Szybka izolacja i oczyszczanie mitochondriów do przeszczepu przez dysocjację tkanek i filtrację różnicową

Ogólnym celem niniejszej procedury jest szybka izolacja czystych i sprawnych oddechowo mitochondriów z tkanki szczura. Osiąga się to poprzez wstępne połączenie i homogenizację próbek tkanki. Kolejne etapy polegają na dodaniu subin A do homogenatu i inkubacji na lodzie.

Następnie homogenat mieszany z BSA poddaje się filtracji, a potem filtruje go ponownie. Końcowe etapy polegają na odwirowaniu filtratu i resuspensji osadu mitochondrialnego w buforze do respiracji. Ostatecznie, poprzez analizę respiracji oraz test luminescencji ATP, można wykazać, że wyizolowane mitochondria są żywe i zdolne do oddychania.

Główną zaletą tej techniki w porównaniu z istniejącymi metodami, w których czas izolacji mitochondriów wynosi od 60 do stu minut, jest możliwość wyizolowania żywotnych i zdolnych do oddychania mitochondriów w czasie krótszym niż 30 minut. Allison mackay, technik z laboratorium współpracującego, zademonstruje test luminescencji ATP tuż przed rozpoczęciem. Rozpuścić subin A w 1 mL buforu homogenizującego oraz rozpuścić BSA również w 1 mL buforu homogenizującego.

Następnie należy pobrać dwie świeże próbki tkanki za pomocą 6 mm wycinaka do biopsji i przechowywać je w XPBS na lodzie w probówce wirówkowej o pojemności 50 ml. Po przygotowaniu przenieść tkankę do probówki C do dysocjacji zawierającej 5 ml lodowatego buforu homogenizującego. Następnie zhomogenizować tkankę, mocując probówkę w urządzeniu do dysocjacji tkanki i wybierając zaprogramowany cykl izolacji mitochondriów.

Po zakończeniu procesu umieść probówkę z powrotem w lodzie i dodaj 250 µL roztworu stokowego subtylizyny. Wymieszaj zawartość poprzez odwracanie probówki. Gdy mieszanina będzie wyglądać na jednorodną, inkubuj homogenat w lodzie przez 10 minut.

Następnie na 50 ml stożkowej probówce do wirowania umieść filtr o oczkach 40 μm i wstaw ją do lodu. Nawilż filtr buforem do homogenizacji, a następnie wylej bufor do pojemnika na odpady. Gdy wszystko będzie przygotowane, przelej homogenat przez filtr do naczynia na filtrat.

Dodać 250 µL roztworu stokowego BSA i wymieszać poprzez odwracanie. Krok ten należy jednak pominąć w przypadku analizy białek mitochondrialnych. Następnie przygotować dwie kolejne próbki.

Przygotować dwie 50 ml stożkowe probówki wirówkowe w lodzie, jedną z filtrem 40 µm, a drugą z filtrem 10 µm. Oba filtry zwilżyć niewielką ilością buforu homogenizującego, a następnie odrzucić ten bufor. Następnie przelać homogenat najpierw przez filtr 40 µm, a potem przez filtr 10 µm.

Etapy filtracji te znacząco poprawiają czystość mitochondriów. Teraz należy podzielić filtrat pomiędzy dwie schłodzone wcześniej probówki do wirówki o pojemności 1,5 ml i wirować je z prędkością 9,000 G przez 10 minut w temperaturze 4 °C. Następnie należy usunąć nadsącz, a dwa oczyszczone osady mitochondrialne zawiesić ponownie i połączyć.

W jednym mililitrze lodowatego buforu do oddychania; kluczowe jest, aby całą procedurę przeprowadzić w temperaturze 4°C. Oczyszczone mitochondria można teraz poddać badaniu w celu określenia aktywności metabolicznej wyizolowanych mitochondriów. Test luminescencji ATP można przeprowadzić przy użyciu zestawu do oznaczania ATP.

W pierwszej kolejności doprowadzić odczynniki z zestawu do temperatury pokojowej. Następnie przygotować roztwór zapasowy HT P i umieścić go w lodzie. Kolejnym krokiem jest dodanie 5 mL buforu do substratu do liofilizowanego roztworu substratu.

Pomieszaj delikatnie i odstaw w ciemne miejsce. Następnie dodaj 100 µL buforu do oddychania do każdego dołka nieprzezroczystej czarnej płytki 96-dołkowej. Dodaj 10 µL przygotowanych mitochondriów do dołków znajdujących się poniżej standardów ATP.

Każdą unikalną próbkę mitochondrialną należy nanieść w trzech powtórzeniach; w trzech studzienkach należy umieścić sam bufor do respiracji jako kontrolę negatywną. Następnie do każdej załadowanej studzienki należy dodać 50 µL roztworu do lizy komórek ssaków. Płytkę należy inkubować w temperaturze 37 °C przez pięć minut na wytrząsarce orbitalnej przy 120 RPM.

Podczas inkubacji przygotować rozcieńczenia standardu A TP w zakresie od 0,1 mM do 0,1 µM. Po inkubacji dodać 10 µL każdego ze standardów A TP do odpowiednich dołków wskazanych na mapie płytki. Następnie dodać do każdego z nich 50 µL zrekonstytuowanego roztworu substratu.

Następnie ponownie inkubuj płytkę, tak jak poprzednio, przez pięć minut. Dalej przystąp do analizy płytek w czytniku płytek. Otwórz oprogramowanie w.

Utwórz nowy element. Kliknij eksperyment. Następnie kliknij domyślny protokół i zatwierdź przyciskiem OK.

W lewej kolumnie wybierz protokół. Następnie przejdź do procedury. Dalej wybierz opcję opóźnienia (delay) i ustaw ją na 10 minutes. Następnie zatwierdź wpis przyciskiem OK.

Teraz wybierz opcję odczytu, a następnie wybierz luminescencję z menu rozwijanego. Skonfiguruj pozostałe ustawienia w następujący sposób: typ odczytu (read type) na endpoint oraz czas integracji (integration time).

Jedna sekunda. Zestawy filtrów ustawiają pozycję optyki otworu emisji na jeden, maksymalną czułość na 100, a pionowe przesunięcie górnej sondy na jeden milimetr. Po wprowadzeniu tych zmian w ustawieniach kliknij OK.

Kliknij układ płytki i skonfiguruj go odpowiednio. Kliknij OK. Po ustawieniu wszystkich parametrów kliknij ikonę odczytu płytki w górnym rzędzie, a następnie kliknij odczytaj.

Po otwarciu spektrofotometru umieść płytkę w tacy tak, aby studzienka A1 znajdowała się w lewym górnym rogu. Następnie otworzy się okno z wyświetloną temperaturą; kliknij OK, a następnie przejdź do analizy danych. Próbki mięśni szkieletowych o masie około 0.18 g (masa mokra) dostarczyły około 24 miliardów mitochondriów, co określono na podstawie zliczania wielkości cząstek.

Próbki wątroby o tej samej wielkości dały o kilka miliardów więcej. Odczyty mitochondriów z komory countingowej były niedoszacowane w porównaniu z licznikiem cząstek. Uzyskano reprezentatywny wykres, który pokazuje, że wyizolowane mitochondria skupiają się pod jednym pikiem o średniej średnicy około 0,4 µm.

Jest to zgodne z wcześniejszymi doniesieniami z wykorzystaniem testu kwasu bi. Zawartość białka mitochondrialnego w mięśniach szkieletowych oraz wątrobie wynosiła kilka miligramów na gram tkanki. Produkt był żywotny i posiadał zdolność do oddychania.

Mitochondria wyizolowane w czasie umożliwiającym kliniczną i chirurgiczną interwencję terapeutyczną. Mikrografie elektronowe transmisyjne wykazały, że wszystkie wyizolowane mitochondria były gęste elektronowo, z uszkodzeniami występującymi u mniej niż jednej z 10 000 struktur, a zanieczyszczenie wynosiło mniej niż jedną na sto tysięcy. Wyniki analizy ATP wykazały, że mitochondria były żywotne, a zawartość ATP wynosiła około 11 lub 15 nanomoli na miligram białka mitochondrialnego.

Analizę oddychania mitochondrialnego przeprowadzono przy użyciu elektrody typu Clarka, która wykazała, że zużycie tlenu wynosiło około 180 nmol tlenu na minutę na każdy miligram białka mitochondrialnego, natomiast wartości RCI wynosiły odpowiednio około 2,5, z nieco wyższym wynikiem dla wątroby. Po opanowaniu ta technika może zostać wykonana w czasie krótszym niż 30 minut, pod warunkiem jej prawidłowego przeprowadzenia.