Nowa metoda doprecyzowywania do wizualizacji zwyrodnienia dróg żółciowych podczas metamorfozy wątroby u minoga morskiego (Petromyzon marinus)

Ogólnym celem niniejszej procedury jest rozjaśnienie całej wątroby oraz miejsca jej połączenia z jelitem w celu przeprowadzenia globalnych analiz strukturalnych i komórkowych degeneracji dróg żółciowych u lamprecji C w fazie metamorfozy. Cel ten osiąga się poprzez wstępną fiksację tkanek w roztworze monomeru hydrożelu.

Następnie hydrożel jest polimeryzowany wraz z utrwalonymi tkankami. Potem usuwa się błonę plazmatyczną utrwalonej tkanki, w wyniku czego tkanka staje się przezroczysta. Na koniec przeprowadza się barwienie immunofluorescencyjne, a następnie wykorzystuje się skanowanie laserne i mikroskopię konfokalną, aby wykazać globalne zmiany strukturalne i komórkowe podczas degeneracji dróg żółciowych u przechodzącej metamorfozę minogi.

Metoda ta może pomóc w udzieleniu odpowiedzi na kluczowe pytania w dziedzinie biomedycznej, takie jak analiza konektomów w ośrodkowym układzie nerwowym, a w naszym przypadku – badanie degeneracji dróg żółciowych podczas metamorfozy w punkcie surowiczym. Zastosowania tej techniki rozciągają się na terapię lub diagnostykę ludzkich dróg żółciowych lub atrezji, ponieważ ta rzadka wrodzona choroba niemowląt wykazuje podobne cechy co degeneracja dróg żółciowych podczas metamorfozy w punkcie surowiczym. Pomysł na tę metodę pojawił się u nas po znalezieniu artykułu w czasopiśmie Nature i zaprezentowaniu podczas spotkania laboratoryjnego filmu online demonstrującego procedurę; przeprowadziła ją Ann Scott, doktorantka z naszego laboratorium. W pierwszej kolejności przygotowano roztwór soli fosforanowo-buforowanej (PBS) oraz bufor fosforanowy (PB), zgodnie z protokołem tekstowym.

W dygestorium przygotować 400 mililitrów hydrożelu, łącząc wodę destylowaną, 40% akrylamid 2% bis-akrylamid 10X PBS, 16% paraformaldehyd, saponinę oraz wodorostratsiarczan amonu. Przygotować jeden litr roztworu do klarowania składającego się z 4% SDS i 0,2 molarnego kwasu borowego oraz sporządzić 500 mililitrów 80% glicerolu do przygotowania tkanki w dygestorium. Odmierzyć 10 mililitrów roztworu monomeru hydrożelu do probówek wirówkowych o pojemności 15 mililitrów.

Przeciąć próbkę tkanki i umieścić tkankę w każdej probówce z utrwalaczem hydrożelowym w temperaturze 4 °C na dwa dni. Po inkubacji, pod wyciągiem, polimeryzować utrwaloną tkankę, dodając 5 µL temid. Następnie dokładnie wymieszać i inkubować próbki w temperaturze pokojowej przez dwie do trzech godzin.

Po inkubacji dokładnie usuń nadmiar żelu, aby oczyścić próbki tkanek. Umieść każdą z nich w 15 mililitrach roztworu klarującego i inkubuj w temperaturze 50 °C przy 70 RPM przez kilka dni, aż staną się przezroczyste. Wymieniaj roztwór klarujący co najmniej raz dziennie i usuwaj wszelki nadmiar żelu.

Przenieść próbki do 15 ml 0,1 M buforu PB z 0,1% Triton X 100 i inkubować przez noc w temperaturze 37°C przy 70 RPM. Powtórzyć inkubację jeszcze dwukrotnie, używając świeżego buforu. Po oczyszczeniu tkanki i usunięciu nadmiaru żelu, zanurzyć próbki w roztworze przeciwciała pierwszorzędowego w PB z Triton X 100 i inkubować przez dwa dni w temperaturze 37°C przy 70 RPM. Po inkubacji przemyć próbki tkanki, używając 15 ml PB z 0,1% Triton X 100, w temperaturze 37°C przy 70 RPM przez noc.

Powtórz płukanie trzykrotnie po usunięciu ostatniej porcji buforu do płukania, dodaj roztwór fluorescencyjnego przeciwciała wtórnego w PB z 0,1% Trix 100 i surowicą blokującą, a następnie inkubuj w ciemności w temperaturze 37 °C przy 70 RPM przez jeden dzień. Po trzykrotnym wypłukaniu próbek w 10 ml PB tritton X 100 w temperaturze 37 °C i 70 RPM przez noc, przeprowadź trzy nocne płukania w PBS. Na koniec inkubuj oczyszczoną tkankę w 80% glicerolu, przykrywając naczynie folią, przez noc.

Obrazowanie za pomocą mikroskopii konfokalnej przeprowadza się następnie w ciemności lub przy słabym oświetleniu, choć w tym filmie światła są włączone w celach wizualizacyjnych. W układzie żółciowym wątroby podczas metamorfozy lamprecji zachodzi kilka ważnych zdarzeń rozwojowych; na przykład, jak pokazano tutaj, przewód żółciowy i pęcherzyk żółciowy ulegają apoptozie i degeneracji. Po zastosowaniu zmodyfikowanej metody klarowania i barwieniu markerem komórek wątroby cytokeratyną 19 oraz markerem antyapoptozy BCL two, wykorzystano konfokalną mikroskopię skaningową do wykonania sekcji optycznych przez nienaruszoną wątrobę.

Barwienie wykazało, że proces degeneracyjny zachodzi w etapach metamorfozy od drugiego do czwartego. Górne panele przedstawiają koniec przedni, a dolne panele koniec tylny. Tutaj pokazano drzewo żółciowe, a tutaj ciemne, przypominające dendryty komórki apoptotyczne oraz otaczające je kanalikuli i przewody w wątrobie.

Rysunek ten przedstawia obrazy trójwymiarowe zrekonstruowane z serii Z mikroskopu konfokalnego trzech wątrób między drugim a trzecim stadium metamorfozy, znakowanych przeciwciałami przeciwko cytokeratynie 19 i BCL 2; drzewo żółciowe oraz ciemne, przypominające dendryty komórki apoptotyczne, a także otaczające kanaliki i przewody są zaznaczone odpowiednio białymi i czarnymi strzałkami. Przedstawiono tutaj konfokalny przekrój optyczny przewodów żółciowych preparatu między drugim a trzecim stadium metamorfozy z kroplami żółci w świetle przewodu. Po obejrzeniu tego filmu powinni Państwo posiadać dobrą wiedzę na temat tego, jak przeprowadzić klarowanie całej tkanki w celu dalszych analiz obrazowych.

Należy pamiętać, że praca z roztworami paraformaldehydu i poliakryloamidu może być niezwykle niebezpieczna, dlatego podczas wykonywania tej procedury należy zawsze przestrzegać środków ostrożności, takich jak noszenie rękawiczek i korzystanie z dygestorium.