Obrazowanie strumienia glutaminy za pomocą genetycznie kodowanych czujników

Ogólnym celem tej procedury jest zobrazowanie transportu glutaminy przez heterologiczny transporter ekspresji w żywych komórkach przy użyciu pierwszych rezonansowych transferów energii lub czujników progowych. Osiąga się to poprzez pierwszą transekcję powodującą siedem komórek z czujnikiem glutaminy i transporterem. Czujnik składa się z donora progów wprowadzonego do bakteryjnego białka wiążącego glutaminę i akceptera progów na końcu C białka wiążącego glutaminę.

Drugim krokiem jest skonfigurowanie systemu perfuzyjnego i zobrazowanie komórek w czasie rzeczywistym za pomocą odwróconego mikroskopu fluorescencyjnego. Ostatnim krokiem jest analiza obrazów i wizualizacja dynamiki glutaminy. Ostatecznie, działania transportera w pojedynczej komórce mogą być wykrywane za pomocą tych czujników progowych.

Główną przewagą tej techniki nad istniejącymi metodami, takimi jak pomiar oparty na chromatografii, jest to, że uzyskuje się znacznie wyższą przestrzenną rozdzielczość czasową. Technika ta składa się z trzech części: transfekcji komórek za pomocą białek czujnikowych, obrazowania w czasie rzeczywistym i analizy poeksperymentalnej Cost. W tym eksperymencie wykorzystano siedem komórek ze względu na ich niską endogenną aktywność transportową glutaminy.

Wysiewaj komórki przy około 70 do 80% płynności co w DMEM plus 10% kosmicznej surowicy cielęcej lub CCS i 100 jednostek na mililitr. Penicylina streptomycyna w naczyniu ze szklanym dnem z ośmioma dołkami. Inkubować w temperaturze 37 stopni Celsjusza, 5% CO2, 100% wilgotności przez 24 godziny.

Po 24 godzinach. Zastąp pożywkę wzrostową DMEM plus 10% CCS bez antybiotyków rośnie przez noc w temperaturze 37 stopni Celsjusza, 5% CO2 100% wilgotności w dniu transfekcji. Dodaj po 0,4 mikrograma DNA osocza kodującego czujnik glutaminy i oznaczony obowiązkowy wymiennik aminokwasów m wiśnia A SCT od dwóch do 50 mikrolitrów pożywki wolnej od surowicy.

Delikatnie dodać jeden mikrolitr odczynnika do transfekcji do 50 mikrolitrów pożywki wolnej od surowicy i inkubować w temperaturze pokojowej przez pięć minut. Następnie wymieszać roztwór zawierający DNA z rozcieńczonym odczynnikiem do transfekcji i inkubować w temperaturze pokojowej przez 20 minut. Po 20 minutach delikatnie dodaj mieszaninę odczynników do transfekcji na siedem komórek i delikatnie wymieszaj, kołysząc komorą.

Inkubuj przez 24 godziny w temperaturze 37 stopni Celsjusza, 5% CO2 i 100% wilgotności po 24 godzinach. Zastąp pożywkę DMEM plus 10% CCS plus 100 jednostek streptomycyny penicyliny. Umieść komórki z powrotem w inkubatorze przed rozpoczęciem perfuzji.

Przygotować perfuzyjne od A do F zgodnie z przepisami zawartymi w dołączonym manuskrypcie. Przymocuj ogranicznik Coxa do 50-mililitrowych strzykawek. Zamknąć kurki odcinające i napełnić strzykawki roztworami perfuzyjnymi.

Otwórz kurek odcinający na krótki czas, aby wypełnić przestrzeń nad zaworem odcinającym buforem. Następnie włącz ośmiokanałową grawitację. Podaj system perfuzyjny za pomocą ołówka perfuzyjnego i wybierz tryb ręczny.

Pod opcją wyboru funkcji. Umieść pojemnik na odpady pod ołówkiem perfuzyjnym. Aby ten eksperyment zakończył się sukcesem, ważne jest, aby ustawić perfuzję w taki sposób, aby zminimalizować dryft i przenoszenie roztworu.

Ręcznie aktywuj porty, naciskając odpowiednie cyfry i napełnij rurki wodą. Za pomocą strzykawki o pojemności 10 mililitrów zamknij porty, umieść strzykawki zawierające od A do F na portach od pierwszego do szóstego systemu perfuzyjnego i otwórz kurki odcinające. Po tym.

Otwórz ponownie porty, aby zastąpić wodę w rurkach. Natężenie przepływu powinno wynosić około 0,8 mililitra na minutę. Naciśnij raz anuluj na kontrolerze perfuzji, aby wrócić do menu wyboru funkcji.

Przełącz się na opcję edycji programu, a następnie wpisz protokół perfuzji wskazany w tej tabeli. Zapisz program perfuzyjny. Komórki są obrazowane od 48 do 72 godzin po transfekcji.

Umyj studzienki naczynia ze szklanym dnem dwukrotnie buforem perfuzyjnym A, uważając, aby nie zmyć komórek. Ustaw naczynie ze szklanym dnem na stoliku mikroskopu fluorescencyjnego. Podłącz system perfuzyjny do komory.

Jeśli używana jest otwarta komora, należy zainstalować inną pompę, która usuwa roztwór perfuzyjny z komory. Otwórz oprogramowanie do obrazowania skoroszytu slajdów. Rozpocznij nowy slajd za pomocą funkcji ostrości, znajdź komórki coex wyrażające czujnik i A SCT dwa M cherry za pomocą odpowiednich zestawów filtrów.

Dostosuj wzmocnienie, klikając zakładkę kamery i przesuwając suwak pod pozycją wzmocnienie. Dostosuj także ustawienie filtra o neutralnej gęstości z menu rozwijanego filtra o neutralnej gęstości. Kliknij pozycję przechwytywanie obrazu, a następnie w oknie pobierania określ filtry, które mają być używane.

Obrazy będą pozyskiwane w trzech kanałach. Pobudzenie dawcy, wzbudzenie dawcy emisji dawcy, misja akceptacyjna i misja akceptacji wzbudzenia dawcy. Kliknij przycisk testu, aby dostosować czas ekspozycji, wpisując żądany czas ekspozycji w polu Obok ustawień filtra, wszystkie trzy kanały muszą być naświetlone przez ten sam czas.

Narysuj obszar zainteresowania za pomocą narzędzia Regiony. Wybierz film poklatkowy w polu typu przechwytywania. Następnie określ interwał i punkty czasowe eksperymentu.

Następnie narysuj obszar w obszarze bez żadnych komórek fluorescencyjnych, które można użyć do odejmowania tła. Kliknij prawym przyciskiem myszy narysowany region, a następnie ustaw go jako tło. Idealnie byłoby, gdyby komórki, które nie wyrażają czujników, były używane jako obszar tła, aby uwzględnić zarówno autofluorescencję, jak i fluorescencję tła wykrytą przez kamerę.

Wybierz żądany program w obszarze wybierz opcję uruchamiania programów funkcji, przełącz się na zapisany program, a następnie naciśnij Enter na kontrolerze perfuzji. Program jest teraz załadowany, a naciśnięcie dowolnego rozpocznie perfuzję, aby upewnić się, że zarówno perfuzja, jak i eksperyment obrazowania rozpoczną się w tym samym czasie. Kliknij przycisk Start w oknie przechwytywania w tym samym czasie, co naciśnięcie na kontrolerze perfuzji.

Pokazano tutaj typowe eksperymenty w czasie z wykorzystaniem komórek wyrażających koks w technice CT, dwóch transporterów i czujników glutaminy o powinowactwie do ośmiu milimolowych i 100 mikromolowych. Napływ glutaminy jest wykrywany jako zmiana współczynników intensywności fluorescencji między dawcą mtfp a akceptorem Wenus. Wykazano również napływ glutaminy w obecności alaniny.

Specyfika transporterów może być również badana za pomocą czujników. W tym przypadku komórki zostały wstępnie załadowane glutaminą, a następnie różne aminokwasy zostały dodane do perfuzji zewnątrzkomórkowej. Osiem, zgodnie z oczekiwaniami, A ct dwa substraty indukowały glutaminę flx, podczas gdy aminokwasy nonsowe nie.

Brak zmian wydajności progów po dodaniu substratu może wynikać z kilku przyczyn, takich jak niska zdolność absorpcji badanego substratu, jak pokazano w komórkach wyrażających czujnik ośmiomilimolowy lub czujnik 100 mikromolowy. Ale to nie wyraża transportera CT dwa, aby potwierdzić, że zmiana wydajności progu jest spowodowana rzeczywistą zmianą podłoża, a nie zmianą innych parametrów. Ten sam protokół perfuzji przeprowadza się przy użyciu komórek wyrażających czujnik, który ma być nasycony w warunkach eksperymentalnych.

W tym przykładzie powinowactwo czujnika wynosi 1,5 mikromola. Po obejrzeniu tego filmu powinieneś dobrze zrozumieć, jak obrazować dynamikę metabolitów za pomocą czujników progowych. Nie zapominaj, że hodowla komórkowa powinna być traktowana odpowiednio zgodnie ze standardowymi procedurami operacyjnymi, aby zminimalizować ryzyko narażenia.