Name: Szybka izolacja i oczyszczanie mitochondriów do przeszczepu przez dysocjację tkanek i filtrację różnicową (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-09-06T14:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 35 s
Description: Poznaj szybką izolację czynnych mitochondriów z tkanek szczura w mniej niż 30 minut. Ta metoda homogenizacji i filtracji różnicowej zapewnia czyste, żywotne mitochondria do badań metabolicznych.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

To badanie było wspierane przez National Heart, Lung, and Blood Institute Grant HL- 103542, oraz The BCH Anesthesia Research Foundation's Distinguished Trailblazer Award dla CAP.

Przygotowanie
<ol>
	<li>Przygotować 1 M roztwór podstawowy K-HEPES (doprowadzić pH do 7,2 za pomocą KOH).</li>
	<li>Przygotować 0,5 M roztwór podstawowy K-EGTA (doprowadzić pH do 8,0 za pomocą KOH).</li>
	<li>Przygotować 1 m KH2PO4 roztwór podstawowy.</li>
	<li>Przygotować 1 M MgCl2 roztwór podstawowy.</li>
	<li>Przygotować bufor homogenizujący (pH 7,2) 300 mM sacharozy, 10 mM K-HEPES i 1 mM K-EGTA. Przechowywać w temperaturze 4 °C.</li>
	<li>Przygotować bufor oddechowy 250 mM sacharozy, 2 mM KH2PO4, 10 mM MgCl2, 20 mM K-HEPES bufor (pH 7,2) i 0,5 mM K-EGTA (pH 8,0). Przechowywać w temperaturze 4 °C.</li>
	<li>Przygotować 10 x PBS roztwór podstawowy, rozpuszczając 80 g NaCl, 2 g KCl, 14,4 g Na2HPO4 i 2,4 g KH2PO4 w 1 l podwójnie destylowanegoH2O(pH 7,4).</li>
	<li>Przygotować 1 PBS przez pipetowanie 100 ml 10 PBS do 1 l podwójnie destylowanegoH2O.</li>
	<li>Przygotuj subtylizynę A, odważając 4 mg subtylizyny A do probówki o pojemności 1,5 ml. Przechowywać w temperaturze -20 °C do czasu użycia.</li>
	<li>Przygotuj bulion BSA, odważając 20 mg BSA do 1,5 ml probówki do mikrofuge. Przechowywać w temperaturze -20 °C do czasu użycia.</li>
</ol>
Izolacja mitochondrialna (Rysunek 1)
<ol>
	<li>Bezpośrednio przed izolacją rozpuścić subtylizycynę A w 1 ml buforu homogenizującego.</li>
	<li>Bezpośrednio przed izolacją rozpuścić BSA w 1 ml buforu homogenizującego.</li>
	<li>Zebrać dwie świeże próbki tkanek za pomocą stempla do biopsji o średnicy 6 mm i przechowywać w 1x PBS w stożkowej probówce wirówkowej o pojemności 50 ml na lodzie.</li>
	<li>Przenieść dwa 6-milimetrowe stemple tkanki do probówki C do dysocjacji zawierającej 5 ml lodowatego buforu homogenizującego.</li>
	<li>Homogenizuj tkankę, umieszczając rurkę dysocjacyjną C na dysocjatorze tkankowym i wybierz wstępnie ustawiony cykl izolacji mitochondriów (homogenizacja 60 sekund).</li>
	<li>Wyjmij rurkę C dysocjacji do wiadra na lód.</li>
	<li>Dodać 250 μl roztworu podstawowego subtylizyny A do homogenatu, wymieszać przez inwersję i inkubować homogenat na lodzie przez 10 minut.
	<ol>
		<li>Fakultatywnie w przypadku, gdy tkanka jest włóknista: Odwirować roztwór o stężeniu 750 x g przez 4 minuty.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Umieścić filtr siatkowy o wielkości 40 μm na stożkowej probówce wirówkowej o pojemności 50 ml na lodzie i wstępnie zwilżyć filtr buforem homogenizującym, a następnie przefiltrować homogenat do stożkowej probówki wirówkowej o pojemności 50 ml na lodzie.</li>
	<li>Dodać 250 μl świeżo przygotowanego roztworu podstawowego BSA do filtratu i wymieszać przez inwersję. 
	Uwaga: Pomiń ten krok, jeśli wymagane jest oznaczanie białka mitochondrialnego.</li>
	<li>Umieścić filtr o wielkości 40 μm na stożkowej probówce wirówkowej o pojemności 50 ml na lodzie i wstępnie zwilżyć filtr buforem homogenizującym, a następnie przefiltrować homogenat do stożkowej probówki wirówkowej o pojemności 50 ml na lodzie.</li>
	<li>Umieścić filtr 10 μm na stożkowej probówce wirówkowej o pojemności 50 ml na lodzie i wstępnie zwilżyć filtr buforem homogenizującym, a następnie przefiltrować homogenat do stożkowej probówki wirówkowej o pojemności 50 ml na lodzie.</li>
	<li>Przenieść filtrat do dwóch wstępnie schłodzonych probówek do mikrofugowania o pojemności 1,5 ml i odwirować przy 9 000 x g przez 10 minut w temperaturze 4 °C.</li>
	<li>Usunąć supernatant i ponownie zawiesić i połączyć granulki w 1 ml lodowatego buforu oddechowego.</li>
</ol>
Test ATP
Uwaga: Aby określić aktywność metaboliczną izolowanych mitochondriów, można przeprowadzić test luminescencji ATP przy użyciu zestawu do testowania ATP. Protokół, odczynniki i wzorce zostały dostarczone w zestawie testowym. Podsumowanie procedury opisano poniżej.
<ol>
	<li>Wyrównaj odczynniki z zestawu do RT.</li>
	<li>Przygotować 10 mM roztwór podstawowy ATP, rozpuszczając liofilizowany granulat ATP w 1,170 μl podwójnie destylowanej wody. Przechowywać na lodzie roztwór podstawowy wzorca ATP i przygotowane próbki mitochondrialne.</li>
	<li>Dodać 5 ml roztworu buforu substratowego do fiolki z liofilizowanym roztworem substratu. Delikatnie wymieszaj i umieść w ciemności.</li>
	<li>Dodać 100 μl buforu oddechowego do wszystkich studzienek na czarnej, nieprzezroczystej płytce 96-dołkowej z dnem.</li>
	<li>Dodać 10 μl mitochondriów z przygotowanych próbek do każdej studzienki czarnej, nieprzezroczystej płytki 96-dołkowej. Uwaga: Próbki są platerowane w trzech egzemplarzach. Dołączyć wiersz dla norm i trzy studzienki dla kontroli ujemnej (bufor oddechowy).</li>
	<li>Dodać 50 μl roztworu do lizy komórek ssaków do wszystkich studzienek, w tym wzorców i kontroli.</li>
	<li>Inkubować płytkę w temperaturze 37 °C przez 5 minut na wytrząsarce orbitalnej z prędkością 125 obr./min.</li>
	<li>Podczas inkubacji należy przygotować wzorce ATP w stężeniach 0,1 mM, 0,05 mM, 0,01 mM, 0,005 mM, 0,001 mM i 0,0001 mM ATP z 10 mM roztworu podstawowego ATP. Przechowuj standardy na lodzie.</li>
	<li>Po inkubacji dodać 10 μl wzorców ATP do odpowiednich studzienek, jak wskazano na mapie płytkowej. Uwaga: Normy są wykonywane w dwóch egzemplarzach.</li>
	<li>Do każdej studzienki dodać 50 μl odtworzonego roztworu substratu.</li>
	<li>Inkubować płytkę w temperaturze 37 °C na wytrząsarce orbitalnej przez 5 minut przy 125 obr./min.</li>
	<li>Otwórz oprogramowanie Gen5 1.11 na komputerze połączonym ze spektrofotometrem.</li>
	<li>W sekcji "Utwórz nowy element" kliknij "Eksperymentuj".</li>
	<li>Kliknij "Protokół domyślny". Kliknij "OK".</li>
	<li>W lewej kolumnie wybierz "Protokół", a następnie "Procedura".</li>
	<li>Wybierz "Opóźnienie". Ustaw wartość 00:10:00. Kliknij "OK".</li>
	<li>Wybierz "Czytaj". Wybierz "Luminescencja" z menu rozwijanego. Dostosuj inne ustawienia do następujących: Typ odczytu Punkt końcowy, Czas integracji 0:01.00 MM:SS.ss, Zestawy filtrów 1, Otwór emisyjny, Pozycja optyki u góry, Czułość 100, Przesunięcie pionowe górnej sondy 1,00 mm.</li>
	<li>Gdy płyta jest gotowa do analizy, kliknij ikonę "Przeczytaj płytę" w górnym wierszu. Kliknij "Czytaj". Gdy spektrofotometr się otworzy, umieść płytkę w tacy z dołkiem A1 w lewym górnym rogu. Otworzy się pudełko z temperaturą. Kliknij "Czytaj". Uwaga: Wyższe wartości korelują ze zwiększonym poziomem ATP i wyższą aktywnością metaboliczną.</li>
</ol>

<ol><li>van Loo, G., Saelens, X., van Gurp, M., MacFarlane, M., Martin, S. J., Vandenabeele, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+role+of+mitochondrial+factors+in+apoptosis%3A+a+Russian+roulette+with+more+than+one+bullet%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Death+Differ%22%5BJournal%5D)">The role of mitochondrial factors in apoptosis: a Russian roulette with more than one bullet.</a> Cell Death Differ. 9 (10), 1031-1042 (2002).</li>
<li>Szabadkai, G., Duchen, M. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mitochondria%3A+the+hub+of+cellular+Ca2%2B+signaling%5BTitle%5D)+AND+%22Physiology+%28Bethesda%29%22%5BJournal%5D)">Mitochondria: the hub of cellular Ca2+ signaling.</a> Physiology (Bethesda). 23, 84-94 (2008).</li>
<li>Chan, D. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mitochondria%3A+Dynamic+Organelles+in+Disease%2C+Aging%2C+and+Development%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Mitochondria: Dynamic Organelles in Disease, Aging, and Development.</a> Cell. 125 (7), 1241-1252 (2006).</li>
<li>Picard, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mitochondrial+structure+and+function+are+disrupted+by+standard+Isolation+methods%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+ONE%22%5BJournal%5D)">Mitochondrial structure and function are disrupted by standard Isolation methods.</a> PLoS ONE. 6 (3), e18317(2011).</li>
<li>Bensley, R. R., Hoerr, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Studies+on+cell+structure+by+freeze-drying+method%3B+preparation+and+properties+of+mitochondria%5BTitle%5D)+AND+%22Anat+Rec%22%5BJournal%5D)">Studies on cell structure by freeze-drying method; preparation and properties of mitochondria.</a> Anat Rec. 60, 449-455 (1934).</li>
<li>Claude, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fractionation+of+mammalian+liver+cells+by+differential+centrifugation+II.+Experimental+procedures+and+results%5BTitle%5D)+AND+%22J+Exp+Med%22%5BJournal%5D)">Fractionation of mammalian liver cells by differential centrifugation II. Experimental procedures and results.</a> J Exp Med. 84 (1), 61-89 (1946).</li>
<li>Hogeboom, H., Schneider, W. C., Palade, G. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cytochemical+studies+of+mammalian+tissues%3B+isolation+of+intact+mitochondria+from+rat+liver%3B+some+biochemical+properties+of+mitochondria+and+submicroscopic+particulate+material%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biol+Chem%22%5BJournal%5D)">Cytochemical studies of mammalian tissues; isolation of intact mitochondria from rat liver; some biochemical properties of mitochondria and submicroscopic particulate material.</a> J Biol Chem. 172 (2), 619-635 (1948).</li>
<li>Ernster, L., Schtaz, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mitochondria%3A+a+historical+Review%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Mitochondria: a historical Review.</a> J Cell Biol. 91 (3 Pt 2), 227s-255s (1981).</li>
<li>Pallotti, F., Lenaz, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+and+subfractionation+of+mitochondria+from+animal+cells+and+tissue+culture+lines%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Isolation and subfractionation of mitochondria from animal cells and tissue culture lines.</a> Methods Cell Biol. 80, 3-44 (2007).</li>
<li>Schmitt, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+semi-automated+method+for+isolating+functionally+intact+mitochondria+from+cultured+cells+and+tissue+biopsies%5BTitle%5D)+AND+%22Anal+Biochem%22%5BJournal%5D)">A semi-automated method for isolating functionally intact mitochondria from cultured cells and tissue biopsies.</a> Anal Biochem. 443 (1), 66-74 (2013).</li>
<li>Fernández-Vizarra, E., Ferrín, G., Pérez-Martos, A., Fernández-Silva, P., Zeviani, M., Enríquez, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+of+mitochondria+for+biogenetical+studies%3A+An+update%5BTitle%5D)+AND+%22Mitochondrion%22%5BJournal%5D)">Isolation of mitochondria for biogenetical studies: An update.</a> Mitochondrion. 10 (3), 253-262 (2010).</li>
<li>Graham, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chapter+3%2C+Unit+3.3%2C+Isolation+of+mitochondria+from+tissues+and+cells+by+differential+centrifugation%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Protoc+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Chapter 3, Unit 3.3, Isolation of mitochondria from tissues and cells by differential centrifugation.</a> Curr Protoc Cell Biol. , (2001).</li>
<li>Frezza, C., Cipolat, S., Scorrano, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Organelle+isolation%3A+functional+mitochondria+from+mouse+liver%2C+muscle+and+cultured+fibroblasts%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Protoc%22%5BJournal%5D)">Organelle isolation: functional mitochondria from mouse liver, muscle and cultured fibroblasts.</a> Nat Protoc. 2 (2), 287-295 (2007).</li>
<li>Wieckowski, M. R., Giorgi, C., Lebiedzinska, M., Duszynski, J., Pinton, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+of+mitochondria-associated+membranes+and+mitochondria+from+animal+tissues+and+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Protoc%22%5BJournal%5D)">Isolation of mitochondria-associated membranes and mitochondria from animal tissues and cells.</a> Nat Protoc. 4 (11), 1582-1590 (2009).</li>
<li>Gostimskaya, I., Galkin, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Preparation+of+highly+coupled+rat+heart+mitochondria%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Preparation of highly coupled rat heart mitochondria.</a> J Vis Exp. (43), (2010).</li>
<li>Gross, V. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+of+functional+mitochondria+from+rat+kidney+and+skeletal+muscle+without+manual+homogenization%5BTitle%5D)+AND+%22Anal+Biochem%22%5BJournal%5D)">Isolation of functional mitochondria from rat kidney and skeletal muscle without manual homogenization.</a> Anal Biochem. 418 (2), 213-223 (2011).</li>
<li>Masuzawa, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transplantation+of+autologously+derived+mitochondria+protects+the+heart+from+ischemia-reperfusion+injury%5BTitle%5D)+AND+%22American+J+Physiol+Heart+and+Circ+Physiol%22%5BJournal%5D)">Transplantation of autologously derived mitochondria protects the heart from ischemia-reperfusion injury.</a> American J Physiol Heart and Circ Physiol. 304 (7), (2013).</li>
<li>McCully, J. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Injection+of+isolated+mitochondria+during+early+reperfusion+for+cardioprotection%5BTitle%5D)+AND+%22American+J+Physiol+Heart+and+Circ+Physiol%22%5BJournal%5D)">Injection of isolated mitochondria during early reperfusion for cardioprotection.</a> American J Physiol Heart and Circ Physiol. 296 (1), 94-105 (2009).</li>
<li>Olson, M. S., Von Korff, R. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Changes+in+endogenous+substrates+of+isolated+rabbit+heart+mitochondria+during+storage%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biol+Chem%22%5BJournal%5D)">Changes in endogenous substrates of isolated rabbit heart mitochondria during storage.</a> J Biol Chem. 242 (2), 325-332 (1967).</li>
<li>Diepart, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comparison+of+methods+for+measuring+oxygen+consumption+in+tumor+cells+in+vitro%5BTitle%5D)+AND+%22Anal+Biochem%22%5BJournal%5D)">Comparison of methods for measuring oxygen consumption in tumor cells in vitro.</a> Anal Biochem. 396 (2), 250-256 (2010).</li>
<li>Lanza, I. R., Nair, K. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Functional+assessment+of+isolated+mitochondria+in+vitro%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Enzymol%22%5BJournal%5D)">Functional assessment of isolated mitochondria in vitro.</a> Methods Enzymol. 457, 349-372 (2009).</li>
</ol>

Wszystkie zwierzęta były leczone zgodnie z aktualnymi wytycznymi instytucjonalnymi. Nie mamy żadnych konkurencyjnych interesów finansowych do ujawnienia.

Aby skutecznie wyizolować mitochondria przy użyciu tego protokołu, konieczne jest przechowywanie wszystkich roztworów i próbek tkanek na lodzie, aby zachować żywotność mitochondriów. Nawet gdy są utrzymywane na lodzie, izolowane mitochondria będą wykazywać spadek aktywności funkcjonalnej w czasie19. Zalecamy, aby wszystkie rozwiązania i dodatki były wcześniej przygotowane. Subtylizyna A jest wstępnie ważona i przechowywana w porcjach 4 mg w probówkach do mikrofuge o pojemności 1,5 ml i przechowywana w temperat...

A correction was made to: <a href="http://www.jove.com/video/51682">Rapid Isolation And Purification Of Mitochondria For Transplantation By Tissue Dissociation And Differential Filtration.</a> An optional step was added to step 7 of the &#39;Mitochondrial Isolation&#39; section of the protocol. The step is:
1. Optional in the case that the tissue is fibrous: Centrifuge the solution at 750 x g for 4 min.

A correction was made to: Rapid Isolation And Purification Of Mitochondria For Transplantation By Tissue Dissociation And Differential Filtration.

Erratum: Rapid Isolation And Purification Of Mitochondria For Transplantation By Tissue Dissociation And Differential Filtration

Mitochondria istnieją w każdej komórce ciała z wyjątkiem czerwonych krwinek i biorą udział w wielu ważnych procesach komórkowych i metabolicznych1-4. Ze względu na te wiele funkcji uszkodzenie mitochondriów może mieć szkodliwe skutki3. W celu zbadania funkcji i dysfunkcji mitochondriów opisano kilka metod izolacji mitochondriów. Najwcześniejsze opublikowane opisy izolacji mitochondriów pochodzą z lat czterdziestych XX wieku,5-8. Pierwsza udokumentowana próba wykazała izolację mitochondriów poprzez rozdrobnienie tkanki wątroby w moździerzu, a następnie odwirowanie w roztworze soli z niską prędkością5,8. Później inne grupy rozszerzyły pierwotną procedurę i wykazały frakcjonowanie tkanek w oparciu o wirowanie różnicowe6-8. Te wczesne metody stanowiły podstawę obecnych technik, które często obejmują homogenizację i/lub wirowanie różnicowe9-15. Liczba etapów homogenizacji i wirowania różni się w zależności od protokołu. Te powtarzające się kroki wydłużają czas izolacji mitochondriów i ostatecznie zmniejszają żywotność. Ponadto ręczna homogenizacja może powodować uszkodzenie mitochondriów i niespójne wyniki, jeśli nie jest odpowiednio kontrolowana10,16.
Ostatnio użyliśmy homogenizacji i wirowania różnicowego, aby wyizolować mitochondria do przeszczepu do tkanki mięśnia sercowego17,18. Ta długa procedura izolacji trwała około 90 minut, w związku z czym możliwość zastosowania klinicznego tej metody była ograniczona. Aby umożliwić ostre zastosowanie terapeutyczne w leczeniu klinicznym i chirurgicznym, opracowaliśmy procedurę szybkiej izolacji mitochondriów, którą można wykonać w czasie krótszym niż 30 minut.
Główne zalety tego protokołu to, że standaryzowana dysocjacja tkanek pozwala na jednolitą i konsekwentną homogenizację tkanki, co nie jest łatwe do osiągnięcia przy ręcznej homogenizacji. Ponadto zastosowanie filtracji różnicowej zamiast wirowania różnicowego eliminuje czasochłonne i powtarzalne etapy wirowania, co pozwala na szybszą izolację wysoce oczyszczonych, żywotnych i kompetentnych do oddychania mitochondriów.
Zdolność do izolowania żywotnych i kompetentnych do oddychania mitochondriów w czasie krótszym niż 30 minut pozwala na kliniczne zastosowanie. Ten protokół izolacji może być stosowany w chirurgii pomostowania aortalno-wieńcowego (CABG) i innych procedurach terapeutycznych.

<table><tbody><tr><td>Sacharoza</td><td>Sigma Aldrich</td><td>84100</td><td></td></tr><tr><td>HEPES</td><td>Sigma Aldrich</td><td>H4034</td><td></td></tr><tr><td>EGTA</td><td>Sigma Aldrich</td><td>E4378</td><td></td></tr><tr><td>Substilsin A</td><td>Sigma Aldrich</td><td>P5380</td><td></td></tr><tr><td>BSA</td><td>Sigma Aldrich</td><td>A7906</td><td></td></tr><tr><td>KH2PO4</td><td>Sigma Aldrich</td><td>P5379</td><td></td></tr><tr><td>MgCl2</td><td>Sigma Aldrich</td><td>M8266</td><td></td></tr><tr><td>NaCl</td><td>Sigma Aldrich</td><td>S6191</td><td></td></tr><tr><td>KCl</td><td>Fisher Scientific</td><td>P2173</td><td></td></tr><tr><td>Na2HPO4</td><td>Fisher Scientific</td><td>S374</td><td></td></tr><tr><td>ATPlite System oznaczania luminescencji, zestaw do oznaczania 1,000</td><td>Perkin Elmer</td><td></td><td></td>6016941</tr><tr><td>50 ml Probówki stożkowe</td><td>BD</td><td>352098</td><td></td></tr><tr><td>40 &mu; m Filtry nylonowe</td><td>BD&nbsp;</td><td>352340</td><td></td></tr><tr><td>Rurka C GentleMACS</td><td>Miltenyl Biotech</td><td>120-005-331</td><td></td></tr><tr><td>1,5 ml Probówka Eppendorf</td><td>Fisher Scientific</td><td>05-408-129</td><td></td></tr><tr><td>Dziurkacz do biopsji 6 mm</td><td>Miltex</td><td>33-36</td><td></td></tr><tr><td>10 &mu; m Pluristrainer</td><td>Pluriselect</td><td>43-500-10-03</td><td></td></tr><tr><td>Wirówka Eppendorf 5415C</td><td>Marshall Scientific</td><td>EP-5415C&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Dysocjator GentleMACS&nbsp;</td><td>Miltenyl Biotech</td><td>130-093-235</td><td></td></tr><tr><td>Płytki 96-dołkowe, poddane hodowli tkankowej</td><td>VWR</td><td>82050-732</td><td></td></tr><tr><td>Wytrząsarka orbitalna Rotomax 120</td><td>Heidolph</td><td>544-41200-00</td><td></td></tr><tr><td>Synergy H4 Hybrid Multi-Mode &nbsp; Czytnik mikropłytek</td><td>BioTek</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Multisizer 4 Licznik redlic</td><td>Beckman Coulter</td><td>A63076</td><td></td></tr><tr><td>Oxytherm System</td><td>Hansatech Instruments</td> Hemacytometr <td></td><td></td></tr><tr><td></td><td>Fisher Scientific</td><td>267110</td><td></td></tr></tbody></table>

szybka izolacja i oczyszczanie mitochondriów do przeszczepu przez dysocjację tkanek i filtrację różnicową

Rapid Isolation And Purification Of Mitochondria For Transplantation By Tissue Dissociation And Differential Filtration

Poprzednio opisane metody izolacji mitochondriów za pomocą wirowania różnicowego i/lub wirowania gradientowego Ficoll wymagają od 60 do 100 minut. Opisujemy metodę szybkiej izolacji mitochondriów z biopsji ssaków przy użyciu komercyjnego dysocjatora tkanek i filtracji różnicowej. W tym protokole ręczna homogenizacja została zastąpiona standaryzowanym cyklem homogenizacji dysocjatora tkankowego. Pozwala to na jednolitą i spójną homogenizację tkanki, co nie jest łatwe do osiągnięcia przy ręcznej homogenizacji. Po dysocjacji tkanek homogenat jest filtrowany przez nylonowe filtry siatkowe, które eliminują powtarzające się etapy wirowania. Dzięki temu izolację mitochondriów można wykonać w czasie krótszym niż 30 minut. Ten protokół izolacji daje około 2 x 1010 żywotnych i kompetentnych do oddychania mitochondriów z 0,18 ± 0,04 g (mokrej masy) próbki tkanki.

Schemat przedstawiający kolejne kroki procedury izolacji mitochondriów z wykorzystaniem dysocjacji tkanki i filtracji różnicowej pokazano na Rysunku 1. Całkowity czas trwania procedury wynosi mniej niż 30 min.
Próbki tkanki pobrano za pomocą 6 mm wycinaka do biopsji. Masa tkanki wynosiła 0,18 ± 0,04 g (masa mokra). Liczba wyizolowanych mitochondriów, określona poprzez zliczanie cząstek, wyniosła 2,4 x 1010 ± 0,1 x 1010 mitochondriów dla mięśnia szkieletow...

Opisano metodę szybkiej izolacji mitochondriów z biopsji tkanek ssaków. Preparaty wątroby szczura lub mięśni szkieletowych homogenizowano za pomocą komercyjnego dysocjatora tkanek, a mitochondria izolowano przez filtrację różnicową przez filtry z siatki nylonowej. Czas izolacji mitochondriów wynosi <30 min w porównaniu do 60 - 100 min przy użyciu metod alternatywnych.

Szybka izolacja i oczyszczanie mitochondriów do przeszczepu przez dysocjację tkanek i filtrację różnicową

Previously described mitochondrial isolation methods using differential centrifugation and/or Ficoll gradient centrifugation require 60 to 100 min to ...

Ogólnym celem niniejszej procedury jest szybka izolacja czystych i sprawnych oddechowo mitochondriów z tkanki szczura. Osiąga się to poprzez wstępne połączenie i homogenizację próbek tkanki. Kolejne etapy polegają na dodaniu subin A do homogenatu i inkubacji na lodzie.Następnie homogenat mieszany z BSA poddaje się filtracji, a potem filtruje go ponownie. Końcowe etapy polegają na odwirowaniu filtratu i resuspensji osadu mitochondrialnego w buforze do respiracji. Ostatecznie, poprzez analizę respiracji oraz test luminescencji ATP, można wykazać, że wyizolowane mitochondria są żywe i zdolne do oddychania.Główną zaletą tej techniki w porównaniu z istniejącymi metodami, w których czas izolacji mitochondriów wynosi od 60 do stu minut, jest możliwość wyizolowania żywotnych i zdolnych do oddychania mitochondriów w czasie krótszym niż 30 minut. Allison mackay, technik z laboratorium współpracującego, zademonstruje test luminescencji ATP tuż przed rozpoczęciem. Rozpuścić subin A w 1 mL buforu homogenizującego oraz rozpuścić BSA również w 1 mL buforu homogenizującego.Następnie należy pobrać dwie świeże próbki tkanki za pomocą 6 mm wycinaka do biopsji i przechowywać je w XPBS na lodzie w probówce wirówkowej o pojemności 50 ml. Po przygotowaniu przenieść tkankę do probówki C do dysocjacji zawierającej 5 ml lodowatego buforu homogenizującego. Następnie zhomogenizować tkankę, mocując probówkę w urządzeniu do dysocjacji tkanki i wybierając zaprogramowany cykl izolacji mitochondriów.Po zakończeniu procesu umieść probówkę z powrotem w lodzie i dodaj 250 µL roztworu stokowego subtylizyny. Wymieszaj zawartość poprzez odwracanie probówki. Gdy mieszanina będzie wyglądać na jednorodną, inkubuj homogenat w lodzie przez 10 minut.Następnie na 50 ml stożkowej probówce do wirowania umieść filtr o oczkach 40 μm i wstaw ją do lodu. Nawilż filtr buforem do homogenizacji, a następnie wylej bufor do pojemnika na odpady. Gdy wszystko będzie przygotowane, przelej homogenat przez filtr do naczynia na filtrat.Dodać 250 µL roztworu stokowego BSA i wymieszać poprzez odwracanie. Krok ten należy jednak pominąć w przypadku analizy białek mitochondrialnych. Następnie przygotować dwie kolejne próbki.Przygotować dwie 50 ml stożkowe probówki wirówkowe w lodzie, jedną z filtrem 40 µm, a drugą z filtrem 10 µm. Oba filtry zwilżyć niewielką ilością buforu homogenizującego, a następnie odrzucić ten bufor. Następnie przelać homogenat najpierw przez filtr 40 µm, a potem przez filtr 10 µm.Etapy filtracji te znacząco poprawiają czystość mitochondriów. Teraz należy podzielić filtrat pomiędzy dwie schłodzone wcześniej probówki do wirówki o pojemności 1,5 ml i wirować je z prędkością 9,000 G przez 10 minut w temperaturze 4 °C. Następnie należy usunąć nadsącz, a dwa oczyszczone osady mitochondrialne zawiesić ponownie i połączyć.W jednym mililitrze lodowatego buforu do oddychania; kluczowe jest, aby całą procedurę przeprowadzić w temperaturze 4°C. Oczyszczone mitochondria można teraz poddać badaniu w celu określenia aktywności metabolicznej wyizolowanych mitochondriów. Test luminescencji ATP można przeprowadzić przy użyciu zestawu do oznaczania ATP.W pierwszej kolejności doprowadzić odczynniki z zestawu do temperatury pokojowej. Następnie przygotować roztwór zapasowy HT P i umieścić go w lodzie. Kolejnym krokiem jest dodanie 5 mL buforu do substratu do liofilizowanego roztworu substratu.Pomieszaj delikatnie i odstaw w ciemne miejsce. Następnie dodaj 100 µL buforu do oddychania do każdego dołka nieprzezroczystej czarnej płytki 96-dołkowej. Dodaj 10 µL przygotowanych mitochondriów do dołków znajdujących się poniżej standardów ATP.Każdą unikalną próbkę mitochondrialną należy nanieść w trzech powtórzeniach; w trzech studzienkach należy umieścić sam bufor do respiracji jako kontrolę negatywną. Następnie do każdej załadowanej studzienki należy dodać 50 µL roztworu do lizy komórek ssaków. Płytkę należy inkubować w temperaturze 37 °C przez pięć minut na wytrząsarce orbitalnej przy 120 RPM.Podczas inkubacji przygotować rozcieńczenia standardu A TP w zakresie od 0,1 mM do 0,1 µM. Po inkubacji dodać 10 µL każdego ze standardów A TP do odpowiednich dołków wskazanych na mapie płytki. Następnie dodać do każdego z nich 50 µL zrekonstytuowanego roztworu substratu.Następnie ponownie inkubuj płytkę, tak jak poprzednio, przez pięć minut. Dalej przystąp do analizy płytek w czytniku płytek. Otwórz oprogramowanie w.Utwórz nowy element. Kliknij eksperyment. Następnie kliknij domyślny protokół i zatwierdź przyciskiem OK.W lewej kolumnie wybierz protokół. Następnie przejdź do procedury. Dalej wybierz opcję opóźnienia (delay) i ustaw ją na 10 minutes. Następnie zatwierdź wpis przyciskiem OK.Teraz wybierz opcję odczytu, a następnie wybierz luminescencję z menu rozwijanego. Skonfiguruj pozostałe ustawienia w następujący sposób: typ odczytu (read type) na endpoint oraz czas integracji (integration time).Jedna sekunda. Zestawy filtrów ustawiają pozycję optyki otworu emisji na jeden, maksymalną czułość na 100, a pionowe przesunięcie górnej sondy na jeden milimetr. Po wprowadzeniu tych zmian w ustawieniach kliknij OK.Kliknij układ płytki i skonfiguruj go odpowiednio. Kliknij OK. Po ustawieniu wszystkich parametrów kliknij ikonę odczytu płytki w górnym rzędzie, a następnie kliknij odczytaj.Po otwarciu spektrofotometru umieść płytkę w tacy tak, aby studzienka A1 znajdowała się w lewym górnym rogu. Następnie otworzy się okno z wyświetloną temperaturą; kliknij OK, a następnie przejdź do analizy danych. Próbki mięśni szkieletowych o masie około 0.18 g (masa mokra) dostarczyły około 24 miliardów mitochondriów, co określono na podstawie zliczania wielkości cząstek.Próbki wątroby o tej samej wielkości dały o kilka miliardów więcej. Odczyty mitochondriów z komory countingowej były niedoszacowane w porównaniu z licznikiem cząstek. Uzyskano reprezentatywny wykres, który pokazuje, że wyizolowane mitochondria skupiają się pod jednym pikiem o średniej średnicy około 0,4 µm.Jest to zgodne z wcześniejszymi doniesieniami z wykorzystaniem testu kwasu bi. Zawartość białka mitochondrialnego w mięśniach szkieletowych oraz wątrobie wynosiła kilka miligramów na gram tkanki. Produkt był żywotny i posiadał zdolność do oddychania.Mitochondria wyizolowane w czasie umożliwiającym kliniczną i chirurgiczną interwencję terapeutyczną. Mikrografie elektronowe transmisyjne wykazały, że wszystkie wyizolowane mitochondria były gęste elektronowo, z uszkodzeniami występującymi u mniej niż jednej z 10 000 struktur, a zanieczyszczenie wynosiło mniej niż jedną na sto tysięcy. Wyniki analizy ATP wykazały, że mitochondria były żywotne, a zawartość ATP wynosiła około 11 lub 15 nanomoli na miligram białka mitochondrialnego.Analizę oddychania mitochondrialnego przeprowadzono przy użyciu elektrody typu Clarka, która wykazała, że zużycie tlenu wynosiło około 180 nmol tlenu na minutę na każdy miligram białka mitochondrialnego, natomiast wartości RCI wynosiły odpowiednio około 2,5, z nieco wyższym wynikiem dla wątroby. Po opanowaniu ta technika może zostać wykonana w czasie krótszym niż 30 minut, pod warunkiem jej prawidłowego przeprowadzenia.

rapid-isolation-purification-mitochondria-for-transplantation-tissue

Research

JoVE Journal

Biology

Biologia

Szybka izolacja i oczyszczanie mitochondriów do przeszczepu poprzez dysocjację tkankową i filtrację różnicową

Opisujemy protokół izolacji czystych, silnie sprzężonych mitochondriów serca szczura do funkcjonalnych lub strukturalnych badań bioenergetyki komórkowej, pomiarów biofizycznych, proteomiki oraz analizy mitochondrialnego DNA i lipidów.

Przygotowanie silnie sprzężonych mitochondriów serca szczura

Ten film opisuje procedurę izolacji mitochondriów z tkanek ludzkiego raka jajnika za pomocą wirowania o różnej prędkości w połączeniu z wirowaniem w gradiacji gęstości. Wyizolowane mitochondria można wykorzystać do analizy proteomicznej proteomu mitochondrialnego ludzkiego raka jajnika.

Izolacja mitochondriów: technika izolowania mitochondriów od próbki tkanki ludzkiego raka jajnika

Porównanie potencjału błony mitochondrialnej między próbkami dostarcza cennych informacji o stanie komórek. Opisano szczegółowe etapy izolacji mitochondriów i oceny odpowiedzi na inhibitory i rozprzęgacze za pomocą fluorescencji. Metoda i użyteczność tego protokołu są zilustrowane przez zastosowanie hodowli komórkowej i zwierzęcego modelu stresu komórkowego.

Izolacja i analiza funkcjonalna mitochondriów z hodowanych komórek i tkanek myszy

Tutaj prezentujemy modyfikację wcześniej opisanej metody, która pozwala na izolację wysokiej jakości i oczyszczonych mitochondriów z mniejszych ilości mięśni szkieletowych myszy. Procedura ta powoduje powstanie wysoce sprzężonych mitochondriów, które oddychają z wysoką funkcją podczas testów respirometycznych opartych na mikropłytkach.

Izolacja mitochondriów z minimalnych ilości mięśni szkieletowych myszy w celu wysokoprzepustowych pomiarów oddechowych na mikropłytkach

Tutaj próbka mięśnia czworogłowego jest pobierana od znieczulonej świni, a mitochondria są izolowane przez wirowanie różnicowe. Następnie określa się częstość oddechów mitochondrialnych kompleksów łańcucha oddechowego I, II i IV za pomocą respirometrii o wysokiej rozdzielczości.

Izolacja nienaruszonych mitochondriów od mięśni szkieletowych za pomocą wirowania różnicowego w celu pomiarów respirometrycznych o wysokiej rozdzielczości

Mitochondria mają wyspecjalizowane rybosomy, które różnią się od swoich bakteryjnych i cytoplazmatycznych odpowiedników. Tutaj pokazujemy, w jaki sposób mitoribosomy można uzyskać z ich natywnego przedziału w komórkach HEK. Metoda polega na izolacji mitochondriów z komórek zawiesinowych, a następnie oczyszczeniu mitoribosomów.

Szybka izolacja mitoribosomu z komórek HEK

Prezentujemy dwuetapowy protokół wysokiej jakości izolacji mitochondriów, który jest zgodny z odkrywaniem białek i kwantyfikacją w skali proteomu. Nasz protokół nie wymaga inżynierii genetycznej, a zatem nadaje się do badania mitochondriów z dowolnych pierwotnych komórek i tkanek.

Dwuetapowa izolacja mitochondriów bez znaczników w celu lepszego odkrywania białek i kwantyfikacji

Mitochondrialne miejsca kontaktu to kompleksy białkowe, które oddziałują z wewnętrznymi i zewnętrznymi białkami błony mitochondrialnej. Miejsca te są niezbędne do komunikacji między błonami mitochondrialnymi, a tym samym między cytozolem a macierzą mitochondrialną. W tym miejscu opisujemy metodę identyfikacji kandydatów kwalifikujących się do tej konkretnej klasy białek.

Ulepszona metoda izolowania mitochondrialnych miejsc kontaktowych

Ten protokół opisuje technikę analizy superkompleksów oddechowych, gdy dostępne są tylko małe ilości próbek.

Izolacja mitochondriów do analizy superkompleksów mitochondrialnych z próbek małych tkanek i kultur komórkowych

Badania bioenergetyczne i metabolomiczne mitochondriów ujawniły ich wieloaspektową rolę w wielu chorobach, ale metody izolacji tych organelli są różne. Opisana tutaj metoda jest w stanie oczyścić wysokiej jakości mitochondria z wielu źródeł tkankowych. Jakość określa się na podstawie współczynników kontroli oddechu i innych wskaźników ocenianych za pomocą respirometrii o wysokiej rozdzielczości.

Solidna izolacja mitochondriów z tkanki serca gryzoni

Poznaj szybką izolację czynnych mitochondriów z tkanek szczura w mniej niż 30 minut. Ta metoda homogenizacji i filtracji różnicowej zapewnia czyste, żywotne mitochondria do badań metabolicznych.

Szybka izolacja i oczyszczanie mitochondriów do przeszczepu przez dysocjację tkanek i filtrację różnicową

Przeglądaj więcej filmów