Name: Pomiar współczynnika przepuszczalności wody osmotycznej (pf) komórek kulistych: na przykładzie izolowanych protoplastów roślinnych (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-10-08T13:00:00.000+00:00
Duration: 14 min 20 s
Description: Naucz się mierzyć współczynnik przepuszczalności wody osmotycznej (Pf) w izolowanych protoplastach roślinnych. Ta metoda pozwala badać funkcję akwaporin w komórkach roślinnych.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Ta praca była wspierana przez granty z Belgijskiego Narodowego Funduszu Badań Naukowych (FNRS), Międzyuniwersyteckiego Programu Przyciągania Polaków - Belgijska Polityka Naukowa oraz "Communauté française de Belgique-Actions de Recherches Concertées" dla FC, od Israel Science Foundation Jerusalem (ISF) dla MM (Grant # 1311/12) i dla NM (Grant # 1312/12).

1. Przygotowanie roztworów
<ol>
	<li>Przygotować roztwory izotoniczne (600 mOsm) i hipotoniczne (500 mOsm) zawierające 10 mM KCl, 1 mM CaCl2 i 8 M kwasu 2-(N-morfolino)-etanosulfonowego (MES), pH 5,7 i dostosować osmolarność odpowiednimi ilościami D-sorbitolu: 540 mM dla roztworu izotonicznego i 440 mM dla roztworu hipotonicznego. Sprawdzić osmolarność roztworu (w granicach 3 % wartości docelowej) za pomocą osmometru.</li>
	<li>Przygotować suchy wywar z "mieszanki enzymatycznej" zawierającej następujące enzymy: 0,55 g celulazy, 0,1 g pektoliazy, 0,33 g poliwinylopirolidonu K 30, 0,33 g masy ciała (patrz tabela 1 poniżej), wymieszać suchy proszek przez wirowanie, przygotować 5,7 mg podwielokrotności i przechowywać w temperaturze -20 °C.</li>
</ol>
2. Izolacja protoplastów mezofilu Arabidopsis
<ol>
	<li>Przygotuj szalkę Petriego (10 cm) z około 6 kroplami (ok. 30 μl każda) roztworu izotonicznego.</li>
	<li>Obierz naskórek liścia Arabidopsis (dolny), pokrój obrany liść na kwadraty o wymiarach około 4 x 4 mm2, a następnie umieść kwadraty na kroplach roztworu izotonicznego odsłoniętą stroną abaksjalną do dołu, dotykając roztworu.</li>
	<li>Rozpuścić 5,7 mg mieszaniny enzymów w 165 μl roztworu izotonicznego (3,3 % w/w) w probówce o pojemności 1,5 ml, delikatnie mieszać pipetując przez około minutę aż do rozpuszczenia i umieścić kilka podobnych kropli roztworu enzymatycznego na tej samej szalce Petriego.</li>
	<li>Przenieść kawałki liści na krople roztworu enzymatycznego, zamknąć naczynie, zamykając pokrywkę jednym krążkiem parafilmu i inkubować przez 20 minut, unosząc naczynie w łaźni wodnej nastawionej na 28 °C.</li>
	<li>Dodaj jeszcze kilka kropli roztworu izotonicznego do naczynia (2 krople na każdą kroplę roztworu enzymatycznego). Przenieś każdy kawałek liścia do nowej kropli roztworu izotonicznego, a następnie, kolejno, do drugiej kropli (aby zmyć roztwór enzymatyczny). Podnieś kawałek za krawędź za pomocą kleszczy, potrząśnij nim w drugiej kropli (jak torebka herbaty), aby uwolnić protoplasty. Zebrać krople z protoplastami (za pomocą odciętej końcówki pipety o pojemności 100 μl) do probówki o pojemności 1,5 ml.</li>
</ol>
3. Test hipotoniczny prowokacyjny: obrzęk mezofilu Arabidopsis
<ol>
	<li>Przygotować system perfuzyjny (rysunek 1A), napełniając jedną kolumnę roztworem izotonicznym, a drugą roztworem hipotonicznym. Otwórz zawór, pozwól, aby przepłynęła trochę roztworu (najpierw hipotoniczne, a następnie izotoniczne), aby napełnić rurkę aż do kolektora dolotowego (rysunek 1B). Upewnij się, że nie ma uwięzionych pęcherzyków powietrza, a następnie zamknij zawór.</li>
	<li>Uszczelnić szkiełko nakrywkowe za pomocą smaru silikonowego (Tabela 1), aby wykonać dno komory w szkiełku z pleksiglasu (Rysunek 1B; patrz również schemat komory na Rysunku 1C). Aby dno komory (odsłonięta powierzchnia szkiełka nakrywkowego w pierścieniu smarowym skierowana do góry) było "lepkie" dla protoplastów, należy pokryć je dodatnio przenoszącym ładunek siarczanem protaminy (1 % w wodzie; Tabela 1) lub poli-L-lizyna (0,1 % w wodzie; Tabela 1). Rozprowadź ten "klej" na szkiełku nakrywkowym za pomocą końcówki pipety, odczekaj 1 - 2 min, spłucz 3 - 4 razy roztworem izotonicznym i strząśnij pozostały roztwór.</li>
	<li>Napełnij komorę roztworem izotonicznym. Następnie dodaj kroplę roztworu zawierającego protoplasty do komory, używając odciętej końcówki pipety i odczekaj 3 - 4 minuty, aż protoplasty opadną. Przykryj komorę przezroczystą pokrywą (rysunki 1D, 1E) dotykającą powierzchni roztworu (unikaj uwięzienia pęcherzyków powietrza pod spodem).</li>
	<li>Umieść szkiełko (delikatnie!) na odwróconym stole mikroskopowym, podłącz je do systemu perfuzyjnego i pompy (chroniąc przed pęcherzykami powietrza w rurce!) i włącz przepływ roztworu izotonicznego dla stałej perfuzji z prędkością 1 ml/min (można zastosować szybsze szybkości, do 4 ml/min).</li>
	<li>Do rejestrowania zmian głośności używany jest mikroskop odwrócony, z obiektywem 20X i kamerą wideo CCD podłączoną do komputera PC. Użyj wtyczki "CMU 1394 Camera Driver" w oprogramowaniu ImageJ (zobacz Tabelę Materiałów Szczegółowych, aby uzyskać adresy pobierania tych dwóch elementów oprogramowania), aby nagrać 60-sekundowy film wideo z wybranymi nieruchomymi protoplastami (przypuszczalnie tymi przyklejonymi do dna) z szybkością 1 obrazu/s (1 Hz). Rozpocznij zapis od 15-sekundowego przemycia roztworem izotonicznym (stanowi to punkt odniesienia), przełącz się na roztwór hipotoniczny na 45 sekund (aby zakończyć łącznie 60 sekund od rozpoczęcia perfuzji). Zapisz film w formacie TIF. UWAGA: Wybierz pole obserwacji z jak największą liczbą komórek, spełniające następujące kryteria: kulisty kształt i dobrze skoncentrowany kontur komórki na ich największym obwodzie (Rysunek 2A).</li>
</ol>
4. Analiza zmiany objętości komórki za pomocą ImageJ
UWAGA: Aby przeanalizować serię obrazów pęczniejącej komórki, użyj wtyczek 'Image Explorer' i 'Protoplast Analyzer' w oprogramowaniu ImageJ (napisanym przez Xaviera Draye)14. Zaczynając od wybranych protoplastów w ich pierwszym punkcie czasowym, wtyczka "Protoplast Analyzer" automatycznie wykryje krawędzie (kontury) protoplastów i obliczy przebieg czasowy ich obszarów podczas eksperymentu (wtyczki są dostępne z programem do analizy PfFit, poniżej).
<ol>
	<li>Uruchom program ImageJ. Aby otworzyć film, kliknij "Plik" w panelu ImageJ, a następnie kolejno w rozwijanych menu: "Importuj", a następnie "Eksplorator obrazów". Zaznacz wybrany film, a następnie kliknij go prawym przyciskiem myszy, a następnie kliknij lewym przyciskiem myszy "Protoplast Analyzer". Przejrzyj film (za pomocą suwaka na dole obrazu protoplastu), aby zidentyfikować protoplasty, które pozostają w dużej mierze nieruchome podczas eksperymentu – zostaną one przeanalizowane. Wróć do pierwszego obrazu, używając myszy, narysuj okręgi (wybrane z narzędzi do rysowania ImageJ) wokół wybranych protoplastów (Rysunek 2B), a następnie kliknij "OK" w wyświetlonej tabeli "Parametry wykrywania".</li>
	<li>Aby uruchomić algorytm wykrywania protoplastów, kliknij "Lokalny" w górnym panelu obrazu protoplastu, a następnie "Proces" w menu rozwijanym. Przyjrzyj się zielonym okręgom wokół wybranych protoplastów (Rysunek 2C) w całym filmie. Zapisz "Wynik" w pliku Excel. Zamknij program ImageJ. UWAGA: W przypadku, gdy pojawi się czerwona kropka (wskazująca na złe dopasowanie konturu – zwykle z powodu słabego kontrastu obrazu), uruchom ponownie z innymi parametrami.</li>
	<li>Aby oddzielić linie należące do każdej komórki (które – jeśli dwie lub więcej komórek było analizowanych jednocześnie – będą się przeplatać, ponieważ analiza odbywa się klatka po klatce), w programie Excel posortuj zapisane dane według kolumny numeru komórki ("obiekt").</li>
	<li>Aby określić współczynnik konwersji pikseli na μm w celu uzyskania rzeczywistej wartości Pf, zrób zdjęcie linijki mikrometrycznej za pomocą tego samego obiektywu mikroskopu 20X. Przeciągnij linię (wybraną z narzędzi do rysowania ImageJ) wzdłuż obrazu linijki i odczytaj liczbę pikseli odpowiadającą długości linijki u dołu panelu głównego ImageJ. Przekonwertuj dowolne wartości obszaru pikseli w pliku Excel na μm2. Zapisz przebieg czasowy obszarów (dla każdej komórki osobno) jako plik tekstowy (tylko dwie kolumny liczb). UWAGA: Będzie to dane wejściowe do programu "PfFit" z dopasowaniem głośności.</li>
</ol>
5. Modelowanie tempa zmian osmolarności w komorze doświadczalnej za pomocą ImageJ i programu Matlab PfFit
<ol>
	<li>Dodać 2 mg cyjanolu ksylenu (tabela 1 poniżej) do 100 ml roztworu izotonicznego (w celu wytworzenia "barwnika wskaźnikowego").</li>
	<li>Przygotować system perfuzyjny (jak w ppkt 3.1) z barwnikiem wskaźnikowym i niebarwionym roztworem hipotonicznym.</li>
	<li>Uszczelnij szkiełko nakrywkowe za pomocą smaru silikonowego do dna komory z pleksi, a następnie delikatnie napełnij komorę barwnikiem wskaźnikowym, przykryj ją szkiełkiem nakrywkowym (tak jak wcześniej w przypadku protoplastów) i umieść na stoliku mikroskopowym.</li>
	<li>Podłącz komorę do systemu perfuzyjnego i pompy, a następnie włącz wskaźnik przepływu barwnika, aby uzyskać stałą perfuzję z prędkością l ml/min.</li>
	<li>Nagraj 60-sekundowy film z częstotliwością 1 Hz. Rozpocznij nagrywanie od 15 sekund Indicator Dye, przełącz się na roztwór hipotoniczny na 45 sekund. Przerwij filmowanie. Spłucz z Indicator Dye (co najmniej przez 30 sekund), a następnie rozpocznij nowy film. Powtórz około 5-6 razy i zapisz wszystkie filmy</li>
	<li>Użyj oprogramowania ImageJ, aby przeanalizować obrazy wideo przepuszczalności barwnika wskaźnikowego, aby uzyskać uśredniony przebieg czasowy zmieniającej się transmitancji.
	<ol>
		<li>Uruchom ImageJ, kliknij "Plik", a następnie "Otwórz" i wyszukaj film. Dla każdego filmu narysuj pionowy prostokąt o szerokości 10 pikseli w dowolnym miejscu na 1. obrazie filmu. Kliknij "Obraz" na panelu głównym ImageJ, a następnie kliknij "Przytnij" w menu rozwijanym.</li>
		<li>Aby wyrównać 60 klatek (filmu trwającego 60 sekund) w jednym wierszu, kliknij ponownie "Obraz", a następnie klikaj kolejno w rozwijanych menu: "Stosy" i "Utwórz montaż" (kolumny 60, wiersze 1). Narysuj poziomy prostokąt o wysokości 1 piksela w dowolnym miejscu wzdłuż całego rzędu obrazów i kliknij "Analizuj" w panelu głównym ImageJ, a następnie kliknij "profil wydruku" w menu rozwijanym. UWAGA: Pojawi się okno "Plot of Montage" (nie pokazane), a z jego menu można otworzyć listę danych dotyczących transmitancji. Każdy obraz filmu jest reprezentowany na tej liście przez 10 wartości transmitancji pochodzących z prostokąta o szerokości 10 pikseli, w związku z czym "podstawa czasu" (numer sekwencyjny obrazu) jest 10 razy dłuższa.</li>
		<li>Skopiuj listy danych transmitancji (po jednej liście na film) do pliku Excel. Uśrednić przebiegi czasu transmisji uzyskane z kilku filmów spłukiwania barwnika wskaźnikowego. Wygeneruj rzeczywistą podstawę czasu, mnożąc liczbę sekwencyjną obrazu przez 0,1. Zapisz uśredniony przebieg czasu (dwie kolumny) do pliku tekstowego. UWAGA: Przed uśrednieniem, jeśli jest to pożądane, wykreśl poszczególne kursy czasowe, aby wykluczyć wszelkie nieprawidłowości. Upewnij się, że film zawiera co najmniej 5 ostatnich sekund transmisji w stanie ustalonym barwnika wskaźnikowego.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Uruchom program dopasowania Matlab PfFit (panel "Dopasowanie wskaźnika", rysunek 3), aby obliczyć różne parametry przebiegu czasowego osmolarności. UWAGA: na podstawie znanych początkowych i końcowych stężeń roztworu w kąpieli, przebieg w czasie zmieniającego się stężenia osmotycznego roztworu oblicza się na podstawie przebiegu stężenia w czasie (obliczanego z kolei na podstawie przepuszczalności barwnika wskaźnikowego), przy założeniu, że ma on taką samą dynamikę jak stężenie barwnika. PfFit to program, z którego można korzystać bezpłatnie. "PfFit_Installer_web.exe" można pobrać ze strony: PfFit User Guide" ze szczegółowymi wyjaśnieniami i definicjami jest dostępny za pośrednictwem Jove jako plik uzupełniający, który pomaga zapoznać użytkownika z programem PfFit.</li>
	<li>W panelu "Dopasowanie wskaźnika" zaimportuj dane dotyczące średniego przebiegu w czasie przepuszczalności barwnika wskaźnikowego ("Plik danych wskaźnika", rysunek 3A) i wprowadź ręcznie bieżące parametry eksperymentu oraz początkowe przypuszczenia parametrów "szerokość" i "t_half" opisujących przebieg w czasie stężenia barwnika wskaźnikowego (rysunek 3B. Kliknij przycisk "Uruchom", aby wyświetlić wykresy przebiegów czasowych stężenia barwnika wskaźnikowego (dane rzeczywiste i dopasowanie, rysunek 4A) oraz modelowanej (obliczonej) osmolarności kąpieli (rysunek 4B). UWAGA: niezbędne jest dobre dopasowanie do danych (zalecenie: zacznij od wartości pokazanych na rysunku 3).</li>
</ol>
6. Określanie Pf za pomocą programu Matlab Fitting PfFit
UWAGA: Oprócz podstawowych założeń dotyczących zachowania protoplastu jako prawdziwego i doskonałego osmometru11, określenie Pf opiera się na założeniu, że Pf może zmieniać się w czasie, że ta dynamika Pf leży u podstaw przebiegu czasowego zmiany objętości komórki i że trzy parametry wystarczą, aby ją opisać: Pfi (początkowa wartość Pf), NachyleniePf (szybkość liniowej zmiany Pf) i Opóźnienie (okres od początku zmiany osmolarności kąpieli do początku zmiany objętości komórki). Można testować różne modele, w tym różne kombinacje tych parametrów i ich wartości, w tym wartości null11. PfFit poszukuje najlepszej kombinacji tych parametrów, aby uzyskać – poprzez obliczenia – najwierniejsze odtworzenie eksperymentalnego przebiegu czasowego zmiany objętości komórki11, obliczonego z kolei na podstawie zaimportowanych serii obszarów konturu komórki (patrz również Suplement "Podręcznik użytkownika PfFit").
<ol>
	<li>Przełącz się na panel "Dopasowanie głośności" (Rysunek 5). Do importu należy wybrać plik z danymi obszarów (plik tekstowy z przebiegiem czasowym "obszarów" analizowanych protoplastów, rysunek 5A). Jako źródło parametrów wybierz "Ostatnie dopasowanie wskaźnika" (Rysunek 5B; alternatywne rozwiązania można znaleźć w "Podręczniku użytkownika PfFit"). UWAGA: Parametry te (rysunek 5D) są następnie wykorzystywane do regeneracji zmiany osmotyku w kąpieli w procedurze dopasowywania objętości.</li>
	<li>W panelu "Dopasowanie głośności" (Rysunek 5C) zainicjuj (wypełnij początkowe przypuszczenia) parametry Pf: Pf, NachyleniePf i Opóźnienie (zalecenie: zacznij odpowiednio od 1, 1 i 30), Wybierz model "Klasa" (zalecenie: zacznij od II i zaznacz "kontrole" dla wszystkich trzech parametrów, które mają zostać dopasowane). Kliknij "Uruchom", a następnie spójrz na figurę pośrednią (Rysunek 5E) i w razie potrzeby dostosuj parametr Opóźnienie oraz długość rekordu.</li>
	<li>Zapoznaj się z wykresem wyników (rysunek 6), aby ocenić jakość dopasowania i zarejestrować błąd dopasowania. Zmień parametry inicjowania po kilka razy i ponownie uruchom przycisk "Uruchom". UWAGA: Nie zniechęcaj się, gdy program utknie – po prostu uruchom ponownie program!</li>
	<li>Powtórz tę procedurę kilka razy, zaczynając od różnych kombinacji parametrów inicjalizacji, dążąc do najniższej wartości błędu dopasowania.</li>
	<li>Skopiuj listę wyników dopasowania bezpośrednio z ekranu lub znajdź je w pliku "_FIT_Vol_Results.txt" wygenerowanym przez PfFit.</li>
</ol>

<ol><li>Tyerman, S. D., Niemietz, C. M., Bramley, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Plant+aquaporins%3A+multifunctional+water+and+solute+channels+with+expanding+roles%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+Cell+Environ%22%5BJournal%5D)">Plant aquaporins: multifunctional water and solute channels with expanding roles.</a> Plant Cell Environ. 25, 173-194 (2002).</li>
<li>Maurel, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Plant+aquaporins%3A+Novel+functions+and+regulation+properties%5BTitle%5D)+AND+%22Febs+Letters%22%5BJournal%5D)">Plant aquaporins: Novel functions and regulation properties.</a> Febs Letters. 581, 2227(2007).</li>
<li>Maurel, C., Verdoucq, L., Luu, D. T., Santoni, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Plant+aquaporins%3A+Membrane+channels+with+multiple+integrated+functions%5BTitle%5D)+AND+%22Annual+Review+of+Plant+Biology%22%5BJournal%5D)">Plant aquaporins: Membrane channels with multiple integrated functions.</a> Annual Review of Plant Biology. 59, 595(2008).</li>
<li>Chaumont, F., Moshelion, M., Daniels, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Regulation+of+plant+aquaporin+activity%5BTitle%5D)+AND+%22Biology+Of+The+Cell%22%5BJournal%5D)">Regulation of plant aquaporin activity.</a> Biology Of The Cell. 97, 749-764 (2005).</li>
<li>Ramahaleo, T., Morillon, R., Alexandre, J., Lassalles, J. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Osmotic+water+permeability+of+isolated+protoplasts.+Modifications+during+development%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+Physiology%22%5BJournal%5D)">Osmotic water permeability of isolated protoplasts. Modifications during development.</a> Plant Physiology. 119, 885-896 (1999).</li>
<li>Suga, S., Murai, M., Kuwagata, T., Maeshima, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Differences+in+aquaporin+levels+among+cell+types+of+radish+and+measurement+of+osmotic+water+permeability+of+individual+protoplasts%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+Cell+Physiol%22%5BJournal%5D)">Differences in aquaporin levels among cell types of radish and measurement of osmotic water permeability of individual protoplasts.</a> Plant Cell Physiol. 44, 277-286 (2003).</li>
<li>Shatil-Cohen, A., Attia, Z., Moshelion, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bundle-sheath+cell+regulation+of+xylem-mesophyll+water+transport+via+aquaporins+under+drought+stress%3A+a+target+of+xylem-borne+ABA%3F%5BTitle%5D)+AND+%22The+Plant+Journal%22%5BJournal%5D)">Bundle-sheath cell regulation of xylem-mesophyll water transport via aquaporins under drought stress: a target of xylem-borne ABA?</a> The Plant Journal. 67, 72-80 (2011).</li>
<li>Hachez, C., Moshelion, M., Zelazny, E., Cavez, D., Chaumont, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Localization+and+quantification+of+plasma+membrane+aquaporin+expression+in+maize+primary+root%3A+A+clue+to+understanding+their+role+as+cellular+plumbers%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">Localization and quantification of plasma membrane aquaporin expression in maize primary root: A clue to understanding their role as cellular plumbers.</a> Plant Molecular Biology. 62, 305-323 (2006).</li>
<li>Hachez, C., Heinen, R. B., Draye, X., Chaumont, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+expression+pattern+of+plasma+membrane+aquaporins+in+maize+leaf+highlights+their+role+in+hydraulic+regulation%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">The expression pattern of plasma membrane aquaporins in maize leaf highlights their role in hydraulic regulation.</a> Plant Molecular Biology. 68, 337-353 (2008).</li>
<li>Besserer, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Selective+regulation+of+maize+plasma+membrane+aquaporin+trafficking+and+activity+by+the+SNARE+SYP121%5BTitle%5D)+AND+%22The+Plant+Cell%22%5BJournal%5D)">Selective regulation of maize plasma membrane aquaporin trafficking and activity by the SNARE SYP121.</a> The Plant Cell. 24, 3463-3481 (2012).</li>
<li>Moshelion, M., Moran, N., Chaumont, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dynamic+changes+in+the+osmotic+water+permeability+of+protoplast+plasma+membrane%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+Physiology%22%5BJournal%5D)">Dynamic changes in the osmotic water permeability of protoplast plasma membrane.</a> Plant Physiology. 135, 2301-2317 (2004).</li>
<li>Moshelion, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Membrane+water+permeability+and+aquaporin+expression+increase+during+growth+of+maize+suspension+cultured+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Plant%2C+Cell+%26+Environment%22%5BJournal%5D)">Membrane water permeability and aquaporin expression increase during growth of maize suspension cultured cells.</a> Plant, Cell & Environment. 32, 1334-1345 (2009).</li>
<li>Sade, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Improving+plant+stress+tolerance+and+yield+production%3A+is+the+tonoplast+aquaporin+SlTIP2%3B2+a+key+to+isohydric+to+anisohydric+conversion%3F%5BTitle%5D)+AND+%22New+Phytologist%22%5BJournal%5D)">Improving plant stress tolerance and yield production: is the tonoplast aquaporin SlTIP2;2 a key to isohydric to anisohydric conversion?</a> New Phytologist. 181, 651-661 (2009).</li>
<li>Volkov, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Water+permeability+differs+between+growing+and+non-growing+barley+leaf+tissues%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Exp.+Bot%22%5BJournal%5D)">Water permeability differs between growing and non-growing barley leaf tissues.</a> J. Exp. Bot. 58, 377(2007).</li>
<li>Locatelli, F., Vannini, C., Magnani, E., Coraggio, I., Bracale, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Efficiency+of+transient+transformation+in+tobacco+protoplasts+is+independent+of+plasmid+amount%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+Cell+Reports%22%5BJournal%5D)">Efficiency of transient transformation in tobacco protoplasts is independent of plasmid amount.</a> Plant Cell Reports. 21, 865-871 (2003).</li>
<li>Hosy, E., Duby, G., Véry, A. A., Costa, A., Sentenac, H., Thibaud, J. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+procedure+for+localisation+and+electrophysiological+characterisation+of+ion+channels+heterologously+expressed+in+a+plant+context%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+Methods%22%5BJournal%5D)">A procedure for localisation and electrophysiological characterisation of ion channels heterologously expressed in a plant context.</a> Plant Methods. 19, (2005).</li>
<li>Shoseyov, O., Posen, Y., Grynspan, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+Recombinant+Type+I+Collagen+Produced+in+Plants%5BTitle%5D)+AND+%22Tissue+Eng+Part+A%22%5BJournal%5D)">Human Recombinant Type I Collagen Produced in Plants.</a> Tissue Eng Part A. 19, 1527-1533 (2013).</li>
</ol>

Nie mamy nic do ujawnienia.

Opisano tutaj prostą i bardzo wydajną procedurę pomiaru Pf izolowanych protoplastów roślinnych, mającą zastosowanie w zasadzie również do innych komórek kulistych, np. oocytów żaby11. Metoda ta opiera się na pomiarzePF w odpowiedzi na osmotyczne wyzwanie dla komórki. Jednak w przeciwieństwie do innych metod opartych na tym podejściu, zmiana roztworów, tj. osmolarności, nie jest natychmiastowa, ale stopniowa, podczas stałej perfuzji w kąpieli, począwszy od roztworu izoton...

Absorpcja wody i przepływ przez błony komórkowe jest podstawowym wymogiem dla istnienia rośliny, zarówno na poziomie komórkowym, jak i całej rośliny. Na poziomie komórkowym akwaporyny (AQP) odgrywają kluczową rolę w regulacji współczynnika przepuszczalności wody osmotycznej (Pf) błony komórkowej1-3.
Do tej pory zastosowano kilka metod pomiaru endogennego Pf protoplastów z różnych organów roślinnych (np. korzeni, mezofilu, endodermy, itp.), sprawdzone przez Chaumont et al. 4). Jednym z podejść do pomiaruPFF jest wystawienie protoplastów na wyzwanie osmotyczne i monitorowanie początkowego tempa zmiany jego objętości (tj. nachylenia wczesnej fazy liniowej zmiany objętości). W oparciu o to podejście opisano wcześniej dwie różne metody, obie oparte na natychmiastowej wymianie rozwiązań. Pierwsza z nich polega na unieruchomieniu protoplastu za pomocą mikropipety ssącej i przełączeniu przepływu roztworu5, a druga na przeniesieniu protoplastu z jednego roztworu do drugiego za pomocą mikropipety6. Te metody odsysania i przenoszenia mikropipet, które umożliwiają akwizycję obrazu na samym początku szybkiej wymiany roztworu (w celu uchwycenia wczesnej liniowej fazy zmiany objętości), prawdopodobnie wiążą się z fizycznym obciążeniem protoplastów i wymagają specjalistycznego sprzętu oraz specjalistycznej mikromanipulacji.
Opisana tutaj metoda minimalizuje zakłócenia w komórkach, nie obejmuje mikromanipulacji i pozwala na wyprowadzenie Pf, gdy perfuzja kąpieli nie jest natychmiastowa.
Po trawieniu enzymatycznym, protoplasty, zanurzone w roztworze izotonicznym, są unieruchamiane na dnie szkła nakrywkowego komory z pleksiglasu (znanego również jako Lucite lub pleksiglas) poprzez interakcję ładunku. Następnie, podczas ciągłej perfuzji w kąpieli, roztwór izotoniczny jest wypłukiwany przez roztwór hipotoniczny, powodując hipoosmotyczne wyzwanie dla protoplastów. Pęcznienie protoplastu jest rejestrowane na wideo, a następnie, łącząc informacje o przebiegu perfuzji w kąpieli w czasie i przebiegu pęcznienia komórek, Pf określa się za pomocą procedur przetwarzania obrazu i dopasowania krzywej.
Zaletą tej metody jest to, że eksperyment jest bardzo wydajny, tzn. możliwe jest monitorowanie kilku komórek jednocześnie w jednym teście, i że nie wymaga specjalnego sprzętu ani szczególnych umiejętności mikromanipulacji. Możliwych jest kilka zastosowań tej metody. Na przykład oznaczanie natywnegoP różnych komórek z różnych tkanek i roślin, takich jak mezofil i komórki pochewki pęczka rzadkiego z liścia7 Arabidopsis, mezofil liści kukurydzy lub komórki kory korzeniowej8-10 lub komórki hodowane w zawiesinie11,12. Ponadto możliwe jest określenie Pf sferycznych komórek zwierzęcych, takich jak komórki oocytów11. Innym przykładem jest badanie aktywności AQP poprzez przejściową ekspresję ich genu w protoplastach (lub innych genach, które mogą na nie wpływać; np. geny kinaz) i określenie ich udziału w Pf; na przykład wyrażenie pomidora AQP SlTIP2; 2 w protoplastach mezofilu Arabidopsis przez transformację PEG i oznaczanie SlTIP2; 2-związane z Pf13. Wreszcie, można również zbadać wpływ na Pf różnych cząsteczek/substancji (leków, hormonów itp.) dodanych do roztworów, na przykład blokera AQP HgCl27.
Poniższy protokół opisuje izolację protoplastów komórek mezofilu Arabidopsis i określenie ich Pf.

<table><tbody><tr><td>KCl</td><td>Chem-Impex International</td><td>01247-1</td><td><a href="http://www.chemimpex.com/">http://www.chemimpex.com</a> Dowolne źródło, stopień anal.</td></tr><tr><td>CaCl2</td><td>Merck</td><td>11718006</td><td><a href="http://www.merck.com/">http://www.merck.com</a> Dowolne źródło, analny</td></tr><tr><td>kwas 2-(N-morfoliny)-etanosulfonowy stopnia (MES)</td><td>Sigma</td><td>15152002</td><td>http://www.sigmaaldrich.com Dowolne źródło, stopień analny</td></tr><tr><td>D-Sorbitol</td><td>Sigma</td><td>18032003</td><td>http://www.sigmaaldrich.com Dowolne źródło, klasa analna</td></tr><tr><td>Cellulase</td><td>Worthington, Lakewood, NJ, USA</td><td>LS002603</td><td><a href="http://www.worthingtonbiochem.com/">http://www.worthingtonbiochem.com</a></td></tr><tr><td>Pektoliaza</td><td>Karlan,&nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; Phonix, AZ, USA</td><td>8006</td><td><a href="http://www.karlan.com/">http://www.karlan.com</a></td></tr><tr><td>Poliwinylo-pirolidon K 30 (PVP)</td><td>Sigma</td><td>81420</td><td>http://www.sigmaaldrich.com</td></tr><tr><td><a href="https://my.labguru.com/catalog/materials/216">Albumina surowicy bydlęcej (BSA)</a></td><td>Sigma</td><td>A9418-5G</td><td><a href="http://www.sigmaaldrich.com/">http:// www.sigmaaldrich.com</a></td></tr><tr><td>Siarczan protaminy</td><td>Sigma</td><td>P4380</td><td>http://www.sigmaaldrich.com</td></tr><tr><td>Poli-L-Lizyna</td><td>Sigma</td><td>P8920</td><td>http://www.sigmaaldrich.com</td></tr><tr><td>Cyjanol ksylenowy</td><td>Sigma</td><td>X4126</td><td>http://www.sigmaaldrich.com</td></tr><tr><td>Smar silikonowy do odkurzaczy ciężki</td><td>Merck</td><td>107921</td><td><a href="https://merck-chemicals.co.id/chemicals/silicone-high-vacuum-grease-heavy/MDA_CHEM-107921/p_LMib.s1Oxr4AAAEvXHg49in.? SecurePage=prawda& SEO_ErrorPageOccurred=prawda& attachments=CoA">https://merck-chemicals.co.id/chemicals/silicone-high-vacuum-grease-heavy/MDA_CHEM-107921/p_LMib.s1Oxr4AAAEvXHg49in.? SecurePage=prawda& SEO_ErrorPageOccurred=prawda& załączniki=CoA</a></td></tr><tr><td>Mikroskop odwrócony&nbsp;</td><td>Nikon</td><td>Eclipse TS100/TS100F</td><td><a href="http://www.nikoninstruments.com/">http://www.nikoninstruments.com</a></td></tr><tr><td>Pompa perystaltyczna</td><td>BIO-RAD</td><td>EP-1 Econo&nbsp; Pump</td><td><a href="http://www.bio-rad.com/">http://www.bio-rad.com</a>Kamera</td></tr> <tr><td>cyfrowa w skali szarości</td><td>Scion Corporation</td><td>CFW-1308M</td><td><a href="http://www.scioncorp.com/">http://www.scioncorp.com</a></td></tr><tr><td>CMU 1394 Camera Driver' plugin for ImageJ</td><td>Carnegie Mellon</td><td></td><td><a href="http://www.cs.cmu.edu/~iwan/1394/download.html">http://www.cs.cmu.edu/~iwan/1394/download.html</a> Darmowe oprogramowanie</td></tr><tr><td>ImageJ</td><td>NIH</td><td></td><<td>a href="http://rsb.info.nih.gov/ij/">http://rsb.info.nih.gov/ij/</a> Darmowe oprogramowanie</td></tr><tr><td>Econo Gradient Zestaw złączek pompowych</td><td>BIO-RAD</td><td>731-9006</td><td><a href="http:// www.bio-rad.com/">http://www.bio-rad.com</a></td></tr><tr><td>Złącza, rozdzielacz</td><td>DirectMed</td><td></td><td><a href="http://directmed.com/main/Plastic-Medical-Tubing-Connectors.html? ACTION=S">http://directmed.com/main/Plastic-Medical-Tubing-Connectors.html? ACTION=S</a></td></tr><tr><td>Zestawy do infuzji biuret (kolumny)</td><td>Welford</td><td>IF-BR-001</td><td></td></tr><tr><td>http://www.welfordmedical.com/content.php?id=61 Rurka</td><td>TYGON</td><td>R-3603</td><td><a href="http://www.usplastic.com/">http://www.usplastic.com</a></td></tr><tr><td>Opakowanie 3M Taśma klejąca 1'', przezroczysta</td><td>Viking Industrial, Wielka Brytania</td><td>VKMONO25</td><td><a href="http://www.vikingtapes.co.uk/c-428-vkmono-mono-filament-tape.aspx#. UuvqOftdy_8">http://www.vikingtapes.co.uk/c-428-vkmono-mono-filament-tape.aspx#. UuvqOftdy_8</a> każda przezroczysta taśma samoprzylepna (taśma klejąca itp.) prawdopodobnie będzie w porządku</td></tr></tbody></table>

pomiar współczynnika przepuszczalności wody osmotycznej (pf) komórek kulistych: na przykładzie izolowanych protoplastów roślinnych

Measuring the Osmotic Water Permeability Coefficient (Pf) of Spherical Cells: Isolated Plant Protoplasts as an Example

Badanie mechanizmów regulacji AQP jest kluczowe dla zrozumienia stosunków wodnych zarówno na poziomie komórkowym, jak i całej rośliny. Przedstawiono prostą i bardzo efektywną metodę oznaczania współczynnika przepuszczalności wody osmotycznej (Pf) w protoplastach roślinnych, mającą zastosowanie w zasadzie również do innych komórek kulistych, takich jak oocyty żaby. Pierwszym etapem testu jest wyizolowanie protoplastów z tkanki roślinnej będącej przedmiotem zainteresowania poprzez trawienie enzymatyczne do komory z odpowiednim roztworem izotonicznym. Drugi etap składa się z osmotycznego testu prowokacyjnego: protoplasty unieruchomione na dnie komory są poddawane stałej perfuzji, zaczynając od roztworu izotonicznego, a następnie roztworu hipotonicznego. Obrzęk komórek jest nagrywany na wideo. W trzecim etapie obrazy są przetwarzane w trybie offline w celu uzyskania zmian objętości, a przebieg zmian objętości w czasie jest skorelowany z przebiegiem w czasie zmiany osmolarności ośrodka perfuzyjnego w komorze, przy użyciu procedury dopasowania krzywej napisanej w Matlabie ("PfFit"), w celu uzyskania Pf.

W celu oznaczenia Pf oraz porównania aktywności różnych białek AQP wykorzystuje się protoplasty mezofila z liści Arabidopsis. Wykazano, że protoplasty te charakteryzują się niskimi podstawowymi (tłowymi) poziomami Pf 7 i mogą służyć jako system ekspresji funkcjonalnej umożliwiający powtarzalne pomiary Pf .
Zdojone protoplasty z dojrzałego liścia 6-tygodniowej rośliny Arabidopsis zostały wyizolowane, a trzy konstrukty genowe z genami AQP z Arabidopsis...

Pomiar współczynnika przepuszczalności wody osmotycznej (Pf) komórek może pomóc w zrozumieniu mechanizmów regulacyjnych akwaporyn (AQPs). Przedstawione tutaj oznaczanie PF w sferycznych protoplastach komórek roślinnych polega na izolacji protoplastów i analizie numerycznej ich początkowej szybkości zmiany objętości w wyniku prowokacji osmotycznej podczas ciągłej perfuzji w kąpieli.

Pomiar współczynnika przepuszczalności wody osmotycznej (pf) komórek kulistych: na przykładzie izolowanych protoplastów roślinnych

Studying AQP regulation mechanisms is crucial for the understanding of water relations at both the cellular and the whole plant levels. Presented here is ...

Ogólnym celem poniższego eksperymentu jest poznanie funkcji akwaporyn poprzez określenie współczynnika przepuszczalności wody osmotycznej lub PF protoplastów roślinnych. Wytnij kawałek liścia bez osiowego naskórka i połóż go na roztworze izotonicznym. Przenieś kawałki do roztworu enzymatycznego i inkubuj przez 20 minut w temperaturze 28 stopni Celsjusza, a następnie do świeżego roztworu izotonicznego.Następnie zbierz protoplasty zawierające roztwór z odciętą końcówką. W drugim kroku przygotuj komorę doświadczalną. Przymocuj szkiełko nakrywkowe do dolnej części szkiełka za pomocą smaru silikonowego.Następnie pokryj dno komory klejem zawierającym ładunek dodatni i wypełnij komorę roztworem izotonicznym. Wyizolowane protoplasty są następnie dodawane do komory, a komora jest delikatnie umieszczana na stoliku mikroskopu. Następnie protoplasty są wystawiane na działanie roztworu hipotonicznego, podczas gdy nagrywane są filmy w celu uchwycenia ich przebiegu w czasie pęcznienia.Następnie przebieg czasu pęcznienia jest analizowany numerycznie przez oprogramowanie, w tym procedury dopasowania w celu określenia PF każdego protoplastu na podstawie uzyskanych wyników analizy numerycznej, które

measuring-osmotic-water-permeability-coefficient-pf-spherical-cells

Research

JoVE Journal

Biology

Biologia

Pomiar współczynnika przepuszczalności wodnej osmotycznej (Pf) sferycznych komórek: izolowane protoplasty roślin jako przykład

Ten protokół szczegółowo opisuje zoptymalizowaną ekstrakcję płynu do mycia apoplast z liści roślin, używając francuskiej fasoli (Phaseolus vulgaris) jako przykładu modelu.

Technika infiltracjjno-wirowa do ekstrakcji płynu apoplastycznego z liści roślin na przykładzie Phaseolus vulgaris

Ten protokół opisuje użycie wyciętych preparatów tkanki jelitowej lub "worków jelitowych" jako modelu ex vivo funkcji bariery jelitowej. Model ten może być stosowany do oceny integralności zarówno bariery nabłonkowej, jak i warstwy żelu śluzowego w określonych miejscach jelitowych w zwierzęcych modelach chorób układu pokarmowego.

Ex vivo Pęcherzyki jelitowe do oceny przepuszczalności błony śluzowej w modelach chorób przewodu pokarmowego

Przedstawiona tutaj jest prosta technika konfokalnego obrazowania poklatkowego o wysokiej rozdzielczości rozwoju korzeni i hipokotylu przez okres do 3 dni przy użyciu obiektywów o dużej aperturze numerycznej i perfluorodekaliny jako medium immersyjnego.

Prosta komora do długoterminowego obrazowania konfokalnego rozwoju korzeni i hipokotylu

Ten artykuł opisuje praktyczne metody przygotowania hydrożeli w foliach wolnostojących i impregnowanych membranach oraz charakteryzuje ich właściwości fizyczne, w tym właściwości transportu wody.

Synteza hydrożeli o właściwościach przeciwporostowych jako membran do oczyszczania wody

Przedstawiono metodę określania przepuszczalności w systemie wkładów membranowych dla płytek wielodołkowych oraz optymalizacji parametrów in silico do obliczania współczynników dyfuzji za pomocą symulacji.

Metoda wyznaczania i symulacji przepuszczalności i dyfuzji w modelu tkankowym 3D w systemie wkładów membranowych dla płytek wielodołkowych

Tutaj prezentujemy protokół do przeprowadzenia analizy ilościowej poziomu asocjacji plazmato-błonowej dla fluorescencyjnie oznakowanego białka związanego obwodowo. Metoda opiera się na obliczeniowej dekompozycji błonowej i cytoplazmatycznej składowej sygnału obserwowanej w komórkach znakowanych markerem fluorescencyjnym błony plazmatycznej.

Oznaczanie partycjonowania błony plazmatycznej dla białek związanych obwodowo

Ten protokół opisuje tworzenie się komórek naśladujących pęcherzyki jedno- i wielolipidowe, dwuwarstwy lipidowe wspierane i dwuwarstwy lipidowe zawieszone. Te modele in vitro można dostosować do różnych typów lipidów i można je wykorzystać do badania różnych interakcji molekuł i makrocząsteczek.

Montaż dwuwarstwowych modeli lipidowych naśladujących i zawieszonych w powietrzu do badania oddziaływań molekularnych

Ten raport zawiera protokoły montażu, hodowli komórek i testów na platformie μSiM do budowy modeli bariery krew-mózg.

Wykorzystanie platformy tkankowej bariery mikroSiM (μSiM) do modelowania bariery krew-mózg

Przedstawiono metodę izolacji specyficznych typów komórek z materiału roślinnego. Technika ta wykorzystuje transgeniczne linie markerowe wykazujące ekspresję białek fluorescencyjnych w określonych typach komórek, dysocjację komórkową oraz sortowanie komórek aktywowane fluorescencją (FACS). Dodatkowo opracowano układ hodowlany, który umożliwia poddanie siewek Arabidopsis thaliana obróbce przed sortowaniem komórek.

Sortowanie komórek protoplastów roślinnych metodą fluorescencyjnej aktywacji (FACS)

Przedstawiamy protokół wyginania nitkowatych komórek bakteryjnych przytwierdzonych do powierzchni szkiełka podstawowego za pomocą pułapki optycznej w celu pomiaru sztywności zgięciowej komórek.

Pomiar sztywności zginania komórek bakteryjnych z wykorzystaniem pułapki optycznej

Naucz się mierzyć współczynnik przepuszczalności wody osmotycznej (Pf) w izolowanych protoplastach roślinnych. Ta metoda pozwala badać funkcję akwaporin w komórkach roślinnych.

Pomiar współczynnika przepuszczalności wody osmotycznej (pf) komórek kulistych: na przykładzie izolowanych protoplastów roślinnych (Wideo) | JoVE Journal

Pomiar współczynnika przepuszczalności wody osmotycznej (_pf) komórek kulistych: na przykładzie izolowanych protoplastów roślinnych

Przeglądaj więcej filmów