Nowa metoda doprecyzowywania do wizualizacji zwyrodnienia dróg żółciowych podczas metamorfozy wątroby u minoga morskiego (Petromyzon marinus)

Ogólnym celem tej procedury jest wyjaśnienie całej wątroby i połączenia z jelitem w celu przeprowadzenia globalnych, strukturalnych i komórkowych analiz zwyrodnienia dróg żółciowych. W metamorficznym minogu C. Osiąga się to poprzez uprzednie utrwalenie tkanek w roztworze monomeru hydrożelowego.

Następnie hydrożel jest polimeryzowany z utrwalonymi tkankami. Następnie usuwa się błonę plazmatyczną utrwalonej tkanki, a tkanka staje się przezroczysta. Wreszcie wykonuje się barwienie immunofluorescencyjne, ostatecznie stosuje się laserową analizę skóry, a mikroskopia konfokalna służy do pokazania globalnych zmian strukturalnych i komórkowych podczas zwyrodnienia dróg żółciowych w metamorficznym c Lampry.

Metoda ta może pomóc odpowiedzieć na kluczowe pytania w dziedzinie biomedycyny, takie jak konektomy w ośrodkowym układzie nerwowym, a w naszym przypadku zwyrodnienie dróg żółciowych podczas metamorfozy punktu surowicy. Implikacje tej techniki rozciągają się na terapię lub diagnostykę dróg żółciowych lub atrezji u ludzi, ponieważ ta rzadka wrodzona choroba niemowlęca ma podobne cechy do zwyrodnienia pęcherzyków podczas metamorfozy punktu surowicy. Po raz pierwszy wpadliśmy na pomysł tej metody, gdy znaleźliśmy artykuł prasowy w nature i zaprezentowaliśmy film online podczas naszego spotkania laboratoryjnego, pokazując, że procedura będzie Ann Scott, doktorantka z naszego laboratorium Po zrobieniu buforu fosforanowego soli fizjologicznej i buforu fosforanowego lub pb, zgodnie z protokołem tekstowym.

W dygestorium przygotuj 400 mililitrów hydrożelu, łącząc wodę destylowaną, 40% akrylamidu, 2%, bisakrylamidu, 10 XPBS, 16% paraformu, aldehydu, saponiny i amonu na siarczan. Przygotuj jeden litr roztworu odczyszczającego składającego się z 4% SDS i 0,2 molowego kwasu borowego i przygotuj 500 mililitrów 80% glicerolu do przygotowania tkanki w dygestorium. Eloqua 10 mililitrów roztworu monomeru hydrożelowego do 15 mililitrowych probówek wirówkowych.

Wypreparuj próbkę tkanki i umieść ją w każdej tubce z hydrożelem utrwalanym w temperaturze czterech stopni Celsjusza przez dwa dni. Po inkubacji pod wyciągiem oparowym należy spolimeryzować utrwaloną tkankę, dodając pięć mikrolitrów temidu. Następnie dobrze wymieszaj i pozwól próbkom inkubować go w temperaturze pokojowej przez dwie do trzech godzin.

Po inkubacji dokładnie usuń nadmiar żelu, aby usunąć próbki tkanek. Umieść każdy w 15 mililitrach roztworu klarującego i inkubuj w temperaturze 50 stopni Celsjusza i 70 obr./min przez kilka dni, aż staną się przezroczyste. Zmieniaj roztwór oczyszczający co najmniej raz dziennie i usuń nadmiar żelu.

Przenieś próbki w 15 mililitrach 0,1 molowego PB z 0,1% Triton X 100 w temperaturze 37 stopni Celsjusza i 70 obr./min przez noc. Powtórzyć inkubację jeszcze dwa razy ze świeżym buforem. Teraz, gdy tkanka jest oczyszczona i wolna od nadmiaru żelu, zanurz próbki w przeciwciałie pierwszorzędowym w PB tritton X 100 i inkubuj w temperaturze 37 stopni Celsjusza i 70 obr./min przez dwa dni po inkubacji, użyj 15 mililitrów PB z 0,1% tritton X 100 do przemycia próbek tkanek w temperaturze 37 stopni Celsjusza i 70 obr./min przez noc.

Powtórzyć płukanie trzy razy po usunięciu końcowego buforu do płukania, dodać fluorescencyjny roztwór przeciwciał drugorzędowych w PB z 0,1% Trix 100 i surowicą blokującą i inkubować w ciemności w temperaturze 37 stopni Celsjusza i 70 obr./min przez jeden dzień. Po trzykrotnym umyciu próbek w 10 mililitrach PB tritton X 100 w temperaturze 37 stopni Celsjusza i 70 obr./min przez noc, należy wykonać trzy nocne płukania w PBS. Na koniec inkubować oczyszczoną tkankę w 80% glicerolu pokrytym folią przez noc.

Obrazowanie za pomocą mikroskopii konfokalnej jest następnie wykonywane w ciemnym lub przyćmionym świetle, chociaż światła są włączone w tym filmie w celach wizualizacyjnych. Podczas metamorfozy lampki żółciowej HEPA zachodzi kilka ważnych zdarzeń rozwojowych, na przykład, jak pokazano tutaj, przewód żółciowy i woreczek żółciowy ulegają apoptozie i ulegają degeneracji. Po zastosowaniu zmodyfikowanej metody klarowania i barwienia markerem komórek wątroby cytokeratyną 19 markerem anty antyapoptozą, zastosowano dwulaserową skaningową mikroskopię konfokalną BCL do wykonania optycznego przekroju przez nienaruszoną wątrobę.

Barwienie ujawniło, że proces zwyrodnieniowy zachodzi w stadiach metamorficznych od drugiego do czwartego. Górne panele są od przodu, a dolne panele od tylnego końca. Pokazane tutaj jest drzewo żółciowe, a tutaj są ciemne dendrytyczne komórki apoptotyczne i otaczające kanaliki i narzędzia kanalikowe w wątrobie.

Rysunek ten przedstawia trójwymiarowe obrazy zrekonstruowane: konfokalna seria Z trzech wątrob między etapami metamorficznymi drugim i trzecim znakowanymi przeciwciałami przeciwko cytokeratynie 19 i BCL dwa, drzewo żółciowe i ciemne dendrytyczne komórki apoptotyczne oraz otaczające je kanaliki i narzędzia kanałowe są oznaczone odpowiednio białymi i czarnymi strzałkami. Pokazano tutaj konfokalny przekrój optyczny dróg żółciowych próbki między etapami metamorficznymi drugim i trzecim z kropelkami żółci w świetle. Po obejrzeniu tego filmu powinieneś dobrze zrozumieć, jak oczyścić całą tkankę do dalszych analiz obrazowych.

Nie zapominaj, że praca z roztworami paraformu, aldehydu i poliakrylamidu może być niezwykle niebezpieczna, a podczas wykonywania tej procedury należy zawsze podejmować środki ostrożności, takie jak noszenie rękawiczek i używanie dygestorium.