Szybka izolacja i oczyszczanie mitochondriów do przeszczepu przez dysocjację tkanek i filtrację różnicową
September 6th, 2014
Opisano metodę szybkiej izolacji mitochondriów z biopsji tkanek ssaków. Preparaty wątroby szczura lub mięśni szkieletowych homogenizowano za pomocą komercyjnego dysocjatora tkanek, a mitochondria izolowano przez filtrację różnicową przez filtry z siatki nylonowej. Czas izolacji mitochondriów wynosi <30 min w porównaniu do 60 - 100 min przy użyciu metod alternatywnych.
Ogólnym celem tej procedury jest szybkie wyizolowanie czystych i kompetentnych do oddychania mitochondriów z tkanki szczura. Osiąga się to poprzez uprzednie skojarzenie i homogenizację próbek tkanek. Kolejnym krokiem jest zmieszanie subiny A z homogenatem i inkubacja na lodzie.
Następnie filtruje się mieszaninę homogenatu w BSA i ponownie ją filtruje. Ostatnim krokiem jest odkręcenie filtratu i ponowne zawieszenie granulek mitochondrialnych w buforze oddechowym. Ostatecznie wyniki mogą wykazać, że izolowane mitochondria są żywotne i kompetentne w oddychaniu dzięki analizie oddychania i testowi luminescencji A TP.
Główną zaletą tej techniki w porównaniu z istniejącymi metodami, które podają czas izolacji mitochondriów od 60 do stu minut, jest to, że żywotne i zdolne do oddychania mitochondria można wyizolować w mniej niż 30 minut. Allison Mackay, technik ze współpracującego laboratorium zademonstruje test luminescencji A TP tuż przed rozpoczęciem. Rozpuścić subinę A w jednym mililitrze buforu homogenizującego i rozpuścić BSA również w jednym mililitrze buforu homogenizującego.
Teraz zacznij od pobrania dwóch świeżych próbek tkanek za pomocą sześciomilimetrowego stempla do biopsji i przechowuj je w jednym XPBS na lodzie w 50-litrowej probówce wirówkowej. Gdy będzie gotowy, przenieś tkankę do rurki C dysocjacyjnej zawierającej pięć mililitrów lodowatego buforu homogenizującego. Następnie homogenizuj tkankę, dopasowując rurkę do dysocjacji tkanek i wybierając wstępnie ustawiony cykl izolacji mitochondrialnej.
Po zakończeniu umieść probówkę z powrotem na lodzie i dodaj 250 mikrolitrów subwooferu, aby skłamać w roztworze podstawowym. Wymieszaj to przez odwrócenie. Gdy mieszanina wygląda na równomiernie rozprowadzoną, inkubować homogenat na lodzie przez 10 minut.
Następnie umieść filtr siatkowy o wielkości 40 mikronów na stożkowej probówce wirówkowej o pojemności 50 mililitrów i zapakuj go do lodu. Zwilżyć filtr buforem homogenizującym i wyrzucić bufor do pojemnika na odpady. Następnie, gdy wszystko jest gotowe, przelej homogenat do filtratu.
Dodać 250 mikrolitrów roztworu podstawowego BSA i wymieszać przez inwersję. Jednak ten krok należy pominąć w przypadku analizy białek mitochondrialnych. Teraz przygotuj jeszcze dwa.
50-mililitrowe stożkowe probówki wirówkowe na lodzie pasują do jednego z filtrem 40 mikronów, a drugiego z filtrem 10 mikronów. Zwilż oba filtry niewielką ilością buforu homogenizującego i wyrzuć ten bufor. Następnie przelej homogenat najpierw przez filtr 40 mikronów, a następnie przez filtr 10 mikronów.
Te etapy filtracji znacznie poprawiają czystość mitochondriów. Teraz podziel filtrat między dwie wstępnie schłodzone 1,5-mililitrowe mikroprobówki do fuge i odwiruj je w temperaturze 9 000 G przez 10 minut w temperaturze czterech stopni Celsjusza. Następnie usuń supernatant i ponownie zawieś i połącz dwie oczyszczone osady mitochondrialne.
W jednym mililitrze lodowatego buforu oddechowego ważne jest, aby cała procedura została przeprowadzona w temperaturze czterech stopni Celsjusza. Oczyszczone mitochondria można teraz przetestować w celu określenia aktywności metabolicznej izolowanych mitochondriów. Test luminescencji A TP można przeprowadzić przy użyciu zestawu do oznaczania A TP.
Najpierw doprowadź odczynniki zestawu do temperatury pokojowej. Następnie przygotuj roztwór podstawowy HT P i umieść go na lodzie. Następnym krokiem jest dodanie pięciu mililitrów buforu substratowego do liofilizowanego roztworu substratu.
Wymieszaj to delikatnie i umieść w ciemności. Następnie dodaj 100 mikrolitrów buforu oddechowego do każdej studzienki 96-dołkowej płytki, która jest nieprzezroczysta na czarno. Dodaj 10 mikrolitrów przygotowanych mitochondriów do studzienek poniżej norm A TP.
Każda unikalna próbka mitochondrialna powinna być posiana na potrójnej płytce z trzema dołkami samego buforu oddechowego jako kontrola ujemna. Kontynuuj, dodając 50 mikrolitrów roztworu do lizy komórek ssaków do każdej studzienki po załadowaniu. Inkubować płytkę w temperaturze 37 stopni Celsjusza przez pięć minut na wytrząsarce orbitalnej z prędkością 120 obr./min.
Podczas inkubacji należy przygotować rozcieńczenia wzorca A TP w zakresie od jednego 10. milimola do jednego 10. mikromola. Po inkubacji dodać 10 mikrolitrów każdego z wzorców A TP do odpowiednich studzienek wskazanych na mapie płytowej. Następnie do każdego z nich dodać 50 mikrolitrów odtworzonego roztworu substratu.
Cóż, a następnie ponownie inkubuj płytkę, jak poprzednio przez pięć minut. Kontynuuj, sprawdzając tabliczki w czytniku płytek. Otwórz oprogramowanie pod.
Utwórz nowy element. Kliknij na eksperyment. Następnie kliknij domyślny protokół i kliknij w porządku.
W lewej kolumnie wybierz protokół. Następnie procedura Następnie wybierz opóźnienie i ustaw je na 10 minut. No dobrze, wpis.
Teraz wybierz, przeczytaj i wybierz luminescencję z menu rozwijanego. Dostosuj inne ustawienia w następujący sposób. Czas integracji punktu końcowego typu odczytu.
Jedna sekunda. Filtr ustawia jedną pozycję optyki otworu emisyjnego, górną czułość 100, górne przesunięcie pionowe sondy o jeden milimetr. Po wprowadzeniu tych zmian ustawień kliknij przycisk OK.
Kliknij na układ płyt i odpowiednio go skonfiguruj. Kliknij w porządku. Teraz, gdy wszystko jest ustawione, kliknij ikonę odczytu płyty w górnym rzędzie i kliknij przeczytaj.
Gdy spektrofotometr się otworzy, umieść płytkę w tacce z dołkiem A w lewym górnym rogu. Teraz otworzy się okno wyświetlające temperaturę, kliknij OK, a następnie kontynuuj analizę danych. Próbki mięśni szkieletowych o wadze około 0,18 grama na mokro dały około 24 miliardów mitochondriów w oparciu o zliczanie wielkości cząstek.
Próbki wątroby tej samej wielkości dały kilka miliardów więcej. Odczyty cytometru hemocytometrycznego mitochondriów były niedoszacowane przy użyciu licznika cząstek. Uzyskano reprezentatywne śledztwo, z którego wynika, że izolowane mitochondria są zlokalizowane pod jednym pikiem o średniej średnicy około czterech dziesiątych mikrona.
Jest to zgodne z poprzednimi doniesieniami wykorzystującymi test dwukwasowy. Białko mitochondrialne mierzono na poziomie kilku miligramów na gram tkanki z mięśni szkieletowych i wątroby. Produkt był żywotny i sprawny w oddychaniu.
Mitochondria wyizolowane w ramach czasowych zgodnych z kliniczną i chirurgiczną interwencją terapeutyczną. Transmisyjne mikrografie elektronowe wykazały, że wszystkie izolowane mitochondria były wgnieceniami elektronowymi z uszkodzeniem mniejszym niż jeden na 10 000, zanieczyszczenie było mniejsze niż jeden na sto tysięcy A TP. Wyniki wykazały, że mitochondria są żywotne, a zawartość TP wynosi około 11 lub 15 nanomoli na miligram białka mitochondrialnego.
Analizę oddychania mitochondrialnego przeprowadzono przy użyciu elektrody typu Clark i wykazała, że zużycie tlenu wynosiło około 180 MLEs tlenu na minutę. Na każdy miligram białka mitochondrialnego, podczas gdy wartości RCI wynosiły około 2,5 z nieco wyższym wynikiem wątroby Po opanowaniu tę technikę można wykonać w mniej niż 30 minut, jeśli jest wykonywana prawidłowo.
View the full transcript and gain access to thousands of scientific videos
Przegląd
Ten artykuł opisuje szybką metodę izolacji czystych i oddechowych mitochondria z biopsji tkankowych szczurów. Procedura znacznie skraca czas izolacji do poniżej 30 minut w porównaniu z tradycyjnymi metodami.
Kluczowe elementy badania
Dziedzina nauki
- Neuronauka
- Biologia komórki
- Badania mitochondrialne
Tło
- Mitochondria są niezbędne dla oddychania komórkowego i produkcji energii.
- Tradycyjne metody izolacji mitochondria mogą być czasochłonne.
- Szybkie techniki izolacji mogą zwiększyć efektywność eksperymentów.
- Życiozdolne mitochondria są kluczowe dla dokładnych badań metabolicznych.
Cel badania
- Opracowanie szybszej metody izolacji mitochondria z tkanek ssaków.
- Zapewnienie, że izolowane mitochondria są czyste i funkcjonalnie kompetentne.
- Ułatwienie późniejszej analizy oddechu i testów ATP.
Zastosowanie metod
- Homogenizacja próbek wątroby lub mięśni szczurów.
- Użycie komercyjnego dysocjator tkanki dla efektywnego mieszania.
- Sekwencyjne filtrowanie przez filtry z nylonowej siatki.
- Rezyspensja ziarenek mitochondrialnych w buforze oddechowym.
Główne wyniki
- Czas izolacji skrócono do mniej niż 30 minut.
- Izolowane mitochondria wykazały żywotność i kompetencję oddechową.
- Wyniki zweryfikowane za pomocą analizy oddechowej i testów luminescencji ATP.
- Metoda wykazuje potencjał dla szerszych zastosowań w badaniach metabolicznych.
Wnioski
- Szybka metoda izolacji jest skuteczna w uzyskiwaniu funkcjonalnych mitochondria.
- Ta technika może usprawnić procesy badawcze w badaniach mitochondrialnych.
- Przyszłe badania mogą zbadać jej zastosowanie w różnych tkankach ssaków.
Często zadawane pytania
Executive Industry Relevance
Rapid mitochondrial isolation under 30 minutes enables timely functional assessment for preclinical metabolic studies and therapeutic screening. This method supports target validation by providing respiration-competent mitochondria from tissue biopsies, reducing biological variability in early discovery. The standardized tissue dissociation and filtration workflow improves reproducibility across labs, facilitating consistent data generation for go/no-go decisions in mitochondrial-targeted programs.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Enables interrogation of mitochondrial function as a therapeutic target in metabolic disease models.
- Operational Value: Replaces manual homogenization with standardized tissue dissociation for uniform sample preparation.
- Predictive Value: Yields viable mitochondria for respiration and ATP assays, supporting mechanistic de-risking of lead compounds.
Screening & Assay Development
- Scientific Value: Provides purified mitochondria suitable for high-content respiration and luminescence-based assays.
- Operational Value: Eliminates repetitive centrifugation steps through differential filtration, increasing throughput.
- Assay Readiness: Delivers consistent mitochondrial yields (~2x10^10 per 0.18g tissue) for reliable compound screening.
Translational & Preclinical Research
- Scientific Value: Maintains mitochondrial integrity and respiration competence, critical for preclinical efficacy testing.
- Operational Value: Compatible with clinical timelines, enabling isolation within surgical intervention windows.
- Translational Continuity: Supports biomarker alignment via ATP content and oxygen consumption metrics.
Pipeline & Workflow Integration
This method fits within the discovery continuum from early target validation to preclinical mitochondrial assessment, offering a rapid, reproducible step before compound screening or efficacy studies.
- Discovery Biology: Supports hypothesis testing of mitochondrial dysfunction in disease models through functional readouts.
- Screening: Enables assay-ready mitochondrial preparations with improved purity via sequential 40µm and 10µm filtration.
- Analytics: Generates quantitative outputs for respiration analysis (oxygen consumption) and ATP luminescence, facilitating condition comparisons.
- Translational Research: Connects to preclinical validation via respiration-competent mitochondria suitable for ex vivo testing.
- Enterprise Reuse: Standardized protocol using commercial tissue dissociator allows cross-lab adoption and workflow integration.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Predictive confidence in mitochondrial target engagement through validated respiration and ATP assays.
- Operational Value: Reduced isolation time (<30 min) and elimination of gradient centrifugation steps increase lab efficiency.
- Strategic Value: Enables faster iteration in lead identification by providing timely mitochondrial functional data.
- Portfolio Impact: Supports risk-adjusted prioritization by reducing false positives in mitochondrial-targeted screening.
Implementation Considerations
- Requires expertise in tissue handling and mitochondrial assay techniques.
- Dependent on access to a commercial tissue dissociator with preset mitochondrial isolation cycle.
- Necessitates sterile nylon mesh filters (40µm and 10µm) and temperature-controlled centrifugation (4°C, 9,000 x g).
- Standardization across tissue types (e.g., skeletal muscle, liver) may require optimization of dissociation parameters.
- Practical limitation: Method validated in rat tissues; extrapolation to human or other mammalian tissues requires additional validation.
