Name: Obrazowanie strumienia glutaminy za pomocą genetycznie kodowanych czujników (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-07-31T13:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 23 s
Description: Poznaj obrazowanie transportu glutaminy w żywych komórkach przy użyciu czujników FRET. Ta metoda umożliwia monitorowanie aktywności transporterów z wysoką rozdzielczością czasowo-przestrzenną.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

Ta praca była wspierana przez grant NIH 1R21NS064412, grant NSF 1052048 oraz grant Jeffress Memorial Trust J-908.

1. Przygotowanie próbki
Uwaga: W wielu przypadkach eksperymenty perfuzyjne zmywają znaczną część komórek, co może stać się frustrującym problemem. Chociaż nie jest to konieczne w przypadku wszystkich linii komórkowych, powlekanie szklanych powierzchni pokrywających poli-L-lizyną (dodać 1,0 ml/25cm2 0,01% roztworu do powierzchni, inkubować >5 min, przemyć dwukrotnie wodą do hodowli komórkowych i wysuszyć w komorze bezpieczeństwa biologicznego) zwiększa przyczepność komórek. Należy również pamiętać o poziomie bezpieczeństwa biologicznego (BSL) używanej linii komórkowej i postępować zgodnie ze standardową procedurą operacyjną zatwierdzoną przez lokalne biuro ds. zdrowia i bezpieczeństwa środowiskowego. W tym eksperymencie wykorzystano komórki cos7 ze względu na niską endogenną aktywność transportu glutaminy (patrz ryc. 4).
<ol>
	<li>Nasiona komórek cos7 przy ~ 70-80% zbiegu w zmodyfikowanym pożywce Dulbecco Eagle Medium (DMEM) + 10% kosmicznej surowicy cielęcej i 100 U / ml penicyliny / streptomycyny, albo na sterylnych 25 mm szklanych szkiełkach nakrywkowych umieszczonych w 6-dołkowym naczyniu hodowlanym lub 8-dołkowych szkiełkach ze szklanym dnem. Inkubować w temperaturze 37 °C, 5% CO2, 100% wilgotności przez 24 godziny.</li>
	<li>Zamień pożywkę wzrostową na DMEM +10% kosmicznej surowicy cielęcej (bez antybiotyków), zgodnie z protokołem producenta. Uprawiaj O/N w temperaturze 37 °C, 5% CO2 przy wilgotności 100%.</li>
	<li>Dodaj po 0,4 mg plazmidowego DNA kodującego czujnik glutaminy (pcDNA3.1, przenoszący czujnik FLIPQTV3.0 pod promotorem CMV 10) i znakowaną mCherry pożywką ASCT2 10 do 50 ml bez surowicy (OPTI-MEM) i delikatnie wymieszaj.</li>
	<li>Dodać 1 ml odczynnika do transfekcji do 50 ml pożywki bez surowicy. Inkubować w temperaturze pokojowej przez 5 minut.</li>
	<li>Zmieszać dwa roztwory zawierające DNA (krok 1.3) i odczynnik do transfekcji (etap 1.4) i inkubować przez 20 minut.</li>
	<li>Delikatnie dodaj odczynnik do transfekcji na wierzch komórek i delikatnie wymieszaj, kołysząc komorą. Inkubować przez 24 godziny w temperaturze 37 °C, 5% CO2, 100% wilgotności.</li>
	<li>Po 24 godzinach należy wymienić pożywkę na DMEM + 10% Cosmic Calf Serum (CCS) + 100 jednostek penicyliny/streptomycyny.</li>
	<li>Komórki są obrazowane 48-72 godziny po transfekcji.</li>
</ol>
2. Eksperyment perfuzyjny
Uwaga: Dla komórek cos7 użytych w tym eksperymencie, media perfuzyjne i komora były utrzymywane w stężeniu RT i otoczenia CO2. Jeśli jednak używane ogniwa wymagają wyższej temperatury i kontroli stężenia CO2 w celu przeżycia, należy użyć podgrzewanego stolika mikroskopowego i/lub komory środowiskowej.
<ol>
	<li>Przygotować bufor perfuzyjny A-F (patrz wykaz materiałów). Podłączyć kran do strzykawek o pojemności 50 ml, zamknąć kurki, a następnie napełnić je roztworami perfuzyjnymi. Otworzyć kran na krótki czas, aby wypełnić przestrzeń nad głową w kurku buforem.</li>
	<li>Włącz 8-kanałowy system perfuzyjny z zasilaniem grawitacyjnym za pomocą ołówka perfuzyjnego, a następnie wybierz "Tryb ręczny" w opcji Wybierz funkcję. Umieść pojemnik na odpady pod ołówkiem perfuzyjnym.</li>
	<li>Ręcznie aktywuj porty, naciskając odpowiednie cyfry i napełnij rurki za pomocą strzykawki o pojemności 10 ml zawierającej wodę, a następnie zamknij port. Po napełnieniu portów wodą należy ustawić strzykawki zawierające A-F na porcie 1-6 systemu perfuzyjnego, a następnie otworzyć kurki. Otwórz ponownie porty, aby zastąpić wodę w rurkach. Natężenie przepływu powinno wynosić około 0,8 ml/min.</li>
	<li>Naciśnij raz anuluj na kontrolerze perfuzji, aby wrócić do menu "Wybierz funkcję". Przełącz na opcję "Edytuj program", a następnie wpisz protokół perfuzji wskazany w Tabeli 1. Zapisz program perfuzyjny.</li>
	<li>Wyjmij komórki z inkubatora. Umyj dwukrotnie buforem perfuzyjnym, a następnie ustaw komórki na stoliku. Podłącz system perfuzyjny do komory. Jeśli używana jest otwarta komora, należy zainstalować inną pompę, która usuwa roztwór perfuzyjny z komory.</li>
	<li>Otwórz oprogramowanie Slidebook. Rozpocznij nowy slajd. 
	Uwaga: Poniższa procedura jest specyficzna dla oprogramowania Slidebook, ale inne oprogramowanie, takie jak MetaFluor i Nis-Element, może być również używane do opisanego tutaj typu obrazowania. Teoretycznie eksperymenty można przeprowadzać przy użyciu dowolnego oprogramowania, które umożliwia obrazowanie w czasie, a sekwencje obrazów można analizować po eksperymentie za pomocą oprogramowania takiego jak ImageJ (http://rsbweb.nih.gov/ij/) lub Fiji (http://fiji.sc/Fiji). Jednak oprogramowanie, które umożliwia monitorowanie w czasie rzeczywistym stosunku akceptorów do dawców, jest bardzo przydatne.</li>
	<li>Zamontuj szkiełko na stoliku mikroskopu fluorescencyjnego. Znajdź komórki współwyrażające czujnik i ASCT-mCherry za pomocą odpowiednich zestawów filtrów (patrz Lista materiałów) w funkcji "FOCUS". Dostosuj wzmocnienie, klikając zakładkę "Kamera" i przesuwając suwak pod "wzmocnienie". Dostosuj także ustawienie filtra o neutralnej gęstości z menu rozwijanego filtra o neutralnej gęstości. Uwaga: Jeśli kostka filtra nie zawiera filtra do oczu, nie używaj okularów, ponieważ światło wzbudzające o krótkiej długości fali jest szkodliwe dla oczu. Zamiast tego użyj ekranu komputera, aby znaleźć komórki.</li>
	<li>Uzyskaj obrazy komórek z kanałami donora (mTFP1)exdonora (mTFP1)em, dawcy (mTFP1) exakceptora (venus) em i akceptora (mTFP1) exakceptora (venus) em m (filtry są określone w Wykazie materiałów). Kliknij "Przechwytywanie obrazu", a następnie w oknie akwizycji określ filtry, które będą używane. Kliknij przycisk "TEST", aby dostosować czas ekspozycji, wpisując żądany czas ekspozycji w polu obok ustawień filtra. Uwaga: Wszystkie trzy kanały muszą być naświetlone na tej samej długości. Dostosowując parametry obrazowania, należy wziąć pod uwagę oczekiwaną zmianę wydajności FRET i wzrost krotności: na przykład, jeśli oczekuje się, że wydajność FRET wzrośnie 2-krotnie podczas eksperymentu, parametry obrazowania powinny być dostosowane tak, aby intensywność DonorexAcceptorem w stanie spoczynku wynosiła <50% maksymalnej wartości, która może być zarejestrowana przez instrument, tak, aby kanał ten nie uległ nasyceniu podczas eksperymentu. Sygnał z oznaczonych komórek powinien być co najmniej trzy razy wyższy niż w obszarze tła.</li>
	<li>Narysuj interesujący Cię region za pomocą narzędzia regionów w oprogramowaniu. Alternatywnie można użyć funkcji oprogramowania do wybierania pikseli powyżej określonej intensywności, a następnie przekonwertować je na regiony. Aby to zrobić, kliknij Maska – Segment, a następnie przesuń suwak, aby podświetlić żądane obszary.</li>
	<li>Wybierz "upływ czasu" w polu typu przechwytywania, a następnie określ interwał (10 sekund w tym eksperymencie) i punkty czasowe eksperymentu.</li>
	<li>Narysuj obszar w obszarze, w którym nie ma żadnych komórek fluorescencyjnych. Ten obszar jest używany do odejmowania tła. Kliknij prawym przyciskiem myszy narysowany region, a następnie ustaw go jako tło. Uwaga: Idealnie byłoby, gdyby komórki, które nie wyrażają czujników, były używane jako obszar tła, aby uwzględnić zarówno autofluorescencję, jak i fluorescencję tła wykrytą przez aparat. Jeżeli w polu widzenia nie ma takich komórek, do uwzględnienia fluorescencji tła należy użyć co najmniej obszaru bez tych komórek.</li>
	<li>Wybierz żądany program w opcji "Wybierz funkcję - Uruchom programy". Przełącz się na zapisany program (patrz krok 2.3), a następnie naciśnij ENTER na kontrolerze perfuzji. Teraz program jest załadowany, a naciśnięcie dowolnego rozpocznie perfuzję.</li>
	<li>Upewnij się, że perfuzja i eksperyment obrazowania rozpoczynają się w tym samym czasie, klikając przycisk "Start" w oknie przechwytywania w tym samym czasie, co naciśnięcie na kontrolerze perfuzji. 
	Uwaga: Zaleca się zapisanie punktu czasowego, w którym nastąpiła wymiana roztworów (można to zrobić za pomocą funkcji "UWAGI", która znajduje się w zakładce akwizycji).</li>
	<li>Wykonaj ten sam protokół perfuzji, używając komórek wyrażających czujnik, co do którego oczekuje się, że będzie nasycony lub niezwiązany w warunkach eksperymentalnych. 
	Uwaga: Tutaj FLIPQTV3.0_1,5 μ, który jest nasycony w warunkach eksperymentalnych, jest używany jako kontrola, rysunek 6. Takie eksperymenty kontrolne są niezbędne do potwierdzenia, że zmiana wydajności FRET jest spowodowana rzeczywistą zmianą podłoża, a nie zmianą innych parametrów, takich jak pH komórki.</li>
</ol>
3. Analiza po eksperymencie
<ol>
	<li>Sprawdź, czy podczas eksperymentu wystąpił dryf próbki. Narysuj obszary zainteresowania (ROI) na obrazie wykonanym w punkcie czasowym 0, a następnie przesuń przesuwany pasek w górnej części okna obrazowania i sprawdź, czy komórki wypadają z ROI na obrazach wykonanych w dalszej części eksperymentu.</li>
	<li>Jeśli tak, użyj funkcji śledzenia, aby skorygować dryf, najpierw tworząc maski wokół komórek, wybierając Maska – Segment, a następnie przesuń linię określającą odcięcie, aby podświetlić obszary zawierające komórki. Śledź regiony, klikając Maska – Śledzenie cząstek – Podstawowe śledzenie cząstek.</li>
	<li>W razie potrzeby ponownie narysuj ROI i region tła.</li>
	<li>Eksportuj średnią intensywność ROI w trakcie eksperymentu. Kliknij Statystyki – Eksport – Dane dotyczące współczynnika/timelapse.</li>
	<li>Gdy wydajność FRET i kwantyfikacja stężenia substratu nie jest konieczna, należy wykreślić przebieg w czasie współczynnika intensywności (DonorexAcceptorem, / DonorexDonorem) jako wskaźnik dynamiki substratu. Aby określić stężenie cytozolowe, należy obliczyć maksymalną i minimalną zmianę stosunku (tj. odpowiednio przy nasyceniu i braku substratu), Δrmax - Δrmin, przez nieliniową regresję Δratio (Δr) za pomocą następującego równania: 
	Δr = [S]/(Kd+[S]) x (Δrmax - Δrmin) + Δrmin 
	gdzie [S] jest stężeniem substratu w cytozolu. Na podstawie uzyskanych wartości Δrmax - Δrmin, nasycenie (S) czujnika przy danym Δr oblicza się jako 
	S = (Δr - Δrmin) / (Δrmax - Δrmin) 
	S można dalej przeliczyć na stężenie substratu [S] za pomocą następującego równania: 
	S = [S]/(Kd+[S]) 
	Uwaga: należy również wykreślić intensywność kanału AcceptorexAcceptorem w celu zbadania, czy warunki eksperymentalne wpłynęły bezpośrednio na fluorescencję akceptora.</li>
	<li>W przypadku zaobserwowania odchylenia linii bazowej spowodowanego wybielaniem fotograficznym należy wykonać korektę linii bazowej. Aby to zrobić, wykreśl intensywność dawcy i akceptora w czasie (Rysunek 5A). Następnie zidentyfikuj punkty czasowe użyte do linii bazowej, zgodnie z opóźnieniem w systemie perfuzji i aktywnością transportową danej komórki (ryc. 5B).</li>
	<li>Oblicz dopasowanie wielonominalne, które najlepiej opisuje linię bazową. Następnie znormalizuj surową intensywność od każdego punktu czasowego do linii bazowej (Rysunek 5C). Obliczyć współczynnik intensywności (DawcaexAkceptorem, / DawcaexDonorem) na podstawie znormalizowanej intensywności dawcy i akceptora.</li>
</ol>

<ol><li>Haussinger, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Regulation+of+hepatic+ammonia+metabolism%3A+the+intercellular+glutamine+cycle%5BTitle%5D)+AND+%22Adv+Enzyme+Regul%22%5BJournal%5D)">Regulation of hepatic ammonia metabolism: the intercellular glutamine cycle.</a> Adv Enzyme Regul. 25, 159-180 (1986).</li>
<li>Haussinger, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hepatic+glutamine+metabolism%5BTitle%5D)+AND+%22Beitr+Infusionther+Klin+Ernahr%22%5BJournal%5D)">Hepatic glutamine metabolism.</a> Beitr Infusionther Klin Ernahr. 17, 144-157 (1987).</li>
<li>Watford, M., Chellaraj, V., Ismat, A., Brown, P., Raman, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hepatic+glutamine+metabolism%5BTitle%5D)+AND+%22Nutrition%22%5BJournal%5D)">Hepatic glutamine metabolism.</a> Nutrition. 18, 301-303 (2002).</li>
<li>Mustroph, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Profiling+translatomes+of+discrete+cell+populations+resolves+altered+cellular+priorities+during+hypoxia+in+Arabidopsis%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+USA%22%5BJournal%5D)">Profiling translatomes of discrete cell populations resolves altered cellular priorities during hypoxia in Arabidopsis.</a> Proc Natl Acad Sci USA. 106, 18843-18848 (2009).</li>
<li>Sasagawa, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quartz-Seq%3A+a+highly+reproducible+and+sensitive+single-cell+RNA+sequencing+method%2C+reveals+non-genetic+gene-expression+heterogeneity%5BTitle%5D)+AND+%22Genome+Biol%22%5BJournal%5D)">Quartz-Seq: a highly reproducible and sensitive single-cell RNA sequencing method, reveals non-genetic gene-expression heterogeneity.</a> Genome Biol. 14, R31(2013).</li>
<li>Sabatini, B. L., Oertner, T. G., Svoboda, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+life+cycle+of+Ca%282%2B%29+ions+in+dendritic+spines%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">The life cycle of Ca(2+) ions in dendritic spines.</a> Neuron. 33, 439-452 (2002).</li>
<li>Okumoto, S., Jones, A., Frommer, W. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantitative+imaging+with+fluorescent+biosensors%5BTitle%5D)+AND+%22Annu+Rev+Plant+Biol%22%5BJournal%5D)">Quantitative imaging with fluorescent biosensors.</a> Annu Rev Plant Biol. 63, 663-706 (2012).</li>
<li>Newman, R. H., Fosbrink, M. D., Zhang, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genetically+encodable+fluorescent+biosensors+for+tracking+signaling+dynamics+in+living+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Chemical+reviews%22%5BJournal%5D)">Genetically encodable fluorescent biosensors for tracking signaling dynamics in living cells.</a> Chemical reviews. , 111-3666 (2011).</li>
<li>Okumoto, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Imaging+approach+for+monitoring+cellular+metabolites+and+ions+using+genetically+encoded+biosensors%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Opin+Biotech%22%5BJournal%5D)">Imaging approach for monitoring cellular metabolites and ions using genetically encoded biosensors.</a> Curr Opin Biotech. 21, 45-54 (2010).</li>
<li>Gruenwald, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Visualization+of+glutamine+transporter+activities+in+living+cells+using+genetically+encoded+glutamine+sensors%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Visualization of glutamine transporter activities in living cells using genetically encoded glutamine sensors.</a> PLoS One. 7, e38591(2012).</li>
<li>Chaudhuri, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Protonophore-+and+pH-insensitive+glucose+and+sucrose+accumulation+detected+by+FRET+nanosensors+in+Arabidopsis+root+tips%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+Journal%22%5BJournal%5D)">Protonophore- and pH-insensitive glucose and sucrose accumulation detected by FRET nanosensors in Arabidopsis root tips.</a> Plant Journal. 56, 948-962 (2008).</li>
<li>Chen, T. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ultrasensitive+fluorescent+proteins+for+imaging+neuronal+activity%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Ultrasensitive fluorescent proteins for imaging neuronal activity.</a> Nature. 499, 295-300 (2013).</li>
<li>Jiang, D. W., Zhao, L. L., Clapham, D. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genome-Wide+RNAi+Screen+Identifies+Letm1+as+a+Mitochondrial+Ca2%2B%2FH%2B+Antiporter%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Genome-Wide RNAi Screen Identifies Letm1 as a Mitochondrial Ca2+/H+ Antiporter.</a> Science. , 326-147 (2009).</li>
<li>Barnett, N. L., Pow, D. V., Robinson, S. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Inhibition+of+Muller+cell+glutamine+synthetase+rapidly+impairs+the+retinal+response+to+light%5BTitle%5D)+AND+%22Glia%22%5BJournal%5D)">Inhibition of Muller cell glutamine synthetase rapidly impairs the retinal response to light.</a> Glia. 30, 64-73 (2000).</li>
<li>Rothstein, J. D., Tabakoff, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Alteration+of+Striatal+Glutamate+Release+after+Glutamine-Synthetase+Inhibition%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurochem%22%5BJournal%5D)">Alteration of Striatal Glutamate Release after Glutamine-Synthetase Inhibition.</a> J Neurochem. 43, 1438-1446 (1984).</li>
<li>Gu, S., Villegas, C. J., Jiang, J. X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Differential+regulation+of+amino+acid+transporter+SNAT3+by+insulin+in+hepatocytes%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biol+Chem%22%5BJournal%5D)">Differential regulation of amino acid transporter SNAT3 by insulin in hepatocytes.</a> J Biol Chem. 280, 26055-26062 (2005).</li>
<li>Palmada, M., Speil, A., Jeyaraj, S., Bohmer, C., Lang, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+serine%2Fthreonine+kinases+SGK1%2C+3+and+PKB+stimulate+the+amino+acid+transporter+ASCT2%5BTitle%5D)+AND+%22Biochem+Bioph+Res+Co%22%5BJournal%5D)">The serine/threonine kinases SGK1, 3 and PKB stimulate the amino acid transporter ASCT2.</a> Biochem Bioph Res Co. 331, 272-277 (2005).</li>
<li>Bröer, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+astroglial+ASCT2+amino+acid+transporter+as+a+mediator+of+glutamine+efflux%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurochem%22%5BJournal%5D)">The astroglial ASCT2 amino acid transporter as a mediator of glutamine efflux.</a> J Neurochem. 73, 2184-2194 (1999).</li>
<li>Wallace, D. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single-spike+detection+in+vitro+and+in+vivo+with+a+genetic+Ca2%2B+sensor%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Single-spike detection in vitro and in vivo with a genetic Ca2+ sensor.</a> Nature. 5, 797-804 (2008).</li>
<li>Haugh, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Live-cell+fluorescence+microscopy+with+molecular+biosensors%3A+what+are+we+really+measuring%5BTitle%5D)+AND+%22Biophys+J%22%5BJournal%5D)">Live-cell fluorescence microscopy with molecular biosensors: what are we really measuring.</a> Biophys J. 102, 2003-2011 (2012).</li>
<li>San Martin, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+genetically+encoded+FRET+lactate+sensor+and+its+use+to+detect+the+Warburg+effect+in+single+cancer+cells%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">A genetically encoded FRET lactate sensor and its use to detect the Warburg effect in single cancer cells.</a> PLoS One. 8, e57712(2013).</li>
<li>Palmer, A. E., Tsien, R. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Measuring+calcium+signaling+using+genetically+targetable+fluorescent+indicators%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Protoc%22%5BJournal%5D)">Measuring calcium signaling using genetically targetable fluorescent indicators.</a> Nat Protoc. 1, 1057-1065 (2006).</li>
<li>Ponsioen, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Detecting+cAMP-induced+Epac+activation+by+fluorescence+resonance+energy+transfer%3A+Epac+as+a+novel+cAMP+indicator%5BTitle%5D)+AND+%22Embo+Rep%22%5BJournal%5D)">Detecting cAMP-induced Epac activation by fluorescence resonance energy transfer: Epac as a novel cAMP indicator.</a> Embo Rep. 5, 1176-1180 (2004).</li>
<li>Joseph, J., Seervi, M., Sobhan, P. K., Retnabai, S. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High+throughput+ratio+imaging+to+profile+caspase+activity%3A+potential+application+in+multiparameter+high+content+apoptosis+analysis+and+drug+screening%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">High throughput ratio imaging to profile caspase activity: potential application in multiparameter high content apoptosis analysis and drug screening.</a> PLoS One. 6, e20114(2011).</li>
<li>Jiang, D., Zhao, L., Clapham, D. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genome-wide+RNAi+screen+identifies+Letm1+as+a+mitochondrial+Ca2%2B%2FH%2B+antiporter%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Genome-wide RNAi screen identifies Letm1 as a mitochondrial Ca2+/H+ antiporter.</a> Science. 326, 144-147 (2009).</li>
<li>Ma, H., Gibson, E. A., Dittmer, P. J., Jimenez, R., Palmer, A. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High-throughput+examination+of+fluorescence+resonance+energy+transfer-detected+metal-ion+response+in+mammalian+cells%5BTitle%5D)+AND+%22J+Am+Chem+Soc%22%5BJournal%5D)">High-throughput examination of fluorescence resonance energy transfer-detected metal-ion response in mammalian cells.</a> J Am Chem Soc. 134, 2488-2491 (2012).</li>
</ol>

Nie ma nic do ujawnienia.

Powodzenie eksperymentów obrazowych zależy od kilku krytycznych czynników. Jednym z tych czynników jest powinowactwo zastosowanych czujników, jak omówiono powyżej. Bezwzględne stężenie substratu w interesującym przedziale subkomórkowym jest jednak często nieznane. Dlatego zalecamy wypróbowanie wielu czujników o rozłożonym powinowactwie, aby znaleźć ten, który działa najlepiej w pożądanych warunkach eksperymentalnych. Na przykład w naszym przypadku transfekowaliśmy komórki cos7 za pomocą czujników glutaminy o 1,5 μ, 100 μ...

Ze względu na niezwykły postęp w technologiach, które pozwalają na badanie transkryptomu i proteomu na poziomie komórkowym, stało się teraz jasne, że biochemia i wynikający z niej strumień metabolitów i jonów są wysoce specyficzne dla typu komórki. Na przykład w wątrobie ssaków sekwencyjna degradacja i synteza glutaminy odbywa się jednocześnie odpowiednio przez komórki okołowrotne i komórki okołożylne, dostarczając amonu do cyklu mocznikowego w pierwszym typie komórki, zużywając nadmiar amoniaku w drugim 1-3. W niektórych przypadkach wykrywa się znaczną heterogeniczność biochemiczną nawet w pojedynczym "typie komórki" 4,5. Oprócz takiej specyficzności przestrzennej, poziomy komórkowe metabolitów i jonów są wysoce dynamiczne (np. cząsteczki sygnałowe, takie jak Ca2+ i cykliczne nukleotydy). Czasoprzestrzenne wzorce metabolitów i jonów często odgrywają kluczową rolę w transdukcji sygnału. Monitorowanie dynamiki komórkowej metabolitów i jonów stanowi jednak wyjątkowe wyzwanie. W wielu przypadkach zmiany stężeń są szybkie i przemijające, czego przykładem jest przypadek cząsteczek sygnałowych, takich jak Ca2+, które rozpadają się w ciągu ~20 ms w kolcach dendrytycznych 6. Ponadto podział szlaków biochemicznych w komórkach i między nimi utrudnia ilościowe określenie dynamiki metabolitów i jonów przy użyciu technik ekstrakcji i chromatografii kolumnowej/spektrometrii mas.
Genetycznie kodowane czujniki dla cząsteczek biologicznych są teraz szeroko stosowane ze względu na wysoką rozdzielczość czasoprzestrzenną, która pozwala eksperymentatorowi badać krótkotrwałą i/lub podzieloną na przedziały dynamikę molekularną (omówione w 7,8). Te genetycznie kodowane czujniki można z grubsza podzielić na dwie kategorie; czujniki oparte na intensywności i czujniki ratiometyczne. Czujniki oparte na intensywności zazwyczaj składają się z domeny wiążącej i białka fluorescencyjnego (FP), a wiązanie substancji rozpuszczonej z domeną wiązania zmienia intensywność fluorescencji. Z drugiej strony czujniki ratiometyczne często wykorzystują rezonansowy transfer energii Föster (FRET) między dwoma FP, które działają jako para FRET. Czujniki te składają się z domeny wiązania i dwóch FP, a wiązanie substancji rozpuszczonej indukuje zmianę wydajności FRET między dwoma FP. W ciągu ostatniej dekady opracowano dużą liczbę czujników metabolitów i jonów o znaczeniu biologicznym 8,9.
Jedną z ekscytujących możliwości oferowanych przez takie genetycznie kodowane czujniki jest ich wykorzystanie w wysokorozdzielczej analizie procesów transportu błonowego, co wcześniej nie było łatwe do wykrycia na poziomie komórkowym. Genetycznie kodowane czujniki ułatwiają analizę mechanizmów transportu, takich jak specyficzność substratu i zależność od pH 10,11. Co więcej, w połączeniu z zasobami genetycznymi, takimi jak biblioteka konstruktów RNAi dla organizmów modelowych, możliwe jest obecnie prowadzenie ogólnogenomowych poszukiwań nowych procesów transportowych przy użyciu genetycznie kodowanych czujników. Rzeczywiście, zastosowanie genetycznie kodowanego czujnika doprowadziło do odkrycia wcześniej niescharakteryzowanych transporterów w wielu przypadkach 12,13.
Ostatnio nasze laboratorium opracowało serię czujników glutaminy opartych na FRET. Wykazaliśmy, że poziomy glutaminy w komórkach można wizualizować za pomocą takich czujników glutaminy FRET 10. Czujniki te składają się z donora FRET (mTFP1) wprowadzonego do bakteryjnego białka wiążącego glutaminę glnH oraz akceptora FRET (wenus) na C-końcach glnH (ryc. 1). Wydajność FRET tych czujników zmniejsza się po związaniu glutaminy, co skutkuje zmniejszeniem stosunku intensywności akceptora do dawcy. Precyzyjna regulacja procesów transportu glutaminy jest ważna w procesach biologicznych, takich jak neuroprzekaźnictwo 14,15 i utrzymanie cyklu mocznikowego w wątrobie 1,16,17.
Tutaj pokazujemy metodologię analizy działań transportowych za pomocą czujników FRET dla glutaminy, przy użyciu zestawu mikroskopu fluorescencyjnego o szerokim polu. Celem pokazanych tutaj eksperymentów jest wykrycie aktywności transportera w pojedynczej komórce i zbadanie specyficzności substratowej transportera o przejściowej ekspresji.

<table><tbody><tr><td>Odwrócony mikroskop fluorescencyjny</td><td>Olympus</td><td>IX81F-3-5</td><td>Odpowiedni byłby również równoważny odwrócony mikroskop fluorescencyjny od innych dostawców.</td></tr><tr><td>Filtr wzbudzenia (mTFP1)</td><td>Omega Optical</td><td>3RD450-460</td><td>Szerokość pasma 450-460 nm</td></tr><tr><td>Filtr wzbudzenia (Venus)</td><td>Chroma</td><td>ET500/20</td><td>Szerokość pasma 490-510 nm</td></tr><tr><td>Filtr emisji (mTFP1)</td><td>Chroma</td><td>HQ495/30m</td><td>Szerokość pasma 475-505 nm</td></tr><tr><td>Filtr emisyjny (Venus)</td><td>Chroma</td><td>ET535/30m</td><td>Szerokość pasma 520-550 nm</td></tr><tr><td>Lustro dichroiczne (kanały FRET)</td><td>Chroma</td><td>470dcxr</td><td>Długoprzepustowa, 470 nm odcięte</td></tr><tr><td>Lustro dichroiczne (kanał YFP)</td><td>Chroma</td><td>89002bs</td><td>Przechodzi 445-490 nm, 510-560 nm, 590-680 nm</td></tr><tr><td>mZestaw filtrów</td> wiśniowych <td>Chroma</td><td>49008</td><td>Wzbudzenie 540-580 nm, dichroiczne długie przepusty z odcięciem 585 nm, filtr emisyjny 595-695 nm</td></tr><tr><td>Źródło światła</td><td>Olympus</td><td>U-LH100L-3-5</td><td>Źródło światła LED lub halogenowe, które wytwarza stabilne natężenie światła, lampy rtęciowe nie są zalecane</td></tr><tr><td>Kamera CCD</td><td></td><td>Qimaging Rolera-MGi EMCCD</td><td></td></tr><tr><td>Apochromatyczny obiektyw fluorescencyjny</td><td>Olympus</td><td></td><td></td></tr><tr><td>System perfuzyjny, ValveBank II</td><td>AutoMate Scientific</td><td>[01-08]</td><td>Inne systemy perfuzyjne, które umożliwiają szybką wymianę roztworu, również działałyby</td></tr><tr><td>w komorach laminarnych</td><td>C& L Instruments</td><td>VC-MPC-TW</td><td>Inne komory larmino-przepływowe również by się sprawdziły.</td></tr><tr><td>Prowadnica komorowa</td><td>Lab-Tek</td><td>154534</td><td>Do eksperymentów w otwartej komorze Pompa</td></tr><tr><td>perfuzyjna</td><td>Thermo Scientific</td><td>74-046-12131</td><td>Do eksperymentów w komorze otwartej</td></tr><tr><td>Oprogramowanie wspomagające pomiary ratiometryczne</td><td>Intellegenent Imaging</td><td>Innovation Slidebook 5.5</td><td></td></tr><tr><td>Szafa bezpieczeństwa biologicznego z przepływem laminarnym</td><td>ESCO</td><td>LA-3A2</td><td></td></tr><tr><td>Isotemp CO2 Inkubator</td><td>Thermo Scientific</td><td>13-255-25</td><td></td></tr><tr><td>Hyklon Dulbecco's MEM (DMEM)</td><td>Hyclon</td><td>SH30243.01</td><td></td></tr><tr><td>Kosmiczna surowica cielęca</td><td>Hyklon</td><td>SH3008703</td><td></td></tr><tr><td>Penicylina/streptomycyna</td><td>Podłoże</td><td></td> higieniczne SV30010 <td></td></tr><tr><td>Bez surowicy do transfekcji (OPTI-MEM I)</td><td>Invitrogen</td><td>31985</td><td>Stosowany z Lipofectaminą 2000</td></tr><tr><td>Roztwór poli-L-lizyny</td><td>Sigma</td><td>P4707</td><td></td></tr><tr><td>25 mm okrągłe szklane szkiełka nakrywkowe</td><td>Thermo Scientific</td><td>12-545-102</td><td>W przypadku zastosowania VC-MPC-TW</td></tr><tr><td>Lipofectamine 2000</td><td>Invitrogen</td><td>11668027</td><td>Można również stosować inne odczynniki do transfekcji.</td></tr><tr><td>Roztwór A (bufor Hanka)</td><td></td><td></td><td>9,7 g soli HANK (Sigma H1387), 0,35 g NaHCO3, 5,96 g HEPES do 1 l, pH dostosowane do 7,35 z NaOH</td></tr><tr><td>roztwór B</td><td></td><td></td><td>Roztwór A + 0,04 mM</td></tr><tr><td>Gln Roztwór C</td><td></td><td></td><td>Roztwór A + 0,2 mM Gln</td></tr><tr><td>Roztwór D</td><td></td><td></td><td>Roztwór A + 1 mM Roztwór</td></tr><tr><td>E</td><td></td><td></td><td>Roztwór A + 5 mM Gln</td></tr><tr><td>Roztwór F</td><td></td><td></td><td>Roztwór A + 5 mM Ala</td></tr></tbody></table>

obrazowanie strumienia glutaminy za pomocą genetycznie kodowanych czujników

Glutamine Flux Imaging Using Genetically Encoded Sensors

Genetycznie kodowane czujniki umożliwiają monitorowanie cząsteczek biologicznych w czasie rzeczywistym w rozdzielczości subkomórkowej. W ciągu ostatnich 15 lat pojawiła się ogromna różnorodność takich czujników cząsteczek biologicznych, z których niektóre stały się niezbędnymi narzędziami używanymi rutynowo w wielu laboratoriach.
Jednym z ekscytujących zastosowań genetycznie kodowanych czujników jest wykorzystanie tych czujników do badania procesów transportu komórkowego. Właściwości transporterów, takie jak kinetyka i specyficzność substratu, mogą być badane na poziomie komórkowym, co stwarza możliwości analiz aktywności transportowych specyficznych dla danego typu komórki. W tym artykule pokażemy, w jaki sposób można zaobserwować dynamikę transportera na przykładzie genetycznie kodowanego czujnika glutaminy. Omówiony zostanie projekt eksperymentu, szczegóły techniczne warunków eksperymentalnych oraz rozważania dotyczące analiz poeksperymentalnych.

Typowe eksperymenty przebiegu czasowego przedstawiono na Rysunku 2. W doświadczeniach tych sensory FRET dla glutaminy o powinowactwie 8 mM (FLIPQTV3.0_8m, Rysunek 2A i 2B) oraz 100 μM (FlipQTV3.0_100 μ C i D) koeksprymowano z obligatoryjnym wymiennikiem aminokwasów ASCT2 18 w komórkach Cos7 10. Napływ glutaminy wykrywano jako zmianę stosunków intensywności fluorescencji między donorem (mTFP1) a akceptorem (Venus) (Rysunek 2A i <stro...

Ten artykuł pokaże, jak monitorować dynamikę glutaminy w żywych komórkach za pomocą FRET. Genetycznie kodowane czujniki umożliwiają monitorowanie cząsteczek biologicznych w czasie rzeczywistym w rozdzielczości subkomórkowej. Omówiony zostanie projekt eksperymentu, szczegóły techniczne warunków eksperymentalnych oraz rozważania dotyczące analiz poeksperymentalnych dla genetycznie kodowanych czujników glutaminy.

Obrazowanie strumienia glutaminy za pomocą genetycznie kodowanych czujników

Genetically encoded sensors allow real-time monitoring of biological molecules at a subcellular resolution. A tremendous variety of such sensors for ...

Ogólnym celem niniejszej procedury jest obrazowanie transportu glutaminy za pomocą heterologicznie ekspresowanego transportera w żywych komórkach z wykorzystaniem czujników transferu energii w rezonansie (FRET). Jest to realizowane poprzez uprzednią transfekcję komórek COS-7 czujnikiem glutaminy oraz transporterem. Czujnik składa się z donora FRET wstawionego w bakteryjne białko wiążące glutaminę oraz akceptora FRET znajdującego się na koniec C-terminalnym białka wiążącego glutaminę.Drugim krokiem jest przygotowanie systemu perfuzji oraz obrazowanie komórek w czasie rzeczywistym przy użyciu odwróconego mikroskopu fluorescencyjnego. Ostatnim krokiem jest analiza obrazów i wizualizacja dynamiki glutaminy. W rezultacie, dzięki zastosowaniu tych sensorów FRET, możliwe jest wykrycie aktywności transporterów w pojedynczej komórce.Główną zaletą tej techniki w porównaniu z istniejącymi metodami, takimi jak pomiary oparte na chromatografii, jest znacznie wyższa rozdzielczość czasowo-przestrzenna. Technika ta składa się z trzech części: transfekcji komórek białkami sensorowymi, obrazowania w czasie rzeczywistym oraz analizy poeksperymentalnej. W tym eksperymencie zastosowano siedem komórek z

glutamine-flux-imaging-using-genetically-encoded-sensors

Research

JoVE Journal

Bioengineering

Bioinżynieria

Obrazowanie przepływu glutaminy z wykorzystaniem genetycznie zakodowanych czujników

Opisano procedurę hodowli w środowisku ciekłym oraz rozdziału szczepów C. elegans wykazujących ekspresję fluorescencyjnych białek reporterowych, która nie wymaga użycia kosztownego sprzętu do sortowania. Podejście to można zastosować w przypadku licznych indukowalnych genów C. elegans w celu odkrywania leków lub biosensingu zanieczyszczeń.

Przesiewanie wysokoprzepustowe i biosensing z wykorzystaniem fluorescencyjnych szczepów C. elegans

Ten film demonstruje ocenę uwalniania i usuwania glutaminianu w pojedynczych synapsach korowo-prążkowych w wycinku mózgu myszy. Stymulacja elektryczna ułatwia uwalnianie glutaminianu w synapsie. Uwolniony glutaminian zmienia fluorescencję białka czujnika, która zanika z czasem, wskazując na skuteczność uwalniania i klirensu.

Analiza uwalniania i klirensu glutaminianu w pojedynczej synapsie neuronu w wycinku mózgu myszy

Przedstawiono opis kalibracji zintegrowanych czujników biologicznych (FIBS) Förster Resonance Energy Transfer do profilowania metabolicznego in situ. FIBS może być używany do pomiaru wewnątrzkomórkowych poziomów metabolitów w sposób nieinwazyjny, pomagając w rozwoju modeli metabolicznych i wysokoprzepustowych badaniach przesiewowych warunków bioprocesowych.

Nieinwazyjne profilowanie metaboliczne z wykorzystaniem FIBS

Ten manuskrypt opisuje użycie genetycznie kodowanych reporterów fluorogenicznych w zastosowaniu obrazowania żywych komórek do badania stresu oksydacyjnego wywołanego ksenobiotykami. To eksperymentalne podejście oferuje niezrównaną rozdzielczość czasoprzestrzenną, czułość i swoistość, unikając jednocześnie wielu niedociągnięć konwencjonalnych metod stosowanych do wykrywania toksykologicznego stresu oksydacyjnego.

Obrazowe podejścia do oceny toksykologicznego stresu oksydacyjnego przy użyciu genetycznie kodowanych czujników fluorogennych

Celem tego protokołu jest ułatwienie badania receptorów NMDA (NMDAR) na większą skalę i umożliwienie badania modulacyjnych efektów małych cząsteczek i ich zastosowań terapeutycznych.

Wysokoprzepustowy test strumienia wapnia do badania receptorów NMDA z wrażliwością na glicynę/D-serynę i glutaminian

Czujnik percepcji gibereliny 1 (GPS1) jest pierwszym biosensorem opartym na transferze energii rezonansu Förstera do pomiaru poziomów komórkowych fitohormonów gibereliny z wysoką rozdzielczością czasoprzestrzenną. Protokół ten przedstawia metodę wizualizacji i ilościowego określania poziomów gibereliny komórkowej przy użyciu genetycznie kodowanego biosensora nlsGPS1 w hipokotylach Arabidopsis i wierzchołkach korzeni.

Wizualizacja poziomów gibereliny komórkowej za pomocą biosensora rezonansowego transferu energii (FRET) nlsGPS1 Förster

Zewnątrzkomórkowa systemowa sygnalizacja wapniowa wywołana glutaminianem jest kluczowa dla indukcji reakcji obronnych roślin na mechaniczne zranienia i ataki roślinożerców u roślin. W artykule opisano metodę wizualizacji przestrzennej i czasowej dynamiki obu tych czynników przy użyciu roślin Arabidopsis thaliana wykazujących ekspresję wrażliwych na wapń i glutaminian biosensorów fluorescencyjnych.

Szerokokątne obrazowanie w czasie rzeczywistym lokalnych i układowych sygnałów rany u rzodkiewnika

Wychwyt glukozy jest zwiększony w neuronach ruchowych Drosophila dotkniętych proteinopatią białka wiążącego DNA TAR (TDP-43), na co wskazuje genetycznie kodowany czujnik glukozy oparty na FRET.

Pomiar wychwytu glukozy w modelach proteinopatii TDP-43 u drosophila

Ten artykuł opisuje protokół do określania różnic w podstawowym stanie redoks i redoks odpowiedzi na ostre perturbacje w pierwotnych neuronach hipokampa i kory mózgowej za pomocą konfokalnej mikroskopii na żywo. Protokół może być stosowany do innych typów komórek i mikroskopów przy minimalnych modyfikacjach.

Obrazowanie na żywo mitochondrialnego stanu redoks glutationu w neuronach pierwotnych przy użyciu wskaźnika ratiometrycznego

Ten protokół przedstawia standardowy przepływ wysokowydajnego przesiewania dla mikroorganizmów przemysłowych. Obejmuje ono konstruowanie biblioteki mutantów poprzez mutagenezę ARTP, przeprowadzanie pozytywnego przesiewania kropel za pomocą zautomatyzowanych mikrofluidów i następnie weryfikację wyników. Niezawodność przepływu została zweryfikowana poprzez przesiewanie wysokowydajnych szczepów B. coagulans.

Przesiewowe badanie wysokowydajne mutantów Bacillus coagulans hiperprodukujących kwas L-mlekowy za pomocą zautomatyzowanej platformy mikrofluidycznej kroplowej

Poznaj obrazowanie transportu glutaminy w żywych komórkach przy użyciu czujników FRET. Ta metoda umożliwia monitorowanie aktywności transporterów z wysoką rozdzielczością czasowo-przestrzenną.

Obrazowanie strumienia glutaminy za pomocą genetycznie kodowanych czujników

Przeglądaj więcej filmów