Analiza uszkodzeń nabłonka wywołanych zakażeniem Entamoeba histolytica

Ogólnym celem tej procedury jest ocena wczesnych interakcji patogenów gospodarza i potencjału inwazji TBA. Histolytica. Najpierw przygotuj nienaruszone trofozoity, trofozoity, lizaty ogółem lub wydzielane trofozoity. Następnie inkubuj komórki nabłonka gospodarza z odpowiednimi stężeniami różnych trofozoitów.

Teraz, korzystając z immunofluorescencji AM, przeanalizuj traktowane kultury nabłonkowe pod kątem wybranych białek ABA histolytica, które oddziałują ze ścisłymi połączeniami komórek nabłonka, a także mierz zmiany bariery parakomórkowej za pomocą transnabłonkowego oporu elektrycznego. Podsumowując, uzyskane wyniki mogą wykazać demontaż złączy ścisłych przez TBA Histolytica, a także wskazać udział wybranych kompleksów w tym procesie. Kluczowymi zaletami tej techniki jest wykorzystanie różnych produktów pasożyta do oceny translokacji czynników Eva histo do nabłonka gospodarza, a także do wykazania udziału tych czynników eva.

Jego czynniki na otwarcie połączeń całych komórek w bardzo wczesnym okresie infekcji. Metoda ta może pomóc odpowiedzieć na kluczowe pytania w dziedzinie ameba ywności, takie jak zrozumienie interakcji molekularnych między nabłonkiem a pasożytem diva isli. Ogólnie rzecz biorąc, osoby nowe w tej metodzie będą miały trudności, ponieważ nie znają odpowiedniej proporcji czasów inkubacji dwóch czasów inkubacji do koinkubacji, a także jak uzyskać różne produkty ELI i jak mierzyć TER.

Implikacje tej techniki rozciągają się na naszą terapię amis, ponieważ te czynniki wirowe, takie jak kompleks E-H-C-P-A-D-H 112, mogą być wykorzystane jako cele w nowych strategiach leczenia. Cztery. Ta metoda in vitro może dostarczyć informacji na temat udziału czynnika wirusa Anica w początkowej interakcji w miejscu szpitala. Może być również stosowany w innych systemach, takich jak inbivo, modele infekcji u myszy chomików, świnek morskich, a także w biopsjach jelit ludzkich. Kultura.

Komórki MDCK w 10 mililitrach uzupełnionego podłoża DMEM o stężeniu 5% dwutlenku węgla i temperaturze 37 stopni Celsjusza. Autentycznie rosną jeden razy 10 do piątych trofozoitów ameby histolytica w 15 mililitrach TYIS 33, pożywka w temperaturze 37 stopni Celsjusza. Aby odłączyć trofozoity, schłodź rurkę przez pięć do 10 minut w lodowatej kąpieli wodnej.

Następnie przenieś kulturę w sposób aseptyczny do stożkowej probówki i odwiruj w temperaturze 360 razy G przez 10 minut w temperaturze czterech stopni Celsjusza. Teraz ostrożnie zdekantuj supernatant. Dodaj lodowaty PBS do osadu i kilkakrotnie odwróć probówkę, aby rozproszyć komórki po odwirowaniu.

Określ liczbę trofozoitów za pomocą hemocytometru, aby ługować trofozoity, zatrzaskowo zamroź w ciekłym azocie na jedną minutę, rozmrozić w temperaturze czterech stopni Celsjusza i energicznie wirować. Teraz aktywuj proteazy obecne w lizatach za pomocą 0,02% beta merkaptoetanolu. Rozcieńczyć dziewięć razy 10 do sześciu trofozoitów w trzech mililitrach lodowatego PBS i przenieść komórki do 50-mililitrowej stożkowej probówki.

Teraz umieść zawiesinę tropho pod kątem poziomym pod kątem pięciu stopni w inkubatorze o temperaturze 37 stopni Celsjusza na dwie godziny, aby zebrać wydzielane produkty, odwiruj probówkę pod ciśnieniem 360 razy G przez 10 minut. Za pomocą jednorazowej i sterylnej strzykawki ostrożnie zebrać supernatant, unikając zanieczyszczenia próbek trofozoitami z osadu. Następnie, aby wyeliminować wszelkie przeniesione komórki, przepuść supernatant przez membranę z octanu celulozy o grubości 0,22 mikrona.

Teraz aktywuj proteazy za pomocą 0,02% beta merkaptoetanolu do hodowli immunofluorescencyjnej. Komórki MDCK na sterylnej szklanej pokrywie wsuwa się do 24-dołkowego naczynia do hodowli komórkowych. Sprawdź komórki pod mikroskopem odwróconym, aż osiągną 100% zbieżności.

Dodaj różne warunki trofozoitów rozcieńczonych w jednym mililitrze ciepłego PBS. Uwzględnij warunki kontrolne komórek MDCK z PBS i no e histolytica, a także komórek MDCK z różnymi stanami trofozoitów, ale emitujących inkubację z przeciwciałami pierwotnymi. Umieść płytkę hodowlaną w inkubatorze na dwie lub 30 minut.

Następnie przemyj komórki nabłonka pięć razy zimnym PBS, aby wyeliminować niezwiązane cząsteczki lub trofozoity. Napraw i permeuj komórki jednym mililitrem 96% etanolu przez kilka minut w temperaturze minus 20 stopni Celsjusza w wilgotnej komorze. Ostrożnie wyjmij szkiełka pokrywy ze studzienek.

Usuń nadmiar płynu z krawędzi za pomocą bibuły filtracyjnej i zanurz szkiełko nakrywkowe z komórkami skierowanymi w dół w 0,5% roztworze blokującym BSA. Próbki należy inkubować przez godzinę w temperaturze pokojowej. W międzyczasie przygotuj mieszaninę przeciwciał pierwszorzędowych w PBS.

Podnieś szkiełka nakrywkowe z roztworu blokującego. Wysuszyć nadmiar płynu na bibule filtracyjnej. Przenieś komórki do roztworu przeciwciała i inkubuj próbki przez noc w temperaturze czterech stopni Celsjusza.

Umyj komórki pięć razy jednym mililitrem PBS, aby usunąć niezwiązane cząsteczki. Teraz przygotuj mieszaninę dwóch fluorescencyjnych przeciwciał drugorzędowych w PBS. Próbki należy inkubować w przeciwciałach drugorzędowych przez jedną godzinę w temperaturze pokojowej w ciemności w celu barwienia jądrowego.

Inkubować komórki przez trzy minuty z 200 mikrolitrami 0,05 milimolowego roztworu dappy w temperaturze pokojowej w ciemności. Teraz przeanalizuj preparaty za pomocą mikroskopii konfokalnej przez sekcje Zacka i płaszczyzny XZ w eksperymentach inkubacyjnych. Używając inhibitorów proteazy lub specyficznego przeciwciała, inkubować każdy warunek eksperymentalny przez 20 minut w temperaturze czterech stopni Celsjusza z inhibitorami proteazy lub hodowlą przeciwciał monoklonalnych.

Komórki MDCK na sterylnych przepuszczalnych nośnikach transwell w górnej komorze umieścić 100 mikrolitrów zawiesiny komórkowej, a w dolnej komorze umieścić 600 mikrolitrów uzupełnionej pożywki DMEM. Umieść przygotowane filtry transwell w inkubatorze pod mikroskopem odwróconym. Sprawdź, czy komórki są w 100% zlewne.

Zebrać i zebrać pożywkę z górnej komory każdej transwell do 50 mikrolitrów tej mieszaniny pożywki. Dodaj 50 mikrolitrów zawiesiny trofozoitów lub kontroli PBS. Teraz przenieś mieszaniny do górnej komory każdej transstułki zawierającej komórki MDCK.

Natychmiast zanurz dwie elektrody STX w każdym transwellu, aby zmierzyć transnabłonkowy opór elektryczny. Upewnij się, że dłuższa elektroda dotyka dna dolnej komory, a krótsza elektroda jest pokryta medium w górnej komorze. E. histolytica hodowano w warunkach akcentu i zbierano w późnej logarytmicznej do wczesnej stacjonarnej fazie wzrostu.

W tym przypadku marker połączenia ścisłego zero jeden został użyty do wizualizacji kontaktów komórkowych komórek nabłonkowych, które są stabilizowane przez połączenia ścisłe i adherencyjne. Immunofluorescencję z przeciwciałem monoklonalnym wykorzystano do zbadania interakcji kompleksu pochodzącego z ameby z powierzchnią nabłonka, zastosowanie trofozoitów, trofozoitów, lizatów całkowitych lub produktów wydzielanych do monowarstwy nabłonka spowodowało kolokalizację kompleksu o ścisłym połączeniu. Po 30 minutach na granicach komórek rozwinęło się nieciągłe barwienie ZO one i internalizacja w pęcherzykach.

Zakłócenie to było najbardziej widoczne w kontaktach komórek MDCK z trofozoitami i trofozoitami. Całkowita lizata konfokalna mikroskopia laserowa wykazała, że kompleks wirulencji przenikał w kierunku przestrzeni międzykomórkowej. Współlokując się z zakłóconym kontaktem z pasożytem barwiącym, zakłóciło funkcję bariery nabłonkowej i spowodowało 90% spadek oporu elektrycznego nabłonka trans.

Wstępna inkubacja trofozoitów z przeciwciałem przeciwko kompleksowi lub z inhibitorami proteazy spowodowała ochronę przed pobranym kroplą Ter. Razem. Dane te sugerują, że zarówno aktywność proteolityczna, jak i właściwości adhezyjne są ważnymi czynnikami wirulencji tego kompleksu podczas inwazji e histolytica. Po obejrzeniu tego filmu powinieneś dobrze zrozumieć, jak analizować mechanizmy, za pomocą których wirus EMBA histolytica w czynnikach otwiera ścisłe połączenia we wczesnym okresie infekcji Kiedy opanujesz tę analizę uszkodzenia nabłonka można przeprowadzić w ciągu trzech godzin, gdy produkty lya i hodowle komórkowe są gotowe.

Podczas wykonywania tej procedury należy pamiętać o przestrzeganiu dokładnych czasów interakcji jonów Postępując zgodnie z tą procedurą. Inne metody, takie jak testy immunoprecypitacyjne, można wykonać, aby odpowiedzieć na dodatkowe pytania, takie jak możliwe powiązania między enba, czynnikami przemocy histolytica i białkami nabłonkowymi po jego rozwoju. Technika ta utorowała drogę naukowcom zajmującym się interakcjami alside do zbadania patogenezy AMS u myszy chomików, świnek morskich i tkanek ludzkich.