Name: In Situ Wykrywanie autoreaktywnych limfocytów T CD4 w mózgu i sercu przy użyciu dekstramerów klasy II o głównym kompleksie zgodności tkankowej (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-08-01T14:00:00.000+00:00
Duration: 13 min 10 s
Description: Poznaj metodę wykrywania autoreaktywnych limfocytów T CD4 w mózgu i sercu przy użyciu dekstramerów klasy II MHC. Ta technika umożliwia precyzyjną analizę częstości komórek T specyficznych dla antygenu in situ.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Ta praca była wspierana przez American Heart Association i Children's Cardiomyopathy Foundation (SDG2462390204001) oraz National Institutes of Health (HL114669). CM jest laureatem grantu na stypendium podoktoranckie przyznanego przez Myocarditis Foundation, NJ.

Oświadczenie etyczne:
Wszystkie procedury na zwierzętach zostały przeprowadzone zgodnie z wytycznymi dotyczącymi opieki i użytkowania zwierząt laboratoryjnych i zatwierdzone przez University of Nebraska-Lincoln, Lincoln, NE.
1. Wprowadzenie EAE
<ol>
	<li>W celu wywołania EAE należy przygotować peptyd/kompletną emulsję adiuwantową Freunda (CFA) zgodnie z opisem w 11 z następującymi modyfikacjami: Krok 1.1: przygotować PLP 139-151 w stężeniu 1 mg/ml w 1x soli fizjologicznej buforowanej fosforanami (PBS). Krok 1.4: użyć 200 μl emulsji CFA zawierającej 100 μg PLP 139-151 na zwierzę. Krok 1.4.1: aby uodpornić dziesięć zwierząt, przygotuj 2 ml emulsji, mieszając 1 ml PLP 139-151 (1 mg / ml w 1x PBS) i równą objętość CFA. Krok 1.5: wstrzyknąć 200 μl emulsji w dawkach podzielonych podskórnie w dwie okolice pachwinowe (~ 75 μl każdy) i okolicę mostka (~ 50 μl) u samic myszy SJL / J w wieku od pięciu do sześciu tygodni. Kroki 1.7 i 1.8 nie mają zastosowania do indukcji EAE.</li>
</ol>
2. Ocena kliniczna myszy EAE i pobieranie mózgów
<ol>
	<li>Monitoruj zwierzęta pod kątem pojawienia się objawów klinicznych i oceniaj nasilenie choroby codziennie od 9 dnia po szczepieniu w następujący sposób: 0 - zdrowe; 1 - osłabienie wiotkiego ogona lub kończyn tylnych, ale nie obu; 2 - osłabienie wiotkiego ogona i kończyn tylnych; 3 - częściowy paraliż kończyn tylnych; 4 - całkowity paraliż kończyn tylnych; 5 - konający lub martwy 12.</li>
	<li>Poddaj myszy eutanazji, gdy osiągną wynik neurologiczny 3 lub 4 za pomocą CO2 . Aby poddać eutanazji myszy, należy najpierw wstępnie napełnić komorę eutanazyjną CO2 , obracając regulator zbiornika CO2 o ciśnieniu nieprzekraczającym 6 psi i pozwolić zwierzętom pozostać w komorze przez około 5 minut, aby osiągnąć całkowite uduszenie. Namocz uśpione zwierzęta w 70% alkoholu. Natychmiast umieść zwierzęta na podkładce chłonnej i za pomocą sterylnych kleszczy i nożyczek odsłonij serca, przecinając jamę piersiową. Nakłuć prawe małżowiny uszne i wykonać perfuzję, wstrzykując 10 ml zimnego 1x PBS do lewej komory serca.</li>
	<li>Wykop czaszkę, przecinając czaszkę w okrągły sposób za pomocą zakrzywionych nożyczek i ostrożnie, odwróć kości czaszki kleszczami. Zbierz mózg przez rozbiór i za pomocą czystego skalpela oddziel mózg od móżdżku. Umieść mózg w probówce zawierającej zimny 1x PBS i pozostaw probówkę na lodzie do czasu przetworzenia.</li>
</ol>
3. Barwienie in situ sekcji mózgowych za pomocą dekstramerów MHC klasy II (IAs)/PLP 139-151
<ol>
	<li>Przygotować 4% niskotopliwą agarozę buforowaną PBS, rozpuść przez ogrzewanie w temperaturze 50 °C i pozostawić w łaźni wodnej o temperaturze 40 °C do czasu użycia.</li>
	<li>Umieść mózg w jednorazowej kasecie histologicznej z głęboką podstawą trzymaną na lodzie i wlej stopioną (40 °C) agarozę. Natychmiast delikatnie dociśnij mózg kleszczami, aby zanurzyć tkankę. Pozostaw kasetę na lodzie na 15-20 minut, aż do całkowitego zestalenia.</li>
	<li>Napełnij wannę wibratomową schłodzonym 1x PBS. Wypełnij przestrzeń wokół wanny wibratonowej kostkami lodu, aby utrzymać temperaturę PBS w zakresie od 0 do 2 °C. Zamocuj czystą żyletkę w wibratomie i ustaw kąt ostrza na 15°.</li>
	<li>Umieszczenie tkanki w wibratomie. Przytnij nadmiar agarozy ze wszystkich stron osadzonej tkanki i lekko odsłonij brzuszną powierzchnię mózgu.
	<ol>
		<li>Posmaruj blok tkanki wibratomu super klejem i przenieś tkankę zatopioną w agarozie na sklejoną powierzchnię, umieszczając odsłoniętą brzuszną powierzchnię mózgu na kleju w celu przekroju poprzecznego. Nie przesuwaj tkanki, gdy tkanka zostanie umieszczona nad blokiem.</li>
		<li>Umieść blok wibratomu zawierający tkankę zatopioną w agarozie na lodzie i pozostaw klej do wyschnięcia na 15 minut.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>W międzyczasie umieść komory na tkanki po jednej na każdym dołku na 24-dołkowej płytce. Napełnij studzienki zawierające komory na chusteczki 1 ml zimnego 1x PBS i pozostaw płytkę na lodzie.
	<ol>
		<li>Przygotować komory na chusteczki poprzez przymocowanie cienkiej siatki nylonowej do odciętego końca pipety polipropylenowej o pojemności 25 ml za pomocą super kleju; po przycięciu nadmiaru siatki wokół pipety, przyciąć pipetę na długość 1 cm od siatki.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Opuść ostrze wibratomu do poziomu górnej powierzchni tkanki; ustaw prędkość wibratomu na 0,22 mm/s i rozpocznij cięcie ruchem do przodu, aby uzyskać skrawki o grubości 200 μm. Przenieś jeden fragment mózgu na studzienkę za pomocą miękkiego pędzla akwarelowego do komór tkankowych umieszczonych w dołkach 24-dołkowej płytki. Utrzymuj płytkę na lodzie do czasu zakończenia cięcia, aby zapobiec degradacji tkanek. Uwaga: Wykonaj poniższe czynności, aby uzyskać w sumie trzy sparowane odcinki z trzech różnych obszarów grzbietu mózgu do powierzchni brzusznej (ryc. 2). Jeden wycinek z każdej pary (w sumie trzy sekcje) umieszczony w trzech oddzielnych komorach tkankowych przeznaczony jest do barwienia określonymi dekstrymerami (IAs/PLP 139-151) i anty-CD4. Podobnie, kolejny zestaw trzech sekcji, które są umieszczone w trzech oddzielnych komorach tkankowych, jest przeznaczony do barwienia dekstramerami kontrolnymi (IAs/TMEV 70-86) i anty-CD4.</li>
	<li>Przenieść trzy komory tkankowe zawierające skrawki przeznaczone do barwienia określonymi dekstrymerami do trzech studzienek na 24-dołkowej płytce z jedną komorą na studzienkę, w której wcześniej dodano 300 μl koktajlu zawierającego dekstramery PLP 139-151 sprzężone z allofikocyjaniną (APC) (2,5 μg/ml) i anty-CD4-fikoerytrynę (PE; 5 μg/ml) w roztworze blokującym (1x PBS z 2% normalną surowicą kozią). Przykryj studzienki pokrywką.</li>
	<li>Podobnie, przenieść trzy komory tkankowe zawierające skrawki przeznaczone do barwienia deksmerami kontrolnymi do trzech dołków w 24-dołkowej płytce z jedną komorą na studzienkę, do której wcześniej dodano 300 μl koktajlu zawierającego deksmery TMEV 70-86 sprzężone z APC (2,5 μg/ml) i anty-CD4-PE (5 μg/ml) w roztworze blokującym. Przykryj studzienki pokrywką. Uwaga: Patrz Massilamany et al., 8 w celu przygotowania dekstramerów, a cząsteczki dekstranu do przygotowania dekstramerów zostały uprzejmie dostarczone przez Immudex, Kopenhaga, Dania.</li>
	<li>Oznacz dołki, owiń płytkę folią aluminiową i umieść płytkę na kołyszącej się platformie ustawionej na delikatne obroty przez 1,5 godziny w ciemności przy temperaturze pokojowej.</li>
	<li>Po okresie inkubacji umyj skrawki tkanek na platformie bujanej, przenosząc komory na tkanki do świeżej studzienki zawierającej 1 ml zimnego 1x PBS i unikaj kapania zawartości jednego dołka do drugiego. Powtórz pranie trzykrotnie, pozostawiając co najmniej 10 minut na pranie. Upewnij się, że skrawki tkanki nie wyschną, ponieważ mogą przyklejać się do boków komory.</li>
	<li>Utrwal skrawki, przenosząc komory tkankowe do świeżej studzienki na 24-dołkowej płytce zawierającej 1 ml przefiltrowanego 4% buforowanego PBS paraformaldehydu (pH 7,4) na platformie bujającej przez 2 godziny z delikatnymi obrotami.</li>
	<li>Powtórz pranie trzy razy, jak opisano w kroku 3.10.</li>
	<li>Umieść poplamione i utrwalone sekcje na czystym szkiełku mikroskopowym za pomocą miękkiego pędzla do akwareli. Wytrzyj nadmiar wody bez dotykania sekcji i zamontuj sekcję za pomocą medium montażowego. Przykryj mikroskopijnym szkiełkiem nakrywkowym i pozostaw szkiełka do wyschnięcia w temperaturze RT O/N w ciemnym pomieszczeniu.</li>
	<li>Szkiełka należy przechowywać w odpornym na światło pojemniku do przechowywania szkiełek w temperaturze 4 °C.</li>
</ol>
4. Wprowadzenie EAM i Zbiórka Serc
<ol>
	<li>Wywołać EAM zgodnie z opisem w odnośniku 11.</li>
	<li>Poddaj myszy eutanazji w 21 dniu po szczepieniu za pomocą czystej komory wyposażonej w butlę z gazem CO2 i namocz zwierzęta w 70% alkoholu. Natychmiast umieść zwierzęta na podkładce chłonnej i za pomocą kleszczy i nożyczek odsłoń serca, przecinając klatkę piersiową. Nakłuć prawe małżowiny uszne i wykonać perfuzję, wstrzykując 10 ml zimnego 1x PBS do lewej komory serca. Zbierz serca i umieść w probówkach zawierających 1x PBS.</li>
</ol>
5. Barwienie in situ wycinków serca za pomocą dekstramerów MHC klasy II (IAk)/Myhc 334-352
<ol>
	<li>Przygotować 4% niskotopliwą agarozę buforowaną PBS, rozpuść przez ogrzewanie w temperaturze 50 °C i pozostawić w łaźni wodnej o temperaturze 40 °C do czasu użycia.</li>
	<li>Umieścić serce w jednorazowej kasecie histologicznej z głęboką podstawą trzymaną na lodzie i wlewać stopioną agarozę o temperaturze 40 °C, aż tkanki zostaną całkowicie zanurzone, jak opisano w kroku 3.2.</li>
	<li>Wykonaj krok 3.3.</li>
	<li>Przytnij nadmiar agarozy ze wszystkich stron osadzonej tkanki i lekko odsłonij podstawę serca. Posmaruj blok tkanki wibratomu super klejem i przenieś tkankę zatopioną w agarozie na sklejoną powierzchnię, umieszczając odsłoniętą powierzchnię serca na kleju. Nie przesuwaj tkanki, gdy tkanka zostanie umieszczona nad blokiem.
	<ol>
		<li>Umieść blok wibratomu zawierający tkankę zatopioną w agarozie na lodzie i pozostaw klej do wyschnięcia na 15 minut.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Wykonaj kroki 3.5 i 3.6.</li>
	<li>Przenieś skrawki serca za pomocą miękkiego pędzla akwarelowego do komór tkankowych umieszczonych w dołkach 24-dołkowej płytki. Trzymaj płytkę na lodzie do czasu zakończenia cięcia, aby zapobiec degradacji tkanki. Uwaga: Wykonaj poniższe czynności, aby uzyskać w sumie osiem sparowanych odcinków od wierzchołka do podstawy serca (ryc. 2). Umieść wszystkie sekcje w komorach na tkanki, przydzielając do 3 sekcji na komorę. Jedna sekcja z każdej pary (w sumie osiem sekcji) jest przeznaczona do barwienia określonymi dekstrymerami (IAk/Myhc 334-352) i anty-CD4. Podobnie, kolejny zestaw ośmiu sekcji jest przeznaczony do barwienia deksmerami kontrolnymi (IAk/RNaza 43-56) i anty-CD4.</li>
	<li>Przenieść trzy komory tkankowe zawierające skrawki przeznaczone do barwienia określonymi deksmerami do trzech dołków w 24-dołkowej płytce z jedną komorą na studzienkę, do której wcześniej dodano 300 μl koktajlu zawierającego dekstrymery Myhc 334-352 sprzężone z APC (2,5 μg/ml) i anty-CD4-PE (5 μg/ml) w roztworze blokującym. Przykryj studzienki pokrywką.
	<ol>
		<li>Podobnie, przenieść trzy komory tkankowe zawierające skrawki przeznaczone do barwienia deksmerami kontrolnymi do trzech dołków w 24-dołkowej płytce z jedną komorą na studzienkę, do której wcześniej dodano 300 μl koktajlu zawierającego deksmery RNase 43-56 sprzężone z APC (2,5 μg/ml) i anty-CD4-PE (5 μg/ml) w roztworze blokującym. Przykryj studzienki pokrywką.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Oznacz dołki, owiń płytkę folią aluminiową i umieść płytkę na kołyszącej się platformie ustawionej na delikatne obroty przez 1,5 godziny w ciemności przy temperaturze pokojowej.</li>
	<li>Wykonaj kroki od 3.10 do 3.11</li>
	<li>Powtórz pranie trzy razy, jak opisano w kroku 3.10.</li>
	<li>Umieść poplamione i utrwalone sekcje (do trzech sekcji/szkiełko) na czystym szkiełku mikroskopowym za pomocą miękkiego pędzla do akwareli. Wytrzyj nadmiar wody bez dotykania sekcji i zamontuj sekcje za pomocą medium montażowego. Przykryj mikroskopijnym szkiełkiem nakrywkowym i pozostaw szkiełka do wyschnięcia w temperaturze RT O/N w ciemnym pomieszczeniu.</li>
	<li>Szkiełka należy przechowywać w odpornym na światło pojemniku do przechowywania szkiełek w temperaturze 4 °C.</li>
</ol>
6. Analiza limfocytów T Dextramer+ (dext+) CD4+ za pomocą laserowego skaningowego mikroskopu konfokalnego (LSCM) (wspólnego zarówno dla części mózgu, jak i serca)
<ol>
	<li>Użyj systemu mikroskopu konfokalnego Nikon A1-Eclipse 90i do rutynowego skanowania i pozyskiwania obrazów. Aby uruchomić program Click open, należy zainstalować oprogramowanie NIS Elements AR (wersja 4.13).
	<ol>
		<li>Wybierz kanały "TRITC" i "Cy5" z panelu. Długości fal wzbudzenia/emisji odpowiednio dla kanałów TRITC i Cy5, 561,5 nm / 553-618 nm i 640,7 nm / 663-738 nm pojawiają się domyślnie.</li>
		<li>Przypisz pseudokolory "zielony" i "czerwony" odpowiednio dla kanałów TRITC (CD4-PE) i Cy5 (dextramer-APC).</li>
		<li>Umieść szkiełko do badania na stoliku mikroskopowym i ustaw ostrość ręcznie pod 100-krotnym powiększeniem. Ustaw "HV" na 110 i przesunięcie na "0". Kliknij "Ostrość" i dostosuj "napięcie", aby zoptymalizować lasery.</li>
		<li>Kliknij "Ostrość"; zeskanuj sekcję od góry do dołu i ustaw poziom "Z" do akwizycji obrazu. Kliknij "Seria CH" i uzyskaj obraz sekwencyjnie. Zidentyfikuj limfocyty T dext + CD4 + pojawiające się jako żółte komórki punktowe na podstawie kolokalizacji sygnałów generowanych zarówno z kanału czerwonego (deksmery), jak i zielonego (CD4).</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Użyj mikroskopu konfokalnego Olympus FV500-BX60 do łatwego ilościowego wyliczania limfocytów T dext+ CD4+. Aby rozpocząć, kliknij otwórz, oprogramowanie FLUOVIEW (wersja 4.3).
	<ol>
		<li>Z menu rozwijanego wybierz barwniki "Cy3" i "Cy5" i kliknij "zastosuj", aby załadować odpowiednie lasery. Uwaga: długości fal wzbudzenia/emisji dla Cy3 (543 nm/pseudokolorowy "zielony"; CD4-PE) i Cy5 (633 nm/pseudokolorowy "czerwony"; dekstramer-APC).</li>
		<li>Umieść szkiełko do badania na szkiełku mikroskopowym i ustaw je ręcznie pod małym powiększeniem (4X lub 10X). Kliknij "Focus" (Ostrość), gdy laser Cy3 jest włączony i skoncentruj się na ognisku zapalnym.</li>
		<li>Zmień obiektyw na 100-krotne powiększenie. Ustaw rozmiar pliku na "512/512" z menu rozwijanego. Kliknij "Ostrość" i dostosuj wartości parametrów "PMT", "Wzmocnienie" i "Przesunięcie", aby zoptymalizować lasery osobno dla Cy3 i Cy5.</li>
		<li>Kliknij "Ze stage", a następnie kliknij "Focus", gdy oba lasery są włączone. Ustaw grubość "stolika Z", klikając strzałki "w górę" i "w dół". Ustaw interwał "Z" na 2 μm.</li>
		<li>Kliknij "Stop" i wybierz "Seq123". Następnie kliknij "XYZ" i rozpocznij pobieranie obrazów z serii "Z" dla wybranego obszaru w ognisku zapalnym. Zapisz "Obrazy szeregowe Z" jako pliki AVI. Aby zapisać pliki obrazów, wybierz obraz z "Z serial image", a następnie zapisz w formacie "tiff".</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Zbadaj trzy sparowane sekcje mózgu, z których jedna została wybarwiona deksmeramiIA / PLP 139-151 / anty-CD4, a druga grupa trzech sekcji dekstramerami / anty-CD4 IAs / TMEV 70-86 / anty-CD4 w celu przeprowadzenia analizy ilościowej.
	<ol>
		<li>Podobnie przeanalizuj osiem sparowanych sekcji dla serca, w których jeden zestaw ośmiu sekcji został wybarwiony dekstramerami IAk/Myhc 334-352/anty-CD4, a drugi zestaw ośmiu sekcji dekstramerami/anty-CD4 RNaza 43-56/anty-CD4.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Zbadaj od 10 do 15 ognisk zapalnych na sekcję w mózgu i w każdym ognisku uzyskaj sekwencyjnie zestaw od 15 do 25 seryjnych obrazów.
	<ol>
		<li>Zbadaj łącznie 20 ognisk zapalnych ze wszystkich ośmiu sekcji serca i z każdego ogniska uzyskaj sekwencyjnie od 10 do 15 seryjnych obrazów. Wykonaj zdjęcia seryjne "Z", skanując slajdy w ruchu "poziomo-pionowo-poziomo-pionowo-pionowo-w dół", aby uniknąć powtórzeń serii "Z" w tej samej ostrości.</li>
		<li>Po przechwyceniu obrazów seryjnych "Z" nazwij pliki, identyfikując numery slajdów, nazwy sekcji i liczbę wykonanych zdjęć seryjnych "Z".
		<ol>
			<li>Użyj oprogramowania "ImageJ", aby policzyć limfocyty T dext+ CD4+ w stosunku do całkowitej liczby limfocytów T CD4+. Wybierz "typ licznika" w "ImageJ", zaznacz "pokaż wszystko" i rozpocznij liczenie, klikając środek każdej komórki i kontynuuj liczenie na różnych obrazach seryjnych "Z" za pomocą bocznych strzałek. Po zliczeniu wszystkich limfocytów T CD4 wybierz inny rodzaj licznika i policz limfocyty T CD4 + dext +. Kliknij kartę wyników, aby uzyskać łączną liczbę komórek zliczonych przy użyciu dwóch różnych liczników.</li>
			<li>Aby uzyskać całkowitą liczbę, dodaj liczbę komórek na wszystkich obrazach seryjnych "Z" reprezentujących wszystkie trzy sekcje mózgu lub wszystkie osiem sekcji serca.</li>
		</ol>
		</li>
	</ol>
	</li>
</ol>

<ol><li>Cecconi, V., Moro, M., Del Mare,, Dellabona, S., P,, Casorati, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Use+of+MHC+class+II+tetramers+to+investigate+CD4%2B+T+cell+responses%3A+problems+and+solutions%5BTitle%5D)+AND+%22Cytometry+A%22%5BJournal%5D)">Use of MHC class II tetramers to investigate CD4+ T cell responses: problems and solutions.</a> Cytometry A. 73 (11), 1010-1018 (2008).</li>
<li>Ferlin, W., Glaichenhaus, N., Mougneau, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Present+difficulties+and+future+promise+of+MHC+multimers+in+autoimmune+exploration%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Opin+Immunol%22%5BJournal%5D)">Present difficulties and future promise of MHC multimers in autoimmune exploration.</a> Curr Opin Immunol. 12, 670-675 (2000).</li>
<li>Kwok, W. W., Ptacek, N. A., Liu, A. W., Buckner, J. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Use+of+class+II+tetramers+for+identification+of+CD4%2B+T+cells%5BTitle%5D)+AND+%22J+Immunol+Methods%22%5BJournal%5D)">Use of class II tetramers for identification of CD4+ T cells.</a> J Immunol Methods. 268, 71-81 (2002).</li>
<li>Landais, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((New+design+of+MHC+class+II+tetramers+to+accommodate+fundamental+principles+of+antigen+presentation%5BTitle%5D)+AND+%22J+Immunol%22%5BJournal%5D)">New design of MHC class II tetramers to accommodate fundamental principles of antigen presentation.</a> J Immunol. 183, 7949-7957 (2009).</li>
<li>Nepom, G. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((MHC+class+II+tetramers%5BTitle%5D)+AND+%22J+Immunol%22%5BJournal%5D)">MHC class II tetramers.</a> J Immunol. 188, 2477-2482 (2012).</li>
<li>Vollers, S. S., Stern, L. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Class+II+major+histocompatibility+complex+tetramer+staining%3A+progress%2C+problems%2C+and+prospects%5BTitle%5D)+AND+%22Immunology%22%5BJournal%5D)">Class II major histocompatibility complex tetramer staining: progress, problems, and prospects.</a> Immunology. 123, 305-313 (2008).</li>
<li>Wooldridge, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tricks+with+tetramers%3A+how+to+get+the+most+from+multimeric+peptide-MHC%5BTitle%5D)+AND+%22Immunology%22%5BJournal%5D)">Tricks with tetramers: how to get the most from multimeric peptide-MHC.</a> Immunology. 126, 147-164 (2009).</li>
<li>Massilamany, C., Upadhyaya, B., Gangaplara, A., Kuszynski, C., Reddy, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Detection+of+autoreactive+CD4+T+cells+using+major+histocompatibility+complex+class+II+dextramers%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Immunol%22%5BJournal%5D)">Detection of autoreactive CD4 T cells using major histocompatibility complex class II dextramers.</a> BMC Immunol. 12, 1471-2172 (2011).</li>
<li>Batard, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dextramers%3A+new+generation+of+fluorescent+MHC+class+I%2Fpeptide+multimers+for+visualization+of+antigen-specific+CD8%2B+T+cells%5BTitle%5D)+AND+%22J+Immunol+Methods%22%5BJournal%5D)">Dextramers: new generation of fluorescent MHC class I/peptide multimers for visualization of antigen-specific CD8+ T cells.</a> J Immunol Methods. 310 (1-2), 136-148 (2006).</li>
<li>Massilamany, C., Gangaplara, A., Jia, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Direct+staining+with+major+histocompatibility+complex+class+II+dextramers+permits+detection+of+antigen-specific%2C+autoreactive+CD4+T+cells+in+situ%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Direct staining with major histocompatibility complex class II dextramers permits detection of antigen-specific, autoreactive CD4 T cells in situ.</a> PLoS One. 9 (1), (2014).</li>
<li>Massilamany, C., Khalilzad-Sharghi, V., Gangaplara, A., Steffen, D., Othman, S. F., Reddy, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Noninvasive+Assessment+of+Cardiac+Abnormalities+in+Experimental+Autoimmune+Myocarditis+by+Magnetic+Resonance+Microscopy+Imaging+in+the+Mouse%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Noninvasive Assessment of Cardiac Abnormalities in Experimental Autoimmune Myocarditis by Magnetic Resonance Microscopy Imaging in the Mouse.</a> J Vis Exp. (88), e51654(2014).</li>
<li>Massilamany, C., Steffen, D., Reddy, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+epitope+from+Acanthamoeba+castellanii+that+cross-react+with+proteolipid+protein+139-151-reactive+T+cells+induces+autoimmune+encephalomyelitis+in+SJL+mice%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neuroimmunol%22%5BJournal%5D)">An epitope from Acanthamoeba castellanii that cross-react with proteolipid protein 139-151-reactive T cells induces autoimmune encephalomyelitis in SJL mice.</a> J Neuroimmunol. 219 (1-2), 17-24 (2010).</li>
<li>Donermeyer, D. L., Beisel, K. W., Allen, P. M., Smith, S. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Myocarditis-inducing+epitope+of+myosin+binds+constitutively+and+stably+to+I-Ak+on+antigen-presenting+cells+in+the+heart%5BTitle%5D)+AND+%22J+Exp+Med%22%5BJournal%5D)">Myocarditis-inducing epitope of myosin binds constitutively and stably to I-Ak on antigen-presenting cells in the heart.</a> J Exp Med. 182 (5), 1291-1300 (1995).</li>
<li>Liao, L., Sindhwani, R., Leinwand, L., Diamond, B., Factor, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cardiac+alpha-myosin+heavy+chains+differ+in+their+induction+of+myocarditis.+Identification+of+pathogenic+epitopes%5BTitle%5D)+AND+%22J+Clin+Invest%22%5BJournal%5D)">Cardiac alpha-myosin heavy chains differ in their induction of myocarditis. Identification of pathogenic epitopes.</a> J Clin Invest. 92 (6), 2877-2882 (1993).</li>
<li>Cameron, T. O., Cochran, J. R., Yassine-Diab, B., Sekaly, R. P., Stern, L. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cutting+edge%3A+detection+of+antigen-specific+CD4%2B+T+cells+by+HLA-DR1+oligomers+is+dependent+on+the+T+cell+activation+state%5BTitle%5D)+AND+%22J+Immunol%22%5BJournal%5D)">Cutting edge: detection of antigen-specific CD4+ T cells by HLA-DR1 oligomers is dependent on the T cell activation state.</a> J Immunol. 166 (2), 741-745 (2001).</li>
<li>Novak, E. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Activated+human+epitope-specific+T+cells+identified+by+class+II+tetramers+reside+within+a+CD4high%2C+proliferating+subset%5BTitle%5D)+AND+%22Int+Immunol%22%5BJournal%5D)">Activated human epitope-specific T cells identified by class II tetramers reside within a CD4high, proliferating subset.</a> Int Immunol. 13 (6), 799-806 (2001).</li>
<li>Reddy, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Detection+of+autoreactive+myelin+proteolipid+protein+139-151-specific+T+cells+by+using+MHC+II+%28IAs%29+tetramers%5BTitle%5D)+AND+%22J+Immunol%22%5BJournal%5D)">Detection of autoreactive myelin proteolipid protein 139-151-specific T cells by using MHC II (IAs) tetramers.</a> J Immunol. 170 (2), 870-877 (2003).</li>
<li>Skinner, P. J., Daniels, M. A., Schmidt, C. S., Jameson, S. C., Haase, A. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cutting+edge%3A+In+situ+tetramer+staining+of+antigen-specific+T+cells+in+tissues%5BTitle%5D)+AND+%22J+Immunol%22%5BJournal%5D)">Cutting edge: In situ tetramer staining of antigen-specific T cells in tissues.</a> J Immunol. 165 (2), 613-617 (2000).</li>
<li>Skinner, P. J., Haase, A. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+situ+tetramer+staining%5BTitle%5D)+AND+%22J+Immunol+Methods%22%5BJournal%5D)">In situ tetramer staining.</a> J Immunol Methods. 268 (1), 29-34 (2002).</li>
<li>Skinner, P. J., Haase, A. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+situ+staining+using+MHC+class+I+tetramers%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Protoc+Immunol%22%5BJournal%5D)">In situ staining using MHC class I tetramers.</a> Curr Protoc Immunol. Chapter 17, Unit 17.14.11(2004).</li>
</ol>

Nie stwierdzono konfliktu interesów.

W przeciwieństwie do tetramerów MHC klasy I, zastosowanie tetramerów MHC klasy II do rutynowych zastosowań nadal stanowi wyzwanie, zwłaszcza w celu wyliczenia częstości prekursorów autoreaktywnych limfocytów T CD4 o niskim powinowactwie, częściowo ze względu na ich zależność od aktywacji 6,15-17. Ostatnio problem ten został rozwiązany poprzez stworzenie nowej generacji tetramerów, zwanych "dekstramerami", co pozwoliło nam wykryć specyficzne dla antygenu limfocyty T CD4 dla wielu autoantygenów, takich jak PLP 1...

Użycie tetramerów klasy II głównego kompleksu zgodności tkankowej (MHC) do wykrywania specyficznych dla antygenu limfocytów T CD4 było wyzwaniem 1-7. Aby zwiększyć czułość wykrywania tetramerów MHC klasy II, zespół badawczy stworzył tetramery nowej generacji, oznaczone jako "dekstramery" 8. Ekstrymery zawierają szkielety dekstranu, w których sprzężonych jest wiele ugrupowań streptawidyna-fluorofor, tak że do jednej cząsteczki dekstranu można przyłączyć kilka biotynylowanych monomerów MHC związanych peptydami9. W ten sposób duże agregaty deksmerów MHC, które zawierają kilka kompleksów peptydowych MHC, mogą wchodzić w interakcje z wieloma receptorami limfocytów T (TCR).
Ta grupa niedawno wygenerowała deksmery dla różnych własnych antygenów i wykazała, że czułość wykrywania deksmerów była około pięciokrotnie większa niż tetramerów 8. Systemy eksperymentalne obejmują eksperymentalne autoimmunologiczne zapalenie mózgu i rdzenia kręgowego (EAE) indukowane białkiem proteolipidowym (PLP) 139-151 u myszy SJL; EAE indukowane glikoproteiną oligodendrocytów mieliny (MOG) 35-55 u myszy C57Bl / 6; oraz eksperymentalne autoimmunologiczne zapalenie mięśnia sercowego (EAM) wywołane sercowym α ciężkim łańcuchem miozyny (Myhc) 334-352 u myszy A / J. Badanie to demonstruje zastosowanie dekstrymerów PLP 139-151- i Myhc 334-352 do wykrywania specyficznych dla antygenu limfocytów T CD4 in situ ze swoistością poprzez opracowanie protokołu bezpośredniego barwienia, eliminując w ten sposób potrzebę wzmacniania sygnałów przy użyciu przeciwciał fluoroforowych, podejścia powszechnie stosowanego przy użyciu tetramerów. Ponadto opracowano kompleksową metodę oceny tkanek, aby wiarygodnie zliczyć częstość występowania limfocytów T CD4 specyficznych dla antygenu in situ 10. Wykrywanie in situ limfocytów T specyficznych dla antygenu pozwala na odróżnienie zdarzeń spowodowanych przez określone bodźce antygenowe od tych spowodowanych aktywacją osoby postronnej. Podobnie, technika in situ daje również możliwość śledzenia kinetyki nacieków limfocytów T specyficznych dla antygenu w narządach docelowych.

<table><tbody><tr><td>CFA</td><td>Sigma Aldrich, St Louis, MO</td><td>5881</td><td>Sklep pod adresem 4 &#176; C</td></tr><tr><td>MTB&nbsp; Ekstrakt z H37Rv&nbsp;</td><td>Difco Laboratories, Detroit, MI</td><td>231141</td><td>Sklep pod adresem 4 &#176; C</td></tr><tr><td>PT</td><td>List Biologicals Laboratories, Campbell, CA</td><td>181</td><td>Sklep pod adresem 4 &#176; C</td></tr><tr><td>1x PBS&nbsp;</td><td>Corning, Manassas, VA</td><td>21-040-CV</td><td>Sklep pod adresem 4 & # 176; C</td></tr><tr><td>Samice myszy A/J&nbsp;</td><td>Jackson Laboratories, Bar Harbor, ME</td><td>646</td><td></td></tr><tr><td>Samica myszy SJL/J</td><td>Jackson Laboratories, Bar Harbor, ME</td><td>686</td><td></td></tr><tr><td>Leur-lok sterylna strzykawka 1 ml</td><td>BD, Franklin Lakes, NJ</td><td>309628</td><td></td></tr><tr><td>Leur-lok sterylna strzykawka 3 ml</td><td>BD, Franklin Lakes, NJ</td><td>309657</td><td></td></tr><tr><td>Sterylna igła, 18 G</td><td>BD, Franklin Lakes, NJ</td><td>305195</td><td></td></tr><tr><td>Sterylna igła, 27 1/2 G</td><td>BD, Franklin Lakes, NJ</td><td>305109</td><td></td></tr><tr><td>3-drogowy kran odcinający&nbsp;</td><td>Smiths Medical ASD, Inc. Dublin, OH</td><td>MX5311L</td><td></td></tr><tr><td>Kerlix Rolki bandaży z gazy&nbsp;</td><td>Covidien, Mansfield, MA</td><td>6720</td><td></td></tr><tr><td>Kimwipes</td><td>Kimberly-Clark Professional, Roswell, GA</td><td>34155</td><td></td></tr><tr><td>Agaroza, Niska temperatura topnienia, klasa analityczna</td><td>Promega corporation, Madison, WI</td><td>V2111</td><td></td></tr><tr><td>Immunopure normalna surowica kozia</td><td>Thermo Scientific, Waltham, MA</td><td>31873</td><td>Przechowywać pod adresem -20 i #176; C</td></tr><tr><td>Anty-mysi CD4 sprzężony z barwnikiem PE</td><td>eBioscience, San Diego, CA&nbsp;</td><td>12004185</td><td>Sklep pod adresem 4 &#176; C</td></tr><tr><td>Paraformaldehydowa</td><td>Mikroskopia Elektronowa Sciences, Hatfield, PA</td><td>19202</td><td>Sklep pod adresem 4 &#176; C</td></tr><tr><td>Wodne podłoże montażowe Faramount</td><td>Dako, Carpinteria, CA</td><td>10073021</td><td></td></tr><tr><td>Probówka stożkowa (15 ml)</td><td>BD Biosciences, San Jose, CA</td><td>352099</td><td></td></tr><tr><td>Probówka stożkowa (50 ml)</td><td>BD Biosciences, San Jose, CA</td><td>352070</td><td></td></tr><tr><td>24-dołkowe płaskodenne płytki do hodowli tkankowych</td><td>BD Biosciences, San Jose, Kalifornia</td><td>356775</td><td></td></tr><tr><td>Pędzle</td> <td>do akwareli #2Charles Leonard, Inc. Hauppauge, NY</td><td>73502</td><td></td></tr><tr><td>Zwykłe szkiełka mikroskopowe, rozmiar: 3" x 1" x 1,2 mm</td><td>Fisher Scientific, Pittsburgh, PA</td><td>1255010</td><td></td></tr><tr><td>Premium Szkło nakrywkowe, 22 x 22-1</td><td>Fisher Scientific, Pittsburgh, PA</td><td>12548B</td><td></td></tr><tr><td>Jednorazowe kasety histologiczne do głębokiej pleśni</td><td>Produkt laboratoryjny, Rochester, NY</td><td>M-475-10</td><td></td></tr><tr><td>Klej Loctite Super</td><td>Henkel Corporation, Westlake, OH</td><td>1471879</td><td></td></tr><tr><td>Żyletki</td><td>Gillette SuperSilver</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Myhc-a 334-352 (DSAFDVLSFTAEEKAGVYK)</td><td>Neopeptyd, Cambridge, MA</td><td></td><td>Sklep pod adresem 4 &#176; C</td></tr><tr><td>PLP 139-151 (HSLGKWLGHPDKF)</td><td>Neopeptyd, Cambridge, MA</td><td></td><td>Sklep pod adresem 4 &#176; C</td></tr><tr><td>MHC klasa II/IAs PLP 139-151 lub dekstramery TMEV 70-86 sprzężone z barwnikiem</td><td></td><td></td> APC <td>Przechowywać w 4 &#176; C</td></tr><tr><td>MHC klasa II/IAk Myhc 334-352 lub&nbsp; lub dekstrymery RNazy 40-56 sprzężone z barwnikiem</td><td></td><td></td> APC <td>Przechowywać w 4 &#176; C</td></tr><tr><td>Dextran sprzężony z SA-APC</td><td>Immundex, Kopenhaga, Demark</td><td></td><td>Store at 4 &#176; C</td></tr><tr><td>Sterylne nożyczki chirurgiczne i kleszcze</td><td>Narzędzie INOX Corporation</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Mikropiekarnik</td><td>GE Healthcare, Pittsuburgh, PA</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Leica VT 1200 Vibratome</td><td>Leica Microsystems, Inc. Buffalo Grove, IL</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Olympus BX 60&nbsp; Laserowy skaningowy mikroskop konfokalny</td><td>Olympus America, Inc. Center Valley, PA</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Mikroskop konfokalny Nikon A1-Eclipse 90i</td><td>Nikon Inc. Melville, Nowy Jork</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

in situ wykrywanie autoreaktywnych limfocytów t cd4 w mózgu i sercu przy użyciu dekstramerów klasy ii o głównym kompleksie zgodności tkankowej

In Situ Detection of Autoreactive CD4 T Cells in Brain and Heart Using Major Histocompatibility Complex Class II Dextramers

Ten raport demonstruje użycie głównych dekstramerów klasy II kompleksu zgodności tkankowej (MHC) do wykrywania autoreaktywnych limfocytów T CD4 in situ w białku proteolipidowym mieliny (PLP) indukowanym przez 139-151 eksperymentalnym autoimmunologicznym zapaleniu mózgu i rdzenia (EAE) u myszy SJL oraz eksperymentalnym eksperymentalnym autoimmunologicznym zapaleniu mięśnia sercowego (EAM) wywołanym przez mi α ozynę serca serca (Myhc) 334-352 u myszy A/J. Zastosowano dwa zestawy koktajli odczynników dekstramerowych, w których komórki dekstramerów+ analizowano za pomocą laserowego skaningowego mikroskopu konfokalnego (LSCM): EAE,IA s/PLP 139-151 dekstramery (specyficzne)/anty-CD4 i IAs/wirus mysiego zapalenia mózgu i rdzenia Theilera (TMEV) 70-86 dekstramery (kontrola)/anty-CD4; oraz EAM, IAk/Myhc 334-352 dekstramery/anty-CD4 i IAk/rybonukleaza bydlęca (RNaza) 43-56 dekstramery (kontrola)/anty-CD4. Analiza LSCM skrawków mózgu uzyskanych od myszy EAE wykazała obecność komórek dodatnich dla dekstramerów CD4 i PLP 139-151, ale nie dekstramerów TMEV 70-86, co sugeruje, że barwienie uzyskane za pomocą dekstramerów PLP 139-151 było specyficzne. Podobnie, skrawki serca przygotowane od myszy EAM również wykazały obecność Myhc 334-352, ale nie komórek RNazy 43-56-dekstrymer+, jak oczekiwano. Ponadto opracowano kompleksową metodę ilościowej analizy częstości występowania specyficznych dla antygenu limfocytów T CD4 w obrazach seryjnych "Z".

W niniejszym raporcie opisano detekcję in situ antygenowo specyficznych, autoreaktywnych limfocytów T CD4 poprzez bezpośrednie barwienie dekstramerami MHC klasy II. Świeżo wycięte przekroje mózgu pobrano od myszy z EAE i zabarwiono koktajlami zawierającymi dekstramery PLP 139-151 (specyficzne) lub TMEV 70-86 (kontrolne) oraz przeciwciała anty-CD4. Górne panele na Rysunku 1 przedstawiają analizę LSCM przekrojów mózgu poddanych podwójnemu barwieniu dekstramerami PLP 139-151 (czerwone) i przeciwcia...

Protokół wykrywania samoreaktywnych limfocytów T CD4 w mózgu i sercu poprzez bezpośrednie barwienie głównymi dekstramerami klasy II kompleksu zgodności tkankowej został opisany w tym raporcie. Do kompleksowej analizy opracowano również wiarygodną metodę wyliczania częstości występowania limfocytów T CD4+ specyficznych dla antygenu in situ.

In Situ Wykrywanie autoreaktywnych limfocytów T CD4 w mózgu i sercu przy użyciu dekstramerów klasy II o głównym kompleksie zgodności tkankowej

This report demonstrates the use of major histocompatibility complex (MHC) class II dextramers for detection of autoreactive CD4 T cells in situ in myelin ...

Ogólnym celem niniejszej procedury jest wykrycie autoreaktywnych limfocytów T z wysokim stopniem specyficzności przy użyciu MHC klasy II dex trimmers. W tym filmie tkanka mózgowa jest pobierana z mózgu myszy z indukowanym białkiem proteolipidu mieliny eksperymentalnym autoimmunologicznym zapaleniem mielitowym. Jest to realizowane poprzez uprzednie staranne pobranie tkanek i przygotowanie bloczków paraffinowych.Drugim krokiem jest pocięcie tkanki zatopionej w agarozie na sekcje o grubości 200 µm za pomocą mikrotomu. Następnie sekcje przenosi się do komór tkankowych na płytce 24-dołkowej, gdzie zostają one zabarwione i utrwalone. Ostatnim krokiem jest osadzenie sekcji tkankowych na szkiełkach przedmiotowych.Ostatecznie do wykazania komórek związanych z tetramerami MHC klasy II i przeciwciałami anty-CD4 wykorzystuje się mikroskopię konfokalną. Pomysł ten sformułowaliśmy po raz pierwszy, gdy wykazaliśmy, że tetramery MHC klasy II są bardziej czułe niż konwencjonalne tetramery MHC klasy II w wykrywaniu swoistych dla antygenu autoreaktywnych limfocytów T CD4. Zazwyczaj osoby rozpoczynające pracę z tą metodą napotykają trudności, ponieważ sekcjonowanie i obchodzenie się ze świeżą tkanką jest dość wymagające.Wizualna demonstracja tej metody jest kluczowa, ponieważ etapy cięcia, montowania i analizy są trudne do opanowania ze względu na swoją złożoność. Oprócz Ting, dwóch pracowników naukowych na stopniu postdoc z mojej grupy – Chandy i Aaron – oraz Christian z laboratorium dr Zoe zaprezentują tę procedurę. Po eutanazji myszy z eksperymentalnym autoimmunologicznym zapaleniem mózgu i rdzenia (EAE) należy odsłonić czaszkę, wycinając sklepienie czaszki okrężnie za pomocą zakrzywionych nożyczek, a następnie ostrożnie odchylić kości czaszki pęsetą. Mózg należy pobrać poprzez rozcięcie tępe za pomocą czystego skalpela.Oddziel rdzeń od móżdżku. Umieść rdzeń w probówce zawierającej zimny 1x roztwór soli fizjologicznej fosforanowej (PBS) i pozostaw probówkę na lodzie do czasu opracowania. Umieść rdzeń w jednorazowej kasecie histologicznej z głębokim dnem, utrzymywanej na lodzie.Następnie wlej stopiony 4% PBS buforowany low melting aros do kasety. Natychmiast delikatnie dociśnij mózgowie pęsetą, aby zanurzyć tkankę, i pozostaw kasetę na lodzie do czasu całkowitego stężenia. Po zestaleniu odetnij nadmiar aeros z każdej strony zatopionej tkanki i lekko odsłoń powierzchnię brzuszną mózgowia.Następnie posmarować blok tkankowy Vibram superglue i przenieść tkankę zatopioną w aros na klejoną powierzchnię, kładąc odsłoniętą powierzchnię brzuszną cerebro na kleju w celu wykonania przekrojów poprzecznych. Nie przesuwać tkanki po jej ustaleniu na bloku. Umieścić blok Vibram z zatopioną w aros tkanką na lodzie i pozostawić klej do wyschnięcia na 15 minut.W międzyczasie umieść przygotowane komory tkankowe w płytce 24-dołkowej, w proporcji jednej komory na dołek. Napełnij dołki zawierające komory tkankowe jednym mililitrem zimnego 1X PBS i pozostaw płytkę w lodzie. Po wyschnięciu kleju opuść ostrze wibracyjne do poziomu górnej powierzchni tkanki.Ustaw prędkość Vibram na 0.22 mm/s i rozpocznij sekcjonowanie ruchem do przodu, aby uzyskać przekroje o grubości 200 µm. Za pomocą miękkiego pędzla akwarelowego przenieś jeden przekrój mózgu do każdej komory z tkanką. Płytkę 24-dołkową należy trzymać na lodzie do czasu zakończenia sekcjonowania, aby zapobiec degradacji tkanki.Następnie przygotuj drugą płytkę 24-dołkową, dodając 300 µL koktajlu zawierającego IA of S myelin protio lipid protein 1 39 to 1 51 dextro oraz przeciwciało CD4 do trzech dołków. Następnie dodaj 300 µL kontrolnego koktajlu IA of S Tyler's murine encephalomyelitis virus 70 to 86 dextro oraz przeciwciała CD4 do kolejnego zestawu trzech dołków. Przejdź do etykietowania dołków.Następnie przenieś trzy komory tkankowe zawierające skrawki przeznaczone do barwienia swoistymi dex trimmerami do trzech wyznaczonych studzienek płytki 24-dołkowej, umieszczając jedną komorę w każdej studience. W podobny sposób przenieś trzy komory tkankowe zawierające skrawki przeznaczone do barwienia kontrolowanymi dex streamerami do odpowiednich studzienek. Przykryj studzienki, w których znajduje się po jednej komorze, pokrywą.Owiń płytkę folią aluminiową i umieść ją na platformie kołyszącej ustawionej na łagodną rotację na 1,5 godziny w ciemności w temperaturze pokojowej. Po okresie inkubacji przemyj skrawki tkanek, przenosząc je do nowej studzienki zawierającej 1 mL zimnego roztworu płuczącego 1x PBS na co najmniej 10 minut na platformie kołyszącej. Powtórz etap płukania trzy razy.Należy dopilnować, aby skrawki tkankowe nie wyschły, ponieważ mogą one przykleić się do ścianek komory. Utwierdź skrawki, przenosząc komory tkankowe do nowej studni płytki 24-dołkowej zawierającej jeden mililitr przefiltrowanego 4% PBS buforowanego parafomaldehydu, a następnie inkubuj na platformie kołyszącej przez dwie godziny przy łagodnych obrotach.Po trzykrotnym dodatkowym przemyciu preparatów, należy umieścić zbarwione i utrwalone skrawki na czystym szkiełku przedmiotowym. Za pomocą miękkiego pędzla akwarelowego należy usunąć nadmiar wody, uważając, aby nie dotknąć skrawka, a następnie zamontować go, stosując medium montażowe. Całość należy przykryć szkiełkiem nakrywkowym i pozostawić do wyschnięcia w temperaturze pokojowej przez noc.W ciemni należy użyć systemu mikroskopu konfokalnego Nikon A1 Eclipse 90i do rutynowego skanowania i akwizycji obrazów. Aby rozpocząć, otwórz oprogramowanie NIS-Elements AR i wybierz z panelu kanały tetraetylo-diaminy, izotiocyjanianu rodaminy (TRITC) oraz Cyanine 5 (Cy5).Przypisz pseudokolor zielony dla kanału Trit Sea oraz czerwony dla kanału SCI five. Umieść preparat do badania na stoliku mikroskopu i ustaw ostrość ręcznie przy 100-krotnym powiększeniu. Ustaw HV na 10 i offset na zero, kliknij focus i dostrój napięcie.Aby zoptymalizować lasery, kliknij focus scan, przeskanuj przekrój od góry do dołu i ustaw poziom Z dla akwizycji obrazu. Następnie kliknij CH series i wykonaj sekwencyjną akwizycję obrazów. Zidentyfikuj komórki T CD4+ typu dextro lub pozytywne, które pod postacią żółtych komórek punktowych wynikają z kolokalizacji sygnałów generowanych z obu kanałów: czerwonego i zielonego.Do łatwego ilościowego zliczania komórek T dodatnich pod kątem CD4 należy użyć konfokalnego mikroskopu Olympus FV 500 BX 60. W celu rozpoczęcia pracy otwórz oprogramowanie flu ovu. Z menu rozwijanego wybierz barwniki S SI three oraz SCI five, a następnie kliknij apply, aby załadować odpowiednie lasery.Umieść preparat do badania na stoliku mikroskopu i ustaw ostrość ręcznie przy niskim powiększeniu; kliknij focus, gdy laser SI three jest włączony, i ustaw ostrość na ognisko zapalne. Zmień obiektyw na powiększenie 100x. W menu rozwijanym ustaw rozmiar pliku na pięć 12 na pięć 12, kliknij focus i dostosuj wartości wzmocnienia (gain) oraz przesunięcia (offset) PMT, aby zoptymalizować lasery oddzielnie dla S SI three i sci five, kliknij Z stage, a następnie kliknij focus przy włączonych obu laserach.Ustaw grubość obszaru skanowania w osi Z, klikając strzałki w górę i w dół. Ustaw interwał Z na dwa µm. Kliknij stop i wybierz.Wykonaj wyszukiwanie w osiach 1, 2, 3. Następnie kliknij X, y, Z i rozpocznij akwizycję obrazów serii Z dla wybranego obszaru w obrębie ogniska zapalnego, zapisując obrazy serii Z jako pliki VI. Aby zapisać pliki obrazów, wybierz obraz z serii Z, a następnie zapisz go w formacie TIFF.Zawsze zapisuj obrazy w formacie multi TIFF. Po zabezpieczeniu danych kolejnym krokiem jest zbadanie trzech par przekrojów, które zostały zabarwione obydwoma zestawami dex trimmers. Najpierw wykonaj obrazy seryjne Z, skanując preparaty w ruchu poziomym-pionowym w górę i poziomym-pionowym w dół, aby uniknąć powtórzeń serii Z w tym samym punkcie ostrości.Po zarejestrowaniu obrazów seryjnych w osi Z, nazwij pliki, określając numery slajdów, nazwy przekrojów oraz liczbę wykonanych obrazów seryjnych Z. Użyj oprogramowania ImageJ, aby policzyć komórki T CD4+ wykazujące pozytywną reakcję z dextro w stosunku do całkowitej liczby komórek T CD4+. Wybierz odpowiedni typ licznika w ImageJ, zaznacz opcję „show all” i rozpocznij liczenie, klikając w centrum każdej komórki i kontynuując liczenie w kolejnych obrazach seryjnych Z za pomocą strzałek bocznych.Po przeliczeniu wszystkich limfocytów T CD4, wybierz inny typ licznika i przelicz limfocyty T CD4 dodatnie i dextro dodatnie. Kliknij kartę wyników, aby uzyskać całkowitą liczbę komórek przeliczonych za pomocą dwóch różnych liczników. Detekcję limfocytów T CD4 specyficznych dla białka proteolipidowego mieliny (PLP) przeprowadzono z wykorzystaniem świeżo wyciętych przekrojów mózgu pochodzących od myszy z EAE, barwionych koktajlami zawierającymi przeciwciała anty-CD4 oraz dextry PLP 139-151 lub kontrolne dextry TMEV 70-86 LSCM.Analiza sekcji mózgu poddanych podwójnemu barwieniu wykazuje komórki pozytywne w kierunku dekamerów PLP 1 39 do 1 51 w kolorze czerwonym oraz komórki pozytywne w kierunku przeciwciała CD four w kolorze zielonym, natomiast komórki podwójnie pozytywne pojawiły się w kolorze żółtym. Komórki z podwójnym barwieniem wykazywały kropkowate punkty wokół obwodu. Cecha ta nie wystąpiła w sekcji barwionej kontrolnie za pomocą TMEV 70 do 86.Przeprowadzono również detekcję limfocytów T CD4 specyficznych dla miozyny serca za pomocą barwienia in situ z użyciem dexterów do miozyny ciężkiej łańcucha alfa 3 34 do 3 52. Analiza tych obrazów za pomocą LSCM wykazała obecność komórek wykazujących pozytywny wynik dla MYHC 3 34 do 3 52 dexters w kolorze czerwonym, komórek pozytywnych dla CD4 w kolorze zielonym oraz komórek związanych zarówno z dexterem, jak i z CD4 w formie żółtych punktowych komórek. Barwienie tła dla kontrolnych RNA 43 do 56 dexters było pomijalne. Po opanowaniu, technika ta może zostać wykonana w około 8 do 10 godzin, w przeciwieństwie do trzech dni w przypadku innych opublikowanych protokołów, pod warunkiem jej prawidłowego przeprowadzenia.Podczas wykonywania tej procedury ważne jest, aby przygotować odczynniki z wyprzedzeniem i systematycznie realizować kolejne kroki. Po obejrzeniu tego filmu powinni Państwo posiadać dokładną wiedzę na temat tego, jak przygotować skrawki i barwić tkanki w celu wyliczenia komórek T CD4 w wybranych organach.

in-situ-detection-autoreactive-cd4-t-cells-brain-heart-using-major

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Immunologia i infekcje

In Situ Wykrywanie Autoreaktywnych Komórek T CD4 w Mózgu i Sercu za Pomocą Dextramerów Kompleksu Glavnnej Zgodności Tkankowej Klasy II

Niniejsza procedura demonstruje oczyszczanie i ekspansję in vitro antygenowo swoistych limfocytów T CD4+ z pełnej krwi obwodowej oraz ich wizualizację przy użyciu tetramerów MHC klasy II. Tetramery umożliwiają bezpośrednią wizualizację limfocytów T o pojedynczej swoistości antygenowej i określonym ograniczeniu MHC klasy II.<br...

Wizualizacja antygenowo swoistych limfocytów T CD4+ z wykorzystaniem tetramerów MHC klasy II

Niniejszy artykuł opisuje szybki protokół wydajnej izolacji komórek mononuklearnych z tkanek mózgu i rdzenia kręgowego, które mogą być skutecznie wykorzystane w analizach cytometrycznych.

Izolacja mononuklearnych komórek mózgu i rdzenia kręgowego z wykorzystaniem gradientów Percollu

W ostatnich latach testy oparte na żywych komórkach były z powodzeniem wykorzystywane do wykrywania przeciwciał przeciwko antygenom powierzchniowym i konformacyjnym. W tym miejscu opisano metodę wykorzystującą wysokoprzepustową cytometrię przepływową, umożliwiającą analizę dużych kohort pacjentów. Wykrycie nowych przeciwciał poprawi diagnostykę i leczenie zaburzeń o podłożu immunologicznym.

Wysokoprzepustowy test cytometrii przepływowej oparty na komórkach do wykrywania przeciwciał przeciwko receptorowi N-metylo-D-asparaginianu lub receptorowi dopaminy-2 w ludzkiej surowicy

Mechanizmy rządzące ruchliwością śródmiąższową komórek T efektorowych CD4 w miejscach zapalenia są stosunkowo nieznane. Przedstawiamy nieinwazyjne podejście do wizualizacji i manipulacji limfocytami T CD4 przygotowanymi in vitro w zapalnej skórze właściwej ucha, co pozwala na badanie dynamicznego zachowania tych komórek in situ.

Obrazowanie migracji śródmiąższowej komórek T CD4 w stanie zapalnym skóry właściwej

Ten artykuł opisuje metodę pomiaru alloreaktywności w mieszanej populacji limfocytów T za pomocą obrazowania cytometrii przepływowej.

Pomiar alloreaktywności limfocytów T za pomocą obrazowej cytometrii przepływowej

Tutaj opisujemy metodę, która łączy barwienie in situ MHC-tetrameru z immunohistochemią w celu określenia lokalizacji, fenotypu i ilości limfocytów T specyficznych dla antygenu w tkankach. Protokół ten służy do określania charakterystyki przestrzennej i fenotypowej limfocytów T CD8 specyficznych dla antygenu w stosunku do innych typów komórek i struktur w tkankach.

In Situ Barwienie tetrameru MHC i analiza ilościowa w celu określenia lokalizacji, liczebności i fenotypu limfocytów T CD8 specyficznych dla antygenu w tkankach

Ten protokół przedstawia prostą i efektywną metodę izolacji, identyfikacji i ilościowego oznaczania komórek odpornościowych znajdujących się w mięśniu sercowym myszy podczas stanu stacjonarnego lub zapalnego. Protokół łączy trawienie enzymatyczne i mechaniczne w celu wytworzenia zawiesiny pojedynczej komórki, która może być dalej analizowana za pomocą cytometrii przepływowej.

Izolacja i identyfikacja pozanaczyniowych komórek odpornościowych serca

Ten artykuł szczegółowo opisuje metodologię znakowania radioaktywnego przeciwciała monoklonalnego anty-CD19 specyficznego dla człowieka i jak go używać do ilościowego oznaczania limfocytów B w ośrodkowym układzie nerwowym i tkankach obwodowych mysiego modelu stwardnienia rozsianego przy użyciu obrazowania in vivo PET, zliczania gamma ex vivo i metod autoradiograficznych.

Obrazowanie limfocytów B CD19 + w eksperymentalnym mysim modelu autoimmunologicznego zapalenia mózgu i rdzenia przy użyciu pozytonowej tomografii emisyjnej

Dostarczamy szczegółowy protokół do izolowania i identyfikacji rzadkich populacji limfocytów T specyficznych dla antygenu w płucach myszy poprzez magnetyczne wzbogacanie limfocytów T na bazie kulek magnetycznych i tetramery peptydu:głównego kompleksu zgodności tkankowej (MHC).

Identyfikacja rzadkich limfocytów T specyficznych dla antygenu z płuc myszy za pomocą peptydów: głównych tetramerów kompleksu zgodności tkankowej

Trójwymiarowa (3D) rekonstrukcja uszkodzenia serca w reperfuzji ostrego zawału mięśnia sercowego (repAMI) umożliwia wierną kwantyfikację i kolokalizację powiązanych wzorców wpływających na chorobę. W tym przypadku zapewniono zautomatyzowane obrazowanie sterowane arkuszem świetlnym do jednoczesnego pomiaru uszkodzenia serca, obszaru ryzyka i odpowiedzi komórek odpornościowych.

Jednoczesna analiza 3D uszkodzenia serca i odpowiedzi immunologicznej w ostrym zawale mięśnia sercowego z reperfuzją przy użyciu mikroskopii fluorescencyjnej arkusza światła

Poznaj metodę wykrywania autoreaktywnych limfocytów T CD4 w mózgu i sercu przy użyciu dekstramerów klasy II MHC. Ta technika umożliwia precyzyjną analizę częstości komórek T specyficznych dla antygenu in situ.

In Situ Wykrywanie autoreaktywnych limfocytów T CD4 w mózgu i sercu przy użyciu dekstramerów klasy II o głównym kompleksie zgodności tkankowej (Wideo) | JoVE Journal

In Situ Wykrywanie autoreaktywnych limfocytów T CD4 w mózgu i sercu przy użyciu dekstramerów klasy II o głównym kompleksie zgodności tkankowej

Przeglądaj więcej filmów