Name: Projektowanie i produkcja ultralekkich, regulowanych sond wieloelektrodowych do zapisów elektrofizjologicznych u myszy (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-09-08T14:00:00.000+00:00
Duration: 15 min 43 s
Description: Poznaj metodę projektowania i produkcji ultralekkich sond wieloelektrodowych do zapisów elektrofizjologicznych u myszy. Technika umożliwia stabilne rejestracje aktywności neuronalnej u swobodnie poruszających się zwierząt.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

Dziękujemy członkom laboratorium Wilsona za ich pomocne rady dotyczące metody wytwarzania.
Ta praca była wspierana przez Fundację Simonsa, nagrodę NIH za ścieżkę kariery do niezależności od NINDS oraz nagrodę NARSAD Young Investigator Award (dla M.M.H.), a także granty od NIH (dla M.A.W.).

1. Założenia projektowe
<ol>
	<li>Zidentyfikuj wybrany obszar mózgu (jądro kolankowate boczne (LGN, wzgórze wzrokowe)) przewijając sekcje strzałkowe elektronicznego atlasu mózgu myszy.</li>
	<li>Przy współrzędnych A/P (-2,3 – -2,7 mm) LGN jest najszerszy. Użyj tego regionu, aby zaprojektować spód dysku (dolne części). 
	UWAGA: Do celowania w LGN można użyć łącznie 8 niezależnie ruchomych elektrod (4-6 elektrod dotrze do LGN, 2-4 elektrody są dodawane w celu zrównoważenia błędów implantacji, rysunek 1A).</li>
	<li>W Solidworks narysuj szkic bryły projektu (Rysunek 1B) w płaszczyźnie czołowej. Kliknij szkic, a następnie użyj kombinacji linii i krzywych, aby narysować szkic, który będzie zawierał kontury podstawy napędu, uchwytów i półszczelin z poliamidu, jak pokazano. Upewnij się, że kontur nie zawiera żadnych otwartych przerw. Następnie kliknij przycisk Wyjdź ze szkicu.</li>
	<li>Następnie wybierz zarówno przednią, jak i prawą płaszczyznę i kliknij "Utwórz oś". Następnie utwórz model bryły projektu 3D, obracając podświetlony niebieski kontur szkicu (Rysunek 1B) o 360°. W menu funkcji kliknij "Revolving Boss/Base". Wybierz linię środkową jako oś obrotu. W sekcji parametrów w obszarze kierunek 1 kliknij opcję Żaluzja, a w polu kąt wybierz 360,00 stopni. W sekcji wybrane kontury upewnij się, że zaznaczony na niebiesko kontur jest zaznaczony.</li>
	<li>Utwórz jedną półszczelinę poliimidową, obracając podświetlone na czerwono kontury o 13° (Rysunek 1C, u góry po lewej). Kroki są identyczne jak w punkcie 1.4 powyżej, z wyjątkiem specyfikacji kąta</li>
	<li>Utwórz jeden uchwyt napędu, obracając zielony kontur o 15° (Rysunek 1C, prawy górny róg).</li>
	<li>Utwórz drugi uchwyt napędu za pomocą funkcji kołowego wzoru (Rysunek 1C, na dole po lewej). W menu funkcji kliknij "Okrągły wzór". W parametrach wybierz linię środkową jako oś obrotu. Wybierz 180,00 stopni jako kąt i 2 jako liczbę wystąpień. Upewnij się, że pierwszy uchwyt jest wybrany w sekcji "Cechy do wzorca".</li>
	<li>Utwórz szesnaście półszczelin poliimidowych za pomocą funkcji wzoru kołowego (Rysunek 1C, na dole po lewej). Wykonuj ruchy podobne do 1.7, ale wybierz pierwszą półszczelinę poliimidową jako "Cechy do wzoru". Kąt wynosi 22,5°, a liczba wystąpień wynosi 16 (Uwaga: jest to tylko 360° podzielone przez liczbę przypadków, w których chcesz utworzyć wzór obiektu)</li>
	<li>Utwórz nową płaszczyznę, na której narysujesz pojemnik poliimidowy. Aby to osiągnąć, kliknij "wstaw" w menu głównym. Kliknij "Geometria odniesienia", wybierz dwie strony półszczelin poliimidowych, a następnie kliknij "Utwórz nową płaszczyznę"; (Rysunek 1D, góra)</li>
	<li>Utwórz gniazdo mikronapędu (otwór na, otwór poliimidowy i szyna zapobiegająca momentowi obrotowemu (Rysunek 1D, na dole). Osiągnij to, tworząc szkic, który obejmuje wszystkie te elementy na nowej płaszczyźnie utworzonej w wersji 1.9. Należy pamiętać, że w przypadku szyn zapobiegających momentowi obrotowemu należy zdefiniować linię środkową między dwiema stronami górnych szczelin z poliamidu. Następnie narysuj szyny zapobiegające momentowi obrotowemu, tworząc dwa okręgi prostopadłe do linii środkowej, których środki są oddalone od siebie o 1 promień, a następnie przycinając środkowy kontur.</li>
	<li>W menu Funkcje kliknij "Extrude Boss/Base", aby utworzyć szynę antymomentową i wybrać wytłoczenie nieprzelotowe o szerokości 10 mm w górę i 2 mm w dół. W przypadku otworu na i otworu poliamidowego kliknij "Cięcie wytłaczające" i wybierz ślepe 6 mm i kilka mm idących w górę dla obu (Rysunek 1E, po lewej).</li>
	<li>Ułóż gniazdo mikronapędu 16x, używając środka jako osi obrotu (22,5°, 16 instancji, równe odstępy), (Rysunek 1E, po prawej)</li>
	<li>Na górze uchwytu narysuj pudełko o wymiarach 3 mm x 3 mm, zaczynając od środkowej końcówki uchwytu napędu, skierowanego w stronę osi środkowej. Wyciągnij to 2 mm w górę za pomocą funkcji "Extrude Boss". Narysuj okręgi o średnicy 1 mm w miejscach, w których będą wchodzić EIB. Następnie wykonaj 1,5 mm "Extrude Cut", aby zrobić otwór. Następnie ułóż ramkę i otwór dwukrotnie, korzystając z funkcji Wzór kołowy (nakładka tekstowa: 180°, 2 instancje, równy odstęp, wokół osi środkowej).</li>
	<li>Użyj wymiarów (w milimetrach) na rysunku 1F, aby narysować szkic górnego elementu. Użyj opcji "Extrude Boss/Base", aby stworzyć model 3D. 
	UWAGA: Po wykonaniu tych czynności projekt napędu jest gotowy. Fizyczny korpus dysku jest tworzony w procesie stereolitografii. Istnieje wiele firm, które oferują druk stereolitograficzny na podstawie plików STL. Polecamy usługi, które mogą drukować w twardym plastiku (takie jak Accura® 55), o minimalnej rozdzielczości co najmniej 0,1 mm.</li>
</ol>
2. Przygotowanie komponentów hipernapędu
<ol>
	<li>Rozłóż mały kawałek taśmy dwustronnej na płaskiej powierzchni i przytnij niezbędną liczbę rurek poliimidowych 31 G na około 8 centymetrów (ID/OD:.0071''/.0116''; Ściana: .00225) (Rysunki 2A - 2B).</li>
	<li>Ułóż pierwszą warstwę rur prowadzących na taśmie dwustronnej, uważając, aby rurki prowadzące były umieszczone jak najbliżej siebie na taśmie. Nanieś niewielką ilość cienkiego kleju cyjanoakrylowego na warstwę poliimidów. (Rysunek 2C)</li>
	<li>Szybko ułóż drugą warstwę poliimidów (rysunek 2D).</li>
	<li>Utwórz symbol zastępczy światłowodu za pomocą kaniuli 26 G. Upewnij się, że jest on nasmarowany smarem na bazie teflonu przed włączeniem go do zespołu (Rysunek 2E).</li>
	<li>Nałożyć linię żywicy epoksydowej o długości 4-5 mm prostopadłą do wiązki poliimidu (rysunek 2F). Gdy żywica epoksydowa stwardnieje (2-3 godziny), usuń taśmę z dolnej warstwy i ponownie zaimpregnuj żywicę epoksydową po drugiej stronie. Po ponownym stwardnieniu żywicy epoksydowej można usunąć kaniulę 26 G i przeciąć konstrukcję w środku za pomocą żyletki (ryc. 2G), w wyniku czego powstają dwie matryce poliimidowe, z których każda może być użyta do jednego hipernapędu (ryc. 2H).</li>
	<li>Wydrukuj szablon stożka na arkuszu przezroczystego papieru i wytnij odpowiedni arkusz wytrzymałej folii aluminiowej (rysunki 3A - 3C).</li>
	<li>Nałóż warstwę żywicy epoksydowej na folię aluminiową i szybko nałóż przezroczysty papier. Za pomocą ciężkiego przedmiotu lub drewnianego kołka wygładź żywicę epoksydową, aby była równomiernie rozprowadzona (Rysunek 3D).</li>
	<li>Wytnij szablon stożka i zaciśnij razem za pomocą zacisku krokodylkowego. Na koniec użyj kolejnej dawki żywicy epoksydowej, aby trwale przymocować kawałki (Rysunek 3E).</li>
</ol>
3. Końcowy montaż mikronapędu
<ol>
	<li>Przymocuj EIB do korpusu napędu i ponownie włóż kaniulę 26 G przez matrycę rurki prowadzącej z poliimidu. Dopasuj matrycę poliimidową do korpusu napędu za pomocą otworu światłowodowego w EIB, aby upewnić się, że rury prowadzące są prostopadłe do EIB, a matryca epoksydowa do korpusu napędu, uważając, aby żadna żywica epoksydowa nie dostała się do rur prowadzących lub do korpusu napędu (rysunki 4A - 4C).</li>
	<li>Przyporządkuj każdą rurkę prowadzącą w matrycy poliimidowej do odpowiedniego wspornika na wewnętrznej ścianie korpusu napędu. Nasuń mały pierścień z poliimidu 33 G na każdą rurkę prowadzącą i do wspornika i nałóż niewielką ilość kleju cyjanoakrylowego, aby przymocować każdą rurkę prowadzącą. (Rysunki 4D - 4E) Na koniec należy przyłożyć cały aparat do wewnętrznej ścianki korpusu napędu i przyciąć poliimidy tak, aby wystawały tuż nad wewnętrzną wargę (rysunki 4F - 4G).</li>
	<li>Zbuduj zespół mikronapędu, wkładając jedną z niestandardowych przez środkowy otwór górnego elementu, a następnie jedną ze sprężyn 5 mm. Nasuń zewnętrzny otwór górnej części na jedną z szyn i delikatnie wkręć. Wkręć, aż sprężyna osiągnie minimalną długość ściśniętą. (Rysunki 4H - 4I) Powtórz ten proces dla każdej szyny/mikronapędu (Rysunek 4J).</li>
	<li>Odwróć układ napędowy do góry nogami i zrób zdjęcie matrycy rurki prowadzącej. Rysunek ten zostanie wykorzystany do zmapowania położenia rurki prowadzącej odpowiadającej każdemu mikronapędowi (Rysunek 4K).</li>
	<li>Włóż rurkę poliamidową (0.005') do każdej rury prowadzącej od spodu podstawy napędu. Niech rurka nośna wystaje 1-2 mm od górnej krawędzi całkowicie opuszczonego napędu mikronapędowego i zapisać na zdjęciu tożsamość odpowiedniego napędu mikronapędu. (Rysunki 4L - 4M)</li>
	<li>Epoksydować rurkę poliimidową do wspornika mikronapędu, uważając, aby żywica epoksydowa nie przedostała się przez mikronapęd na sprężynę lub (rysunki 4N, 4P - 4Q).</li>
	<li>Całkowicie opuść wszystkie napędy microdrive. Odetnij wszystkie rurki poliimidowe równo z dnem matrycy poliimidowej (rysunek 4O).</li>
	<li>Zamontuj płytkę interfejsu elektrody do podstawy napędu za pomocą dwóch #00-90 x 3/16'' (Rysunek 4R). 
	UWAGA: W tym momencie macierz napędowa jest gotowa do załadowania stereotrodami lub tetrodami. Szczegółowe informacje na temat budowy i obciążenia tetrody znajdują się w punkcie 10. Wydrukowana podstawa napędu i mikronapędy zostały zaprojektowane w oprogramowaniu CAD 3D SolidWorks 2011: proszę <a href="/files/ftp_upload/51675/MouseDriveDoublePost.STL">kliknij tutaj,</a> aby pobrać plik SolidWorks.</li>
	<li>Po załadowaniu odwróć napęd i ostrożnie opuść stożek ekranujący nad napędem, tak aby wystawał tylko dolny element. Przymocuj stożek ekranujący, epoksydując stożek do korpusu napędu.</li>
	<li>Po przymocowaniu stożka zdejmij izolację z drutu ze stali nierdzewnej o niewielkiej długości (.008'' Goły, .011'' Powlekany) i przypnij do EIB. Zdrap wewnętrzną, aluminiową część stożka igłą i zmielić drut stalowy do stożka za pomocą srebrnej farby. Po wyschnięciu srebrnej farby wzmocnij ją odrobiną żywicy epoksydowej. Alternatywnie, drut stalowy można bezpośrednio przymocować do stożka za pomocą odrobiny przewodzącej żywicy epoksydowej (MG Chemicals, Surrey, Kanada).</li>
</ol>

<ol><li>Boyden, E. S., Zhang, F., Bamberg, E., Nagel, G., Deisseroth, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Millisecond-timescale%2C+genetically+targeted+optical+control+of+neural+activity%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Millisecond-timescale, genetically targeted optical control of neural activity.</a> Nat Neurosci. 8, 1263-1268 (2005).</li>
<li>Fenno, L., Yizhar, O., Deisseroth, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+development+and+application+of+optogenetics%5BTitle%5D)+AND+%22Annu+Rev+Neurosci%22%5BJournal%5D)">The development and application of optogenetics.</a> Annu Rev Neurosci. 34, 389-412 (2011).</li>
<li>Alexander, G. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Remote+control+of+neuronal+activity+in+transgenic+mice+expressing+evolved+G+protein-coupled+receptors%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Remote control of neuronal activity in transgenic mice expressing evolved G protein-coupled receptors.</a> Neuron. 63, 27-39 (2009).</li>
<li>Halassa, M. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Selective+optical+drive+of+thalamic+reticular+nucleus+generates+thalamic+bursts+and+cortical+spindles%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Selective optical drive of thalamic reticular nucleus generates thalamic bursts and cortical spindles.</a> Nat Neurosci. 14, 1118-1120 (2011).</li>
<li>Tsien, J. Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Subregion-+and+cell+type-restricted+gene+knockout+in+mouse+brain%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Subregion- and cell type-restricted gene knockout in mouse brain.</a> Cell. 87, 1317-1326 (1996).</li>
<li>Nestler, E. J., Hyman, S. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Animal+models+of+neuropsychiatric+disorders%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Animal models of neuropsychiatric disorders.</a> Nat Neurosci. 13, 1161-1169 (2010).</li>
<li>Collins, P. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Grand+challenges+in+global+mental+health%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Grand challenges in global mental health.</a> Nature. 475, 27-30 (2011).</li>
<li>Wilson, M. A., McNaughton, B. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dynamics+of+the+hippocampal+ensemble+code+for+space%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Dynamics of the hippocampal ensemble code for space.</a> Science. 261, 1055-1058 (1993).</li>
<li>Wilson, M. A., McNaughton, B. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Reactivation+of+hippocampal+ensemble+memories+during+sleep%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Reactivation of hippocampal ensemble memories during sleep.</a> Science. 265, 676-679 (1994).</li>
<li>Nguyen, D. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Micro-drive+array+for+chronic+in+vivo+recording%3A+tetrode+assembly%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Micro-drive array for chronic in vivo recording: tetrode assembly.</a> J Vis Exp. (26), (2009).</li>
</ol>

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Protokół ten przedstawia proces konstruowania ultralekkiej macierzy mikronapędów do celowania w jeden lub wiele regionów mózgu myszy. Po końcowych etapach budowy hipernapęd jest gotowy do wszczepienia przy użyciu standardowych technik implantacji chirurgicznej i przymocowania do czaszki myszy za pomocą cementu dentystycznego. Po implantacji każda elektroda może być wysuwana niezależnie za pomocą małego śrubokręta, podczas gdy mysz jest przytrzymywana ręką. Odległość na obrót, jaką przesuwa się każda elektroda, zależy od skoku. Użycie, o których tutaj mowa, przesuwa każdą elektrodę o około 150 mm na obrót, chociaż w celu uzyskania większej rozdzielczości można użyć pół i ćwierć obrotu.
Wymiary szkicu na rysunku 1B określają całkowity rozmiar implantu, dlatego oczywistym sposobem dwukierunkowego skalowania implantów jest zmiana wymiarów na tym krytycznym szkicu. Dodatkowo długość można wydłużyć, aby celować w głębsze struktury mózgu. Polecamy tytanowe wykonane na zamówienie, ponieważ są one lekkie i mniej kruche niż stalowe. Zwróć uwagę, że szyny antymomentowe muszą skalować się liniowo wraz z długością, a w tym momencie nie określiliśmy maksymalnej długości, na jakiej można wydrukować te konstrukcje. Aby celować w wiele obszarów mózgu, kształt dolnej części można zmodyfikować. Dodanie podkładek o znanych rozmiarach (grubość 200 μm) może zapewnić potrzebne przekładki między poliimidami ukierunkowanymi na oddzielne struktury mózgu (na przykład hipokamp i korę przedczołową). Można je włączyć do etapów montażu dolnego elementu, a następnie odciąć po stwardnieniu żywicy epoksydowej.
Dużym ograniczeniem tej konstrukcji jest jej zależność od autorskiego oprogramowania (w tym przypadku Solidworks). Przyszły rozwój programów open source, które zapewniają przyjazne dla użytkownika interfejsy sprzyjające projektowaniu takiego sprzętu przy minimalnym zapleczu inżynieryjnym, przyniósłby ogromne korzyści społeczności neuronaukowej.
Ta metoda ma kilka zalet w porównaniu z istniejącymi metodami. Po pierwsze, projekt jest prosty, zależny od bardzo niewielu szkiców (rysunek 1). Po drugie, jest ultralekki, nie wymaga cementu dentystycznego ani ciężkiego materiału do jego montażu. Ogółem waży około 1,7 g – prawie jedną trzecią wagi dostępnych na rynku implantów o podobnej funkcjonalności. Po trzecie, nie wymaga specjalistycznego sprzętu do wykonania – korpus implantu można wydrukować w 3D z wielu źródeł (na przykład approto.com, ale jest jeszcze kilka innych); mogą być wykonane na zamówienie (na przykład antrinonline.com); sprężyny są dostępne na rynku (na przykład leesprings.com); W rezultacie cały proces montażu może odbyć się w ciągu jednego dnia. Wreszcie, implanty te zostały wykorzystane do rejestrowania z wielu obszarów mózgu podczas naturalnego żerowania, ustrukturyzowanych zadań behawioralnych i snu (ryc. 5).
Przyszłe zastosowania tej metody obejmują implementację jej skalowalności. Jest prawdopodobne, że implant może być skalowany dwukierunkowo po prostu poprzez zmianę 1) rozmiaru szkicu na rysunku 1B i 2) liczby gniazd mikronapędu (rysunek 1D) wzorzystych. Na przykład, można go przeskalować w dół, aby zarejestrować swobodnie zachowujące się myszy we wczesnym okresie rozwoju, i przeskalować w górę, aby zarejestrować dane dotyczące szczurów, królików, fretek i być może naczelnych innych niż ludzie.
Ostatnim słowem jest przypomnienie czytelnikowi, że kluczowe znaczenie dla pomyślnego wdrożenia opisanej metody ma prototypowanie wszelkich modyfikacji, które wdrażają w załączonych plikach projektowych .stl. Czytelnik zauważy na przykład, że załączony projekt zawiera szynę antyrekwartową "rysunek 8". Był to najlepszy możliwy projekt, biorąc pod uwagę ograniczenia druku 3D, ponieważ często wymagane jest wywiercenie tych otworów. Gdyby był to okrąg, zagroziłoby stabilności, ale gdyby był to kształt kwadratowy lub kątowy, ograniczyłoby to możliwość naprawienia niedoskonałości druku 3D przez wiercenie.

Mus musculus, ze względu na swoją genetyczną podatność, szybko stał się modelem zwierzęcym wybieranym przez fizjologów zainteresowanych mikroanalizą genetycznie zidentyfikowanych neuronów oraz badaniem mysich modeli chorób ludzkich. Na przykład, niedawne wprowadzenie przyczynowych narzędzi genetycznych, takich jak optogenetyczne i chemiczne aktywatory genetyczne, pozwoliło eksperymentatorom przetestować konieczność i wystarczalność zidentyfikowanych obwodów neuronalnych w zachowaniu1-4. Szeroka dostępność rekombinowanych transgenicznych linii sterujących myszy (Cre-lines) wzmocniła eksperymentalną łatwość, z jaką celowane są podtypy neuronów, zwiększając wartość myszy w tych eksperymentach.
Podobnie, genetyczne badania przesiewowe i powiązania powszechnych zaburzeń neurologicznych i psychiatrycznych w całym genomie ułatwiły identyfikację genetycznych czynników ryzyka chorób mózgu6,7. Postępy te, w połączeniu z rosnącym zestawem narzędzi do manipulacji genetycznych i inżynierii genomu u myszy, sprawiły, że jest to organizm z wyboru do modelowania chorób ludzkich. Połączenie modeli chorób i narzędzi genetyki przyczynowej daje bezprecedensową możliwość zrozumienia chorób mózgu i zidentyfikowania celów interwencji na poziomie obwodu.
Aby w pełni wykorzystać te molekularne narzędzia i uzyskać wgląd w funkcje mikroukładów w zdrowiu i chorobie, konieczne jest połączenie ich z fizjologicznymi odczytami aktywności mózgu. Idealnie byłoby, gdyby eksperymentator był w stanie monitorować dużą liczbę neuronów przy jednoczesnym zachowaniu rozdzielczości pojedynczej komórki. Taką możliwość dają zewnątrzkomórkowe, wieloelektrodowe nagrania u swobodnie zachowujących się zwierząt; Jednak zastosowanie tej technologii w myszy zostało ograniczone. Do rejestracji z małych celów (np. warstwy CA1 w hipokampie) konieczne jest użycie elektrod regulowanych, ponieważ niewielkie ruchy elektrod rejestrujących po implantacji chirurgicznej uniemożliwiają utrzymanie stabilności zapisu8,9. Tradycyjnie, metody, które zostały zastosowane do przesuwania elektrod w mózgu, nakładają ograniczenia masy, gdy są stosowane u myszy, co utrudnia powiązanie rejestracji dużej liczby neuronów z zachowaniem w tym organizmie.
Tutaj wprowadzane są metody wytwarzania miniaturowych, ultralekkich układów mikroelektrod, które są indywidualnie dostosowywane do docelowego obszaru mózgu, kompatybilne z optogenetyką i łatwe do złożenia z dostępnych na rynku części. Każdy "mikronapęd" w wieloelektrodowym "hipernapędzie" wykorzystuje mechanizm sprężynowo-śrubowy do przesuwania elektrody oraz plastikową szynę, wbudowaną w korpus hipernapędu, aby przeciwdziałać momentowi obrotowemu ze. Po pierwsze, opisano proces projektowania korpusów hipernapędów i mikronapędów w programie CAD do druku 3D. Projektując korpusy hipernapędów, które są dostosowane do konkretnych struktur, możliwe jest zwiększenie precyzji celowania i dalsze zwiększenie wydajności preparatu. Po drugie, szczegółowo opisano proces produkcji, w którym układ wieloelektrodowy jest montowany ręcznie z części, które są dostępne na rynku. Technika ta została z powodzeniem wykorzystana do nagrywania z zespołów neuronów w hipokampie, wzgórzu i korze mózgowej u swobodnie zachowującego się zwierzęcia podczas naturalnych zadań związanych z żerowaniem i operacjami.

<table><tbody><tr><td>mikronapędowe</td><td>Antrin</td><td></td><td>Half Circle 0,6 UNM tytanowe. Gwint 8 mm. Długość 9 mm od spodu łba.</td></tr><tr><td>Łatwość gwintowania</td><td>AGS CO.</td><td>#TA2</td><td>Stukanie</td></tr><tr><td>smaru Microdrives</td><td></td><td></td><td>Patrz . Plik STL</td></tr><tr><td>Korpus</td><td></td><td></td> dysku <td>Patrz . Plik STL</td></tr><tr><td>Zewnętrzna rurka prowadząca z poliimidu Elementy</td><td>inwazyjne&nbsp; &nbsp;</td><td>IWG Pozycja # 72113300022-012</td><td>Długość: 12' ', ID: 0.0071' ', OD: 0,0116' ', ŚCIANA: 0,00225' '</td></tr><tr><td>Wewnętrzna poliimidowa rurka prowadząca Elementy</td><td>inwazyjne&nbsp;</td><td>IWG Pozycja # 72113900001-012</td><td>Długość: 12' ', ID: 0.0035' ', OD: 0,0055' ', ŚCIANA: 0,001' '</td></tr><tr><td>Przewód uziemiający</td><td>A-M Systems, Inc.</td><td>&nbsp; Numer katalogowy # 791900</td><td>0.008'' Goły, 0.011'' Powlekany</td></tr><tr><td>smar Tri-Flow</td><td></td><td></td><td>na bazie teflonu - Aerosol</td></tr><tr><td>Microdrive Springs</td><td>Lee Spring</td><td>Part # CB0050B 07 E</td><td>Średnica zewnętrzna: 1.016 mm, Średnica otworu: 1.193 mm, Średnica drutu: 0.127 mm, Długość swobodna: 10.160 mm, Długość bryły: 3.581 mm</td></tr><tr><td><a name="ZASIĘG! A24">Z-poxy 5 minut</a></td><td>Technologia Pacer (Zap)</td><td>PT37</td><td></td></tr><tr><td>Srebrna farba</td><td>GC Elektronika</td><td>Część #: 22-023</td><td>Srebrny wydruk II</td></tr><tr><td></td><td>Tri-Flow&nbsp;</td><td>20009</td><td></td></tr><tr><td>Rurka podskórna 26 G - małe części ze stali nierdzewnej</td><td></td><td>HTXX-26T-12-10</td><td>Długość: 12' ', ID: 0.012' ', OD: 0,018' '</td></tr><tr><td>EIB</td><td>Component Supply Co.</td><td>MX-0090-03SP</td><td>#00-90 x 3/16' '</td></tr><tr><td>Cienkie nożyczki - Toughcut</td><td>Fine Science Tools</td><td>14058-09</td><td></td></tr><tr><td>Papier przezroczysty</td><td>22 mm 3M</td><td>PP2500</td><td></td></tr><tr><td>Folia aluminiowa</td><td>Reynold's Wrap Heavy Duty</td><td></td><td>Extra Thick</td></tr></tbody></table>

projektowanie i produkcja ultralekkich, regulowanych sond wieloelektrodowych do zapisów elektrofizjologicznych u myszy

Design and Fabrication of Ultralight Weight, Adjustable Multi-electrode Probes for Electrophysiological Recordings in Mice

Liczba badań fizjologicznych u myszy, mus musculus, ostatnio wzrosła, równolegle z rozwojem metod genetycznego celowania w preparację mikroukładów i modelowanie chorób. Na przykład wprowadzenie optogenetyki pozwoliło na dwukierunkową manipulację genetycznie zidentyfikowanymi neuronami, w niespotykanej dotąd rozdzielczości czasowej. Aby wykorzystać te narzędzia i uzyskać wgląd w dynamiczne interakcje między mikroobwodami mózgu, niezbędna jest możliwość nagrywania z zespołów neuronów głęboko w mózgu tego małego gryzonia, zarówno w preparatach zaciśniętych na głowie, jak i swobodnie zachowujących się. Nagrywanie z głębokich struktur i odrębnych warstw komórek wymaga przygotowania, które umożliwia precyzyjny postęp elektrod w kierunku pożądanych obszarów mózgu. Aby rejestrować zespoły neuronowe, konieczne jest, aby każda elektroda była niezależnie ruchoma, co pozwala eksperymentatorowi na rozdzielenie pojedynczych komórek, pozostawiając sąsiednie elektrody niezakłócone. Aby zrobić jedno i drugie w swobodnie zachowującej się myszy, potrzebny jest napęd elektrod, który jest lekki, wytrzymały i wysoce konfigurowalny do celowania w określone struktury mózgu.
Przedstawiono technikę projektowania i wytwarzania miniaturowych, ultralekkich, mikronapędowych układów elektrod, które można indywidualnie dostosować i łatwo złożyć z dostępnych na rynku części. Urządzenia te są łatwo skalowalne i można je dostosować do docelowej struktury; Jest z powodzeniem stosowany do nagrywania z obszarów wzgórza i kory mózgowej u swobodnie zachowującego się zwierzęcia podczas naturalnego zachowania.

Konstrukcja implantu jest procesem, który rozpoczyna się od zaprojektowania wydrukowanego w technologii 3D hyperdrive'u (Rycina 1), a następnie przechodzi do wykonania elementu dolnego (Rycina 2), stożka ekranującego (Rycina 3) i końcowego montażu hyperdrive'u poprzez indywidualną konstrukcję microdrive'ów (Rycina 4). Kolejnym etapem jest wyposażenie microdrive'ów w elektrody (patrz 10). Po tym kroku możliwe jest wykorzystanie tych urządzeń do rejestracji aktywności z wielu obszarów mózgu. Na Rycine 5 przedstawiono przykładowe przebiegi z jednoczesnej rejestracji z bocznego ciała kolankowatego (LGN) i hipokampa (HPC). Stabilność pojedynczych jednostek pokazanych na Rycine 5B była wyjątkowa, wykazując spójne kształty fal w ciągu kilku dni. Potwierdzono, że neurony te są neuronami LGN, ponieważ reagowały one na stymulację diodą emitującą światło, co obrazuje histogram czasu perystymulacyjnego (PSTH) na Rycine 5C. W tej samej preparacji zarejestrowano potencjał polowy HPC jako wskaźnik stanu behawioralnego. Przebiegi te wykazały obecność ostrych fal i ripli (sharp wave ripples) (Rycina 5D) podczas spoczynku behawioralnego, co jest zgodne z ich hipokampowym pochodzeniem.
<img alt="Proces rozmieszczania poliimidu i modelowania 3D; schemat, szkic, metoda obrotowa, projekt CAD." src="/files/ftp_upload/51675/51675fig1highres.jpg" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="Rysunek 1"> 
Rysunek 1. Projektowanie mikronapędu w programie Solidworks. A. Schemat przekroju czołowego mózgu myszy w współrzędnych A/P od -2,3 do -2,7 mm od bregmy. Nad korą narysowano cztery oddzielne poliimidy (300 µm), ilustrując celowanie elektrodami w obszar LGN (kolor czerwony). B. Szkic bryły projektowej. Obrót niebieskiego konturu o 180° pozwala uzyskać model 3D bryły projektowej (wstawka). C. Dodanie gniazd poliimidowych i uchwytów napędu do bryły projektowej. Obrót czerwonych zaznaczonych konturów z rysunku B o 13° skutkuje powstaniem połowy gniazda poliimidowego (lewy górny róg). Jeden uchwyt napędu dodano poprzez obrót zielonego konturu z rysunku B o 15° (prawy górny róg). Drugi uchwyt dodano przy użyciu funkcji wzoru kołowego (lewy dolny róg). Tą samą funkcją można utworzyć 16 połowic gniazd poliimidowych (prawy dolny róg). D. Do projektu dodano nową płaszczyznę (góra), co pozwala na stworzenie nowego szkicu gniazda mikronapędu, składającego się z otworu na śrubę, otworu na poliimidy i szyny przeciwobrotowej (dół). E. Elementy te zostaną zaimplementowane w projekcie za pomocą funkcji wycięcia i ekstruzji, a następnie obrócone o 360°, aby utworzyć 16 gniazd. F. Wymiary szkicu górnej części (lewo) oraz modelu 3D (prawo). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/51675/51675fig1large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby zobaczyć powiększoną wersję tego rysunku.</a>
<img alt="Wytwarzanie urządzenia mikrofluidycznego; wyrównywanie włókien, utwardzanie polimeru, widok w przekroju; konfiguracja laboratoryjna." src="/files/ftp_upload/51675/51675fig2highres.jpg" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="Rysunek 2"> 
Rysunek 2. Przygotowanie dolnej części hyperdrive'a. A. Pierwsza rurka polimidowa zostaje umieszczona na taśmie dwustronnej. B. Kolejne rurki są układane pojedynczo, z dbałością o zminimalizowanie odstępów między nimi. C. Po ułożeniu pierwszej warstwy nanoszona jest cienka warstwa kleju cyjanoakrylowego. D. Druga warstwa polimidów jest szybko dodawana przed wyschnięciem kleju. E. Na wierzchu wiązki polimidów umieszcza się kaniulę 26 G jako placeholder dla włókna optycznego. F. Cała konstrukcja zostaje stabilnie utrwalona kroplą żywicy epoksydowej. G. Po usunięciu kaniuli konstrukcja może zostać przecięta w połowie żyletką, co pozwala uzyskać dwie identyczne dolne części. H. Widok powierzchni cięcia gotowej dolnej części, przedstawiający dwa podwójne rzędy czterech polimidów oraz otwór na włókno optyczne. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/51675/51675fig2large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.</a>
<img alt="Montaż miękkiego robotycznego mikromanipulatora; schematy i zdjęcia; demonstracja struktury robotycznej." src="/files/ftp_upload/51675/51675fig3highres.jpg" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="Rysunek 3"> 
Rysunek 3. Montaż hyperdrive'u. A. Macierz polimidowa zostaje włożona do korpusu napędu i wyrównana z elektroniczną płytką interfejsu (EIB) za pomocą kaniuli 26 G. B. Niewielka ilość żywicy epoksydowej służy do przymocowania macierzy polimidowej do korpusu napędu. C. Może być konieczne drugie nałożenie żywicy epoksydowej, po czym nadmiar żywicy należy usunąć za pomocą narzędzia typu Dremel. D. Widok z góry na korpus napędu z włożoną macierzą. E. Za pomocą małego kawałka rurki polimidowej 33 G zewnętrzne rurki prowadzące zostają przymocowane w odpowiednich szczelinach korpusu napędu. F. Wszystkie zewnętrzne rurki prowadzące powinny zostać przypisane do szyny, dbając o zminimalizowanie naprężeń rurek. G. Po przypisaniu wszystkich zewnętrznych rurek prowadzących należy je zabezpieczyć żywicą epoksydową i odciąć tuż nad wewnętrzną krawędzią. H. Zespół mikronapędu, składający się z niestandardowej śruby, sprężyny 5 mm i elementu górnego, powinien zostać zmontowany i umieszczony nad szyną odpowiadającą jednej z rurek prowadzących. I. Każdy zespół mikronapędu należy ostrożnie wkręcić w korpus napędu. J. Po montażu każda rurka prowadząca powinna mieć odpowiadający jej mikronapęd. K. Widok z dołu macierzy polimidowej. L - M. Rurki polimidowe (0.005') zostają włożone do każdej zewnętrznej rurki prowadzącej. N. Każda wewnętrzna rurka prowadząca powinna ściśle pasować do widelca odpowiadającego jej mikronapędu. O. Wewnętrzne rurki polimidowe zostają przymocowane żywicą epoksydową do odpowiedniego mikronapędu i odcięte tak krótko, jak to możliwe. Po przyklejeniu wszystkich wewnętrznych rurek prowadzących, rurki wystające z macierzy polimidowej powinny zostać odcięte równo z krawędzią macierzy. P. Odwrócony widok makro napędu podczas ładowania wewnętrznych rurek prowadzących. Q. Górny widok makro napędu podczas ładowania wewnętrznych rurek prowadzących. R. W pełni zmontowany hyperdrive z podłączoną płytką EIB, gotowy do załadowania elektrod. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/51675/51675fig3large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby zobaczyć powiększoną wersję tego rysunku.</a>
<img alt="Proces mikrowytwarzania: Schemat fotolitografii z użyciem maskowania na folii aluminiowej." src="/files/ftp_upload/51675/51675fig4highres.jpg" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="Rycina 4"> 
Rycina 4. Przygotowanie stożka ekranującego. A. Szablon stożka wydrukowany na folii przezroczystej. B - D. Arkusz folii aluminiowej zostaje przyklejony do szablonu za pomocą cienkiej warstwy żywicy epoksydowej. E. Po wycięciu szablonu stożek jest formowany i sklejany żywicą epoksydową.
<img alt="Badanie neuronaukowe z myszą, zestaw do rejestracji EEG, schematy obszarów mózgu, wykres aktywności impulsowej." src="/files/ftp_upload/51675/51675fig5highres.jpg" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="Rysunek 5"> 
Rysunek 5. Rejestracje wielomiejscowe z wykorzystaniem ultralekkiego hyperdrive'u. A. Zdjęcie swobodnie poruszającej się myszy z wszczepionym hyperdrive'em. B. Przykłady rejestracji przebiegów czasowych dwóch pojedynczych jednostek u tej myszy. C. Po lewej, przekrój koronarny mózgu myszy z zaznaczonym jądrem bocznym ciała kolankowatego, do którego wprowadzono niektóre elektrody. Po prawej, przykładowe histogramy czasu po stymulacji (PSTH) dwóch neuronów LGN zsynchronizowane ze stymulacją wizualną (żółty pasek). D. Po lewej, przekrój koronarny z zaznaczonym hipokampem (HPC), do którego wprowadzono inny zestaw elektrod. Po prawej, przykład rejestracji lokalnego potencjału polowego dla oscylacji typu ripple w hipokampie (zaznaczenie czerwone).
<img alt="Schemat mikronapędu neurologicznego; podpisane elementy: tetroda, rurka prowadząca, szyna przeciwobrotowa." src="/files/ftp_upload/51675/51675fig6highres.jpg" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="Rysunek 6"> 
Rysunek 6. Przegląd komponentów napędu. (Po lewej) Kompleksowy przegląd komponentów hyperdrive. (Po prawej) Ilustracja pojedynczego zestawu mikronapędu.

Zrozumienie neuronalnych substratów zachowania wymaga nagrania zespołu obwodów mózgowych. Ze względu na swoją podatność genetyczną, mysz oferuje model do rozwarstwiania obwodów i mimikry choroby. W tym miejscu opisano metodę projektowania i wytwarzania zminiaturyzowanych sond, która jest odpowiednia do celowania w głęboką strukturę mózgu u myszy.

Projektowanie i produkcja ultralekkich, regulowanych sond wieloelektrodowych do zapisów elektrofizjologicznych u myszy

The number of physiological investigations in the mouse, mus musculus, has experienced a recent surge, paralleling the growth in methods of genetic ...

Ogólnym celem niniejszej procedury jest zaprojektowanie i zbudowanie wytrzymałego, ultralekkiego implantu z niezależnie regulowanymi elektrodami, wykonanego z dostępnych komercyjnie części, który może zostać dostosowany do dowolnego obszaru mózgu i łatwo przeskalowany do zastosowań u różnych gatunków małych zwierząt. W pierwszej kolejności należy zidentyfikować interesujący obszar mózgu i zaplanować rozmieszczenie elektrod rejestrujących. Na tej podstawie zostanie określona konstrukcja korpusu oraz podstawy napędu.Drugim krokiem jest zaprojektowanie w oprogramowaniu SolidWorks korpusu napędu, w którym zostaną umieszczone poszczególne mikronapędy, a także elementów górnych, które będą utrzymywać elektrody. Następnie przygotowuje się element dolny zawierający rurki prowadzące dla elektrod oraz stożek ekranujący. Ostatnim etapem jest pełny montaż hyperdrive'u poprzez włożenie elementu dolnego do korpusu napędu, skonstruowanie poszczególnych mikronapędów, podłączenie płytki interfejsu elektronicznego oraz załadowanie elektrod do mikronapędów.Ostatecznie implantowany jest hyperdrive, co pozwala na rejestrację pojedynczych jednostek z wielu obszarów mózgu. Dzięki łatwości, z jaką można dostosować i skalować hyperdrive, rozwiązanie to przyniesie korzyści wielu badaczom pracującym na różnych modelach zwierzęcych. Zastosowanie wytrzymałych i lekkich implantów umożliwia nam uzyskanie stabilnych rejestracji zespołów neuronalnych u myszy w warunkach swobodnego zachowania podczas wykonywania zadań psychofizycznych.Aby rozpocząć procedurę, należy zidentyfikować interesujący nas obszar mózgu. W naszym przypadku jest to ciało kolankowate boczne (LGN) w współrzędnych AP od -2,3 do -2,7 mm. LGN jest w tym miejscu najszersze, dlatego obszar ten wykorzystuje się do zaprojektowania podstawy prowadnicy.Otwórz oprogramowanie SolidWorks i wybierz płaszczyznę przednią. Za pomocą funkcji szkicu narysuj profil 2D napędu, który będzie obejmował kontury uchwytów podstawy napędu oraz połowic gniazd poliamidowych. Upewnij się, że kontur nie zawiera żadnych przerw.Następnie należy wybrać płaszczyznę przednią oraz prawą i kliknąć opcję tworzenia osi. Następnie należy wybrać funkcję obrotowego wyciągnięcia. Należy zaznaczyć niebieski profil 2D, a następnie obrócić profil 2D wokół osi o 360 stopni.Aby utworzyć trójwymiarową podstawę napędu, kliknij opcję blind w sekcji direction one i wprowadź 360 stopni jako kąt obrotu. Następnie utwórz jedną poliamidową połowę gniazda, zaznaczając podświetlony kontur i korzystając z funkcji revolve, aby obrócić kontur o 13 stopni wokół osi centralnej. Następnie zaznacz kontur uchwytów i obróć go o 15 stopni wokół osi centralnej, aby utworzyć drugi uchwyt napędu.Korzystając z funkcji wzoru kołowego w menu funkcji, kliknij wzór kołowy i wybierz oś centralną jako oś obrotu. Wybierz kąt 180 stopni oraz liczbę instancji równą dwóm, a następnie upewnij się, że w sekcji funkcji do powielenia zaznaczono pierwszy uchwyt, aby utworzyć 16 poliamidowych półwpustów. Używając funkcji wzoru kołowego, zaznacz pierwszy poliamidowy półwpust jako funkcję do powielenia.Powtórz wzór 16 razy, wprowadzając wartość 16 w polu liczby wystąpień oraz 22,5 stopni w polu kąta. Zdefiniuj nową płaszczyznę, klikając zakładkę płaszczyzny w sekcji geometrii referencyjnej. Wybierz dwie krawędzie jednego z górnych gniazd poliamidowych, aby utworzyć nową płaszczyznę.Ta płaszczyzna jest miejscem, w którym zostanie umieszczone gniazdo. Naszkicuj na tej płaszczyźnie okrągłe kontury otworu na śrubę oraz otworu poliamidowego. W przypadku szyn przeciwrotacyjnych wyznacz linię środkową pomiędzy dwiema stronami górnych szczelin poliamidowych.Następnie narysuj szyny przeciwrotacyjne, tworząc dwa okręgi prostopadłe do linii środkowej, których środki są oddalone od siebie o jeden promień, a następnie przytnij środkowe kontury, aby utworzyć gniazdo mikronapędu, w tym otwór na śrubę, otwór na poliamid oraz szynę przeciwrotacyjną. Kliknij pole Wypchnij boss/podstawę, aby utworzyć szynę przeciwrotacyjną, i wybierz wypchnięcie ślepe o wartości 10 mm w górę oraz 2 mm w dół. Następnie za pomocą funkcji Zaokrąglenie dodaj zaokrąglenia o promieniu 0,3 mm do krawędzi.Aby dodatkowo zwiększyć wytrzymałość otworu na śrubę oraz otworu poliamidowego, kliknij funkcję wyciągnij (extrude), wytnij (cut) i wybierz opcję ślepa (blind). Wykonaj cięcia o głębokości 3 mm dla obu elementów, kierując się w dół oraz o kilka milimetrów w górę. Następnie utwórz wzór gniazda mikronapędu 16 razy, używając środka górnej części uchwytu jako osi obrotu.Narysuj kwadrat o wymiarach 3 mm na 3 mm, zaczynając od środka końcówki uchwytu napędowego, skierowany w stronę osi centralnej. Wytłocz go o 2 mm w górę. Używając funkcji wytłaczania wypukłego, narysuj okręgi o średnicy 1 mm w miejscach, w których zostaną później umieszczone śruby EIB.Wykonaj wycięcie ekstruzyjne o głębokości 1,5 mm, aby stworzyć otwór. Następnie powiel kostkę i otwór dwukrotnie. Korzystając z funkcji wzoru kołowego, wykonaj dodatkowe wycięcia ekstruzyjne w korpusie napędu, aby dodatkowo zmniejszyć jego masę, rysując wzór na płaszczyźnie przedniej i stosując funkcję wzoru kołowego.Następnie narysuj szkic górnego elementu z wymiarami wskazanymi w milimetrach. Potem użyj funkcji wyciągnij bazę boss, aby stworzyć jego model 3D. Po zakończeniu projektowania napędu, za pomocą funkcji zaokrąglenie, dodaj zaokrąglenia o promieniu jednego milimetra do narożników; korpus napędu oraz elementy górne można wydrukować w większości usług druku 3D.W tej procedurze należy przykleić niewielki kawałek dwustronnej taśmy do płaskiej powierzchni, a następnie pociąć poliamidowe rurki o rozmiarze 31 gauge na odcinki o długości około ośmiu centymetrów. Następnie ułożyć pierwszą warstwę rurek prowadzących na dwustronnej taśmie tak, aby przylegały do siebie jak najciaśniej. Na koniec nanieść niewielką ilość rzadkiego kleju cyjanoakrylowego na warstwę poliamidów.Następnie szybko rozłóż drugą warstwę poliamidu. Po tym czasie wykonaj miejsce na światłowód, używając kaniuli o rozmiarze 26 gauge. Przed włączeniem kaniuli do zestawu należy upewnić się, że została ona nasmarowana środkiem smarnym na bazie teflonu.Następnie nałóż linię czterech do pięciu milimetrów epoksydu prostopadle do wiązki poliamidowej. Po utwardzeniu epoksydu, po dwóch do trzech godzinach, usuń taśmę z dolnej warstwy i ponownie nałóż epoksyd po drugiej stronie. Po ponownym utwardzeniu epoksydu usuń kaniulę 26 gauge.Wykonaj cięcie w środku za pomocą żyletki, aby uzyskać dwie matryce poliamidowe, z których każda może zostać wykorzystana do jednego napędu nadprzestrzennego. Następnie wydrukuj szablon stożka na arkuszu folii przezroczystej i wytnij odpowiadający mu arkusz z wytrzymałej folii aluminiowej. Nałóż warstwę żywicy epoksydowej na folię aluminiową, a następnie szybko przyłóż folię przezroczystą, dociskając ją ciężkim przedmiotem lub drewnianym kołkiem; wygładź żywicę tak, aby była rozłożona równomiernie.Następnie wytnij szablon stożka i zepnij go za pomocą klipsa krokodylka. Na koniec użyj kolejnej kropli żywicy epoksydowej, aby trwale połączyć elementy i złożyć mikronapęd. W pierwszej kolejności przymocuj EIB do korpusu napędu za pomocą dwóch śrub.Następnie ponownie wprowadź kaniulę 26 G przez matrycę z poliamidowych rurek prowadzących. Wyrównaj poliamidową matrycę z korpusem napędu, korzystając z otworu światłowodowego w EIB, aby upewnić się, że rurki prowadzące są prostopadłe do EIB. Następnie przymocuj matrycę do korpusu napędu za pomocą żywicy epoksydowej, dbając o to, aby żywica nie dostała się do wnętrza rurek prowadzących ani do korpusu napędu.Na koniec nadmiar żywicy epoksydowej usuwa się za pomocą narzędzia typu dremel, a następnie przypisuje każdą rurkę prowadzącą w matrycy poliamidowej do odpowiadającego jej uchwytu na wewnętrznej ściance korpusu napędu. Na każdą rurkę prowadzącą nasuwa się mały pierścień z poliamidu o rozmiarze 33 gauge, wsuwając go do uchwytu. Następnie nanosi się niewielką ilość kleju cyjanoakrylowego, aby przymocować każdą rurkę prowadzącą.Na koniec przymocuj cały aparat do wewnętrznej ścianki korpusu napędu za pomocą epoksydu i przytnij poliamid tak, aby wystawał tuż ponad wewnętrzną krawędź. Następnie złóż mikro-napęd, przekładając jedną z wykonanych na zamówienie śrub przez otwór centralny elementu górnego, a następnie zakładając jedną z pięciomilimetrowych sprężyn. Nasuń otwór zewnętrzny elementu górnego na jedną z szyn i delikatnie wkręć śrubę.Następnie wkręcaj śrubę, aż sprężyna osiągnie minimalną długość po ściśnięciu. Powtórz ten proces dla każdego mikronapędu szyny. Następnie odwróć zespół napędowy do góry dnem i zapamiętaj układ matrycy rurek prowadzących.Służy ono później do wyznaczenia położenia rurki prowadzącej odpowiadającej każdemu mikronapędowi. Następnie należy zapisać tożsamość odpowiedniego mikronapędu. Teraz należy wsunąć rurkę poly IDE do każdej rurki prowadzącej od spodu podstawy napędu.Pozostaw rurkę nośną tak, aby wystawała od jednego do dwóch milimetrów ponad górną krawędź całkowicie opuszczonego mikronapędu. Następnie zanotuj identyfikator odpowiadającego mu mikronapędu na fotografii.Przymocuj rurkę poliamidową do podpory mikronapędu za pomocą żywicy epoksydowej, dbając o to, aby żywica nie spłynęła na sprężynę lub śrubę mikronapędu. Następnie utnij wszystkie rurki poliimidowe na wysokości łba śruby mikronapędu i wyrównaj je u dołu matrycy poliimidowej. Po tym etapie zamontuj EIB do podstawy napędu za pomocą dwóch śrub.Na tym etapie macierz napędowa jest gotowa do załadowania stereo TRO lub terosów. Po załadowaniu należy odwrócić napęd i ostrożnie opuścić stożek ekranujący na napęd, tak aby wystawał z niego tylko dolny element; następnie przymocować stożek ekranujący do korpusu napędu za pomocą epoksydu. Po zamocowaniu stożka należy odciąć niewielki kawałek drutu ze stali nierdzewnej i przypiąć go do EIB.Zadrap igłą wewnętrzną aluminiową część stożka, a następnie uziem drut stalowy do stożka za pomocą srebrnej farby. Po wyschnięciu srebrnej farby wzmocnij połączenie kroplą żywicy epoksydowej. Poniżej znajduje się zdjęcie swobodnie poruszającej się myszy z implantem hyperdrive.Oto przykłady dwóch zapisów kształtu fali pojedynczych jednostek z tej myszy. Przedstawiony tutaj przekrój czołowy mózgu myszy wyróżnia ciało kolankowate boczne, do którego wprowadzono niektóre elektrody. A tutaj znajduje się przykład peri-stymulacyjnych histogramów czasowych dwóch neuronów LGN, wyrównanych względem stymulacji wzrokowej.Oto przekrój czołowy z zaznaczonym hipokampem, do którego wprowadzono kolejny zestaw elektrod. Tutaj przedstawiono przykład zapisu potencjału polowego lokalnego dla ripple hipokampa. Przy odpowiednim doświadczeniu nowy hyperdrive można złożyć w ciągu jednego dnia. Napędy opracowane w tej procedurze mogą być łączone z innymi technikami, takimi jak optogenetyka, w celu stymulacji i rejestracji aktywności zidentyfikowanych subpopulacji neuronów.

design-fabrication-ultralight-weight-adjustable-multi-electrode

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Neuronauka

Projektowanie i produkcja ultralekki, regulowane wieloelektrodowe sondy do rejestracji elektrofizjologicznych w myszy

W niniejszym artykule opisano procedurę chirurgiczną oraz wskazówki dotyczące obsługi związane z implantacją ultrasciennej macierzy mikroelektrod na bazie poliimidu (PBM-array) na czaszkę myszy w celu rejestracji wysokiej gęstości encefalografii (EEG) w modelu mysim.

Rejestracja EEG o wysokiej gęstości u swobodnie poruszających się myszy z wykorzystaniem mikroelektrod na bazie poliamidu

Ten film przedstawia protokół wszczepienia wielozębowej liniowej sondy krzemowej do mózgu myszy w celu pomiaru lokalnych potencjałów pola. Procedura polega na przymocowaniu sondy do jednostki stereotaktycznej, ustawieniu jej dokładnie nad docelowym obszarem mózgu, wprowadzeniu jej do mózgu i zabezpieczeniu cementem dentystycznym. Po implantacji zespół zabezpieczany jest obudową. Po powrocie do zdrowia konfiguracja pozwala na rejestrowanie lokalnych potencjałów pola, zapewniając wgląd w...

Rejestrowanie aktywności elektrycznej mózgu u zachowujących się myszy za pomocą liniowych sond krzemowych z wieloma zębami

Ten film demonstruje technikę wszczepiania zespołu elektrod do mózgu myszy. Zespół zawiera elektrody bipolarne do rejestrowania aktywności z hipokampa i elektrodę odniesienia do uzyskiwania podstawowej aktywności z móżdżku. Znieczuloną mysz umieszcza się na stereotaktycznej ramie, a zespół elektrod wszczepia się w docelowy obszar mózgu. Następnie zwierzę może dojść do siebie przed wykonaniem zapisu elektrofizjologicznego.

Wszczepienie zespołu elektrod do mózgu myszy w celu zapisu elektrofizjologicznego

Prezentujemy metody budowy elektrod do jednoczesnego rejestrowania zewnątrzkomórkowej aktywności neuronalnej i uwalniania wielu substancji neuroaktywnych w pobliżu miejsc rejestracji u obudzonych myszy. Technika ta pozwala na szczegółową analizę przypuszczalnych lokalnych wejść synaptycznych do neuronu będącego przedmiotem zainteresowania.

Zewnątrzkomórkowy zapis aktywności neuronalnej w połączeniu z mikrojonoforowym zastosowaniem substancji neuroaktywnych u obudzonych myszy

Ten protokół opisuje budowę hybrydowego układu mikronapędów, który umożliwia wszczepienie dziewięciu niezależnie regulowanych tetrod i jednej regulowanej sondy opto-krzemowej w dwóch obszarach mózgu u swobodnie poruszających się myszy. Zademonstrowano również metodę bezpiecznego odzyskiwania i ponownego wykorzystania sondy optokrzemowej do wielu celów.

Hybrydowy system mikronapędowy z odzyskiwalną sondą optokrzemową i tetrodą do nagrywania w dwóch lokalizacjach o wysokiej gęstości w swobodnie poruszających się myszach

Tutaj opisujemy projekt mikronapędu, procedurę implantacji chirurgicznej i strategię rekonwalescencji po operacji, które pozwalają na przewlekłe zapisy pola i pojedyncze jednostki z wielu regionów mózgu jednocześnie u młodocianych i dorastających myszy w krytycznym oknie rozwojowym od 20 dnia po urodzeniu (p20) do 60 dnia po urodzeniu (p60) i później.

Lekki implant napędowy do przewlekłych zapisów tetrody u młodych myszy

Proponuje się tani system zapisu elektroencefalograficznego w połączeniu z cewką o rozmiarach milimetrowych do napędzania przezczaszkowej stymulacji magnetycznej mózgu myszy in vivo. Korzystając z konwencjonalnych elektrod śrubowych z niestandardowym, elastycznym podłożem z matrycą wieloelektrodową, można przeprowadzić zapis w wielu miejscach z mózgu myszy w odpowiedzi na przezczaszkową stymulację magnetyczną.

Niedrogi elektroencefalograficzny system zapisu w połączeniu z cewką o rozmiarach milimetrowych do przezczaszkowej stymulacji mózgu myszy in vivo

Ten protokół opisuje wytwarzanie rąk i chirurgiczne wszczepianie elektrod elektromiograficznych (EMG) w mięśniach kończyn przednich myszy, aby rejestrować aktywność mięśni podczas eksperymentów z zachowaniem głowy.

Rejestrowanie aktywności mięśni kończyn przednich u myszy z unieruchomioną głową z przewlekle wszczepionymi elektrodami EMG

Tutaj przedstawiamy lekki, opłacalny system implantacji sond dla przewlekłej elektrofizjologii u gryzoni, zoptymalizowany pod kątem łatwości użycia, odzyskiwania sondy, wszechstronności eksperymentalnej oraz zgodności z zachowaniem.

Implant DREAM: lekki, modułowy i opłacalny system implantów do przewlekłej elektrofizjologii u myszy zamocowanych na głowie i swobodnie zachowujących się

Opracowaliśmy uproszczone i opłacalne podejście do produkcji elektrod i przeprowadziliśmy zapisy sygnałów w wielu regionach u swobodnie poruszających się myszy. Wykorzystanie optogenetyki, wraz z elektrofizjologią wieloregionalną i rejestracją sygnału wapnia, umożliwiło ujawnienie aktywności neuronalnej w różnych regionach w modelu rozpalania napadów.

Zintegrowana metoda tworzenia elastycznych i wygodnych optymór elektrofizjologicznych do wieloregionalnego zapisu in vivo

Protokół ten został opracowany, aby stworzyć niezawodny i łatwo dostępny system do rejestrowania swobodnie poruszającego się EEG gryzoni.

Opłacalny i minimalnie inwazyjny protokół do przewlekłej wielomiejscowej elektroencefalografii u swobodnie poruszających się myszy

Poznaj metodę projektowania i produkcji ultralekkich sond wieloelektrodowych do zapisów elektrofizjologicznych u myszy. Technika umożliwia stabilne rejestracje aktywności neuronalnej u swobodnie poruszających się zwierząt.

Projektowanie i produkcja ultralekkich, regulowanych sond wieloelektrodowych do zapisów elektrofizjologicznych u myszy

Przeglądaj więcej filmów