Identyfikacja partnerów interakcji białkowych w komórkach ssaków za pomocą proteomiki ilościowej SILAC-immunoprecypitacji

Ogólnym celem tej procedury jest zidentyfikowanie partnerów interakcji białkowych dla danego białka będącego przedmiotem zainteresowania. Osiąga się to poprzez najpierw wyhodowanie komórek w pożywkach do hodowli komórkowych zawierających argininę i lizynę znakowanych różnymi stabilnymi izotopami węgla i azotu. Drugim krokiem jest transfekcja, plazmidy i pokrycie białka będącego przedmiotem zainteresowania lub plazmidu kontrolnego w znakowanych komórkach.

Następnie komórki są poddawane lizie, a próbki są poddawane immunoprecydacji z lizatów. Następnie równe objętości osadów immunologicznych kontrolnych i próbek są łączone i przekazywane do analizy lc MS MS. Ostatnim krokiem jest analiza danych ze spektrometrii mas w celu zidentyfikowania białek oddziałujących z białkiem będącym przedmiotem zainteresowania.

Ostatecznie, znakowanie stabilnymi izotopami aminokwasów w hodowli komórkowej lub wytrącanie aminokwasów silakowych jest w stanie zidentyfikować dużą liczbę zarówno bezpośrednich, jak i pośrednich interakcji z białkiem będącym przedmiotem zainteresowania w komórkach hodowli tkankowej. Główną zaletą tej techniki w porównaniu z istniejącymi metodami, takimi jak znakowanie kranowe, jest to, że eliminuje ona potrzebę wysyłania przez badacza pojedynczych pasm ze spektrometrii mas. Usuwa to ważne źródło uprzedzeń, jednocześnie zwiększając wrażliwość.

Chociaż metoda ta może być wykorzystana do uzyskania wglądu w białko komórkowe, interakcje białek można również zastosować do innych systemów, takich jak badanie interakcji patogenów z gospodarzami. Aby rozpocząć zeskrobywanie limfocytów T HEK 2 93 znakowanych SLAC, wyrażających białko znakowane GFP lub kontrolę GFP z naczynia do hodowli komórkowej do lodowatego PBS, a następnie odwirować zawiesinę komórkową w temperaturze 220 razy G przez pięć minut w temperaturze czterech stopni Celsjusza, umyć komórki trzy dodatkowe razy w 10 mililitrach lodowatego PBS, ponownie zawiesić osad komórkowy w 200 mikrolitrach buforu do lizy komórek zawierającego świeżo dodany koktajl inhibitorów proteazy trzy w jednym stężeniu X i dodać pięć mikrolitrów koktajlu RNA na mililitr buforu do lizy, inkubować na lodzie przez pięć minut. Następnie odwirować lizat komórkowy w temperaturze 13 000 razy G przez 10 minut w temperaturze czterech stopni Celsjusza i zachować supernatant jako rozpuszczalny lizat komórkowy.

Zmierz stężenie białka w lizacie komórkowym za pomocą testu A BCA. Następnie znormalizować stężenie białka w każdej próbce lizatu w końcowej objętości 500 mikrolitrów za pomocą buforu do lizy zawierającego inhibitory proteazy. Dodaj 500 mikrolitrów buforu rozcieńczającego zawierającego jeden x koktajl inhibitorów proteazy trzy do każdego ze znormalizowanych lizatów komórkowych, aby dostosować całkowitą objętość do jednego mililitra.

Utrzymuj lizaty na lodzie podczas przygotowywania kulek anty GFP i zachowaj 50 mikrolitrów podwielokrotności każdej próbki, która ma być wykorzystana do wprowadzenia próbki. Zwiruj zawiesinę koralików, aby ponownie zawiesić koraliki. Następnie użyj końcówki pipety o pojemności 200 mikrolitrów z odcięciem końcowym, aby przenieść 25 mikrolitrów kulek na próbkę do świeżej probówki.

Na każde 25 mikrolitrów zawiesiny perełkowej dodać 20 objętości buforu rozcieńczającego do przemycia, odwirować kulki w temperaturze 2 700 razy G przez pięć minut. Przemyć kulki dodatkowo 20 objętościami buforu rozcieńczającego. Następnie dodaj 100 mikrolitrów buforu rozcieńczającego na 25 mikrolitrów zawiesiny perełek.

Następnie użyj końcówki pipety o pojemności 200 mikrolitrów z odcięciem końcowym, aby przenieść 85 mikrolitrów zawiesiny zawieszonych kulek do każdej z lizatów próbek oznaczonych SLAC. Inkubować próbki z kulkami na rotatorze w temperaturze czterech stopni Celsjusza przez dwie godziny po inkubacji próbek z kulkami, odwirować próbki w temperaturze 2 700 razy G przez pięć minut w temperaturze czterech stopni Celsjusza. Zachować 50 mikrolitrów supernatantu jako próbkę niezwiązaną i wyrzucić pozostałą część supernatantu.

Ponownie zawiesić kulki w każdej probówce w jednym mililitrze buforu rozcieńczającego, a następnie odwirować w temperaturze 2 700 razy G przez pięć minut w temperaturze czterech stopni Celsjusza. Powtórz ten krok prania dwukrotnie, aby wymyć białko z kulek. Dodać 50 mikrolitrów dwóch ładujących XSDS do każdej próbki i podgrzewać w temperaturze 95 stopni Celsjusza przez 10 minut.

Po zakończeniu ogrzewania odwirować każdą próbkę w temperaturze 2 700 razy G przez pięć minut w temperaturze czterech stopni Celsjusza. Przenieść supernatant do wstępnie nasmarowanych probówek i przechowywać w temperaturze minus 80 stopni Celsjusza do momentu przygotowania do poddania analizie MS. Następnie wymieszać równe objętości osadów kontrolnych i aminowych próbki i przesłać połączoną próbkę do urządzenia do spektrometrii mas w celu analizy lc ms MS.

Przed analizą danych spektrometrii mas skopiuj surowe dane do nowego arkusza kalkulacyjnego. Następnie w tym arkuszu kalkulacyjnym usuń wszystkie kolumny z wyjątkiem kolumn zawierających numer dostępu, liczbę unikalnych proporcji peptydów, porównanie próbek, zmienność proporcji i opis białka. Użyj funkcji sortowania programu Excel, aby uporządkować dane według liczby peptydów i usunąć wpisy dotyczące białek, w których brakuje więcej niż jednego peptydu.

Następnie posortuj według proporcji i usuń białka, które nie mają proporcji SLAC. Następnie przekonwertuj proporcje slac na logarytm dwóch wartości. Użycie formuły równa się nawiasom logarytmicznym, stosunkowi SLAC dwóm i nawiasom, w których stosunek SLAC jest podstawiany jako identyfikator komórki.

Następnie utwórz nową kolumnę w pliku Excel i oblicz Log dwa współczynniki SLAC dla wszystkich przykładowych kolumn próbnych do konwersji przykładowego współczynnika próbki na próbny współczynnik próby. Użyj formuły równa się jeden podzielony przez stosunek. Otwórz pryzmat GraphPad.

Wybierz nową tabelę danych i wykres Wybierz kolumnę z listy po lewej stronie okna i wybierz wprowadź dane importu. Wprowadź wartości repliki skumulowane w opcjach kolumn. Naciśnij przycisk Utwórz.

Następnie wybierz i skopiuj podaną kolumnę logarytmu dwóch próbek makiety współczynnika SLAC z arkusza kalkulacyjnego Excel do nowego pliku pryzmatu. Następnie kliknij rozwijane menu wstawiania i wybierz nową analizę. W obszarze Analiza kolumnowa wybierz pozycję rozkład częstotliwości.

Zachowaj opcje domyślne i kliknij OK. W folderze wyników zostanie wygenerowana nowa sekcja histogramu. Wybierz sekcję rozkładu częstotliwości, a następnie kliknij rozwijane menu wstawiania i wybierz dopasowanie nowej krzywej regresji nieliniowej XY analizy.

Kliknij rozkład Gaussa i kliknij OK. W wyświetlonym oknie wyników podana jest średnia i odchylenie standardowe. Wygeneruj próg, dodając 1,96 odchylenia standardowego do średniego zwrotu do pliku programu Excel.

Utwórz nową kartę o nazwie Akcesja do kolumny etykiety połączonej A i skopiuj do niej wszystkie numery dostępu z poszczególnych eksperymentów. Następnie wybierz zakładkę danych, a następnie opcję usuń duplikaty. Następnie utwórz kolumny dla współczynników SLAC i zmienności proporcji z każdego eksperymentu, a także dla kolumny opisu nazwy białka.

Na karcie Opis użyj formuły WYSZUKAJ.PIONOWO, aby zebrać opis każdego numeru dostępu. Przeciągnij formułę w dół kolumny, aby wypełnić opis białka, a następnie użyj tej formuły, aby uzyskać dane dotyczące stosunku i zmienności z poszczególnych eksperymentów. Aby wyróżnić oddziałujące białka w połączonym zestawie danych, zanotuj wartość progową dla konkretnego eksperymentu.

Wybierz kolumnę proporcji i kliknij kartę Strona główna. Następnie formatowanie warunkowe, podświetl komórki, reguły, więcej reguł, a następnie wybierz styl Format klasyczny sprzedaje tylko te, które zawierają wartość sprzedaży większą lub równą. W polu wpisz wartość odchylenia standardowego 1,96 i kliknij przycisk OK.

Oceń zmienność proporcji dla każdej pozytywnej interakcji. Jeśli odjęcie procentowej zmienności spowoduje spadek trafienia poniżej wartości progowej. Należy do tego podchodzić z ostrożnością.

Powtórz to dla każdej z kolumn wyników i porównaj między eksperymentami wyróżnione białka zidentyfikowane w dwóch lub więcej eksperymentach reprezentują interakcję o wysokim poziomie ufności. Analiza Western blot potwierdziła oczyszczenie białka znakowanego GFP, które jest przedmiotem zainteresowania. Brak pasma przerwa DH w związanych próbkach wskazuje, że nieoddziałujące białka zostały wyczerpane z próbek na etapie immunoprecypitacji, podczas gdy obecność pasma EIF 4G w tych próbkach wskazuje, że zachowano znanych oddziałujących partnerów wiążących.

Kilka zidentyfikowanych białek wiążących EIF cztery A zostało zachowanych między dwiema izoformami. Białka, które oddziałują z EIF four A, są identyfikowane przez wysoki stosunek LAC, podczas gdy białka niezwiązane w tym eksperymencie mają proporcje poniżej 0,96. Na tym schemacie kompleksu czynnika inicjacji cztery białka wiążące EIF A, które zostały zidentyfikowane w eksperymencie wytrącania aminokwasów SLAC, są zacieniowane na czerwono do białego.

Zgodnie ze stosunkiem logarytmu dwóch SLAC, wysokie pokrycie zarówno bezpośrednich, jak i pośrednich partnerów wiążących kompleksy EIF cztery A jeden i dwa ilustruje skuteczność tego podejścia w identyfikacji interakcji białkowych Podczas próby tej procedury należy pamiętać, że chociaż pewne różnice w poziomach białka można skompensować na etapie analizy danych, Najlepiej, jeśli można tego uniknąć, zapewniając dokładną normalizację poziomu białka wejściowego i unikając utraty kulek AROS podczas etapów prania.