntezie ATP16-18. Porównawcze badania proteomiczne ujawniają zależne od cyklu życiowego zmiany w białkach glikosomalnych i mitochondrialnych ze zwiększonym wzrostem białek glikolitycznych w pasożytach krwi i białkach mitochondrialnych zaangażowanych w cykl TCA i łańcuch oddechowy13,19. Podczas gdy wiele badań koncentrowało się na różnicach między glikosomami BSF i PCF, niewiele wiadomo na temat zmian w glikosomy PCF, które zachodzą w odpowiedzi na zmiany środowiskowe.
W jelicie tylnym muchy poziom glukozy jest niski z przejściowym wzrostem podczas karmienia20. W większości badań in vitro pasożyty PCF są hodowane w pożywkach zawierających glukozę. Jednak ostatnie badania wykazały, że metabolizm PCF zmienia się znacząco w odpowiedzi na dostępność glukozy17. Przy braku glukozy wzrasta wychwyt proliny i aktywność dehydrogenazy proliny18. Tej zmianie metabolizmu mitochondrialnego prawdopodobnie towarzyszy zmiana składu i morfologii glikosomu, jednak nie zostało to bezpośrednio ocenione.
Mikroskopia elektronowa i fluorescencyjna są powszechnie stosowanymi technikami do badania dynamiki glikosomów u T. brucei2,21-24. Protokoły te są czasochłonne i pracochłonne, kosztowne i trudne do dostosowania do badań w czasie rzeczywistym i protokołów o wysokiej przepustowości. Aby przezwyciężyć to ograniczenie, system reporterowy fluorescencyjno-organelli używany do badania organelli w systemach ssaków i drożdży został zmodyfikowany do stosowania u T. brucei12.
Systemy reporterowe organelli fluorescencyjnych były szeroko stosowane u wyższych eukariontów, takich jak komórki drożdży, roślin i ssaków25-27. W takich układach białko fluorescencyjne jest łączone z sekwencją aminokwasów, która kieruje białko do określonych organelli. Degradację lub syntezę docelowych białek mierzy się za pomocą fluorescencji, a zmiany w składzie organelli są odzwierciedlane przez zmiany we fluorescencji komórek.
Gdy otwarta ramka odczytu wzmocnionego żółtego białka fluorescencyjnego (eYFP) jest połączona z peroksysomalną sekwencją celującą typu II (PTS2)12, białko PTS2eYFP jest importowane do dojrzałych, kompetentnych do importu glikosomów, a fluorescencja może być monitorowana za pomocą cytometrii przepływowej. Różnice w składzie glikosomów znajdują odzwierciedlenie w zmianach fluorescencji komórek. System ten może pomóc w rozwiązaniu mechanizmów, które regulują wywołane przez środowisko zmiany w składzie glikosomu.
Ten manuskrypt opisuje generowanie systemu reporterowego glikosomów u pasożytów PCF w połączeniu z cytometrią przepływową do monitorowania dynamiki glikosomów w czasie rzeczywistym u żywych pasożytów i podaje przykład tego, jak był on używany do śledzenia zmian w składzie glikosomu w odpowiedzi na różne środowiska. Podsumowując, na skład glikosomów wpływa zewnątrzkomórkowe stężenie glukozy, a przejście kultur logarytmicznych do świeżej pożywki powoduje zmiany w składzie glikosomu. System ten można zmodyfikować w celu zbadania dynamicznego zachowania innych organelli w trypanosomach i innych pasożytach.

<table><tbody><tr><td>Adenozyna</td><td>Avocado Research Chemicals Ltd</td><td>A10781</td><td>SDM79 Składnik</td></tr><tr><td>L-Alanina</td><td>Avocado Research Chemicals Ltd</td><td>A15804</td><td>SDM79 Składnik</td></tr><tr><td>L-arginina</td><td>CalBiochem</td><td>1820</td><td>SDM79 Składnik</td></tr><tr><td>Kwas p-aminobenzoesowy</td><td>ICN Biomedicals</td><td>102569</td><td>SDM79 Składnik</td></tr><tr><td>Basal Medium Eagle Vitamin Solution (100x)</td><td>Sigma</td><td>B6891</td><td>SDM79 Składnik</td></tr><tr><td>Biotyna</td><td>Fisher</td><td>BP232-1</td><td>SDM79 Składnik</td></tr><tr><td>Chlorek wapnia</td><td>VWR</td><td>BDH0224</td><td>Cytomix</td></tr><tr><td>EDTA</td><td>Fisher</td><td>S311-100</td><td>Składnik Cytomix</td></tr><tr><td>Zestaw do ekstrakcji żelu EZNA</td><td>Omega Biotek</td><td>D2500-01</td><td>Oczyszczanie DNA</td></tr><tr><td>Klasa badawcza Serum</td><td>Fisher</td><td>03-600-511</td><td>SDM79 Składnik</td></tr><tr><td>Kwas foliowy</td><td>ICN Biomedicals</td><td>101725</td><td>SDM79 Składnik</td></tr><tr><td>Glukozamina HCl</td><td>ICN Biomedicals</td><td>194671</td><td>SDM79 Składnik</td></tr><tr><td>Glukoza</td><td>GIBCO</td><td>15023-021</td><td>SDM79 Składnik</td></tr><tr><td>L-Glutamina</td><td>CalBiochem</td><td>3520</td><td>SDM79 Składnik</td></tr><tr><td>Glicerol</td><td>Acros Organics</td><td>Ac15892-0010</td><td>Pożywka do zamrażania</td></tr><tr><td>Pożywka z komórek owadów Graces w proszku</td><td>GIBCO</td><td>11300-043</td><td>SDM79 Składnik</td></tr><tr><td>Hemin</td><td>MP Biomedicals</td><td>194025</td><td>SDM79 Składnik</td></tr><tr><td>Guanozyna</td><td>Avocado Research Chemicals Ltd</td><td>A11328</td><td>SDM79 Składnik</td></tr><tr><td>HEPES</td><td>MP Biomedicals</td><td>194025</td><td>SDM79 Składnik</td></tr><tr><td>Chlorek</td> <td>magnezuFisher</td><td>BP214-500</td><td>Cytomix składnik</td></tr><tr><td>L-metionina</td><td>Fisher</td><td>BP388-100</td><td>SDM79 Składnik</td></tr><tr><td>MEM Aminokwasy (50x)</td><td>Cellgro</td><td>25-030-CI</td><td>SDM79 Składnik</td></tr><tr><td>Mieszanina NEAA (100x)</td><td>Lonza</td><td>13-114E</td><td>SDM79 Składnik</td></tr><tr><td>Minimalny niezbędny środek (1x) z L-glutaminą</td><td>Składnik Cellgro</td><td>10-010-CM</td><td>SDM79</td></tr><tr><td>MOPS</td><td>Fisher</td><td>BP308-500</td><td>SDM79 Składnik</td></tr><tr><td>Biowęglan sodu</td><td>Fisher</td><td>S233-500</td><td>SDM79 Składnik</td></tr><tr><td>Roztwór penicyliny-streptomycyny</td><td>Cellgro</td><td>30-002-CI</td><td>SDM79 Składnik</td></tr><tr><td>L-fenyloalanina</td><td>ICN Biomedicals</td><td>102623</td><td>SDM79 Składnik</td></tr><tr><td>Chlorek potasu</td><td>Fisher</td><td>P217-500</td><td>Cytomix składnik</td></tr><tr><td>Fosforan potasu dwuzasadowy bezwodny</td><td>Fisheer</td><td>P290-212</td><td>Składnik Cytomix</td></tr><tr><td>L-Proline</td><td>Fisher</td><td>BP392-100</td><td>SDM79 Składnik</td></tr><tr><td>L-seryna</td><td>Acros Organics</td><td>56-45-1</td><td>SDM79 Składnik</td></tr><tr><td>Kwas pirogronowy, sól sodowa</td><td>Acros Organics</td><td>113-24-6</td><td>SDM79 Składnik</td></tr><tr><td>L-Tauryna</td><td>TCI America</td><td>A0295</td><td>SDM79 Składnik</td></tr><tr><td>L-treonina</td><td>Acros Organics</td><td>72-19-5</td><td>SDM79 Składnik</td></tr><tr><td>L-tyrozyna</td><td>ICN Biomedicals</td><td>103183</td><td>SDM79 Składnik</td></tr><tr><td>E.Z.N.A. Cycle Pure kit</td><td>Omega Biotek</td><td>D6492-02</td><td></td></tr><tr><td>Bufor wiążący</td> do oczyszczania DNA <td>Omega Biotek</td><td>PDR041</td><td>Oczyszczanie DNA</td></tr><tr><td>Bufor do płukania SPW</td><td>Omega Biotek</td><td>PDR045</td><td>Oczyszczanie DNA</td></tr><tr><td>Gene Pulser Xcell</td><td>Biorad</td><td>165-2660</td><td>Transformacja trypanosomów</td></tr><tr><td>4 mm Kuwety do elektroporacji</td><td>VWR</td><td></td><td>Transformacja trypanosomów</td></tr></tbody></table>

wykorzystanie białek fluorescencyjnych do monitorowania dynamiki glikosomów w afrykańskim trypanosomie

Using Fluorescent Proteins to Monitor Glycosome Dynamics in the African Trypanosome

Trypanosoma brucei to pasożyt kinetoplastyd, który powoduje u bydła ludzką afrykańską trypanosomatozę (HAT), czyli śpiączkę, oraz chorobę wyniszczającą, nagana, u bydła1. Pasożyt przemieszcza się naprzemiennie między krwiobiegiem żywiciela ssaka a wektorem muchy tse-tse. Skład wielu organelli komórkowych zmienia się w odpowiedzi na te różne warunki zewnątrzkomórkowe2-5.
Glikosomy to wysoce wyspecjalizowane peroksysomy, w których wiele enzymów biorących udział w glikolizie jest podzielonych na przedziały. Skład glikosomów zmienia się w sposób regulowany rozwojowo i środowiskowo4-11. Obecnie najpowszechniejszymi technikami stosowanymi do badania dynamiki glikosomów są mikroskopia elektronowa i fluorescencyjna; techniki, które są drogie, czasochłonne i pracochłonne oraz niełatwe do dostosowania do analiz o wysokiej przepustowości.
Aby przezwyciężyć te ograniczenia, ustanowiono system reporterowy fluorescencyjno-glikosomowy, w którym wzmocnione białko żółtej fluorescencji (eYFP) jest łączone z sekwencją celującą w peroksysomy (PTS2), która kieruje białko fuzyjne do glikosomów12. Po imporcie białka fuzyjnego PTS2eYFP glikosomy stają się fluorescencyjne. Degradacja i recykling organelli powoduje utratę fluorescencji, którą można zmierzyć za pomocą cytometrii przepływowej. Duża liczba komórek (5 000 komórek/s) może być analizowana w czasie rzeczywistym bez konieczności intensywnego przygotowywania próbek, takich jak utrwalanie i montaż. Metoda ta zapewnia szybki sposób wykrywania zmian w składzie organelli w odpowiedzi na zmienne warunki środowiskowe.

W tym systemie zaobserwowano zależną od glukozy zmianę w składzie glikosomów. Podczas hodowli komórek w pożywkach zawierających glukozę obserwuje się dwie populacje: jedną jasną i jedną słabo fluorescencyjną (Rysunek 2A). Komórki słabo fluorescencyjne zawierają niedojrzałe glikosomy, do których nie został zaimportowany PTS2eYFP, natomiast komórki jasne zawierają mieszankę glikosomów dojrzałych i niedojrzałych12. W obecności glukozy w pożywce błędna lokalizacja białek glikosomalnych jest letaln...

Dynamika glikosomów w afrykańskich trypanosomach jest trudna do zbadania za pomocą tradycyjnych technik biologii komórki, takich jak mikroskopia elektronowa i fluorescencyjna. Jako sposób obserwacji dynamicznego zachowania organelli, zastosowano system reporterowy fluorescencyjno-organelli w połączeniu z cytometrią przepływową do monitorowania dynamiki glikosomów w czasie rzeczywistym u żywych pasożytów.

Wykorzystanie białek fluorescencyjnych do monitorowania dynamiki glikosomów w afrykańskim trypanosomie

Trypanosoma brucei is a kinetoplastid parasite that causes human African trypanosomiasis (HAT), or sleeping sickness, and a wasting disease, nagana, in ...

Ogólnym celem następującego eksperymentu jest obserwacja zmian w składzie glikozomów w żywych komórkach w czasie rzeczywistym. Osiąga się to poprzez ekspresję białka fluorescencyjnego połączonego z sekwencją kierującą do peroksysomów PTs 2. Białko fuzyjne jest importowane do dojrzałych glikozomów, które stają się fluorescencyjnymi organellami.Degradacja i recykling prowadzą do utraty fluorescencji, którą można monitorować za pomocą cytometrii przepływowej; komórki są poddawane różnym warunkom środowiskowym w celu zidentyfikowania czynników wyzwalających przebudowę glikanów. Wyniki pokazują, że skład glikanów zmienia się w odpowiedzi na zmiany środowiskowe, co stwierdzono na podstawie zmian fluorescencji komórkowej po przeniesieniu komórek z pożywki ubogiej w składniki odżywcze do pożywki bogatej. Zatem główną zaletą tej techniki w porównaniu z istniejącymi metodami, takimi jak mikroskopia elektronowa i fluorescencyjna, jest możliwość analizy tysięcy komórek w czasie rzeczywistym.Procedurę zaprezentują Sarah Bauer, studentka studiów magisterskich, oraz Megan Conlan, studentka studiów licencjackich z mojego laboratorium. Pasożyty w procyklicznej formie owadziej (PCF) wykorzystane w t

using-fluorescent-proteins-to-monitor-glycosome-dynamics-african

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Immunologia i infekcje

Wykorzystanie białek fluorescencyjnych do monitorowania dynamiki glikosomy w świdrowcach afrykańskich

Niniejszy eksperyment w formie wizualizacji jest przewodnikiem po wykorzystaniu fluorescencyjnego klonu molekularnego HIV do eksperymentów z obrazowaniem konfokalnym żywych komórek.

Wizualizacja transferu HIV między komórkami z wykorzystaniem fluorescencyjnych klonów HIV oraz konfokalnej mikroskopii żywych komórek

Opisujemy metody obrazowania, których używamy do badania dystrybucji i ruchliwości transfekowanych białek fluorescencyjnych rezydujących w retikulum endoplazmatycznym (ER) za pomocą konfokalnego obrazowania żywych komórek. Analizujemy również ultrastrukturalnie wpływ ich ekspresji na architekturę tego przedziału subkomórkowego.

Wizualizacja subdomen retikulum endoplazmatycznego w hodowanych komórkach

Translokacja efektorowa do komórek gospodarza poprzez system wydzielania typu III jest powszechną strategią wirulencji wśród bakterii Gram-ujemnych. Zastosowano test oparty na fuzji efektorowej beta-laktamazy do ilościowej analizy translokacji. W komórkach zakażonych Yersinia konwersja reportera FRET przez beta-laktamazę jest monitorowana za pomocą laserowej mikroskopii skaningowej.

Analiza translokacji efektorowej Yersinia enterocolitica do komórek gospodarza za pomocą fuzji efektorów beta-laktamazy

Ten manuskrypt opisuje użycie bioluminescencyjnego szczepu afrykańskich trypanosomów do śledzenia późnych stadiów infekcji i pokazuje, jak obrazowanie na żywo in vivo może być wykorzystane do wizualizacji infekcji w ośrodkowym układzie nerwowym w czasie rzeczywistym.

Obrazowanie bioluminescencyjne w celu wykrycia późnego stadium zakażenia trypanosomatozą afrykańską

Dodanie znacznika do białka to potężny sposób na uzyskanie wglądu w jego funkcję. W tym miejscu opisujemy protokół endogennego znakowania setek białek Trypanosoma brucei równolegle, tak aby możliwe było znakowanie skali genomu.

Wysokoprzepustowe znakowanie genów u Trypanosoma brucei

Obrazowanie morfogenezy zarodków owadów za pomocą mikroskopii fluorescencyjnej opartej na arkuszach świetlnych stało się najnowocześniejszym rozwiązaniem. Protokół ten nakreśla i porównuje trzy techniki montażu odpowiednie dla zarodków Tribolium castaneum, wprowadza dwie nowatorskie, wykonane na zamówienie linie transgeniczne, dobrze nadające się do obrazowania na żywo, omawia podstawowe kontrole jakości i wskazuje obecne ograniczenia eksperymentalne.

Mikroskopia fluorescencyjna oparta na arkuszach świetlnych żywych lub utrwalonych i barwionych zarodków Tribolium castaneum

Opisujemy, jak techniki mikro- i fotomanipulacji, takie jak FRAP i fotoaktywacja, umożliwiają określenie parametrów ruchliwości i czasoprzestrzennej dynamiki białek w migrujących komórkach. Odczyty eksperymentalne obejmują dynamikę subkomórkową i obrót regulatorów ruchliwości lub leżącego u podstaw cytoszkieletu aktynowego.

Techniki mikromanipulacji pozwalające na analizę dynamiki morfogenetycznej i obrotu regulatorów cytoszkieletu

Interakcje białko-białko są kluczowe dla systemów biologicznych, a badania kinetyki wiązania dostarczają wglądu w dynamikę i funkcję kompleksów białkowych. Opisujemy metodę, która określa ilościowo parametry kinetyczne kompleksu białkowego za pomocą rezonansu fluorescencyjnego, transferu energii i techniki zatrzymanego przepływu.

Wykorzystanie transferu energii rezonansu fluorescencyjnego in vitro do badania dynamiki kompleksów białkowych w milisekundowej skali czasowej

Tutaj opisano nieinwazyjne metody lokalizacji białek błony fotoreceptorowej i oceny zwyrodnienia siatkówki w oku złożonym Drosophila za pomocą fluorescencji eGFP.

Badanie transportu białek błonowych w komórkach fotoreceptorowych Drosophila przy użyciu białek znakowanych eGFP

Ten protokół opisuje spersonalizowane znakowanie fluorescencyjne oparte na przeciwciałach i wstrzykiwanie do wczesnych zarodków Drosophila, aby umożliwić obrazowanie na żywo białek o niskiej obfitości lub modyfikacji potranslacyjnych, które są trudne do wykrycia przy użyciu tradycyjnych metod GFP/mCherry-tag.

Wizualizacja białek o niskiej liczebności i modyfikacji potranslacyjnych w żywych zarodkach Drosophila poprzez wstrzyknięcie przeciwciał fluorescencyjnych

Opisujemy metodę badania, jak pH reaguje na sygnały środowiskowe w glikosomy krwiobiegowej formy afrykańskich trypanosomów. Podejście to obejmuje czujnik białka dziedzicznego wrażliwego na pH w połączeniu z cytometrią przepływową w celu pomiaru dynamiki pH, zarówno jako test przebiegu w czasie, jak i w formacie wysokoprzepustowego badania przesiewowego.

Pomiar dynamicznych zmian pH glikosomalnego u żywego Trypanosoma brucei

Poznaj metodę cytometrii przepływowej do monitorowania dynamiki glikosomów w żywych komórkach afrykańskiego trypanosoma. Technika fluorescencyjna umożliwia analizę tysięcy komórek w czasie rzeczywistym.

Wykorzystanie białek fluorescencyjnych do monitorowania dynamiki glikosomów w afrykańskim trypanosomie

Przeglądaj więcej filmów