In Situ Wykrywanie autoreaktywnych limfocytów T CD4 w mózgu i sercu przy użyciu dekstramerów klasy II o głównym kompleksie zgodności tkankowej

Ogólnym celem niniejszej procedury jest wykrycie autoreaktywnych limfocytów T z wysokim stopniem specyficzności przy użyciu MHC klasy II dex trimmers. W tym filmie tkanka mózgowa jest pobierana z mózgu myszy z indukowanym białkiem proteolipidu mieliny eksperymentalnym autoimmunologicznym zapaleniem mielitowym. Jest to realizowane poprzez uprzednie staranne pobranie tkanek i przygotowanie bloczków paraffinowych.

Drugim krokiem jest pocięcie tkanki zatopionej w agarozie na sekcje o grubości 200 µm za pomocą mikrotomu. Następnie sekcje przenosi się do komór tkankowych na płytce 24-dołkowej, gdzie zostają one zabarwione i utrwalone. Ostatnim krokiem jest osadzenie sekcji tkankowych na szkiełkach przedmiotowych.

Ostatecznie do wykazania komórek związanych z tetramerami MHC klasy II i przeciwciałami anty-CD4 wykorzystuje się mikroskopię konfokalną. Pomysł ten sformułowaliśmy po raz pierwszy, gdy wykazaliśmy, że tetramery MHC klasy II są bardziej czułe niż konwencjonalne tetramery MHC klasy II w wykrywaniu swoistych dla antygenu autoreaktywnych limfocytów T CD4. Zazwyczaj osoby rozpoczynające pracę z tą metodą napotykają trudności, ponieważ sekcjonowanie i obchodzenie się ze świeżą tkanką jest dość wymagające.

Wizualna demonstracja tej metody jest kluczowa, ponieważ etapy cięcia, montowania i analizy są trudne do opanowania ze względu na swoją złożoność. Oprócz Ting, dwóch pracowników naukowych na stopniu postdoc z mojej grupy – Chandy i Aaron – oraz Christian z laboratorium dr Zoe zaprezentują tę procedurę. Po eutanazji myszy z eksperymentalnym autoimmunologicznym zapaleniem mózgu i rdzenia (EAE) należy odsłonić czaszkę, wycinając sklepienie czaszki okrężnie za pomocą zakrzywionych nożyczek, a następnie ostrożnie odchylić kości czaszki pęsetą. Mózg należy pobrać poprzez rozcięcie tępe za pomocą czystego skalpela.

Oddziel rdzeń od móżdżku. Umieść rdzeń w probówce zawierającej zimny 1x roztwór soli fizjologicznej fosforanowej (PBS) i pozostaw probówkę na lodzie do czasu opracowania. Umieść rdzeń w jednorazowej kasecie histologicznej z głębokim dnem, utrzymywanej na lodzie.

Następnie wlej stopiony 4% PBS buforowany low melting aros do kasety. Natychmiast delikatnie dociśnij mózgowie pęsetą, aby zanurzyć tkankę, i pozostaw kasetę na lodzie do czasu całkowitego stężenia. Po zestaleniu odetnij nadmiar aeros z każdej strony zatopionej tkanki i lekko odsłoń powierzchnię brzuszną mózgowia.

Następnie posmarować blok tkankowy Vibram superglue i przenieść tkankę zatopioną w aros na klejoną powierzchnię, kładąc odsłoniętą powierzchnię brzuszną cerebro na kleju w celu wykonania przekrojów poprzecznych. Nie przesuwać tkanki po jej ustaleniu na bloku. Umieścić blok Vibram z zatopioną w aros tkanką na lodzie i pozostawić klej do wyschnięcia na 15 minut.

W międzyczasie umieść przygotowane komory tkankowe w płytce 24-dołkowej, w proporcji jednej komory na dołek. Napełnij dołki zawierające komory tkankowe jednym mililitrem zimnego 1X PBS i pozostaw płytkę w lodzie. Po wyschnięciu kleju opuść ostrze wibracyjne do poziomu górnej powierzchni tkanki.

Ustaw prędkość Vibram na 0.22 mm/s i rozpocznij sekcjonowanie ruchem do przodu, aby uzyskać przekroje o grubości 200 µm. Za pomocą miękkiego pędzla akwarelowego przenieś jeden przekrój mózgu do każdej komory z tkanką. Płytkę 24-dołkową należy trzymać na lodzie do czasu zakończenia sekcjonowania, aby zapobiec degradacji tkanki.

Następnie przygotuj drugą płytkę 24-dołkową, dodając 300 µL koktajlu zawierającego IA of S myelin protio lipid protein 1 39 to 1 51 dextro oraz przeciwciało CD4 do trzech dołków. Następnie dodaj 300 µL kontrolnego koktajlu IA of S Tyler's murine encephalomyelitis virus 70 to 86 dextro oraz przeciwciała CD4 do kolejnego zestawu trzech dołków. Przejdź do etykietowania dołków.

Następnie przenieś trzy komory tkankowe zawierające skrawki przeznaczone do barwienia swoistymi dex trimmerami do trzech wyznaczonych studzienek płytki 24-dołkowej, umieszczając jedną komorę w każdej studience. W podobny sposób przenieś trzy komory tkankowe zawierające skrawki przeznaczone do barwienia kontrolowanymi dex streamerami do odpowiednich studzienek. Przykryj studzienki, w których znajduje się po jednej komorze, pokrywą.

Owiń płytkę folią aluminiową i umieść ją na platformie kołyszącej ustawionej na łagodną rotację na 1,5 godziny w ciemności w temperaturze pokojowej. Po okresie inkubacji przemyj skrawki tkanek, przenosząc je do nowej studzienki zawierającej 1 mL zimnego roztworu płuczącego 1x PBS na co najmniej 10 minut na platformie kołyszącej. Powtórz etap płukania trzy razy.

Należy dopilnować, aby skrawki tkankowe nie wyschły, ponieważ mogą one przykleić się do ścianek komory. Utwierdź skrawki, przenosząc komory tkankowe do nowej studni płytki 24-dołkowej zawierającej jeden mililitr przefiltrowanego 4% PBS buforowanego parafomaldehydu, a następnie inkubuj na platformie kołyszącej przez dwie godziny przy łagodnych obrotach.

Po trzykrotnym dodatkowym przemyciu preparatów, należy umieścić zbarwione i utrwalone skrawki na czystym szkiełku przedmiotowym. Za pomocą miękkiego pędzla akwarelowego należy usunąć nadmiar wody, uważając, aby nie dotknąć skrawka, a następnie zamontować go, stosując medium montażowe. Całość należy przykryć szkiełkiem nakrywkowym i pozostawić do wyschnięcia w temperaturze pokojowej przez noc.

W ciemni należy użyć systemu mikroskopu konfokalnego Nikon A1 Eclipse 90i do rutynowego skanowania i akwizycji obrazów. Aby rozpocząć, otwórz oprogramowanie NIS-Elements AR i wybierz z panelu kanały tetraetylo-diaminy, izotiocyjanianu rodaminy (TRITC) oraz Cyanine 5 (Cy5).

Przypisz pseudokolor zielony dla kanału Trit Sea oraz czerwony dla kanału SCI five. Umieść preparat do badania na stoliku mikroskopu i ustaw ostrość ręcznie przy 100-krotnym powiększeniu. Ustaw HV na 10 i offset na zero, kliknij focus i dostrój napięcie.

Aby zoptymalizować lasery, kliknij focus scan, przeskanuj przekrój od góry do dołu i ustaw poziom Z dla akwizycji obrazu. Następnie kliknij CH series i wykonaj sekwencyjną akwizycję obrazów. Zidentyfikuj komórki T CD4+ typu dextro lub pozytywne, które pod postacią żółtych komórek punktowych wynikają z kolokalizacji sygnałów generowanych z obu kanałów: czerwonego i zielonego.

Do łatwego ilościowego zliczania komórek T dodatnich pod kątem CD4 należy użyć konfokalnego mikroskopu Olympus FV 500 BX 60. W celu rozpoczęcia pracy otwórz oprogramowanie flu ovu. Z menu rozwijanego wybierz barwniki S SI three oraz SCI five, a następnie kliknij apply, aby załadować odpowiednie lasery.

Umieść preparat do badania na stoliku mikroskopu i ustaw ostrość ręcznie przy niskim powiększeniu; kliknij focus, gdy laser SI three jest włączony, i ustaw ostrość na ognisko zapalne. Zmień obiektyw na powiększenie 100x. W menu rozwijanym ustaw rozmiar pliku na pięć 12 na pięć 12, kliknij focus i dostosuj wartości wzmocnienia (gain) oraz przesunięcia (offset) PMT, aby zoptymalizować lasery oddzielnie dla S SI three i sci five, kliknij Z stage, a następnie kliknij focus przy włączonych obu laserach.

Ustaw grubość obszaru skanowania w osi Z, klikając strzałki w górę i w dół. Ustaw interwał Z na dwa µm. Kliknij stop i wybierz.

Wykonaj wyszukiwanie w osiach 1, 2, 3. Następnie kliknij X, y, Z i rozpocznij akwizycję obrazów serii Z dla wybranego obszaru w obrębie ogniska zapalnego, zapisując obrazy serii Z jako pliki VI. Aby zapisać pliki obrazów, wybierz obraz z serii Z, a następnie zapisz go w formacie TIFF.

Zawsze zapisuj obrazy w formacie multi TIFF. Po zabezpieczeniu danych kolejnym krokiem jest zbadanie trzech par przekrojów, które zostały zabarwione obydwoma zestawami dex trimmers. Najpierw wykonaj obrazy seryjne Z, skanując preparaty w ruchu poziomym-pionowym w górę i poziomym-pionowym w dół, aby uniknąć powtórzeń serii Z w tym samym punkcie ostrości.

Po zarejestrowaniu obrazów seryjnych w osi Z, nazwij pliki, określając numery slajdów, nazwy przekrojów oraz liczbę wykonanych obrazów seryjnych Z. Użyj oprogramowania ImageJ, aby policzyć komórki T CD4+ wykazujące pozytywną reakcję z dextro w stosunku do całkowitej liczby komórek T CD4+. Wybierz odpowiedni typ licznika w ImageJ, zaznacz opcję „show all” i rozpocznij liczenie, klikając w centrum każdej komórki i kontynuując liczenie w kolejnych obrazach seryjnych Z za pomocą strzałek bocznych.

Po przeliczeniu wszystkich limfocytów T CD4, wybierz inny typ licznika i przelicz limfocyty T CD4 dodatnie i dextro dodatnie. Kliknij kartę wyników, aby uzyskać całkowitą liczbę komórek przeliczonych za pomocą dwóch różnych liczników. Detekcję limfocytów T CD4 specyficznych dla białka proteolipidowego mieliny (PLP) przeprowadzono z wykorzystaniem świeżo wyciętych przekrojów mózgu pochodzących od myszy z EAE, barwionych koktajlami zawierającymi przeciwciała anty-CD4 oraz dextry PLP 139-151 lub kontrolne dextry TMEV 70-86 LSCM.

Analiza sekcji mózgu poddanych podwójnemu barwieniu wykazuje komórki pozytywne w kierunku dekamerów PLP 1 39 do 1 51 w kolorze czerwonym oraz komórki pozytywne w kierunku przeciwciała CD four w kolorze zielonym, natomiast komórki podwójnie pozytywne pojawiły się w kolorze żółtym. Komórki z podwójnym barwieniem wykazywały kropkowate punkty wokół obwodu. Cecha ta nie wystąpiła w sekcji barwionej kontrolnie za pomocą TMEV 70 do 86.

Przeprowadzono również detekcję limfocytów T CD4 specyficznych dla miozyny serca za pomocą barwienia in situ z użyciem dexterów do miozyny ciężkiej łańcucha alfa 3 34 do 3 52. Analiza tych obrazów za pomocą LSCM wykazała obecność komórek wykazujących pozytywny wynik dla MYHC 3 34 do 3 52 dexters w kolorze czerwonym, komórek pozytywnych dla CD4 w kolorze zielonym oraz komórek związanych zarówno z dexterem, jak i z CD4 w formie żółtych punktowych komórek. Barwienie tła dla kontrolnych RNA 43 do 56 dexters było pomijalne. Po opanowaniu, technika ta może zostać wykonana w około 8 do 10 godzin, w przeciwieństwie do trzech dni w przypadku innych opublikowanych protokołów, pod warunkiem jej prawidłowego przeprowadzenia.

Podczas wykonywania tej procedury ważne jest, aby przygotować odczynniki z wyprzedzeniem i systematycznie realizować kolejne kroki. Po obejrzeniu tego filmu powinni Państwo posiadać dokładną wiedzę na temat tego, jak przygotować skrawki i barwić tkanki w celu wyliczenia komórek T CD4 w wybranych organach.