Name: Nowa metoda doprecyzowywania do wizualizacji zwyrodnienia dróg żółciowych podczas metamorfozy wątroby u minoga morskiego (Petromyzon marinus) (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-06-06T14:15:00.000+00:00
Duration: 7 min 3 s
Description: Poznaj zmodyfikowaną metodę CLARITY do wizualizacji dróg żółciowych u minoga morskiego Petromyzon marinus podczas metamorfozy wątroby. Ta technika umożliwia analizę zwyrodnienia dróg żółciowych.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Autorzy doceniają wkład Hammond Bay Biological Station, Great Lakes Science Center, U.S. Geological Survey. Dziękujemy również dr Melindzie Frame z Centrum Zaawansowanej Mikroskopii na Uniwersytecie Stanowym Michigan za jej wsparcie techniczne w laserowej skaningowej mikroskopii konfokalnej. Badanie to jest wspierane przez dotacje Komisji Rybołówstwa Wielkich Jezior dla YWCD i WML.

1. Przygotowanie roztworu
<ol>
	<li>Przygotować 1 l 10 x 0,1 M buforu fosforanowego soli fizjologicznej (PBS, pH 7,4): Odważyć 26,2 g fosforanu sodu (jednozasadowego), 115 g fosforanu sodu (dwuzasadowego) i 87,66 g NaCl. Rozpuścić w około 800 ml destylowanegoH2O, dostosować pH i doprowadzić objętość do 1 l za pomocą destylowanegoH2O.
	<ol>
		<li>Przygotować 1 l 0,1 M buforu fosforanowego soli fizjologicznej (pH 7,4): Weź 100 ml 10x PBS i dodaj 900 ml destylowanegoH2O.</li>
		<li>Przygotować 1 l 0,1 M buforu fosforanowego soli fizjologicznej (pH 7,4) z 0,1% Triton X-100: Weź 100 ml 10x PBS, dodaj 1 ml Triton X-100 i zwiększ objętość do 1 l za pomocą destylowanegoH2O.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Przygotować 1 l 10 x 0,1 M buforu fosforanowego (PB, pH 7,4): Odważyć 26,2 g fosforanu sodu (jednozasadowego) i 115 g fosforanu sodu (dwuzasadowego). Rozpuścić w około 800 ml destylowanegoH2O, dostosować pH i doprowadzić objętość do 1 l za pomocą destylowanegoH2O.
	<ol>
		<li>Przygotować 1 l 0,1 M buforu fosforanowego (pH 7,4): Weź 100 ml 10x PB i dodaj 900 ml destylowanegoH2O.</li>
		<li>Przygotować 1 l 0,1 M buforu fosforanowego (pH 7,4) z 0,1% Triton X-100: Pobrać 100 ml 10x PB, dodać 1 ml Triton X-100 i zwiększyć objętość do 1 l za pomocą destylowanegoH2O.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Przygotować 400 ml roztworu monomeru hydrożelowego (4% akrylamidu, 0,25% bis-akrylamidu, 4% paraformaldehydu, 0,0075% nadsiarczanu amonu, 0,0005% saponiny w 0,1 M PBS): Odważyć 0,3 g nadsiarczanu amonu i 0,2 g saponiny. Dodać 210 ml destylowanegoH2O, 40 ml 40% akrylamidu, 10 ml 2% bis-akrylamidu, 40 ml 10x PBS (pH 7,4), 100 ml 16% paraformaldehydu i dobrze wymieszać.</li>
	<li>Przygotować 4 litry roztworu klarującego (4% SDS w 0,2 M kwasie borowym): Odważyć 49,464 g kwasu borowego i 160 g SDS. Rozpuścić w około 3,5 l destylowanegoH2O, dostosować pH do 8,5 za pomocą NaOH i zwiększyć objętość do 4 l.</li>
	<li>Przygotować 1 l 80% roztworu glicerolu: Odmierz 800 ml glicerolu, dodaj 200 ml destylowanegoH2Oi dobrze wymieszaj.</li>
</ol>
2. Przygotowanie tkanek
<ol>
	<li>Przygotować roztwór monomeru hydrożelu i podaszkę 10 ml do każdej probówki wirówkowej o pojemności 15 ml.</li>
	<li>Rozciąć całą tkankę i utrwalić w hydrożelu przez 2 dni w temperaturze 4 °C. Upewnij się, że roztwór hydrożelu jest co najmniej 10 razy większy od objętości tkanki.</li>
	<li>Doprowadzić utrwaloną tkankę hydrożelową (w probówce wirówkowej o pojemności 15 ml) do dygestorium.</li>
	<li>Spolimeryzować utrwaloną tkankę hydrożelową, dodając 5 μl TEMED, dobrze wymieszać i pozostawić w dygestorium w temperaturze pokojowej na 2-3 godziny.</li>
	<li>Dokładnie usuń nadmiar żelu. Uwaga: Dodatkowy żel utrudni proces oczyszczania i penetrację przeciwciał podczas barwienia.</li>
	<li>Inkubować utrwaloną tkankę w 10 ml roztworu klarującego w wytrząsarce inkubatora ustawionej na 70 obr./min i 50 °C przez kilka dni, aż tkanka stanie się przezroczysta. Zmieniaj roztwór czyszczący co najmniej raz dziennie i usuwaj nadmiar żelu z tkanki podczas zmiany roztworu oczyszczającego.</li>
	<li>Opłucz chusteczkę w 10 ml 0,1 M PB 0,1% Triton X-100 przy 70 obr./min w temperaturze 37 °C przez noc. Powtórz ten krok 3 razy i usuń nadmiar żelu z tkanki podczas zmiany roztworu buforowego.</li>
	<li>Inkubować oczyszczoną tkankę w pierwszorzędowym roztworze przeciwciała w PB z 0,1% Triton X-100 przy 70 obr./min i 37 °C przez 2 dni. Uwaga: Przygotuj wystarczającą ilość roztworu przeciwciała pierwotnego, aby zanurzyć całą tkankę.</li>
	<li>Opłucz chusteczkę w 10 ml PB 0,1% Triton X-100 przy 70 obr./min i 37 °C przez noc. Powtórz ten krok 3 razy i usuń nadmiar żelu z tkanki podczas zmiany roztworu buforowego.</li>
	<li>Wykonaj poniższe czynności w ciemnym pomieszczeniu lub przy słabym świetle. Przykryj próbki folią, aby zapobiec wybielaniu zdjęć.</li>
	<li>Inkubować oczyszczoną tkankę z fluorescencyjnym roztworem przeciwciał drugorzędowych w PB z 0,1% Triton X-100 i surowicą blokującą przy 70 obr./min i temperaturze 37 °C przez 1 dzień.</li>
	<li>Opłucz chusteczkę w 10 ml PB 0,1% Triton X-100 przy 70 obr./min i 37 °C przez noc. Powtórz ten krok 3 razy i usuń nadmiar żelu z tkanki podczas zmiany roztworu buforowego.</li>
	<li>Wypłukać chusteczkę w 10 ml PBS przy 70 obr./min w temperaturze 37 °C przez noc. Powtórz ten krok 3 razy i usuń nadmiar żelu z tkanki podczas zmiany roztworu buforowego.</li>
	<li>Inkubować oczyszczoną tkankę w 80% glicerolu przy 70 obr./min i w temperaturze 37 °C przez noc.</li>
	<li>Przechowywać fluorescencyjną barwioną tkankę w temperaturze 4 °C przed mikroskopią konfokalną.</li>
</ol>

<ol><li>Applegate, V. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Natural+history+of+the+sea+lamprey+%28Petromyzon+marinus%29+in+Michigan%5BTitle%5D)+AND+%22US+Fish+and+Wildlife+Service+Special+Science+Report+on+Fishery+Service%22%5BJournal%5D)">Natural history of the sea lamprey (Petromyzon marinus) in Michigan.</a> US Fish and Wildlife Service Special Science Report on Fishery Service. (55), (1950).</li>
<li>Hardisty, M. W., Potter, I. C. The general biology of adult lampreys. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aHardisty%2C+MW+%22The+biology+of+lampreys%22">The biology of lampreys</a>. Hardisty, M. W., Potter, I. C. 1, New York Academic Press. 127-206 (1971).</li>
<li>Youson, J. H., Potter, I. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+description+of+the+stages+in+the+metamorphosis+of+the+anadromous+sea+lamprey%2C+Petromyzon+marinus+L%5BTitle%5D)+AND+%22Can.+J.+Zool%22%5BJournal%5D)">A description of the stages in the metamorphosis of the anadromous sea lamprey, Petromyzon marinus L.</a> Can. J. Zool. 57, 1808-1817 (1979).</li>
<li>Boomer, L. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cholangiocyte+apoptosis+is+an+early+event+during+induced+metamorphosis+in+the+sea+lamprey%2C+Petromyzon+marinus+L%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Pediatr.+Surg%22%5BJournal%5D)">Cholangiocyte apoptosis is an early event during induced metamorphosis in the sea lamprey, Petromyzon marinus L.</a> J. Pediatr. Surg. 45, 114-120 (2010).</li>
<li>Kasai, M., Suzuki, H., Ohashi, E., Ohi, R., Chiba, T., Okamoto, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Technique+and+results+of+operative+management+of+biliary+atresia%5BTitle%5D)+AND+%22World+J.+Surg%22%5BJournal%5D)">Technique and results of operative management of biliary atresia.</a> World J. Surg. 2, 571-580 (1978).</li>
<li>Suzuki, T., Hashimoto, T., Kondo, S., Sato, Y., Hussein, M. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Evaluating+patients%E2%80%99+outcome+post-Kasai+operation%3A+a+19-year+experience+with+modification+of+the+hepatic+portoenterostomy+and+applying+a+novel+steroid+therapy+regimen%5BTitle%5D)+AND+%22Pediatr.+Surg.+Int%22%5BJournal%5D)">Evaluating patients’ outcome post-Kasai operation: a 19-year experience with modification of the hepatic portoenterostomy and applying a novel steroid therapy regimen.</a> Pediatr. Surg. Int. 26, 825-830 (2010).</li>
<li>Hartley, J. L., Davenport, M., Kelly, D. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Biliary+atresia%5BTitle%5D)+AND+%22Lancet%22%5BJournal%5D)">Biliary atresia.</a> Lancet. 374, 1704-1713 (2009).</li>
<li>Morecki, R., Glaser, J. H., Cho, S., Balistreri, W. F., Horwitz, M. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Biliary+atresia+and+reovirus+type+3+infection%5BTitle%5D)+AND+%22New+Engl.+J.+Med%22%5BJournal%5D)">Biliary atresia and reovirus type 3 infection.</a> New Engl. J. Med. 307, 481-484 (1982).</li>
<li>Shimadera, S., Iwai, N., Deguchi, E., Kimura, O., Fumino, S., Yokoyama, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+inv+mouse+as+an+experimental+model+of+biliary+atresia%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Pediatr.+Surg%22%5BJournal%5D)">The inv mouse as an experimental model of biliary atresia.</a> J. Pediatr. Surg. 42, 1555-1560 (2007).</li>
<li>Sidon, E. W., Youson, J. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Morphological+changes+in+the+liver+of+the+sea+lamprey%2C+Petromyzon+marinus+L.%2C+during+metamorphosis%3A+I.+Atresia+of+the+bile+ducts%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Morphol%22%5BJournal%5D)">Morphological changes in the liver of the sea lamprey, Petromyzon marinus L., during metamorphosis: I. Atresia of the bile ducts.</a> J. Morphol. 177, 109-124 (1983).</li>
<li>Yeh, C. -Y., Chung-Davidson, Y. -W., Wang, H., Li, K., Li, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Intestinal+synthesis+and+secretion+of+bile+salts+as+an+adaptation+to+developmental+biliary+atresia+in+the+sea+lamprey%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Nat.+Acad.+Sci.+U.S.A%22%5BJournal%5D)">Intestinal synthesis and secretion of bile salts as an adaptation to developmental biliary atresia in the sea lamprey.</a> Proc. Nat. Acad. Sci. U.S.A. 109, 11419-11424 (2012).</li>
<li>Chung, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Structural+and+molecular+interrogation+of+intact+biological+systems%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Structural and molecular interrogation of intact biological systems.</a> Nature. 497, 332-337 (2013).</li>
<li>Alarcón, V. B., Filosa, M. F., Youson, J. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cytokeratins+in+the+liver+of+the+sea+lamprey+%28Petromyzon+marinus%29+before+and+after+metamorphosis%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Tissue+Res%22%5BJournal%5D)">Cytokeratins in the liver of the sea lamprey (Petromyzon marinus) before and after metamorphosis.</a> Cell Tissue Res. 287, 365-374 (1997).</li>
<li>Youson, J. H., Ogilvie, D. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ultrastructural+features+of+degeneration+of+the+gallbladder+during+lamprey+biliary+atresia%5BTitle%5D)+AND+%22Tissue+and+Cell%22%5BJournal%5D)">Ultrastructural features of degeneration of the gallbladder during lamprey biliary atresia.</a> Tissue and Cell. 22, 477-492 (1990).</li>
<li>Morii, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Onset+of+apoptosis+in+the+cystic+duct+during+metamorphosis+of+a+Japanese+lamprey%2C+Lethenteron+reissneri%5BTitle%5D)+AND+%22Anat.+Rec%22%5BJournal%5D)">Onset of apoptosis in the cystic duct during metamorphosis of a Japanese lamprey, Lethenteron reissneri.</a> Anat. Rec. 293, 1155-1166 (2010).</li>
</ol>

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Protokół ten jest modyfikowany w oparciu o nową metodę o nazwie "CLARITY"12, która sieciuje nienaruszoną tkankę za pomocą poliakrylamidu w celu utworzenia nanoporowatego hydrożelu, a następnie usuwa błonę plazmatyczną tkanki, aby uzyskać przezroczystość optyczną i przepuszczalność makromolekularną. "CLARITY" umożliwia obrazowanie nienaruszonych tkanek projekcji dalekiego zasięgu i lokalnego okablowania obwodów w układzie nerwowym. Ta nowa metoda może być wykorzystana do wizualizacji całego układu żółciowego w ...

Minóg morski rozwija się w trzech różnych etapach życia1,2. Larwy minoga morskiego (L) spędzają większość czasu w norach jako filtry bentosowe. Po przejściu przez siedem etapów metamorficznych dramatycznych zmian w morfologii zewnętrznej i reorganizacji narządów wewnętrznych3, powstałe młode osobniki (JV) wchodzą w fazę pasożytniczą, podczas której żywią się krwią i płynami tkankowymi ryb gospodarzy, zwiększając masę ciała ponad 100-krotnie. Po 1,0 do 1,5 roku żerowania na rybach żywicielskich w oceanie lub dużych jeziorach, dorosłe osobniki przestają żerować wczesną wiosną i migrują do rzek na tarło, a następnie umierają1,2.

Podczas metamorfozy, wątroba minoga morskiego traci woreczek żółciowy i całe drzewo żółciowe, ewolucyjnie zmutowany fenotyp, który naśladuje atrezję dróg żółciowych choroby u niemowląt. Zarośnięcie dróg żółciowych u niemowląt jest rzadką chorobą wątroby u dzieci z ciężkimi powikłaniami medycznymi4,5,6,7,8,9,10, jednak patogeneza i etiologia atrezji dróg żółciowych są w dużej mierze nieznane4. Pacjenci z atrezją dróg żółciowych umierają w ciągu dwóch lat po urodzeniu, chyba że zostanie wykonana interwencja chirurgiczna (procedura Kasai)5. Następnie pacjenci ci wymagają intensywnego leczenia klinicznego i często przeszczepu wątroby 6. Zaproponowano wiele teorii etiopatogenezy atrezji dróg żółciowych, takich jak infekcja wirusowa, wrodzone wady rozwojowe, choroba autoimmunologiczna i toksyczna zniewaga. Jednak wkład każdego z nich w rozwój atrezji dróg żółciowych pozostaje niejednoznaczny7,8,9,10.

W przeciwieństwie do niemowląt, które cierpią na patologiczne atrezje dróg żółciowych, minóg morski przechodzi rozwojowo zaprogramowaną atrezję dróg żółciowych bez rozległego martwiczego zapalenia lub marskości wątroby10. Zwierzęta mogą cierpieć na przejściową cholestazę podczas tego procesu10, ale przystosowują się do tego stanu rozwojowego poprzez syntezę de novo i wydzielanie soli żółciowych w jelicie po rozwojowym atrezji dróg żółciowych, oprócz znanych mechanizmów, takich jak zmniejszenie syntezy soli żółciowych w wątrobie11. Ten proces rozwojowy u minoga morskiego stanowi jedyną znaną możliwość zbadania progresji atrezji dróg żółciowych.

Nowo opracowana metoda o nazwie "CLARITY" umożliwia obrazowanie w wysokiej rozdzielczości w złożonych układach nerwowych ssaków poprzez przekształcenie nienaruszonej tkanki w optycznie przezroczysty nanoporowaty hydrożel12. Korzystając z wątroby minoga morskiego i zmodyfikowanego protokołu CLARITY, można udokumentować obrazowanie zwyrodnienia dróg żółciowych w nienaruszonych tkankach podczas metamorfozy wątroby.

<table><tbody><tr><td>40% akrylamid&nbsp;</td><td>Bio-Rad</td><td>161-0140</td><td></td></tr><tr><td>2% bis-akrylamid&nbsp;</td><td>Bio-Rad</td><td>161-0142</td><td></td></tr><tr><td>TEMED</td><td>Bio-Rad</td><td>161-0800</td><td></td></tr><tr><td>nadsiarczan amonu&nbsp;</td><td>Kwas borowy Sigma</td><td>A3678-25G</td><td></td></tr><tr><td></td><td>saponina Sigma</td><td>B7901-1KG</td><td></td></tr><tr><td>&nbsp;</td><td>Sigma</td><td>47036</td><td></td></tr><tr><td>dodecylosiarczan sodu&nbsp;</td><td>Sigma</td><td>L337-500G</td><td></td></tr><tr><td>fosforan sodu (monozasadowy)</td><td>Sigma</td><td>04269-1KG</td><td></td></tr><tr><td>fosforan sodu (dwuzasadowy)</td><td>Sigma</td><td>S5136-1KG</td><td></td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>Sigma</td><td>X100-500ML</td><td></td></tr><tr><td>glicerol&nbsp;</td><td>Sigma</td><td>G9012-500ML</td><td></td></tr><tr><td>16% paraformaldehyd&nbsp;</td><td>Mikroskopia elektronowa Nauki</td><td>15710-S</td><td></td></tr><tr><td>Granulki NaOH&nbsp;</td><td>EMD</td><td>SX0590-3</td><td></td></tr><tr><td>Probówki wirówkowe 15 ml</td><td>Narzędzia</td> preparacyjne dowolnej marki<td></td><td></td></tr><tr><td>&nbsp;</td><td>Dowolna marka</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

nowa metoda doprecyzowywania do wizualizacji zwyrodnienia dróg żółciowych podczas metamorfozy wątroby u minoga morskiego (petromyzon marinus)

A New Clarification Method to Visualize Biliary Degeneration During Liver Metamorphosis in Sea Lamprey (Petromyzon marinus)

Atrezja dróg żółciowych jest rzadką chorobą wieku niemowlęcego, z częstością występowania szacowaną na 1 na 15 000 w południowo-wschodnich Stanach Zjednoczonych, ale bardziej powszechną w krajach Azji Wschodniej, z częstością zgłaszaną 1 na 5 000 na Tajwanie. Chociaż wiele wiadomo na temat leczenia atrezji dróg żółciowych, jej patogeneza jest nadal nieuchwytna. Minóg morski (Petromyzon marinus) daje wyjątkową okazję do zbadania mechanizmu i postępu zwyrodnienia dróg żółciowych. Minóg morski rozwija się w trzech różnych stadiach życia: larwalnym, pasożytniczym i dorosłym. Podczas przejścia od larw do pasożytniczego młodocianego minoga morskiego przechodzi metamorfozę z dramatyczną reorganizacją i przebudową morfologii zewnętrznej i narządów wewnętrznych. W wątrobie dochodzi do utraty całego układu żółciowego, w tym pęcherzyka żółciowego i drzewa żółciowego. Nowo opracowana metoda o nazwie "CLARITY" została zmodyfikowana w celu wyjaśnienia całej wątroby i połączenia z jelitem u metamorficznego minoga morskiego. Proces zwyrodnienia dróg żółciowych został uwidoczniony i rozpoznany podczas metamorfozy minoga morskiego za pomocą laserowej skaningowej mikroskopii konfokalnej. Metoda ta stanowi potężne narzędzie do badania atrezji dróg żółciowych w unikalnym modelu zwierzęcym.

Podczas przeobrażenia minogi morskiej w systemie hepatobiliarnej zachodzi kilka ważnych zdarzeń rozwojowych. Przewód żółciowy i pęcherzyk żółciowy ulegają apoptozie i degeneracji (Rysunek 1). Łącząc zmodyfikowaną metodę klarowania z barwieniem markerem komórek wątroby cytokeratyną 19 (CK19, obecną w cholangiocytach i hepatocytach przed i po przeobrażeniu13) oraz markerem antyapoptozy Bcl2 z użyciem mikroskopii konfokalnej, zarejestrowano cały system żółciowy wzdłuż osi Z (Rysunek 2</st...

Minóg morski traci pęcherzyk żółciowy i drogi żółciowe podczas metamorfozy, procesu podobnego do atrezji dróg żółciowych u ludzi. Nowa metoda fiksacji i klarowania (CLARITY) została zmodyfikowana w celu wizualizacji całego drzewa żółciowego za pomocą laserowej skaningowej mikroskopii konfokalnej. Ta metoda stanowi potężne narzędzie do badania zwyrodnienia dróg żółciowych.

Nowa metoda doprecyzowywania do wizualizacji zwyrodnienia dróg żółciowych podczas metamorfozy wątroby u minoga morskiego (Petromyzon marinus)

Biliary atresia is a rare disease of infancy, with an estimated 1 in 15,000 frequency in the southeast United States, but more common in East Asian ...

Ogólnym celem niniejszej procedury jest rozjaśnienie całej wątroby oraz miejsca jej połączenia z jelitem w celu przeprowadzenia globalnych analiz strukturalnych i komórkowych degeneracji dróg żółciowych u lamprecji C w fazie metamorfozy. Cel ten osiąga się poprzez wstępną fiksację tkanek w roztworze monomeru hydrożelu.Następnie hydrożel jest polimeryzowany wraz z utrwalonymi tkankami. Potem usuwa się błonę plazmatyczną utrwalonej tkanki, w wyniku czego tkanka staje się przezroczysta. Na koniec przeprowadza się barwienie immunofluorescencyjne, a następnie wykorzystuje się skanowanie laserne i mikroskopię konfokalną, aby wykazać globalne zmiany strukturalne i komórkowe podczas degeneracji dróg żółciowych u przechodzącej metamorfozę minogi.Metoda ta może pomóc w udzieleniu odpowiedzi na kluczowe pytania w dziedzinie biomedycznej, takie jak analiza konektomów w ośrodkowym układzie nerwowym, a w naszym przypadku – badanie degeneracji dróg żółciowych podczas metamorfozy w punkcie surowiczym. Zastosowania tej techniki rozciągają się na terapię lub diagnostykę ludzkich dróg żółciowych lub atrezji, ponieważ ta rzadka wrodzona choroba niemowląt wykazuje podobne cechy co degeneracja dróg żółciowych podczas metamorfozy w punkcie surowiczym. Pomysł na tę metodę pojawił się u nas po znalezieniu artykułu w czasopiśmie Nature i zaprezentowaniu podczas spotkania laboratoryjnego filmu online demonstrującego procedurę; przeprowadziła ją Ann Scott, doktorantka z naszego laboratorium. W pierwszej kolejności przygotowano roztwór soli fosforanowo-buforowanej (PBS) oraz bufor fosforanowy (PB), zgodnie z protokołem tekstowym.W dygestorium przygotować 400 mililitrów hydrożelu, łącząc wodę destylowaną, 40% akrylamid 2% bis-akrylamid 10X PBS, 16% paraformaldehyd, saponinę oraz wodorostratsiarczan amonu. Przygotować jeden litr roztworu do klarowania składającego się z 4% SDS i 0,2 molarnego kwasu borowego oraz sporządzić 500 mililitrów 80% glicerolu do przygotowania tkanki w dygestorium. Odmierzyć 10 mililitrów roztworu monomeru hydrożelu do probówek wirówkowych o pojemności 15 mililitrów.Przeciąć próbkę tkanki i umieścić tkankę w każdej probówce z utrwalaczem hydrożelowym w temperaturze 4 °C na dwa dni. Po inkubacji, pod wyciągiem, polimeryzować utrwaloną tkankę, dodając 5 µL temid. Następnie dokładnie wymieszać i inkubować próbki w temperaturze pokojowej przez dwie do trzech godzin.Po inkubacji dokładnie usuń nadmiar żelu, aby oczyścić próbki tkanek. Umieść każdą z nich w 15 mililitrach roztworu klarującego i inkubuj w temperaturze 50 °C przy 70 RPM przez kilka dni, aż staną się przezroczyste. Wymieniaj roztwór klarujący co najmniej raz dziennie i usuwaj wszelki nadmiar żelu.Przenieść próbki do 15 ml 0,1 M buforu PB z 0,1% Triton X 100 i inkubować przez noc w temperaturze 37°C przy 70 RPM. Powtórzyć inkubację jeszcze dwukrotnie, używając świeżego buforu. Po oczyszczeniu tkanki i usunięciu nadmiaru żelu, zanurzyć próbki w roztworze przeciwciała pierwszorzędowego w PB z Triton X 100 i inkubować przez dwa dni w temperaturze 37°C przy 70 RPM. Po inkubacji przemyć próbki tkanki, używając 15 ml PB z 0,1% Triton X 100, w temperaturze 37°C przy 70 RPM przez noc.Powtórz płukanie trzykrotnie po usunięciu ostatniej porcji buforu do płukania, dodaj roztwór fluorescencyjnego przeciwciała wtórnego w PB z 0,1% Trix 100 i surowicą blokującą, a następnie inkubuj w ciemności w temperaturze 37 °C przy 70 RPM przez jeden dzień. Po trzykrotnym wypłukaniu próbek w 10 ml PB tritton X 100 w temperaturze 37 °C i 70 RPM przez noc, przeprowadź trzy nocne płukania w PBS. Na koniec inkubuj oczyszczoną tkankę w 80% glicerolu, przykrywając naczynie folią, przez noc.Obrazowanie za pomocą mikroskopii konfokalnej przeprowadza się następnie w ciemności lub przy słabym oświetleniu, choć w tym filmie światła są włączone w celach wizualizacyjnych. W układzie żółciowym wątroby podczas metamorfozy lamprecji zachodzi kilka ważnych zdarzeń rozwojowych; na przykład, jak pokazano tutaj, przewód żółciowy i pęcherzyk żółciowy ulegają apoptozie i degeneracji. Po zastosowaniu zmodyfikowanej metody klarowania i barwieniu markerem komórek wątroby cytokeratyną 19 oraz markerem antyapoptozy BCL two, wykorzystano konfokalną mikroskopię skaningową do wykonania sekcji optycznych przez nienaruszoną wątrobę.Barwienie wykazało, że proces degeneracyjny zachodzi w etapach metamorfozy od drugiego do czwartego. Górne panele przedstawiają koniec przedni, a dolne panele koniec tylny. Tutaj pokazano drzewo żółciowe, a tutaj ciemne, przypominające dendryty komórki apoptotyczne oraz otaczające je kanalikuli i przewody w wątrobie.Rysunek ten przedstawia obrazy trójwymiarowe zrekonstruowane z serii Z mikroskopu konfokalnego trzech wątrób między drugim a trzecim stadium metamorfozy, znakowanych przeciwciałami przeciwko cytokeratynie 19 i BCL 2; drzewo żółciowe oraz ciemne, przypominające dendryty komórki apoptotyczne, a także otaczające kanaliki i przewody są zaznaczone odpowiednio białymi i czarnymi strzałkami. Przedstawiono tutaj konfokalny przekrój optyczny przewodów żółciowych preparatu między drugim a trzecim stadium metamorfozy z kroplami żółci w świetle przewodu. Po obejrzeniu tego filmu powinni Państwo posiadać dobrą wiedzę na temat tego, jak przeprowadzić klarowanie całej tkanki w celu dalszych analiz obrazowych.Należy pamiętać, że praca z roztworami paraformaldehydu i poliakryloamidu może być niezwykle niebezpieczna, dlatego podczas wykonywania tej procedury należy zawsze przestrzegać środków ostrożności, takich jak noszenie rękawiczek i korzystanie z dygestorium.

a-new-clarification-method-to-visualize-biliary-degeneration-during

Research

JoVE Journal

Biology

Biologia

Nowa metoda klaryfikacji do wizualizacji degeneracji dróg żółciowych podczas metamorfozy wątroby u minoga rzecznego (Petromyzon marinus)

Zarodek danio pręgowanego jest doskonałym modelem do badań nad biologią rozwojową. Podczas embriogenezy danio pręgowany rozwija się z masą żółtka, co stanowi trójwymiarowe wyzwanie dla obserwacji i analizy próbek. Protokół ten opisuje, w jaki sposób tworzyć dwuwymiarowe preparaty do montażu płaskiego całych próbek zarodków danio pręgowanego barwionych metodą montażu in situ (WISH).

Przygotowanie do obserwacji i analizy próbek zarodków danio pręgowanego wybarwionych metodą hybrydyzacji in situ metodą całego wierzchowca

Aby pomóc ocenić mechanizmy molekularne leżące u podstaw regeneracji wątroby u danio pręgowanego za pomocą dróg żółciowych, stworzyliśmy model uszkodzenia wątroby, w którym hepatocyty wykazujące ekspresję nitroreduktazy są genetycznie ablowane po leczeniu metronidazolem.  W tym protokole opisujemy, jak umiejętnie manipulować, monitorować i analizować ablację hepatocytów i regenerację wątroby napędzaną przez żółć.

Ablacja specyficzna dla hepatocytów u danio pręgowanego w celu zbadania regeneracji wątroby napędzanej przez drogi żółciowe

Szkielet rozgałęziony, w tym grabie skrzelowe, zęby gardłowe i kości skrzelowe, służy jako główne miejsce przetwarzania żywności u większości ryb. Tutaj opisujemy protokół preparowania i płaskiego montażu tego wewnętrznego szkieletu u cierników trójgrzbietowych. Ta metoda ma również zastosowanie do wielu innych gatunków ryb.

Rozwarstwienie i płaskie ułożenie szkieletu skrzelowego ciernika trójkolcowego

Danio pręgowany staje się cennym modelem przetwarzania lipidów w diecie i chorób metabolicznych. Opisano protokoły żywienia larw bogatych w lipidy, obrazowanie na żywo fluorescencyjnych analogów lipidów w diecie oraz ilościowe oznaczanie spożycia pokarmu. Techniki te można zastosować do różnych technik badań przesiewowych, obrazowania i dociekań opartych na hipotezach.

Paradygmat żywienia wysokotłuszczowego dla larw danio pręgowanego: karmienie, obrazowanie na żywo i kwantyfikacja spożycia pokarmu

Tutaj prezentujemy protokół do izolacji i charakterystyki struktury, siły węchowej i reakcji behawioralnej domniemanych związków feromonów minogów morskich.

Identyfikacja feromonów minoga morskiego za pomocą frakcjonowania pod kontrolą testów biologicznych

Tutaj prezentujemy ustandaryzowaną serię protokołów do obserwacji górnej bruzdy ocznej, niedawno zidentyfikowanej, ewolucyjnie zachowanej struktury w oku kręgowców. Wykorzystując larwy danio pręgowanego, demonstrujemy techniki niezbędne do identyfikacji czynników, które przyczyniają się do powstawania i zamykania górnej bruzdy ocznej.

Wizualizacja bruzdy ocznej górnej podczas embriogenezy Danio rerio

Prezentujemy dość prostą i czułą metodę dokładnego oznaczania gęstości dróg żółciowych w wątrobie myszy. Metoda ta może pomóc w określeniu wpływu modyfikatorów genetycznych i środowiskowych oraz skuteczności potencjalnych terapii w mysich modelach chorób dróg żółciowych.

Określanie gęstości dróg żółciowych w wątrobie myszy

Tutaj demonstrujemy metodę ilościowego określania wielkości wątroby u larw danio pręgowanego, umożliwiając ocenę wpływu manipulacji genetycznych i farmakologicznych na wzrost i rozwój wątroby.

Kwantyfikacja wielkości wątroby u larw danio pręgowanego za pomocą mikroskopii jasnego pola

Regeneracja mięśni szkieletowych jest napędzana przez komórki macierzyste mięśni rezydujące w tkankach, które są upośledzone w wielu chorobach mięśni, takich jak dystrofia mięśniowa, co skutkuje niezdolnością mięśni do regeneracji. W tym miejscu opisujemy protokół, który pozwala na badanie regeneracji mięśni w modelach choroby mięśni danio pręgowanego.

Badanie regeneracji mięśni w modelach chorób mięśni danio pręgowanego

Ten protokół opisuje procedurę usuwania brzusznego płata wątroby u dorosłego danio pręgowanego, aby umożliwić badanie regeneracji wątroby.

Częściowa hepatektomia u dorosłych danio pręgowanego

Ten protokół opisuje zbieranie i wizualizację elasmoidalnych łusek danio pręgowanego podczas regeneracji in vivo. Ponadto przedstawiono hodowlę ex vivo tych łusek do 7 dni po zbiorach.

Regeneracja łusek danio pręgowanego w kulturze łusek toto i ex vivo

Poznaj zmodyfikowaną metodę CLARITY do wizualizacji dróg żółciowych u minoga morskiego Petromyzon marinus podczas metamorfozy wątroby. Ta technika umożliwia analizę zwyrodnienia dróg żółciowych.

Nowa metoda doprecyzowywania do wizualizacji zwyrodnienia dróg żółciowych podczas metamorfozy wątroby u minoga morskiego (Petromyzon marinus) (Wideo) | JoVE Journal

Nowa metoda doprecyzowywania do wizualizacji zwyrodnienia dróg żółciowych podczas metamorfozy wątroby u minoga morskiego (Petromyzon marinus)

Przeglądaj więcej filmów