Pomiar współczynnika przepuszczalności wody osmotycznej (_pf) komórek kulistych: na przykładzie izolowanych protoplastów roślinnych

Ogólnym celem poniższego eksperymentu jest poznanie funkcji akwaporyn poprzez określenie współczynnika przepuszczalności wody osmotycznej lub PF protoplastów roślinnych. Wytnij kawałek liścia bez osiowego naskórka i połóż go na roztworze izotonicznym. Przenieś kawałki do roztworu enzymatycznego i inkubuj przez 20 minut w temperaturze 28 stopni Celsjusza, a następnie do świeżego roztworu izotonicznego.

Następnie zbierz protoplasty zawierające roztwór z odciętą końcówką. W drugim kroku przygotuj komorę doświadczalną. Przymocuj szkiełko nakrywkowe do dolnej części szkiełka za pomocą smaru silikonowego.

Następnie pokryj dno komory klejem zawierającym ładunek dodatni i wypełnij komorę roztworem izotonicznym. Wyizolowane protoplasty są następnie dodawane do komory, a komora jest delikatnie umieszczana na stoliku mikroskopu. Następnie protoplasty są wystawiane na działanie roztworu hipotonicznego, podczas gdy nagrywane są filmy w celu uchwycenia ich przebiegu w czasie pęcznienia.

Następnie przebieg czasu pęcznienia jest analizowany numerycznie przez oprogramowanie, w tym procedury dopasowania w celu określenia PF każdego protoplastu na podstawie uzyskanych wyników analizy numerycznej, które pokazują różnice w PF indukowane, na przykład przez ekspresję różnych genów akwaporyny. Metoda ta może pomóc odpowiedzieć na kluczowe pytania z zakresu fizjologii błon komórkowych, takie jak regulacja funkcji akwaporyny. Chociaż ta metoda może zapewnić wgląd w wodę matyczną, przepuszczalność roślin wodnych, które są albo rodzime, albo modyfikowane genetycznie.

Można go również zastosować do innych systemów, takich jak IDE Exposed Origin of Interest. Przed rozpoczęciem tej procedury należy przygotować wymagane roztwory izotoniczne i hipertoniczne oraz sprawdzić ich osmolarność. Stosując oter OSM, osmolarność każdego roztworu musi mieścić się w granicach 3% wartości docelowej.

Napełnij 10-centymetrową szalkę Petriego około sześcioma kroplami roztworu izotonicznego. Oderwij pieczęć ABBA lub opuść naskórek liścia opsys królika i pokrój obrany liść na kwadraty o wymiarach około czterech na cztery milimetry. Umieść małe kawałki na kroplach roztworu izotonicznego odsłoniętą stroną osiową do dołu i dotykając roztworu.

Następnie rozpuść 5,7 miligrama mieszanki enzymatycznej w 165 mikrolitrach roztworu izotonicznego w probówce o pojemności 1,5 mililitra i delikatnie mieszaj, pipetując przez około minutę, aż do rozpuszczenia. Umieść kilka podobnych kropli roztworu enzymatycznego na tej samej szalce Petriego. Przenieś kawałki liści na roztwór enzymatyczny. Krople.

Zamknij naczynie i uszczelnij pokrywkę jedną rundą perfilu. Zanurz naczynie w łaźni wodnej ustawionej na 28 stopni Celsjusza na 20 minut. Po 20 minutach dodaj jeszcze kilka kropli roztworu izotonicznego do naczynia za pomocą kleszczy.

Podnieś każdy kawałek liścia za krawędź, aby przenieść go do nowego roztworu izotonicznego Upuść, a następnie kolejno do drugiej kropli. Potrząśnij kawałkiem liścia w drugiej kropli, aby uwolnić protoplasty za pomocą odciętej końcówki pipety o pojemności 100 mikrolitrów. Zbierz krople z protoplastami do 1,5 mililitrowej probówki.

Przygotować system profuzji, wypełniając jedną kolumnę roztworem izotonicznym, a drugą kolumnę roztworem hipotonicznym. Otwórz zawór, aby przepuścić trochę roztworu hipotonicznego i napełnić rurkę aż do kolektora dolotowego. Po upewnieniu się, że nie ma uwięzionych pęcherzyków powietrza, zamknij zawór.

Powtórz dla roztworu izotonicznego. Uszczelnij szkiełko nakrywkowe za pomocą smaru silikonowego, aby wykonać dno komory w szkiełku z pleksi, aby dno komory było lepkie dla protoplastów, pokryj je dodatnim ładunkiem zawierającym siarczan protaminy lub poli L lizynę. Użyj końcówki pipety, aby rozprowadzić ten klej na szkiełku nakrywkowym.

Poczekaj od jednej do dwóch minut. Spłucz trzy do czterech razy roztworem izotonicznym i strząśnij pozostały roztwór. Napełnij komorę roztworem izotonicznym.

Następnie za pomocą odciętej końcówki pipety dodaj do komory kroplę protoplastów zawierających roztwór. I poczekaj trzy do czterech minut, aż protoplasty opadną. Przykryj komorę przezroczystą pokrywą dotykającą powierzchni roztworu.

Unikaj zatrzymywania pęcherzyków powietrza pod spodem. Delikatnie umieść szkiełko na odwróconym stole mikroskopu i podłącz podłączone do systemu perfuzyjnego i pompy chroniącej przed pęcherzykami powietrza w przewodach. Włącz przepływ roztworu izotonicznego, aby uzyskać stałą perfuzję z prędkością jednego mililitra na minutę.

Aby rejestrować zmiany głośności, wybierz pole obserwacji z jak największą liczbą komórek o kształcie sferycznym i dobrze wyostrzonym konturem komórki na ich największym obwodzie. Nagraj 62. film z wybranymi nieruchomymi protoplastami z szybkością jednego obrazu na sekundę lub jednego herca. Rozpocznij nagrywanie od 15-sekundowego przemycia roztworem izotonicznym i przełącz się na roztwór hipertoniczny na 45 sekund.

Zapisz film w formacie Tiff pod adresem Aby przeanalizować serię obrazów pęczniejącej komórki, użyj wtyczek Eksploratora obrazów i analizatora protoplastów w oprogramowaniu obrazu J. Uruchom obraz J.To otwórz film, kliknij plik w panelu Obraz J, a następnie kolejno w menu rozwijanym w miarę rozwijania importu. Następnie eksplorator obrazów.

Wyróżnij wybrany film. Kliknij go prawym przyciskiem myszy, a następnie w lewo. Kliknij analizator protoplastów.

Na pierwszym obrazie użyj myszki, aby narysować okręgi wokół wybranych protoplastów. Następnie kliknij OK. W tabeli parametrów wykrywania, która pojawia się, aby uruchomić algorytm wykrywania protoplastów, kliknij pozycję lokalnie w górnym panelu obrazu protoplastów.

Następnie przetwarzaj. W menu rozwijanym przyjrzyj się zielonym kółkom wokół wybranych protoplastów w całym filmie. Za pomocą dolnego suwaka zapisz wyniki w pliku Excel.

Analiza odbywa się klatka po klatce. Dlatego w przypadku więcej niż jednej komórki konieczne jest sortowanie, aby oddzielić wiersze należące do każdej komórki Here. Trzy przebiegi czasowe są wyświetlane w arkuszu Excela przed i po sortowaniu z wartościami obszaru przekonwertowanymi z pikseli na mikrometry kwadratowe.

Każdy kurs jest następnie eksportowany do osobnego pliku tekstowego. Aby rozpocząć tę procedurę, podłącz komorę do systemu perfuzyjnego i pompy i włącz wskaźnik przepływu matrycy dla stałej szybkości perfuzji jednego mililitra na minutę, nagraj 62. film z częstotliwością jednego herca. Rozpocznij nagrywanie od 15-sekundowej matrycy wskaźnika, a następnie przełącz się na roztwór hipertoniczny Na 45 sekund zatrzymaj nagrywanie.

Równo ze wskaźnikiem. Zgiń ponownie na co najmniej 30 sekund. Przed rozpoczęciem nowego filmu nagraj i zapisz od pięciu do sześciu filmów, aby przeanalizować filmy.

Aby uzyskać średni przebieg czasowy zmieniającej się przepuszczalności matrycy wskaźnika, uruchom obraz J kliknij plik. Następnie otwórz film i wyszukaj go. Dla każdego filmu narysuj pionowy prostokąt o szerokości 10 pikseli w dowolnym miejscu na pierwszym obrazie filmu, kliknij obraz na panelu głównym Obraz J.

Następnie kliknij przyciąć w menu rozwijanym. Aby wyrównać 60 klatek w jednym rzędzie, kliknij obraz, a następnie klikaj kolejno w menu rozwijanych, rozwijając stosy i dokonując montażu. Narysuj poziomy prostokąt o wysokości jednego piksela w dowolnym miejscu wzdłuż całego rzędu obrazów i kliknij przycisk analizuj w panelu głównym Obraz J.

Następnie kliknij przycisk Profil działki. Z menu rozwijanego skopiuj listy danych transmitancji do pliku Excel. Uśrednić przebiegi czasu transmisji uzyskane z filmów Sero spłukiwania matrycy wskaźnika.

Wygeneruj bazę w czasie rzeczywistym, mnożąc liczbę sekwencyjną obrazu przez 0,1. Zapisz średni przebieg czasowy w pliku tekstowym, aby obliczyć różne parametry przebiegu czasowego osmolarności. Użyj programu dopasowania MATLAB PF fit, który jest dostępny do użycia.

Bezpłatnie. Szczegóły dotyczące pobierania i korzystania z tego programu są dostępne w tekście protokołu. W panelu dopasowania wskaźnika.

Importuj dane dotyczące średniego przebiegu czasowego wskaźnika przepuszczalności barwnika. Ręcznie wprowadź aktualne parametry eksperymentu, początkowe domysły parametrów za pomocą ant H. Opisując przebieg czasowy stężenia barwnika wskaźnikowego również mogą ulec zmianie. Kliknij przycisk uruchom, aby wyświetlić wykres przebiegów czasowych wskaźnika stężenia DAI i modelowanej osmolarności kąpieli.

Dobre dopasowanie do danych jest niezbędne do określenia współczynnika przepuszczalności wody. Przełącz się na panel dopasowania głośności. Wybierz opcję importu pliku danych obszaru.

Wybierz ostatnią pasującą złączkę wskaźnika jako źródło parametrów. Wybierz klasę modelu. Zacznij od dwóch.

Parametry PF pf slow PF i delay muszą być zainicjowane, na przykład, jak pokazano, ale możliwe są również inne wartości. Zaznacz kontrole, czy wszystkie trzy parametry mają zostać zamontowane. Kliknij przycisk Uruchom.

Następnie spójrz na figurę pośrednią i w razie potrzeby dostosuj parametr opóźnienia oraz długość rekordu. Sprawdź wykres wyników, aby ocenić dopasowanie, jakość i zarejestrować błąd dopasowania. Zmień parametry inicjowania kilka razy po raz kolejny i uruchom ponownie.

Powtórz tę procedurę kilka razy, zaczynając od różnych kombinacji parametrów inicjalizacji, dążąc do najniższej wartości błędu dopasowania w celu wyznaczenia współczynnika przepuszczalności wody lub pf i porównania aktywności różnych akwaporyn Protoplasty Mesil z liścia opsysu królika zostały wyizolowane i oddzielnie przekształcone za pomocą trzech konstruktów genów z genami akwaporyny od królika, opsys i labirynt. Protoplasty znakowano za pomocą co-ran za pomocą wektora kodującego wzmocnione białko zielonej fluorescencji. Dla każdej komórki uzyskano przebiegi czasowe zmian objętości komórki po ekspozycji na prowokację hipotoniczną, a także przebieg w czasie zmiany osmolarności kąpieli podczas prowokacji hipotonicznej, wartości PF wyprowadzono dla każdej komórki.

Korzystając z programu PF FIT, zaobserwowano, że wartości PF PROTOPLASTÓW przekształconych za pomocą każdej z trzech akwaporyn były znacznie wyższe niż PF komórki kontrolnej przekształconej za pomocą samego GFP. Po opanowaniu ta technika może dostarczyć analizę kilkudziesięciu komórek w ciągu kilku dni eksperymentalnych, jeśli zostanie wykonana prawidłowo. Po obejrzeniu tego filmu powinieneś dobrze zrozumieć, jak określić przepuszczalność wody SMO w izolowanych protoplastach lub innych komórkach ogniskowych poddanych testowi hipotonicznemu.

W przypadku pozostałych pytań prosimy o kontakt.