4-wymiarowe śledzenie in vivo hematopoetycznych komórek macierzystych i progenitorowych w dorosłym szpiku kostnym nazębnym myszy

Ogólnym celem tej procedury jest uzyskanie stosów 3D o wysokiej rozdzielczości zawierających hematopoetyczne komórki macierzyste i progenitorowe oraz monitorowanie ich w czasie za pomocą wielopunktowego obrazowania poklatkowego. Osiąga się to poprzez uprzednie znakowanie hematopoetycznych komórek macierzystych i progenitorowych lub HSC barwnikiem lipofilowym. HSC są następnie wstrzykiwane do myszy biorcy.

Mysz jest przygotowana do mikroskopii za pomocą niestandardowej głowicy i uchwytu na próbki w celu stabilnego pozycjonowania zwierząt. Następnie uzyskuje się stosy komórek macierzystych i progenitorowych o wysokiej rozdzielczości i wykonuje się obrazowanie poklatkowe wielu lokalizacji szpiku kostnego zawierających HS PC, ostatecznie konfokalne wewnątrzżyciowe, a mikroskopia fotonowa wykorzystuje się do pokazania lokalizacji i ruchu HSC w przestrzeni szpiku kostnego. Główną przewagą tej techniki nad istniejącymi metodami, takimi jak immunofluorescencja na skrawkach szpiku kostnego, jest to, że jesteśmy w stanie uchwycić informacje w skali czterowymiarowej, trzech wymiarach plus czas.

Implikacje tej techniki rozciągają się na terapię chorób hematologicznych, ponieważ pomaga zrozumieć, gdzie musimy skierować krwiotwórcze komórki macierzyste w szpiku kostnym, aby zagwarantować ich prawidłowe funkcjonowanie. Po raz pierwszy wpadliśmy na pomysł tej metody, gdy zdaliśmy sobie sprawę, jak ważna jest możliwość śledzenia HS PC w miarę upływu czasu. Ta metoda pomaga nam odpowiedzieć na wszelkie pytania, które mamy w niszy komórek macierzystych, w której chcemy wiedzieć, gdzie znajdują się komórki macierzyste i jak zachowują się w czasie.

Aby rozpocząć pobieranie hematopoetycznych komórek macierzystych i progenitorowych, jak wykazano przez to laboratorium w poprzednim filmie geograficznym i do których odniesiono się w protokole tekstowym. Następnie dodaj lipofilowy barwnik DID do zawiesiny komórek w końcowym stężeniu pięciu mikromolowców. Natychmiast wymieszaj zawiesinę, aby upewnić się, że barwnik nie wytrąci się z roztworu i nie oznaczy komórek.

Inkubuj komórki przez 10 minut w temperaturze 37 stopni Celsjusza, aby umyć komórki. Najpierw wirować z prędkością 500 razy G przez pięć minut i zdekantować płyn. Następnie ponownie zawieś komórki w 200 mikrolitrach PBS i zbierz do strzykawki insulinowej.

Strzykawka insulinowa jest zalecana zamiast konwencjonalnej strzykawki, ponieważ nie ma martwej przestrzeni igły. Zezwalając na podanie całej zawiesiny komórkowej myszy w celu wstrzyknięcia komórek do śmiertelnie napromieniowanej myszy poprzez wstrzyknięcie żyły ogonowej. Najpierw umieść mysz w ciepłej komorze.

Gdy pojawi się żyła ogonowa, rozszerzona naczyniami krwionośnymi, przenieś mysz do ogranicznika. Ostrożnie wsuń igłę do żyły ogonowej. Wstrzyknij komórki do żyły.

Nie należy napotkać oporu przy wstrzykiwaniu. Zostaw mysz na noc. Aby umożliwić komórkom migrację do przestrzeni szpiku kostnego, znieczul mysz i monitoruj początek głębokiego znieczulenia za pomocą odruchu płatkowego.

Przetrzyj górną część skóry głowy 70% etanolem na chusteczce. Uważając, aby etanol nie dostał się do oczu myszy. Aby odsłonić obszar kalwarii, który ma być zobrazowany, wykonaj małe nacięcie z tyłu głowy między uszami, podnosząc skórę kleszczami do góry, jednocześnie przytrzymując skórę do góry.

Wsuń nożyczki pod skórę i delikatnie przetnij wzdłuż zewnętrznej strony żądanego obszaru obrazowania. Przetrzyj odsłoniętą kość sterylnym wacikiem zwilżonym sterylnym PBS, aby kość była wilgotna. Pozwala to uniknąć nadmiernego wysuszenia i bliznowacenia, które mogą wpływać na jakość obrazowania.

Następnie wymieszaj odpowiednią ilość cementu dentystycznego w łódce serwatkowej, aż stanie się pastą. Szybko nałóż go na dolną powierzchnię nakrycia głowy autoklawu, które przymocuje się do czaszki. Zanim cement stwardnieje, umieść nakrycie głowy na czaszce myszy, uważając, aby cement dentystyczny nie dostał się na obszar obrazowania i poczekaj, aż stężeje.

Nałóż niewielką ilość intra hydrożelu, który utrzymuje czaszkę wilgotną, uważając, aby nie naruszyć cementu podczas wysychania. Następnie przymocuj nakrycie głowy do uchwytu i zabezpiecz je na miejscu. Za pomocą upewnij się, że rowki mieszczą się w nacięciach uchwytu.

Usuń hydrożel za pomocą sterylnych patyczków kosmetycznych przed przeniesieniem do mikroskopu. Następnie włóż uchwyt do stolika mikroskopu i umieść matę grzewczą pod myszką. Włóż sondę termometru doodbytniczego i zabezpiecz wszystko na miejscu na scenie taśmą klejącą.

Umieść małą kroplę maści okulistycznej na oczach myszy, aby upewnić się, że nie wyschną podczas znieczulenia. Mysz nie może być pozostawiona bez opieki w żadnym momencie procesu obrazowania pod narkozą. Aby ustawić ostrość na czaszce za pomocą okularów.

Najpierw napełnij okienko obrazowania kalwarii oczyszczoną sterylną wodą za pomocą soczewki zanurzającej się w wodzie. Opuść go tak, aby dotykał kropli wody. Ustaw ostrość na czubku czaszki za pomocą okularów mikroskopu.

Umieść obszar obrazowania na szwie centralnym i przesuń się w kierunku tyłu głowy, aby znaleźć szew koronalny. Jako pozycję wyjściową umieść oprogramowanie w trybie przechwytywania obrazów XY, a także stosu z trzema DZ. Ustaw szybkość obrazowania na 400 Hz, a rozdzielczość na 512 na 512 pikseli.

Skonfiguruj oprogramowanie tak, aby przechwytywało wiele kanałów, i ustaw metodę zbierania tak, aby zmieniała ustawienia między stosami lub między klatkami. Skonfiguruj trzy niezależne ustawienia przechwytywania. Wyłączanie podświetlenia laserowego po zakończeniu akwizycji każdego stosu.

Następnie skonfiguruj pierwsze skanowanie sekwencyjne dla dwufotonowego sygnału kostnego generacji drugiej harmonicznej. Otwórz migawkę lasera wielofotonowego i upewnij się, że wzmocnienie i przesunięcie lasera wielofotonowego są prawidłowo ustawione. Upewnij się również, że moc lasera wynosi od 12,5 do 25%, a laser jest włączony.

Wybierz odpowiedni PMT jako jedyny detektor i zmień kolor na biały. Powtórz procedurę konfiguracji kanału dla połączonej autofluorescencji i DID przy drugim ustawieniu. Skanuj za pomocą dwóch odpowiednich p mts.

Zmień kolor kanału na zielony dla autofluorescencji i czerwony dla DID. Na koniec skonfiguruj trzecie i ostatnie skanowanie w celu wykrycia GFP. Ustaw moc lasera linii laserowej 488 nanometrów na około 15%Wybierz odpowiednią tubę powielacza zdjęć lub PMT jako jedyny aktywny detektor i zmień jego pseudo kolor na zielony.

Aktywuj tryb obrazowania na żywo, aby rozpocząć skanowanie podglądu wybranego kanału i dostosować wzmocnienie i przesunięcie detektora w celu uzyskania optymalnej ekspozycji. Powtórz tę czynność dla każdego skanowania w oknie sekwencyjnym i zapisz ustawienia tych skanów wielokanałowych w celu łatwego ponownego wykorzystania. Następnie aktywuj przechwytywanie wielopozycyjne określane w tym oprogramowaniu jako zaznacz i znajdź i zresetuj punkty współrzędnych.

Następnie zeskanuj obszar obrazowania kości, zaczynając od przecięcia szwu środkowego i koronalnego. Zeskanuj głębokość obszaru szpiku kostnego za pomocą zarówno autofluorescencji, jak i DID z widokiem złożonym. Po wykryciu komórki oznacz ją jako nową pozycję współrzędnych, klikając ikonę dodaj nową pozycję po lewej stronie znacznika i okna.

Po sprawdzeniu bieżącego pola widzenia przesuń stolik o odległość jednego pola widzenia. Powtórz ten proces dla każdego pola widzenia. Stopniowo pracując wokół całego okienka obrazowania na lewo od szwu centralnego, przesuwając się w kierunku nosa myszy.

Gdy rozwidlenie szwu środkowego jest w zasięgu wzroku, przejdź na prawą stronę szwu i powtórz procedurę. Skanowanie lewej strony w odwrotnym kierunku. Zaznacz współrzędne wszystkich nowych interesujących Cię komórek za pomocą narzędzia Oznacz i znajdź.

Aby przejrzeć punkty, ustaw górną i dolną część stosu Zs wokół każdej komórki dla każdej pozycji. Dla każdego punktu ustaw ostrość w górę i w dół oraz ustaw górną i dolną pozycję Z dla przechwytywania trzech stosów DZ. Zaktualizuj pojedynczy punkt w znaczniku i znajdź, ustaw interwał Ponacinka na pięć mikrometrów, a uśrednianie dla każdego kanału skanowania sekwencyjnego na odpowiednią jakość.

Uzyskaj wysokiej jakości stos referencyjny dla każdego interesującego miejsca, rozpoczynając całą procedurę skanowania. Po zakończeniu skanowania w wysokiej jakości aktywuj ustawienie poklatkowe dla ustawień przechwytywania i poklatkowego. Ustaw interwał czasu na pięć minut, a całkowity czas wykonywania na żądaną długość.

Zastosuj te ustawienia do całego skanowania. W tym przykładzie pokazano, jak można uzyskać więcej niż trzy punkty: Modyfikując te ustawienia, można skrócić czas skanowania, aby umożliwić pięciominutowy interwał poklatkowy, zmniejszając liczbę skanów używanych do uśredniania, ograniczając rozdzielczość do 512 na 512 pikseli. Konwersja skanowania na dwukierunkowe i/lub zwiększenie prędkości skanowania do 600 Hz lub więcej umożliwia rozpoczęcie obrazowania jak poprzednio, klikając przycisk Start i pokazane oprogramowanie.

Po zakończeniu obrazowania należy przeprowadzić eutanazję myszy zgodnie z opisem w protokole tekstowym. Wykonany na zamówienie, wysoce precyzyjny uchwyt na mysz, w tym okienko obrazowania kalwarii, umożliwia przedłużone obrazowanie znakowanych PC HS wstrzykniętych śmiertelnie napromieniowanym myszom biorcy, pokazane tutaj są wycinkami 2D stosów 3D HSPC o rozdzielczości pojedynczej komórki zawierających obszary szpiku kostnego o grubości około 90 do 120 mikrometrów sygnału z kolagenu. Kość jest pokazana na biało, komórki oznaczone DID są pokazane na czerwono.

Komórki autofluorescencyjne są pokazane na żółto, a komórki osteoblastyczne są pokazane na zielono. Pokazano tutaj 40-metrowy film poklatkowy przedstawiający zidentyfikowane komputery HS, pokazujące HSC oznaczone jako DID na czerwono, migrujące w pobliżu komórek osteoblastycznych na zielono Po opanowaniu. Technika ta powinna być możliwa do wykonania w ciągu około godziny w przypadku operacji i wstępnego obrazowania, po którym następuje odpowiedni czas na obrazowanie poklatkowe.

Po obejrzeniu tego filmu powinieneś być całkiem pewien, że będziesz w stanie skonfigurować obrazowanie cielęcia myszy i spojrzeć na wiele komputerów HS w czasie.