Name: Analiza uszkodzeń nabłonka wywołanych zakażeniem Entamoeba histolytica (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-06-12T14:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 49 s
Description: Poznaj metodę analizy uszkodzeń nabłonka wywołanych zakażeniem Entamoeba histolytica przy użyciu immunofluorescencji i pomiaru oporności elektrycznej. Technika ta pozwala badać wczesne interakcje pasożyta z komórkami gospodarza.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Ta praca była wspierana przez granty z Instytutu Nauki i Technologii Dystryktu Federalnego (ICyTDF, 64/2012 dla EO) oraz Meksykańskiej Rady ds. Nauki i Technologii (Conacyt, 179895 do MS).

1. Zakładanie i utrzymywanie kultur E. histolytica
<ol>
	<li>Rosnąć aksenicznie (całkowicie wolne od wszelkich innych organizmów skażających) 1 x 105 trofozoitów szczepu Entamoeba histolytica HMl:IMSS klon A 18 w probówkach hodowlanych16 x 125 mm z nakrętkami teflonowymi (lub 1 x 106 trofozoitów w jednorazowej kolbie T-25) i 15 ml (lub 50 ml w kolbie T-25) podłoża TYI-S-33 (bulion TYI uzupełniony 3% mieszanką witamin diamentowych, 10% inaktywowanej termicznie surowicy dorosłego bydła, 0,5 j.m./ml penicyliny i 35 μg/ml streptomycyny)19 w inkubatorze w temperaturze 37 °C.</li>
	<li>Trofozoity należy zbierać w logarytmicznej fazie wzrostu, zwykle w odstępach 48-96 godzin (ryc. 1), schładzając probówki hodowlane przez 5-10 minut w łaźni lodowo-wodnej w celu uwolnienia trofozoitów przyczepionych do szklanej probówki hodowlanej.</li>
	<li>Przenieś kulturę do stożkowej probówki i odwróć ją kilka razy, aby rozproszyć komórki. Określić liczbę komórek za pomocą hemocytometru (komora Neubauera) i przenieść inokulum do probówki hodowlanej zawierającej świeżą pożywkę TYI-S-33.
	<ol>
		<li>Używaj małej liczby ameb na dłuższe okresy inkubacji (~3 x 105 komórek przez ~5 dni) i większej liczby na krótsze okresy (~1 x 10,6 komórek na ~1 dzień). Podczas gdy zliczone inokulacje są pożądane, ustalone kultury stają się przewidywalne, dzięki czemu możliwe jest oszacowanie ilości inokulacji.</li>
		<li>Miareczkowanie ilości trofozoitów, aby zoptymalizować liczbę komórek dla każdego eksperymentu.</li>
		<li>Utrzymuj równoległą zduplikowaną hodowlę, aby mieć kopię zapasową w przypadku niezamierzonego zanieczyszczenia lub pęknięcia rurki.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Szczelnie zakryj probówki i inkubuj je w temperaturze 37 °C pod kątem 5° w poziomie.</li>
	<li>Regularnie sprawdzaj kultury poprzez oględziny, ponieważ nadmierny wzrost kultury może zawierać wiele zlizowanych komórek.</li>
</ol>
2. Ustanowienie i utrzymanie kultury MDCK
<ol>
	<li>Hodować komórki MDCK (Madin Darby Canine Kidney) typu I (wysoka odporność) w jednorazowych kolbach T-75 z 10 ml pożywki DMEM uzupełnionej penicyliną (100 j.m./ml), streptomycyną (100 mg/ml), insuliną (0,08 U/ml) i 10% surowicą cieląt noworodków w wilgotnej atmosferze 5% CO2 i 95% powietrza w temperaturze 37 °C.</li>
	<li>Aby podzielić komórki, sprawdź je pod odwróconym mikroskopem. Podziel komórki, gdy są ~ 85-100% zlewne.</li>
	<li>Użyj aspiratora próżniowego w sterylnym kapturze i sterylnej szklanej pipety Pasteura, aby usunąć pożywkę z kultury. Aby uniknąć skrobania komórek, odwróć kolbę do góry nogami i zasysaj pożywkę z dolnego rogu.</li>
	<li>Dozować 10 ml podgrzanego PBS (140 mM NaCl, 2,7 mM KCl, 10 mM Na2HPO4, 1,8 mM KH2PO4, pH 7,4) do kolby T-75 (5 ml w przypadku kolby T-25) i delikatnie kołysać kolbą, aby przemyć komórki. Usunąć PBS przez aspirację próżniową. Wymagane jest dokładne mycie, ponieważ surowica hamuje trypsynę.</li>
	<li>Dozować 1,5 ml 0,05% trypsyny do kolby T-75 (w przypadku kolby T-25 użyć 0,5 ml) i delikatnie kołysać kolbą, aby pokryć warstwę komórek trypsyną.</li>
	<li>Inkubować przez 5-10 minut w inkubatorze (dokładny czas zależy od aktywności trypsyny).</li>
	<li>Sprawdź, czy komórki nie są oderwane, trzymając kolbę pod światło i poszukaj płynących komórek. Oderwanie komórek (zaokrąglone komórki) można również sprawdzić za pomocą mikroskopu. Często komórki uwalniają się szybciej po szybkim, delikatnym uderzeniu w bok kolby.</li>
	<li>Dodać 15 ml uzupełnionego DMEM do kolby T-75 (5 ml dla kolby T-25). Ponownie zawiesić komórki, pipetując w górę i w dół 4 lub 5 razy.</li>
	<li>Aby rozmnażać komórki, rozcieńczyć zawiesinę komórek w stosunku 1:5 ze świeżo uzupełnionym DMEM. W tym momencie można również określić liczbę komórek za pomocą hemocytometru, ale zwykle jest to konieczne tylko w przypadku dzielenia komórek na specjalne formaty dla niektórych testów.</li>
</ol>
3. Przygotowanie całkowitych lizatów trofozoitu
<ol>
	<li>Odłącz trofozoity od probówek hodowlanych, schładzając probówkę przez 5-10 minut w łaźni lodowato-wodnej. Przenieść kulturę w sposób aseptyczny do stożkowej probówki i odwirować przy 360 x g przez 10 minut w temperaturze 4 °C. Ostrożnie odrzucić supernatant przez dekantację, dodać lodowaty PBS do osadu, kilkakrotnie odwrócić probówkę w celu rozproszenia komórek i ponownie odwirować przy 360 x g przez 10 minut. Powtórz ten krok dwukrotnie, aby usunąć wszelkie ślady podłoża TYI-S-33.</li>
	<li>Określ liczbę trofozoitów za pomocą hemocytometru.</li>
	<li>Liza trofozoitów w cyklach zamrażania i rozmrażania. Zamrozić odmierzone inokulum trofozoitów (600 000 trofozoitów/ml) rozcieńczone w lodowatym PBS, w ciekłym azocie przez 1 minutę. Rozmrozić próbkę w temperaturze 4 °C i energicznie przetrząsnąć. Powtórz zamrażanie i rozmrażanie 3 razy, aby zakończyć lizę komórek.</li>
	<li>Aktywuj proteazy obecne w lizatach za pomocą 0,02% β-merkaptoetanolu.</li>
</ol>
4. Przygotowanie produktów wydzielanych trofozoitem
<ol>
	<li>Wykonaj kroki od 3.1 do 3.2.</li>
	<li>Określ liczbę komórek i żywotność w tym momencie za pomocą hemocytometru i stosując test wykluczenia błękitu trypanowego20:
	<ol>
		<li>Rozcieńczyć 9 x 106 trofozoitów w 3 ml lodowatego PBS i przenieść komórki do stożkowej probówki o pojemności 50 ml. Pobrać 10 μl tej zawiesiny i dodać 1 μl 0,4% roztworu podstawowego błękitu trypanowego o pH 7,2.</li>
		<li>Użyj komory Neubauera do liczenia komórek w małym powiększeniu.</li>
		<li>Policz wszystkie komórki i oddziel liczbę niebieskich komórek, ponieważ niebieskie komórki wchłonęły barwnik i należy je uznać za martwe.</li>
		<li>Oblicz procent żywotnych komórek, dzieląc liczbę żywych komórek przez całkowitą liczbę komórek i mnożąc przez 100.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Przenieść stożkową rurkę zawierającą zawiesinę trofozoitów do inkubatora w temperaturze 37 °C na 2 godziny pod kątem poziomym pod kątem 5°.</li>
	<li>Aby zebrać wydzielane produkty, należy odwirować probówki o sile 360 x g przez 10 minut. Za pomocą jednorazowej i sterylnej strzykawki ostrożnie pobrać supernatant, unikając zanieczyszczenia próbek trofozoitami z osadu. Wyeliminuj wszelkie przeniesione komórki, przepuszczając supernatant przez membranę z octanu celulozy o wielkości 0,22 μm. Aktywuj proteazy za pomocą 0,02% β-merkaptoetanolu.</li>
	<li>Aby odrzucić przypuszczalne niepożądane zanieczyszczenie cząsteczkami uwolnionymi z martwych komórek, należy ponownie zastosować test wykluczania błękitu trypanowego pod kątem żywotności komórek. Żywotna i całkowita liczba komórek powinny być takie same, jak uzyskane w kroku 4.2. Jeśli tak nie jest, pobrany supernatant może zawierać nie tylko wydzielane białka i powinien zostać odrzucony.</li>
</ol>
5. Interakcja komórek MDCK z trofozoitami, lizatami trofozoitowymi lub produktami wydzielanymi
<ol>
	<li>Inkubować zlewające się monowarstwy komórek MDCK z żywymi trofozoitami (stosunek MDCK do ameby 1:1), lizatami trofozoitów (stosunek MDCK do ameby 1:2) lub wydzielanymi produktami (stosunek MDCK do ameby 1:10) w temperaturze 37 °C przez 2 i 30 minut (ryc. 2A).</li>
	<li>Umyj komórki nabłonka pięciokrotnie lodowatym PBS, aby wyeliminować niezwiązane cząsteczki lub trofozoity.</li>
</ol>
6. Przygotowanie próbek do immunofluorescencji
<ol>
	<li>Hodowla komórek MDCK na sterylnych szklanych szkiełkach nakrywkowych umieszczonych w 24-dołkowym naczyniu do hodowli komórkowych. Sprawdź komórki pod mikroskopem odwróconym, aż osiągną 100% zbieżności. Następnie zastąpić pożywkę 1 ml świeżo uzupełnionej pożywki DMEM i przenieść płytkę do inkubatora o temperaturze 37 °C na kolejne 24 godziny.</li>
	<li>Usunąć pożywkę za pomocą aspiratora próżniowego i sterylnej szklanej pipety Pasteura i dodać 1 ml ciepłego PBS do każdej studzienki. Usuń PBS i powtórz pranie ze świeżym PBS. Uważaj, aby nie zeskrobać komórek z dna studzienki szklaną pipetą.</li>
	<li>Dodać trofozoity rozcieńczone w 1 ml ciepłego PBS w różnych warunkach: żywe trofozoity (T), całkowite lizaty trofozoitów (TL) i wydzielane produkty (SP).
	<ol>
		<li>Umieść płytkę hodowlaną w inkubatorze na 2 lub 30 minut.</li>
		<li>Przygotuj dwa warunki kontrolne: jeden o określonym czasie 0 min, w którym komórki MDCK nie powinny być inkubowane z E. histolytica, ale tylko z 1 ml ciepłego PBS; i drugi warunek jako kontrola przeciwciał drugorzędowych, w tym przypadku inkubacja MDCK z T, TL lub SP przez 2 lub 30 minut i pominięcie inkubacji z przeciwciałami pierwszorzędowymi.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Umyj komórki nabłonka pięciokrotnie zimnym PBS, aby wyeliminować niezwiązane cząsteczki lub trofozoity.</li>
	<li>Utrwalić i przepuszczalnić komórki za pomocą 1 ml 96% etanolu przez 30 minut w temperaturze -20 °C.</li>
	<li>Aby usunąć etanol, wykonaj trzy szybkie płukania 1 ml PBS w temperaturze pokojowej.</li>
	<li>Wykonaj następujące czynności w wilgotnej komorze, aby uniknąć wysuszenia próbek:
	<ol>
		<li>Użyj dowolnego dostępnego płaskiego pudełka, które można zamknąć i wypełnić mokrym ręcznikiem papierowym, na którym próbki można bezpiecznie umieścić. Na przykład puste pudełko na końcówki do pipet dobrze nadaje się do tego celu.</li>
		<li>Wewnątrz komory równomiernie ułożyć warstwę Parafilm i odpipetować 25 μl roztworu blokującego (0,5% BSA) dla każdego szkiełka nakrywkowego.</li>
		<li>Wyjmij szkiełka nakrywkowe z dołków za pomocą drobnych kleszczyków, ostrożnie usuń nadmiar płynu z krawędzi bibułą filtracyjną i umieść szkiełko nakrywkowe w kropli zawierającej roztwór blokujący (0,5% BSA) tak, aby komórki były skierowane w stronę roztworu blokującego. Inkubować próbki przez 1 godzinę w temperaturze pokojowej.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Przygotować mieszaninę przeciwciał pierwszorzędowych w PBS: mysi anty-EhCPADH112 IgM (mα-EhCPADH112; rozcieńczenie 1:10) i IgG królicze anty-ZO-1 (pα-ZO-1; rozcieńczenie 1:100).</li>
	<li>Umieścić świeży arkusz Parafilmu w wilgotnym pudełku i odpipetować 25 μl roztworu przeciwciał do każdego szkiełka nakrywkowego.</li>
	<li>Podnieść szkiełka nakrywkowe z roztworu blokującego, osuszyć nadmiar płynu na krawędziach za pomocą bibuły filtracyjnej i umieścić je w kroplach tak, aby komórki były skierowane w stronę roztworu przeciwciała. Próbki inkubować przez noc w temperaturze 4 °C.</li>
	<li>Umieścić każde szkiełko nakrywkowe w 24-dołkowym basenie (strona z komórkami na górze) i dodać 1 ml PBS.
	<ol>
		<li>Przemyć pięć razy 1 ml PBS w celu usunięcia niezwiązanych cząsteczek.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Przygotować mieszaninę fluorescencyjnych przeciwciał drugorzędowych w PBS: mysz anty-IgM kozła sprzężoną z FITC (rozcieńczenie 1:100) i kozia anty-IgG królika sprzężona z TRITC (rozcieńczenie 1:50).</li>
	<li>Umieścić świeży arkusz Parafilmu w wilgotnym pudełku i odpipetować 25 μl roztworu przeciwciał drugorzędowych do każdego szkiełka nakrywkowego.</li>
	<li>Przenieść próbki jak w ppkt 6.10 i inkubować przez 1 godzinę w temperaturze pokojowej w ciemności, aby uniknąć bielenia barwników fluorescencyjnych. Powtórz krok 6.11.1.</li>
	<li>W przypadku barwienia jądrowego inkubować przez 3 minuty z 200 μl 0,05 mM roztworu DAPI w temperaturze pokojowej i chronić przed światłem. Powtórz krok 6.11.1.</li>
	<li>Aby zachować barwniki fluorescencyjne, umieść szkiełka nakrywkowe (komórki skierowane w dół) w 5 μl roztworu zapobiegającego blaknięciu Vecta Shield na szklanych szkiełkach mikroskopowych. Uszczelnij szkiełka nakrywkowe lakierem do paznokci, aby uniknąć wyschnięcia próbki.</li>
	<li>W przypadku długotrwałego przechowywania szkiełka należy przechowywać w pudełku z szkiełkami mikroskopowymi w temperaturze -20 °C.</li>
	<li>Analizuj preparaty za pomocą mikroskopii konfokalnej przez przekroje stosu Z i płaszczyzny xz (ryc. 2A).</li>
</ol>
7. Inkubacja trofozoitów z inhibitorami proteazy lub specyficznym przeciwciałem
<ol>
	<li>Powtórz kroki od 3.1 do 3.2. Dla każdego warunku doświadczalnego inkubować 1 x 105 trofozoitów (zawieszonych w 50 μl PBS) z inhibitorami proteazy (1 mM Complete i 40 μg/ml E-64) lub 30 μg przeciwciała monoklonalnego przeciwko EhCPADH112 (mαEhCPADH112)21 przez 20 minut w 4 °C (Figura 2B). Preparaty te należy stosować do testów koinkubacji zgodnie z opisem w kroku 8.5.</li>
</ol>
8. Pomiar przeznabłonkowej rezystancji elektrycznej (TER)
<ol>
	<li>Hodowla komórek MDCK na sterylnych przepuszczalnych podłożach transwell (wielkość porów 0,4 μm). W górnej komorze umieścić 100 μl zawiesiny komórkowej, a w dolnej komorze umieścić 600 μl uzupełnionej pożywki DMEM.
	<ol>
		<li>Okresowo sprawdzaj poziom medium. W razie potrzeby można dodać świeże podłoże.</li>
		<li>Sprawdź komórki pod mikroskopem odwróconym, aż osiągną 100% zbieżności. Zmieniaj podłoże co 2-3 dni.</li>
		<li>Aby poprawić przyczepność komórek (jeśli to konieczne), przed dodaniem zawiesiny komórek należy zrównoważyć filtry transwell przez noc w temperaturze 37 °C w DMEM.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Wysterylizuj elektrody STX2 w okapie przez zanurzenie w etanolu, a następnie w sterylnym PBS na 15 minut każda, w świetle UV. Podłącz elektrody do woltoomomierza nabłonkowego EVOM i wybierz tryb rezystancji.</li>
	<li>Zebrać pożywkę z górnej komory każdej transwell i zebrać je. Pobrać 50 μl tej mieszaniny pożywek i połączyć ją z 50 μl zawiesiny trofozoitów (1 x 105 trofozoitów w PBS) lub tylko z PBS (kontrola). Użyj podobnej mieszanki dla każdego transwella.</li>
	<li>Dodać mieszaniny do górnej komory każdej transstułki zawierającej komórki MDCK. Warunki eksperymentalne obejmują komórki MDCK bez trofozoitów (kontrola), współhodowlę z trofozoitami lub z trofozoitami wstępnie inkubowanymi z inhibitorami proteazy lub mαEhCPADH112. Aby wyeliminować opór wytwarzany przez filtry, należy używać transwelli inkubowanych tylko z pożywką. Dla każdego warunku doświadczalnego należy użyć co najmniej trzech transwelli.</li>
	<li>Natychmiast zmierz TER, zanurzając elektrody STX2 w każdym transwellu.
	<ol>
		<li>Upewnij się, że dłuższa elektroda dotyka dna dolnej komory, a krótsza elektroda jest pokryta medium w górnej komorze (patrz rysunek 2B).</li>
		<li>Upewnij się, że za każdym razem trzymasz elektrody prostopadle. To znacznie poprawi odtwarzalność. Unikaj przesuwania lub przechylania elektrody podczas pomiarów, ponieważ doprowadzi to do zmienności danych.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Pomiar ten należy traktować jako początkową wartość TER. Następnie monitoruj TER przez następne 30 minut.</li>
	<li>Aby obliczyć końcową wartość TER, odejmij wartość TER tylko filtrów. Aby porównać wyniki różnych eksperymentów, znormalizuj każdy punkt danych do wartości początkowych, przyjmując je jako 100% (Rysunek 2B).</li>
</ol>

<ol><li>Faust, D. M., Guillen, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Virulence+and+virulence+factors+in+Entamoeba+histolytica%2C+the+agent+of+human+amoebiasis%5BTitle%5D)+AND+%22Microbes+Infect%22%5BJournal%5D)">Virulence and virulence factors in Entamoeba histolytica, the agent of human amoebiasis.</a> Microbes Infect. 14, 1428-1441 (2012).</li>
<li>Stauffer, W., Ravdin, J. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Entamoeba+histolytica%3A+an+update%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Opin+Infect+Dis%22%5BJournal%5D)">Entamoeba histolytica: an update.</a> Curr Opin Infect Dis. 16, 479-485 (2003).</li>
<li>Santi-Rocca, J., Rigothier, M. C., Guillen, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Host-microbe+interactions+and+defense+mechanisms+in+the+development+of+amoebic+liver+abscesses%5BTitle%5D)+AND+%22Clin+Microbiol+Rev%22%5BJournal%5D)">Host-microbe interactions and defense mechanisms in the development of amoebic liver abscesses.</a> Clin Microbiol Rev. 22, 65-75 (2009).</li>
<li>Turner, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Intestinal+mucosal+barrier+function+in+health+and+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Immunol%22%5BJournal%5D)">Intestinal mucosal barrier function in health and disease.</a> Nat Rev Immunol. 9, 799-809 (2009).</li>
<li>Garcia-Rivera, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Entamoeba+histolytica+%3A+a+novel+cysteine+protease+and+an+adhesin+form+the+112+kDa+surface+protein%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Entamoeba histolytica : a novel cysteine protease and an adhesin form the 112 kDa surface protein.</a> Mol Microbiol. 33, 556-568 (1999).</li>
<li>Leippe, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Amoebapores%5BTitle%5D)+AND+%22Parasitol+Today%22%5BJournal%5D)">Amoebapores.</a> Parasitol Today. 13, 178-183 (1997).</li>
<li>Leippe, M., Bruhn, H., Hecht, O., Grotzinger, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ancient+weapons%3A+the+three-dimensional+structure+of+amoebapore%5BTitle%5D)+AND+%22A.+Trends+Parasitol%22%5BJournal%5D)">Ancient weapons: the three-dimensional structure of amoebapore.</a> A. Trends Parasitol. 21, 5-7 (2005).</li>
<li>Ocadiz, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((EhCP112+is+an+Entamoeba+histolytica+secreted+cysteine+protease+that+may+be+involved+in+the+parasite-virulence%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Microbiol%22%5BJournal%5D)">EhCP112 is an Entamoeba histolytica secreted cysteine protease that may be involved in the parasite-virulence.</a> Cell Microbiol. 7, 221-232 (2005).</li>
<li>Sajid, M., McKerrow, J. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cysteine+proteases+of+parasitic+organisms%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Biochem+Parasitol%22%5BJournal%5D)">Cysteine proteases of parasitic organisms.</a> Mol Biochem Parasitol. 120, 1-21 (2002).</li>
<li>Betanzos, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+EhCPADH112+complex+of+Entamoeba+histolytica+interacts+with+tight+junction+proteins+occludin+and+claudin-1+to+produce+epithelial+damage%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">The EhCPADH112 complex of Entamoeba histolytica interacts with tight junction proteins occludin and claudin-1 to produce epithelial damage.</a> PLoS One. 8, (2013).</li>
<li>Lauwaet, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Proteinase+inhibitors+TPCK+and+TLCK+prevent+Entamoeba+histolytica+induced+disturbance+of+tight+junctions+and+microvilli+in+enteric+cell+layers+in+vitro%5BTitle%5D)+AND+%22Int+J+Parasitol%22%5BJournal%5D)">Proteinase inhibitors TPCK and TLCK prevent Entamoeba histolytica induced disturbance of tight junctions and microvilli in enteric cell layers in vitro.</a> Int J Parasitol. 34, 785-794 (2004).</li>
<li>Leroy, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Contact-dependent+transfer+of+the+galactose-specific+lectin+of+Entamoeba+histolytica+to+the+lateral+surface+of+enterocytes+in+culture%5BTitle%5D)+AND+%22Infect+Immun%22%5BJournal%5D)">Contact-dependent transfer of the galactose-specific lectin of Entamoeba histolytica to the lateral surface of enterocytes in culture.</a> Infect Immun. 63, 4253-4260 (1995).</li>
<li>Leroy, A., Lauwaet, T., De Bruyne, G., Cornelissen, M., Mareel, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Entamoeba+histolytica+disturbs+the+tight+junction+complex+in+human+enteric+T84+cell+layers%5BTitle%5D)+AND+%22FASEB+J%22%5BJournal%5D)">Entamoeba histolytica disturbs the tight junction complex in human enteric T84 cell layers.</a> FASEB J. 14, 1139-1146 (2000).</li>
<li>Leroy, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Disturbance+of+tight+junctions+by+Entamoeba+histolytica%3A+resistant+vertebrate+cell+types+and+incompetent+trophozoites%5BTitle%5D)+AND+%22Arch+Med+Res%22%5BJournal%5D)">Disturbance of tight junctions by Entamoeba histolytica: resistant vertebrate cell types and incompetent trophozoites.</a> Arch Med Res. 31, (2000).</li>
<li>Lauwaet, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Entamoeba+histolytica+trophozoites+transfer+lipophosphopeptidoglycans+to+enteric+cell+layers%5BTitle%5D)+AND+%22Int+J+Parasitol%22%5BJournal%5D)">Entamoeba histolytica trophozoites transfer lipophosphopeptidoglycans to enteric cell layers.</a> Int J Parasitol. 34, 549-556 (2004).</li>
<li>Kissoon-Singh, V., Moreau, F., Trusevych, E., Chadee, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Entamoeba+histolytica+Exacerbates+Epithelial+Tight+Junction+Permeability+and+Proinflammatory+Responses+in+Muc2%28-%2F-%29+Mice%5BTitle%5D)+AND+%22Am+J+Pathol%22%5BJournal%5D)">Entamoeba histolytica Exacerbates Epithelial Tight Junction Permeability and Proinflammatory Responses in Muc2(-/-) Mice.</a> Am J Pathol. 182, 852-865 (2013).</li>
<li>Lejeune, M., Moreau, F., Chadee, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Prostaglandin+E2+produced+by+Entamoeba+histolytica+signals+via+EP4+receptor+and+alters+claudin-4+to+increase+ion+permeability+of+tight+junctions%5BTitle%5D)+AND+%22Am+J+Pathol%22%5BJournal%5D)">Prostaglandin E2 produced by Entamoeba histolytica signals via EP4 receptor and alters claudin-4 to increase ion permeability of tight junctions.</a> Am J Pathol. 179, 807-818 (2011).</li>
<li>Orozco, M. E., Martinez Palomo, A., Gonzalez Robles, A., Guarneros, G., Galindo, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Interactions+between+lectin+and+receptor+mediate+the+adhesion+of+E.+histolytica+to+epithelial+cells.+Relation+of+adhesion+to+the+virulence+of+the+strains%5BTitle%5D)+AND+%22Arch+Invest+Med+%28Mex%29%22%5BJournal%5D)">Interactions between lectin and receptor mediate the adhesion of E. histolytica to epithelial cells. Relation of adhesion to the virulence of the strains.</a> Arch Invest Med (Mex). 13 Suppl 3, 159-167 (1982).</li>
<li>Diamond, L. S., Harlow, D. R., Cunnick, C. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+new+medium+for+the+axenic+cultivation+of+Entamoeba+histolytica+and+other+Entamoeba%5BTitle%5D)+AND+%22Trans+R+Soc+Trop+Med+Hyg%22%5BJournal%5D)">A new medium for the axenic cultivation of Entamoeba histolytica and other Entamoeba.</a> Trans R Soc Trop Med Hyg. 72, 431-432 (1978).</li>
<li>Strober, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Trypan+blue+exclusion+test+of+cell+viability%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Protoc+Immunol%22%5BJournal%5D)">Trypan blue exclusion test of cell viability.</a> Curr Protoc Immunol. Appendix 3, (2001).</li>
<li>Arroyo, R., Orozco, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Localization+and+identification+of+an+Entamoeba+histolytica+adhesin%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Biochem+Parasitol%22%5BJournal%5D)">Localization and identification of an Entamoeba histolytica adhesin.</a> Mol Biochem Parasitol. 23, 151-158 (1987).</li>
<li>Diamond, L. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Axenic+cultivation+of+Entamoeba+hitolytica%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Axenic cultivation of Entamoeba hitolytica.</a> Science. 134, 336-337 (1961).</li>
<li>Diamond, L. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Techniques+of+axenic+cultivation+of+Entamoeba+histolytica+Schaudinn%2C+1903+and+E.+histolytica-like+amebae%5BTitle%5D)+AND+%22J+Parasitol%22%5BJournal%5D)">Techniques of axenic cultivation of Entamoeba histolytica Schaudinn, 1903 and E. histolytica-like amebae.</a> J Parasitol. 54, 1047-1056 (1968).</li>
<li>Dukes, J. D., Whitley, P., Chalmers, A. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+MDCK+variety+pack%3A+choosing+the+right+strain%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">The MDCK variety pack: choosing the right strain.</a> BMC Cell Biol. 12, (2011).</li>
<li>Espinosa-Cantellano, M., Martinez-Palomo, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pathogenesis+of+intestinal+amebiasis%3A+from+molecules+to+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Clin+Microbiol+Rev%22%5BJournal%5D)">Pathogenesis of intestinal amebiasis: from molecules to disease.</a> Clin Microbiol Rev. 13, 318-331 (2000).</li>
<li>Martinez-Palomo, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Structural+bases+of+the+cytolytic+mechanisms+of+Entamoeba+histolytica%5BTitle%5D)+AND+%22J+Protozool%22%5BJournal%5D)">Structural bases of the cytolytic mechanisms of Entamoeba histolytica.</a> J Protozool. 32, 166-175 (1985).</li>
<li>Martinez-Lopez, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+EhADH112+recombinant+polypeptide+inhibits+cell+destruction+and+liver+abscess+formation+by+Entamoeba+histolytica+trophozoites%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Microbiol%22%5BJournal%5D)">The EhADH112 recombinant polypeptide inhibits cell destruction and liver abscess formation by Entamoeba histolytica trophozoites.</a> Cell Microbiol. 6, 367-376 (2004).</li>
<li>Ocadiz-Ruiz, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effect+of+the+silencing+of+the+Ehcp112+gene+on+the+in+vitro+virulence+of+Entamoeba+histolytica%5BTitle%5D)+AND+%22Parasit+Vectors%22%5BJournal%5D)">Effect of the silencing of the Ehcp112 gene on the in vitro virulence of Entamoeba histolytica.</a> Parasit Vectors. 6, 248 (2013).</li>
<li>Johnson, L. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Applications+of+imaging+techniques+to+studies+of+epithelial+tight+junctions%5BTitle%5D)+AND+%22Adv+Drug+Deliv+Rev%22%5BJournal%5D)">Applications of imaging techniques to studies of epithelial tight junctions.</a> Adv Drug Deliv Rev. 57, 111-121 (2005).</li>
</ol>

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

W celu zbadania interakcji gospodarz-patogen in vitro podczas zakażenia nabłonka przez E. histolytica, kluczowa jest praca z dobrze znanymi kulturami zarówno komórek nabłonkowych, jak i trofozoitów. Na przykład, dawniej, kultury E. histolytica były zwykle zakładane w połączeniu z pewnymi gatunkami bakterii lub trypanosomatidami22,23. Jednak jednoczesna hodowla kultur E. histolytica przynosi efekt przeciwny do zamierzonego w badaniu interakcji gospodarz-patogen, ponieważ zaob...

Entamoeba histolytica to jednokomórkowy pierwotniak odpowiedzialny za ludzką amebiasę, infekcję jelitową powodującą stan zapalny i biegunkę. E. histolytica zakaża do 50 milionów osób rocznie, ale tylko u około 10% zakażonych osób rozwijają się objawy związane z amebiazą1. Do zakażenia dochodzi po spożyciu skażonej żywności lub wody zawierającej cysty E. histolytica. W jelicie torbiele wytwarzają żywe trofozoity, które przylegają do mucyny okrężnicy i namnażająsię 2. Trofozoity zwykle tworzą torbiele, które są wydalane z kałem. W innych przypadkach i z nieznanych jeszcze przyczyn trofozoity przerywają warstwę nabłonka jelitowego i atakują leżące pod nią tkanki. W najgorszych przypadkach dostają się do krwiobiegu i wpływają na inne narządy, takie jak wątroba3.
Przerwanie bariery nabłonkowej wymaga przerwania transbłonowych struktur nabłonkowych, które utrzymują komórki połączone. Kontakty komórkowe nabłonka są tworzone przez wierzchołkowy kompleks połączeniowy składający się z połączeń ścisłych (TJ) i adherens (AJ) oraz desmosomów4. Najbardziej wierzchołkowymi połączeniami są TJ, a zatem są pierwszą barierą naruszoną przez E. histolytica i niektóre inne patogeny podczas inwazji gospodarza. TJ składają się z transbłonalnych receptorów adhezyjnych, takich jak klaudyny, okludyna i cząsteczki adhezji połączeniowej (JAM), które angażują się w homo- lub heterofilowe interakcje z receptorami sąsiedniej komórki. Są one wewnątrzkomórkowo związane przez cząsteczki rusztowania z rodziny zonula occludens (ZO), które łączą receptory adhezyjne z cytoszkieletem aktyny, aby zapewnić dalszą wytrzymałość mechaniczną nabłonka. TJ są odpowiedzialne za uszczelnienie tkanki jelitowej przed światłem jelita, zapobiegając nadmiernemu wyciekowi wody i substancji rozpuszczonej. W ten sposób, po tym, jak TJ zostanie zakłócony przez pasożyta, tkanki zostają zaatakowane. E. histolytica wydziela kilka cząsteczek, takich jak: (i) te zaangażowane w adhezję ameb do komórek docelowych5; (ii) czynniki błonowo czynne uczestniczące w zabijaniu komórek gospodarza przez egzocytozę, na przykład peptydy tworzące kanały jonowe, zwane amebapory6,7; oraz (iii) proteinazy, które degradują białka macierzy zewnątrzkomórkowej i pośredniczą w rozpadzie tkanek5,8,9.
Proteaza cysteinowa EhCP112 i cząsteczka adhezyjna EhADH112, które razem tworzą kompleks EhCPADH112, to dwa białka wirulencji E. histolytica, które odgrywają główną rolę w demontażu TJ 10. Żywe trofozoity, ich całkowite lizaty i wydzielane produkty indukują zmiany molekularne w kompleksie TJ i funkcjonalne zaburzenie bariery nabłonkowej. W tym badaniu wykazano, że EhCP112 i EhADH112 oddziałują z białkami okludyny i klaudyny-1, prowadząc do internalizacji i degradacji białek komórkowych, ułatwiając w ten sposób wejście E. histolytica przez szlak parakomórkowy.
Nasze dane oraz dane z innych grup11-17zdecydowanie sugerują konieczność specyficznych interakcji gospodarz-patogen, które umożliwiają inwazję pasożytów. Odkrycie molekularnych podstaw tych interakcji ma ogromne znaczenie dla lepszego zrozumienia patogenezy amebiozy. Selektywne zaburzenie TJ przez trofozoity, charakteryzujące się zwiększoną przepuszczalnością parakomórkową, można zmierzyć poprzez zmniejszenie przeznabłonkowego oporu elektrycznego (TER). Przenoszenie białek pasożytniczych w kierunku nabłonka gospodarza można określić za pomocą barwienia immunofluorescencyjnego i konfokalnej mikroskopii laserowej, metody, która może również ujawnić kolokalizację czynników wirulencji ameb z nabłonkowymi markerami połączeniowymi wskazującymi na możliwe bezpośrednie interakcje. W tym artykule szczegółowo opisujemy, w jaki sposób komórki nabłonkowe i trofozoity są hodowane, zbierane i manipulowane w celu zbadania interakcji gospodarz-patogen i ich konsekwencji.

<table><tbody><tr><td>Entamoeba histolytica HM1:IMSS, Klon A&nbsp;</td><td>Szpital IMSS, Meksyk</td><td>Bez/liczba</td><td>zjadliwych trofozoitów18&nbsp; </td></tr><tr><td>TYI bulion</td><td>Becton, Dickinson and Company Merck Merck Merck J.T. Baker Reproquifin SIGMA-Aldrich SIGMA-Aldrich</td><td>211862 K35625437 626 21578 4873 3252-01 CAS 50-81-7 C7880 F-5879</td><td>3,45% peptonu biosatu BBL 58 mM glukozy 39 mM NaCl 5 mM KH2PO4 6,5 mM K2HPO4 16,3 mM kwas askorbinowy 8,1 mM L-cysteina 0,1 mM cytrynian żelazowo-amonowy, dostosuj pH 6,819</td></tr><tr><td>Surowica bydlęca dla dorosłych</td><td>Microlab , Labs., Mex.</td><td>SU146</td><td>Stosować w stężeniu 10% i inaktywować do 56 &deg; C przez 30 min</td></tr><tr><td>Diament&nbsp; witamina&nbsp; mieszanina- Tween 80</td><td>In vitro</td><td>SR-07</td><td>Stosować w stężeniu 3%</td></tr> <tr><td>Penicyliny&nbsp;</td><td>Nad jeziorem,&nbsp; M&eacute;x.</td><td>34564SSA IV</td><td>0,5 j.m./ml</td></tr><tr><td>Streptomycyny&nbsp;</td><td>Nad jeziorem,&nbsp; M&eacute;x.</td><td>75757SSA IV</td><td>35 &mikro; g/ml</td></tr><tr><td>Pyrex 15 ml probówki hodowlane z nakrętką z nakrętką fenolową wyłożoną PTFE</td><td>Corning-Pyrex</td><td>9826-16X</td><td>16 x 125 mm, pojemność 15 ml i nakrętki wykonane ze specjalnej formuły odpornej na działanie temperatury</td></tr><tr><td>Płytki do hodowli komórkowych, 6-dołkowe</td><td>Corning-Costar</td><td>3516</td><td>Sterylne płytki, średnica studzienki 34,8 mm i obszar wzrostu 9,5 cm2.&nbsp; Pierścienie na pokrywie zapobiegają zanieczyszczeniu krzyżowemu</td></tr><tr><td>25 cm2 kolba do hodowli komórkowych</td><td>Corning-Costar</td><td>430168</td><td>Kolby z przechyloną szyjką</td></tr><tr><td>MDCK (nerka psa Madina Darby'ego) typ I</td><td>Kolekcja kultur typu amerykańskiego</td><td>CCL34</td><td>Komórki nabłonka nerki wyhodowane między pasażem 60th a 90th</td></tr><tr><td>DMEM medium&nbsp;</td><td>Gibco&nbsp;</td><td>12800-017</td><td>Dulbecco's Modified Eagle Medium o wysokiej zawartości glukozy.</td></tr><tr><td>Surowica cielęca noworodków</td><td>In vitro</td><td>S-02</td><td>Stosować w dawce 10%.&nbsp; &nbsp;</td></tr><tr><td>Mieszanina penicyliny/streptomycyny&nbsp;</td><td>In vitro&nbsp;</td><td>A-01</td><td>Roztwór podstawowy 10 000 U/&mikro; g/ml</td></tr><tr><td>Insulina&nbsp; &nbsp;</td><td>AMSA</td><td>398MJ94SSA IV</td><td>Roztwór podstawowy 100 j.m./ml</td></tr><tr><td>Roztwór trypsyny&nbsp;</td><td>In vitro</td><td>EN-005</td><td>0,05% roztwór enzymatyczny bez wapnia i magnezu</td></tr><tr><td>75 cm2 kolba do hodowli komórkowych</td><td>Corning-Costar</td><td>430720</td><td>Kolby z szyjką skośną do hodowli trofozoitów w podłożu TYI-S-33</td></tr><tr><td>Przepuszczalne nośniki Transwell</td><td>Corning-Costar</td><td>3470</td><td>0,4 &mikro; m Membrana poliestrowa, wkładka 6,5 mm w płytce 24-dołkowej, obszar wzrostu 0,3 cm2</td></tr><tr><td>24-dołkowe naczynie do hodowli komórkowych&nbsp; &nbsp;</td><td>Corning-Costar</td><td>3524</td><td>Przezroczysty polistyren, poddany obróbce w celu optymalnego przylegania komórek, sterylizowany promieniowaniem gamma i certyfikowany jako niepirogenny</td></tr><tr><td>Kompletny</td> koktajl inhibitorów proteazy Mini <td>Roche</td><td>11836 153 001</td><td>hamuje szerokie spektrum seryny, cysteiny i metaloproteaz. Stężenie końcowe 1 mM&nbsp;</td></tr><tr><td>Trans-epoksysukcynylo-L-leucyloamido (4-guanidyno)butan (E-64)</td><td>SIGMA-Aldrich</td><td>E3132</td><td>Inhibitor proteazy cysteinowej, stężenie końcowe 40 &mikro; g/ml</td></tr><tr><td>p&alpha; ZO-1&nbsp;</td><td>Invitrogen</td><td>402200</td><td>IgG królik poliklonalny&nbsp; przeciwciało&nbsp; przeciw&nbsp; syntetycznemu peptydowi w środkowym regionie ludzkiego białka m&alfa ZO-1</td></tr><tr><td>; EhCPADH112</td><td>Domowe przeciwciało</td><td>bez/ liczby</td><td>IgM mysiego przeciwciała monoklonalnego&nbsp; przeciw&nbsp; epitopowi 444-601 znajdującemu się na C-końcu EhCPADH11221,27FITC-koza</td></tr> <tr><td>anty-mysia IgM</td><td>Zymed</td><td>62-6811</td><td>Izotiocyjanian fluoresceiny (FITC)-znakowany kozią anty-myszą wtórną&nbsp; przeciwciało</td></tr><tr><td>TRITC- kozie anty-królicze IgG (H+L)</td><td>Zymed</td><td>816114</td><td>Izotiocyjanian tetrametylo-rodaminy (TRITC)&nbsp; kozie przeciwciało anty-królicze IgG&nbsp; przeciwciało drugorzędowe.</td></tr><tr><td>Światowy instrument precyzyjny elektrody STX2</td><td>&nbsp;</td><td>102711</td><td>Składa się ze stałej pary podwójnych elektrod o szerokości 4 mm i grubości 1 mm. Każda sztyft pary elektrod zawiera osad srebro/chlorek srebra do pomiaru napięcia oraz srebrną elektrodę do przepuszczania prądu. Do użytku z</td></tr><tr><td>woltoomomierzem nabłonkowym EVOM EVOM</td><td>World Precision Instrument&nbsp;</td><td>12111</td><td>Używaj w trybie rezystancyjnym i utrzymuj odłączony podczas pomiarów TER</td></tr><tr><td>Komora Neubauera</td><td>MEARIENFELD</td><td>610610</td><td>Hemocytometr&nbsp;</td></tr><tr><td>Leica TCS_SP5_MO</td><td>Leica</td><td>Bez/numeryczna</td><td>Laserowa mikroskopia konfokalna z oprogramowaniem Leica microsystems CMS Gmbh/leica Las af Lite/BIN</td></tr><tr><td>Vectashield</td><td>Vector Laboratories, Inc.</td><td>H-1000</td><td>Pożywka montażowa do fluorescencji</td></tr><tr><td>4',6-diamino-2-fenyloindol (Dapi)</td><td>SIGMA</td><td>D-9542</td><td>0,05 mM stężenie końcowe</td></tr><tr><td>Albumina surowicy bydlęcej (BSA)</td><td>US Biological</td><td>A-1310</td><td>0,5%&nbsp; końcowe stężenie dla roztworu blokującego</td></tr></tbody></table>

analiza uszkodzeń nabłonka wywołanych zakażeniem entamoeba histolytica

Analysis of the Epithelial Damage Produced by Entamoeba histolytica Infection

Entamoeba histolytica jest czynnikiem wywołującym ludzką amebię, główną przyczyną biegunki i ropnia wątroby w krajach tropikalnych. Zakażenie jest inicjowane przez interakcję patogenu z komórkami nabłonka jelitowego. Ta interakcja prowadzi do zakłócenia struktur międzykomórkowych, takich jak połączenia ścisłe (TJ). TJ zapewnia uszczelnienie warstwy nabłonka w celu oddzielenia tkanki gospodarza od światła jelita. Ostatnie badania dostarczają dowodów na to, że zakłócenie TJ przez pasożytnicze białko EhCPADH112 jest warunkiem wstępnym inwazji E. histolytica, której towarzyszy dysfunkcja bariery nabłonkowej. W związku z tym analiza mechanizmów molekularnych zaangażowanych w rozkład TJ podczas inwazji E. histolytica ma ogromne znaczenie dla lepszego zrozumienia patogenezy amebiozy. W artykule przedstawiono prosty model, który pozwala na ocenę początkowych interakcji gospodarz-patogen oraz potencjału inwazji pasożyta. Parametry, które mają być analizowane, obejmują przeznabłonkowy opór elektryczny, oddziaływanie EhCPADH112 z receptorami powierzchni nabłonka, zmiany w ekspresji i lokalizacji markerów połączeń nabłonkowych oraz lokalizację cząsteczek pasożyta w komórkach nabłonkowych.

Aby uzyskać udaną hodowlę E. histolytica, muszą zostać spełnione dwa istotne warunki: wzrost w warunkach aksenicznych oraz zbiór w fazie logarytmicznej. Wcześniej hodowle E. histolytica łatwo było zakładać w powiązaniu z określonymi gatunkami bakterii lub trypanosomatydów22. Obecnie jednak powszechną praktyką jest akseniczna hodowla tego pasożyta, co oznacza nieograniczone pasażowanie ameb w środowisku wolnym od metabolizujących bakterii, grzybów, pierwotniaków lub komórek metazoicznych. Doda...

Zakażenie człowieka przez Entamoeba histolytica prowadzi do amebii, głównej przyczyny biegunki w krajach tropikalnych. Zakażenie jest inicjowane przez interakcje patogenu z komórkami nabłonka jelitowego, powodując otwarcie kontaktów komórka-komórka, a w konsekwencji biegunkę, po której czasami następuje zakażenie wątroby. W tym artykule przedstawiono model do oceny wczesnych interakcji gospodarz-patogen, aby lepiej zrozumieć patogenezę amebiozy.

Analiza uszkodzeń nabłonka wywołanych zakażeniem Entamoeba histolytica

Entamoeba histolytica is the causative agent of human amoebiasis, a major cause of diarrhea and hepatic abscess in tropical countries. Infection is ...

Ogólnym celem niniejszej procedury jest ocena wczesnych interakcji między gospodarzem a patogenem oraz potencjału inwazyjnego TBA.Histolytica. W pierwszej kolejności należy przygotować zawiesiny nienaruszonych trofozoitów, trofozoitów, lizatów całkowitych lub wydzielin trofozoitów. Następnie komórki nabłonkowe gospodarza należy inkubować z odpowiednimi stężeniami poszczególnych typów trofozoitów.Następnie, wykorzystując immunofluorescencję z użyciem przeciwciał monoklonalnych, należy przeanalizować poddane działaniu hodowle nabłonkowe pod kątem wybranych białek *E. histolytica*, które wchodzą w interakcje z połączeniami ścisłymi komórek nabłonkowych; należy również zmierzyć zmiany w barierze parakomórkowej poprzez pomiar transepitelialnego oporu elektrycznego. Zbiorczo wyniki te mogą wykazać rozpad połączeń ścisłych wywołany przez *E. histolytica* oraz wskazać udział wybranych kompleksów w tym procesie. Kluczowymi zaletami tej techniki są możliwość wykorzystania różnych produktów pasożyta do oceny translokacji czynników *E. histolytica* do nabłonka gospodarza, a także wykazanie udziału tych czynników.Czynniki wpływające na otwieranie złączy w całych komórkach w bardzo wczesnych fazach infekcji. Ta metoda może pomóc w udzieleniu odpowiedzi na kluczowe pytania w dziedzinie badań nad amebozą, takie jak zrozumienie interakcji molekularnych między nabłonkiem a pasożytem. Zazwyczaj osoby początkujące w tej metodzie napotykają trudności ze względu na brak wiedzy na temat odpowiednich czasów inkubacji, proporcji obu typów komórek do wspólnej inkubacji, a także sposobów pozyskiwania różnych produktów ELI i pomiaru TER.Wnioski płynące z zastosowania tej techniki mają znaczenie dla terapii amebozy, ponieważ czynniki wirulencji, takie jak kompleks E-H-C-P-A-D-H 112, mogłyby zostać wykorzystane jako cele w nowych strategiach leczenia. Po czwarte, ta metoda in vitro może dostarczyć wiedzy na temat udziału wirulencyjnych czynników Anica w początkowej interakcji z miejscem kolonizacji w gospodarstwie. Można ją również zastosować w innych systemach, takich jak modele infekcji in vivo u chomików, myszy, świni świń oraz w biopsjach jelit ludzkich. Hodowla.Komórki MDCK znajdują się w 10 mililitrach uzupełnionego medium DMEM w atmosferze 5% dwutlenku węgla i temperaturze 37 stopni Celsjusza. Hoduj autentycznie 1 × 10⁵ trofozoitów Entamoeba histolytica w 15 mililitrach medium TYIS 33 w temperaturze 37 stopni Celsjusza. Aby odlepić trofozoity, schładzaj probówkę przez 5 do 10 minut w kąpieli wodno-lodowej.Następnie przenieś kulturę w sposób aseptyczny do probówki stożkowej i wiruj przy 360 ×g przez 10 minut w temperaturze czterech stopni Celsjusza. Teraz ostrożnie zlej supernatant. Dodaj schłodzony do temperatury lodu PBS do osadu i kilkukrotnie odwróć probówkę, aby rozproszyć komórki po wirowaniu.Wyznacz liczbę trofozoitów za pomocą komory liczydła (hemocytometru), aby poddać trofozoity lizie; zamroź je gwałtownie w ciekłym azocie przez jedną minutę, rozmroź w temperaturze 4°C i intensywnie wymieszaj w wortexie. Następnie aktywuj proteazy obecne w lizatach za pomocą 0,02% beta-merkaptoetanolu. Rozcieńcz 9 × 10⁶ trofozoitów w 3 ml schłodzonego na lodzie PBS i przenieś komórki do stożkowej probówki o pojemności 50 ml.Następnie umieść zawiesinę trofozoitów pod kątem pięciu stopni w inkubatorze w temperaturze 37 °C na dwie godziny w celu zebrania wydzielonych produktów, a następnie odwiruj probówkę przy 360 ×g przez 10 minut. Użyj jednorazowej, sterylnej strzykawki, aby ostrożnie zebrać supernatant, unikając zanieczyszczenia próbek trofozoitami z osadu. Następnie, aby wyeliminować wszelkie przeniesione komórki, przefiltruj supernatant przez membranę z octanu celulozy o rozmiarze porów 0,22 µm.Następnie aktywuj proteazy za pomocą 0,02% beta-merkaptoetanolu dla hodowli do immunofluorescencji. Komórki MDCK znajdują się na sterylnych szkiełkach podstawkowych w 24-dołkowej płytce do hodowli komórek. Obserwuj komórki pod mikroskopem odwróconym, aż osiągną 100% konfluencji.Dodaj różne warianty trofozoitów rozcieńczone w jednym mililitrze ciepłego PBS. Uwzględnij warunki kontrolne komórek MDCK z PBS bez E. histolytica, a także komórki MDCK z różnymi wariantami trofozoitów, ale z pominięciem inkubacji z przeciwciałami pierwotnymi. Umieść płytkę hodowlaną w inkubatorze na 30 minut.Następnie pięciokrotnie przemyj komórki nabłonka zimnym PBS, aby usunąć niezwiązane cząsteczki lub trofozoity. Utrwal i permeabilizuj komórki za pomocą jednego mililitra 96% etanolu przez kilka minut w temperaturze -20°C w komorze wilgotnościowej. Ostrożnie wyjmij szkiełka nakrywki z dołków.Usunąć nadmiar cieczy z krawędzi za pomocą papieru filtracyjnego i zanurzyć szkiełko nakrywkę komórkami skierowanymi w dół w 0,5% roztworze blokującym BSA. Inkubować próbki przez jedną godzinę w temperaturze pokojowej. W tym czasie przygotować mieszaninę przeciwciał pierwszorzędowych w PBS.Wyjmij szkiełka nakrywki z roztworu blokującego. Osusz nadmiar cieczy za pomocą papieru filtracyjnego. Przenieś komórki do roztworu przeciwciał i inkubuj próbki przez noc w temperaturze 4 °C.Umyj komórki pięciokrotnie, używając jednego mililitra PBS, aby usunąć niezwiązane cząsteczki. Następnie przygotuj w PBS mieszaninę dwóch fluorescencyjnych przeciwciał wtórnych. Inkubuj próbki z przeciwciałami wtórnymi przez jedną godzinę w temperaturze pokojowej, w ciemności, w celu przeprowadzenia barwienia jąder.Inkubuj komórki przez trzy minuty z 200 µL 0,05 mM roztworu dappy w temperaturze pokojowej, w ciemności. Następnie przeanalizuj preparaty za pomocą mikroskopii konfokalnej, wykonując przekroje Z oraz płaszczyzny XZ w eksperymentach z koinkubacją. Wykorzystując inhibitory proteaz lub swoiste przeciwciało, inkubuj każdą z warunków eksperymentalnych przez 20 minut w temperaturze 4 °C z inhibitorami proteaz lub hodowlą przeciwciał monoklonalnych.Komórki MDCK na sterylnych przepuszczalnych podłożach transwell w górnej komorze, nanieść 100 µL zawiesiny komórkowej, a w dolnej komorze umieścić 600 µL uzupełnionej pożywki DMEM. Przygotowane filtry transwell umieścić w inkubatorze na mikroskopie odwróconym. Zweryfikować, czy komórki osiągnęły 100% konfluencji.Zebrać i połączyć pożywkę z górnej komory każdego transwellu, odmierzywszy 50 µL tej mieszaniny pożywek. Dodać 50 µL zawiesiny trofozoitów lub kontrolnie PBS. Następnie przenieść mieszaniny do górnej komory każdego transwellu zawierającego komórki MDCK.Niezależnie od czasu wprowadź dwie elektrody STX do każdego transwellu, aby zmierzyć transepitelialną oporność elektryczną. Upewnij się, że dłuższa elektroda dotyka dna dolnej komory, a krótsza elektroda jest zanurzona w medium w górnym przedziale. E histolytica były hodowane w warunkach beztlenowych i zbierane w późnej fazie logarytmicznej lub wczesnej fazie stacjonarnej wzrostu.W tym badaniu wykorzystano marker połączeń ścisłych ZO-1 do wizualizacji kontaktów komórek nabłonkowych, które są stabilizowane przez połączenia ścisłe i adherencyjne. Do badania interakcji kompleksu pochodzącego od ameby z powierzchnią nabłonka zastosowano immunofluorescencję z przeciwciałem monoklonalnym. Aplikacja trofozoitów, lizatów całkowitych lub produktów wydzielniczych na monowarstwę nabłonkową doprowadziła do kolokalizacji kompleksu z połączeniami ścisłymi. Po 30 minutach na granicach komórek pojawiło się przerywane barwienie ZO-1 oraz internalizacja w pęcherzykach.Zaburzenie to było najbardziej widoczne w kontaktach komórek MDCK z trofozoitami. Konfokalna mikroskopia laserowa całkowitych lizatów wykazała, że kompleks wirulencji przenikał w stronę przestrzeni międzykomórkowej. Kolokalizacja z zaburzonym barwieniem ZO-1 w miejscu kontaktu z pasożytem doprowadziła do naruszenia funkcji bariery nabłonkowej i spowodowała 90% spadek transepitelialnego oporu elektrycznego.Preinkubacja trofozoitów z przeciwciałem przeciwko kompleksowi lub z inhibitorami proteaz zapewniła ochronę przed spadkiem TER. Te dane sugerują, że zarówno aktywność proteolityczna, jak i właściwości adhezyjne są istotnymi czynnikami wirulencji tego kompleksu podczas inwazji E. histolytica. Po obejrzeniu tego filmu powinni Państwo posiadać dogłębną wiedzę na temat analizy mechanizmów, dzięki którym czynniki wirulencji E. histolytica otwierają połączenia ścisłe we wczesnych fazach infekcji. Po opanowaniu tej metody analiza uszkodzeń nabłonka może zostać przeprowadzona w ciągu trzech godzin, pod warunkiem przygotowania produktów lya i kultur komórkowych.Podczas wykonywania tej procedury ważne jest ścisłe przestrzeganie czasów oddziaływania jonów zgodnie z instrukcją. W celu odpowiedzi na dodatkowe pytania, takie jak możliwe powiązania między czynnikami wirulencji E. histolytica a białkami nabłonkowymi, po zakończeniu etapu rozwoju można przeprowadzić inne metody, np. analizy immunoprecypitacji. Technika ta utorowała drogę badaczom zajmującym się oddziaływaniami alside w badaniu patogenezy AMS u chomików, myszy, świnek morskich oraz w tkankach ludzkich.

analysis-epithelial-damage-produced-entamoeba-histolytica

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Immunologia i infekcje

Analiza uszkodzenia nabłonka wywołanego przez infekcję Entamoeba histolytica

Ten film demonstruje metodę barwienia hematoksyliny i eozyny (H&amp;E) do oceny uszkodzenia jelita grubego w mysim modelu zapalenia jelita grubego wywołanego przez DSS - choroby zapalnej jelit. Po wyizolowaniu okrężnicy od myszy leczonej DSS i uzyskaniu skrawków tkanki, barwienie H&amp;E skrawków pomaga zidentyfikować uszkodzenia tkanek spowodowane stanem zapalnym.

Barwienie hematoksyliną i eozyną w celu oceny uszkodzenia jelita grubego w zapaleniu jelita grubego wywołanym przez DSS

Dokładna ocena efektów przeciwzapalnych ma ogromne znaczenie dla oceny potencjalnych nowych leków do leczenia nieswoistych zapaleń jelit. Cyfrowa mikroskopia holograficzna umożliwia ocenę stanu zapalnego w próbkach tkanki mysiej i ludzkiej okrężnicy, a także zautomatyzowaną multimodalną ocenę gojenia się ran nabłonkowych in vitro.

Multimodalne ilościowe obrazowanie fazowe z cyfrową mikroskopią holograficzną dokładnie ocenia stan zapalny jelit i gojenie się ran nabłonkowych

Obecne metody leczenia chorób zapalnych jelit (IBD) mają na celu złagodzenie objawów choroby, ale mogą powodować poważne skutki uboczne. W związku z tym badane są alternatywne strategie w modelach zapalenia jelita grubego u zwierząt. W tym miejscu wyjaśniamy, w jaki sposób analizowany jest korzystny wpływ suplementów diety na kliniczne objawy IBD w takim modelu zapalenia jelita grubego.

Analiza korzystnego wpływu suplementów diety na funkcje bariery nabłonkowej jelit podczas eksperymentalnego zapalenia jelita grubego

Tutaj prezentujemy protokoły wizualizacji odpowiedzi wapnia (Ca2+) wywołanych przez komórki HeLa zakażone przez Shigella. Optymalizując parametry infekcji bakteryjnej i obrazując za pomocą sond fluorescencyjnychCa2+, scharakteryzowano nietypowe globalne i lokalne sygnały Ca2+ indukowane przez bakterie w szerokim zakresie kinetyki infekcji.

Obrazowanie odpowiedzi Ca2+ podczas zakażenia komórek nabłonkowych Shigella

Korzystając z mikroskopii przyżyciowej, przedstawiona tutaj metoda umożliwia wizualizację w czasie rzeczywistym wydalania komórek nabłonka jelitowego u żywych zwierząt. W związku z tym miejscowo wybarwiona błona śluzowa jelit (akryflawina i rodamina B-dekstran) znieczulonych myszy jest obrazowana do rozdzielczości pojedynczej komórki za pomocą mikroskopii konfokalnej.

Podejście oparte na mikroskopii przyżyciowej do oceny przepuszczalności jelit i wydajności wydalania komórek nabłonkowych

Systematyczne ocenianie stanu zapalnego jelit za pomocą darmowego systemu wspomaganego komputerowo jest potężnym narzędziem do ilościowego porównywania zmian histopatologicznych w modelach zapalenia jelita grubego charakteryzujących się obecnością wrzodów i zmian zapalnych. Ocena wyniku histologicznego zapalenia jelita grubego wzmacnia obserwacje kliniczne i ułatwia interpretację danych.

Systematyczna analiza punktacji zapalenia jelit w modelu zapalenia jelita grubego wywołanego mysim dekstranem sodu

Obecny protokół opisuje testy infekcji do badania przestrzegania Shigella, inwazji i replikacji wewnątrzkomórkowej przy użyciu linii komórkowych nabłonka in vitro.

Analizy zakażeń komórek nabłonkowych preparatem Shigella

Badanie przedstawia metodę badania in vitro infekcji bakteryjnej z wykorzystaniem organoidów pochodzenia tkankowego z komórek macierzystych. Protokół opisuje, jak hodować i różnicować organoidy w dwóch wymiarach, zakażać je adherentno-inwazyjnymi Escherichia coli oraz oceniać kluczowe odczyty, w tym przełamanie bariery nabłonkowej, obrazowanie infekcji oraz odpowiedź RNA nabłonkowego.

Dwuwymiarowa hodowla organoidów na inwazynie lub wyciągu z błony podstawowej do badania interakcji gospodarz-bakteria

Oporność na antybiotyki wśród szczepów Escherichia coli adhezywno-inwazyjnych stanowi wyzwanie dla oceny inwazji bakteryjnej przy użyciu tradycyjnego testu ochrony gentamycyną. Opisano ulepszoną metodę oceny ilościowej inwazji bakteryjnej poprzez liczenie jednostek tworzących kolonie i oceny jakościowej poprzez wizualizację zakażonych komórek za pomocą konfokalnej mikroskopii immunofluorescencyjnej.

Test ochrony amikacyny do ilościowego i wizualnego określenia Escherichia coli inwazji komórkowej

Niniejszy protokół opisuje przygotowanie syntetycznego substratu tRNA dla homologu metylotransferazy DNA/tRNA 2 (Dnmt2) z Entamoeba histolytica, Ehmeth, oraz pomiar jego aktywności metylotransferazy. To podejście eksperymentalne może być wykorzystane do badania aktywności innych białek Dnmt2.

Analiza metylacji tRNA in vitro z użyciem enzymu DNA i tRNA metylotransferazy Dnmt2 (Ehmeth) z Entamoeba histolytica

Poznaj metodę analizy uszkodzeń nabłonka wywołanych zakażeniem Entamoeba histolytica przy użyciu immunofluorescencji i pomiaru oporności elektrycznej. Technika ta pozwala badać wczesne interakcje pasożyta z komórkami gospodarza.

Analiza uszkodzeń nabłonka wywołanych zakażeniem Entamoeba histolytica

Przeglądaj więcej filmów