Nieinwazyjna ocena nieprawidłowości serca w eksperymentalnym autoimmunologicznym zapaleniu mięśnia sercowego za pomocą obrazowania za pomocą rezonansu magnetycznego u myszy

Ogólnym celem niniejszej procedury jest ustalenie nieprawidłowości w funkcji serca poprzez obrazowanie serc żywych zwierząt dotkniętych zapalną chorobą serca. Osiąga się to najpierw poprzez wywołanie choroby, na przykład zapalenia mięśnia sercowego. Drugim krokiem jest przygotowanie zwierzęcia do obrazowania metodą mikroskopii rezonansu magnetycznego i umieszczenie go w uchwycie dla zwierząt.

Następnie mysz umieszcza się wewnątrz magnesu w celu wykonania obrazowania serca. Ostatnim krokiem jest analiza parametrów czynnościowych serca przy użyciu oprogramowania segment. W rezultacie technika ta jest wykorzystywana do obliczenia objętości końcoworozkurczowej oraz frakcji wyrzutowej u myszy z autoimmunologicznym zapaleniem mięśnia sercowego.

Główną zaletą tej techniki w porównaniu z istniejącymi metodami, takimi jak histopatologia, jest jej nieinwazyjność oraz możliwość uzyskania trójwymiarowego obrazu serca o wysokiej rozdzielczości. Metoda ta może pomóc w uzyskaniu odpowiedzi na kluczowe pytania w dziedzinie kardiologii dotyczące diagnostyki zapalnych chorób serca. Zazwyczaj osoby rozpoczynające pracę z tą metodą mogą napotkać trudności wynikające z braku doświadczenia w przygotowaniu zwierząt do obrazowania mikro-rezonansem magnetycznym.

W związku z tym kluczowa jest wizualna demonstracja tej metody. Rozpocznij ten protokół od przygotowania roztworu peptydowego do indukowania autoimmunologicznego zapalenia mięśnia sercowego; rozpuść peptyd 3 34 do 3 52 ciężkiego łańcucha miozyny sercowej alfa w soli fizjologicznej z buforem fosforanowym do stężenia końcowego 2 mg na 1,5 ml. Następnie przygotuj toksynę krztuśca, dodając 1 ml sterylnego 1x buforu fosforanowego do fiolki zawierającej 50 µg liofilizowanej toksyny krztuśca.

Aby uzyskać stężenie zapasu 50 ng/µL, należy pobrać 20 µL roztworu zapasowego do sterylnej probówki o pojemności 1,5 ml i dodać 980 µL sterylnego 1x roztworu soli fizjologicznej z buforem fosforanowym (PBS), aby uzyskać stężenie robocze 1 ng/µL. Należy również przygotować pełny adiuwant Freunda (CFA), dodając 40 mg ekstraktu z mycobacterium tuberculosis, H 37 RV lub MTB do 10 ml CFA, aby uzyskać stężenie końcowe 5 mg/ml.

Następnie przygotuj emulsję peptydową CFA; aby przygotować 1,5 ml aliquoty emulsji, odmierz 750 µl roztworu peptydu 3 34 do 3 52 ciężkiego łańcucha alfa miozyny sercowej do jednej probówki o pojemności 1,5 ml, a do drugiej probówki o pojemności 1,5 ml odlej taką samą objętość CFA uzupełnionego ekstraktem MTB. Następnie, używając strzykawki 3 ml z końcówką Luer-Lock, pobierz najpierw roztwór peptydu, a następnie CFA z ekstraktem MTB. Przymocuj strzykawkę do trójdrożnego kurka, a drugi wylot kurka połącz z pustą strzykawką 3 ml.

Ustaw stopień otwarcia kurka. Mieszanina peptydów i CFA powinna przepływać z jednej strzykawki do drugiej z umiarkowanym oporem. Mieszać, wielokrotnie przepychając zawartość z jednej strzykawki do drugiej przez około jedną minutę, a następnie umieścić cały zestaw w lodzie na około trzy minuty.

Powtórz tę procedurę co najmniej 10 razy. Określ konsystencję emulsji, ostrożnie umieszczając maleńką kroplę na spokojnej wodzie w 100 mililitrowym szklanym naczyniu. Kropla nie powinna rozpraszać się w wodzie; jeśli tak się dzieje, kontynuuj mieszanie, aż do uzyskania pożądanej konsystencji.

Przenieś zawartość emulsji z strzykawek o pojemności 3 ml do strzykawki o pojemności 1 ml z końcówką Luer-Lock, zastępując jedną z dwóch strzykawek 3 ml podłączonych do kurka jedną strzykawką 1 ml. Następnie przymocuj igłę o rozmiarze 27,5 G.

Wstrzyknąć 150 µL emulsji peptydu z CFA w podzielonych dawkach podskórnie w oba regiony pachwinowe samic myszy aj w wieku od sześciu do ośmiu tygodni. Następnie podać 100 µL zawiesiny toksyny pertussis dootrzewnowo każdemu zwierzęciu w dniu zerowym oraz w drugim dniu po immunizacji. Powtórzyć procedurę immunizacji w siódmym dniu, podając 150 µL emulsji peptydu z CFA w podzielonych dawkach podskórnie po obu stronach mostka.

Przygotuj tę emulsję na świeżo zgodnie z opisem. Następnie w 21. dniu poddaj zwierzęta obrazowaniu MRM. Aby przygotować się do obrazowania, umieść najpierw każdą mysz w komorze indukcji znieczulenia zawierającej mieszankę powietrza z 2% ISO fluorine, stosując podkładkę grzewczą w celu utrzymania ciepłoty.

Następnie przenieś zwierzę do specjalnie zaprojektowanego uchwytu dla zwierząt. Unieruchom głowę za pomocą listwy zgryzowej, aby ustabilizować zwierzę w pozycji brzusznej. Pysk powinien zostać umieszczony w stożku nosowym w celu utrzymania znieczulenia.

Włącz grzejnik z nadmuchiwaniem powietrza, wprowadzając jego wąż wylotowy do pionowego otworu skanera, aby utrzymać temperaturę ciała zwierzęcia podczas eksperymentu. Przez cały czas trwania sesji obrazowania utrzymuj znieczulenie stężeniem 1-2% izofluranu przy przepływie 2 ml/min. Potwierdź znieczulenie, wykonując uciśnięcie palca u stopy.

Następnie należy zainstalować pneumatyczny czujnik poduszkowy oraz sondę temperatury rektalnej, aby monitorować oddech i temperaturę ciała przez cały czas trwania sesji obrazowania. Do lewej kostki należy przymocować czujnik pulsoksymetryczny światłowodowy, a stopę zabezpieczyć pętlą z nici i taśmą w celu utrzymania stabilnej pozycji. Obrazowanie zostanie przeprowadzone poprzez synchronizację sygnałów oddechowych i kardiologicznych (gating) bez użycia środków kontrastowych.

W celu uzyskania wysokorozdzielczych trójwymiarowych obrazów mikroskopii rezonansu magnetycznego należy zastosować magnes z szerokim otworem pionowym o indukcji 9,4 Tesli. Po przygotowaniu zwierzęcia należy umieścić mysz w skanerze tak, aby serce znajdowało się w centrum pola widzenia. Następnie należy uruchomić interfejs obrazowania, wybrać z paska poleceń menu nowego typu badania, przejść do strony strojenia, a następnie wybrać opcje start probe, tune oraz autoscale.

Użyj pokręteł dostrojenia (tune/match) znajdujących się na końcu cewki, aby dostroić cewkę RF do częstotliwości rezonansu protonów wynoszącej 400 MHz. Następnie przejdź do strony pre-scan. Aby przeprowadzić kalibrację częstotliwości i mocy, naciśnij szybki przycisk X, Y, Z, aby otworzyć stronę shimowania.

Następnie wybierz wszystkie iteracje i wykonaj automatyczne shimmingowanie. Wybierz sekwencję scout. Zmień pole widzenia na 35 millimeters.

Pozostaw pozostałe ustawienia domyślne i uruchom sekwencję. Jeśli serce nie znajduje się w centrum pola widzenia, dostosuj położenie uchwytu dla zwierzęcia, ponownie nastroj cewkę RF i ponownie wykonaj obraz zwiadowczy. Następnie wybierz sekwencję gem.

Wprowadź widoczne tutaj parametry akwizycji w zakładce „acquire”, aby uzyskać dwie płaszczyzny ortogonalne wzdłuż krótkiej i długiej osi serca. Następnie wybierz sekwencję cine, aby zebrać obrazy cine krótkiej osi z pomiarem pulsoksymetrii i zmierzyć anatomiczne oraz funkcjonalne parametry lewej komory. Wprowadź widoczne tutaj parametry, aby uzyskać sekwencję cine echo gradientowe.

Dostosuj pozycję i kąt przekrojów obrazowania w oparciu o widok długiej osi serca. Następnie uruchom sekwencję. Po zakończeniu obrazowania.

Konwertuj pozyskane obrazy do formatu DICOM za pomocą karty IO i prześlij odpowiednie pliki do centrum danych w celu ich przetworzenia. Po zakończeniu procedury obrazowania pozwól zwierzęciu dojść do siebie po znieczuleniu w klatce z filtrem na górnej pokrywie. Nie pozostawiaj myszy bez nadzoru, dopóki nie odzyska ona wystarczającej świadomości, aby utrzymać pozycję sternalną.

W tym miejscu oprogramowanie Segment służy do analizy parametrów anatomicznych i funkcjonalnych lewej komory. Należy rozpocząć od załadowania do oprogramowania obrazów cine w formacie DICOM. Następnie należy wybrać MRGE jako technikę obrazowania, cine jako typ obrazu oraz krótka oś w połowie komory.

W widoku płaszczyzny obrazu należy określić ramy czasowe dla końca rozkurczu i końca skurczu, korzystając odpowiednio z podmenu „set current timeframe to end diastole” oraz „set current timeframe to end systole” w menu edycji. Następnie należy użyć przycisków poleceń LV, a potem endo i EPI w panelu w prawym dolnym rogu. Aby ręcznie narysować odpowiednio lewą komorę, endokardium i epikardium, należy usunąć mięśnie brodawkowate, klikając odpowiedni przycisk polecenia.

Aby zwiększyć dokładność obliczeń, odczytaj ilościowe parametry lewej komory, takie jak objętość rozkurczowa, objętość skurczowa, objętość wyrzutowa i frakcja wyrzutowa, z panelu w prawym górnym rogu. Następnie użyj przycisku polecenia mis, a potem przycisku polecenia suwmiarki pomiarowej, aby zmierzyć parametry lewej komory, takie jak grubość ścian oraz średnica komory. Na koniec koniecznie użyj opcji zapisu obu stosów obrazów i segmentacji, aby zapisać obrazy wraz z segmentacjami w formacie dot mat, co umożliwi ponowne przetworzenie obrazów w razie potrzeby.

Kąt, pod którym wykonano przekrój serca w celu pozyskania obrazu w widoku dwukomorowym, przedstawiono tutaj. Można zauważyć przybliżony 1,5-krotny wzrost grubości lewej komory, co wskazuje na wady strukturalne w sercach myszy z eksperymentalnym autoimmunologicznym zapaleniem mięśnia sercowego w porównaniu do myszy zdrowych. Rzut serca, zmierzony na podstawie objętości rozkurczowej lewej komory i frakcji wyrzutowej, był obniżony u myszy z autoimmunologicznym zapaleniem mięśnia sercowego w porównaniu do myszy zdrowych.

Na koniec w sercach z powyższych grup badawczych oceniono stan zapalny za pomocą barwienia hematoksyliną, eozyną i safraninem; ocena histologiczna serc myszy z zapaleniem mięśnia sercowego, w przeciwieństwie do myszy zdrowych, wykazała wieloogniskowe nacieki limfocytarne. Podczas przeprowadzania tej procedury ważne jest zapewnienie stałej temperatury ciała zwierzęcia, aby częstotliwość akcji serca i częstość oddechów nie uległy znaczącym zmianom w trakcie eksperymentów. Jest to kluczowe dla uzyskania powtarzalnych wyników.

Po obejrzeniu tego filmu powinni Państwo posiadać dobrą wiedzę na temat techniki mikroskopii rezonansu magnetycznego w ocenie nieprawidłowości funkcjonalnych w zapalnych chorobach serca, takich jak zapalenie mięśnia sercowego u myszy. Należy jednak pamiętać, że praca w silnych polach magnetycznych może być niezwykle niebezpieczna, dlatego uchwyt dla zwierząt oraz pozostałe komponenty muszą być niemagnetyczne.