Name: Podstawowe elementy techniczne zamrażania-pękania/wytrawiania przez zamrożenie w biologicznej mikroskopii elektronowej (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-09-11T13:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 17 s
Description: Poznaj technikę zamrażania-pękania i wytrawiania przez zamrożenie w mikroskopii elektronowej. Metoda ta umożliwia tworzenie replik węglowo-platynowych biologicznych próbek i nanomateriałów.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

Ta prezentacja została wsparta nagrodą Clinical Innovator Award dla JLC od Flight Attendant Medical Research Institute oraz przez Agencję Ochrony Środowiska Stanów Zjednoczonych. Chociaż badania opisane w tym artykule zostały sfinansowane w całości lub w części przez Agencję Ochrony Środowiska Stanów Zjednoczonych na podstawie umowy o współpracy CR83346301 z Centrum Medycyny Środowiskowej, Astmy i Biologii Płuc na Uniwersytecie Karoliny Północnej w Chapel Hill, nie zostały one poddane wymaganej przez Agencję ocenie naukowej i politycznej. i w związku z tym niekoniecznie odzwierciedla poglądy Agencji i nie należy wnioskować o jej oficjalnym poparciu. Wzmianka o nazwach handlowych lub produktach komercyjnych nie stanowi poparcia ani rekomendacji do użycia.

1. Przygotowanie próbek biologicznych do zamrażania/trawienia przez zamrażanie
<ol>
	<li>Użyj konwencjonalnego preparatu utrwalającego EM, takiego jak 2% aldehyd glutarowy + 2% paraformaldehyd w 0,1 M buforze fosforanowym przez 1 godzinę, aby wykonać pierwotne utrwalanie tkanek biologicznych. UWAGA: Chociaż może być pożądane zamrożenie niektórych rodzajów próbek bez uprzedniego utrwalenia, uniwersalne środki ostrożności dotyczące patogenów przenoszonych przez krew wymagają odpowiedniego utrwalenia, gdy próbka składa się z tkanki ludzkiej.</li>
	<li>Po pierwotnym utrwaleniu próbkę należy przepłukać w tym samym buforze uzupełnionym 0,2 M sacharozą przez nie więcej niż 1 godzinę.</li>
	<li>Przenieść próbkę do roztworu krioprotektantu składającego się z 25% glicerolu w 0,1 M buforze fosforanowym na nie dłużej niż 1 godzinę.</li>
</ol>
2. Zamrażanie i przechowywanie próbek przed zamarznięciem
<ol>
	<li>Wybierz złote lub miedziane kikuty próbki o odpowiednim rozmiarze i kształcie dla przetwarzanej próbki (Rysunek 4).</li>
	<li>Za pomocą cienkich kleszczyków i/lub igieł strzykawkowych o małej średnicy umieść małe fragmenty próbki na wierzchu metalowego króćca próbki.
	<ol>
		<li>Zmniejsz płynną zawartość próbki do lepkiej, lekko przypominającej klej konsystencji, odciągając płyn z krawędzi kikuta bibułą filtracyjną.</li>
		<li>W przypadku pojedynczych replik użyj igieł strzykawkowych o małej średnicy, aby utworzyć kopiec tkanki na kikutu. W przypadku podwójnych replik odwróć inny króciec i umieść go dokładnie nad króćcem, a następnie delikatnie umieść na powierzchni próbki, tworząc kanapkę (Rysunek 5A). Nie wyciskaj próbki spomiędzy dwóch króćców.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Napełnij dwa izolowane naczynia Dewara ciekłym azotem. UWAGA: W pierwszym zbiorniku znajduje się metalowy słupek zawierający małą studnię, która służy do skraplania niewielkiej ilości gazu propan z dostępnej w handlu butli (rysunek 5B). Drugi zbiornik jest podzielonym naczyniem do przechowywania/przechowywania do krótkotrwałego utrzymywania zamrożonych próbek w ciekłym azocie.
	<ol>
		<li>Używając dyszy butli umieszczonej w studni propanu, otwórz zawór butli i pozwól, aby gaz spłynął do studni pierwszego naczynia, gdzie się skropli. UWAGA: UWAGA!! PROPAN JEST WYBUCHOWY, MOŻE SPOWODOWAĆ ZAMARZANIE W KONTAKCIE I JEST ŚRODKIEM DUSZĄCYM. Używaj propanu tylko w okapie chemicznym certyfikowanym do takiego użytku, zwracając również uwagę na to, aby uniknąć zewnętrznych źródeł zapłonu, używając odzieży chroniącej przed niskimi temperaturami i utrzymując odpowiednią wentylację.</li>
		<li>Tak szybko, jak to możliwe, podnieś mocowanie próbki za pomocą drobnych kleszczyków i zanurz je w skroplonym gazie w pierwszym naczyniu na kilka sekund, a następnie szybko przenieś do drugiego naczynia z ciekłym azotem (rysunek 5B).</li>
		<li>Po zamrożeniu próbek należy przechowywać w ciekłym azocie do momentu, gdy będą gotowe do przeniesienia do instalacji do szczelinowania zamrażalniczego. W razie potrzeby przenieś kikuty do większego pojemnika Dewara z ciekłym azotem w celu przedłużenia przechowywania, jednak należy uważać, aby nie dopuścić do rozmrożenia kikutów.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
3. Działanie przyrządu do zamrażania i łamania oraz przetwarzanie próbek
<ol>
	<li>Ładowanie próbek na mosiężny uchwyt i do komory
	<ol>
		<li>Załaduj złote odcinki próbki do podwójnego uchwytu na próbkę lub urządzenia zaciskowego w formie broszury pod ciekłym azotem i trzymaj tam, aż będą gotowe do umieszczenia w komorze na próbki (Rysunek 6).</li>
		<li>Gdy komora osiągnie wysoką próżnię (około 2 x 10-6 mbar), a stolik zostanie schłodzony do temperatury ciekłego azotu, wyłącz pompę, odpowietrz komorę i jak najszybciej umieść zamontowane króćce próbek na stole do pobierania próbek.</li>
		<li>Włącz pompę, przywróć wysoką próżnię i użyj elektronicznego stage i regulatorów temperatury ramienia, aby dostosować temperaturę stołu próbek do -100 °C i skierować ciekły azot do ramienia mikrotomu i doprowadzić go do temperatury ciekłego azotu.</li>
	</ol>
	</li>
	<li> Proces pękania
	<ol>
		<li>Po osiągnięciu wysokiej próżni, temperatury etapu -100 ºC i ramienia mikrotomu w temperaturze ciekłego azotu, zdalnie otwórz podwójny uchwyt na próbkę repliki, rozbijając w ten sposób próbki na mocowaniach próbki (freeze-fracture_movie1.mov).</li>
		<li>W przypadku próbek przeznaczonych do wytrawiania po złamaniu, należy użyć żyletki umieszczonej w zacisku na ramieniu mikrotomu, aby ogolić (tj. złamać) powierzchnię próbek zamiast kroku 3.2.1 (freeze-etch_movie2.mov).</li>
		<li>Jeśli ma zostać wykonany dodatkowy etap trawienia przez zamrażanie, umieść schłodzone ramię mikrotomu na pękniętych powierzchniach na jedną do kilku minut. UWAGA: Ten manewr spowoduje sublimację (tj. wytrawienie) wody z pękniętej powierzchni. Efektem tego manewru jest ujawnienie prawdziwych powierzchni komórek, macierzy zewnątrzkomórkowej i/lub zespołów molekularnych poprzez sublimację wody, a także powierzchni pęknięć przechodzących przez dwuwarstwę lipidową błon.</li>
	</ol>
	</li>
	<li> Cieniowanie metalu i odparowywanie replik za pomocą dział elektronowych 
	<ol>
		<li>Aktywuj pistolet elektronowy lub oporowy platynowo-węglowy i pozwól mu odparować cienką warstwę (około 2 nm) platyny/węgla na pękniętą powierzchnię pod kątem 30º - 45º. Zwykle zajmuje to około 15 - 20 sekund.</li>
		<li>Aktywuj pistolet elektronowy lub oporowy jak w kroku 3.3.1 i odparuj cienką warstwę węgla na pękniętą powierzchnię próbki bezpośrednio z góry (90º), aby zapewnić podparcie repliki. Zwykle zajmuje to około 15 - 20 sekund.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Pobieranie replik
	<ol>
		<li>Po zakończeniu cieniowania replikacji i stabilizacji węgla wyłącz pompę próżniową, odpowietrz komorę i wyjmij mocowanie próbki z instrumentu.</li>
		<li>Za pomocą pary cienkich kleszczyków usuń każdy króciec złotej próbki z podwójnej broszury/zacisku repliki i pozostaw do rozmrożenia na kilka sekund, a następnie delikatnie opuść króciec na powierzchnię wody w płytce punktowej (Rysunek 7). UWAGA: Replika z włókna węglowego/platyny zawierająca przylegający materiał próbki będzie unosić się na powierzchni wody.</li>
		<li>Manewruj replikami za pomocą pętli z cienkiego drutu lub konwencjonalnej siatki mikroskopu elektronowego z miedzi trzymanej przez drobne kleszcze i przenieś na inną płytkę punktową zawierającą 5% dichromian sodu w 50% kwasie siarkowym przez jedną do kilku godzin. UWAGA: Ta kąpiel trawi rzeczywisty materiał próbki biologicznej z repliki. Wybielacz domowy o pełnej mocy może być zastąpiony roztworem dichromianu/kwasu siarkowego.</li>
		<li>Po zakończeniu trawienia przenieś replikę z powrotem na powierzchnię czystej wody i odzyskaj na standardową siatkę miedzianego mikroskopu elektronowego. (UWAGA: Repliki mogą rozpadać się na mniejsze kawałki podczas trawienia, ale nawet bardzo małe repliki mogą zawierać istotne informacje i powinny być pobrane i zbadane.) Przechowuj repliki siatek nośnych w dostępnych na rynku skrzynkach siatkowych, gdzie pozostaną stabilne przez lata przy delikatnym obchodzeniu się.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
4. Badanie ultrastrukturalne replik zamrażalno-łamliwych/trawiących
<ol>
	<li>Zobacz repliki w transmisyjnym mikroskopie elektronowym przy napięciu przyspieszającym zwykle od 50 do 80 kV.</li>
	<li>Rejestruj odpowiednie obrazy na standardowej kliszy TEM lub za pomocą aparatu cyfrowego o wysokiej rozdzielczości.</li>
</ol>

<ol><li>Steere, R. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Electron+microscopy+of+structural+detail+in+frozen+biological+specimens%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biophysic+and+BiochemCytol%22%5BJournal%5D)">Electron microscopy of structural detail in frozen biological specimens.</a> J Biophysic and BiochemCytol. 3, 45-60 (1957).</li>
<li>Pinto da Silva, P., Branton, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Membrane+splitting+in+freeze-etching.+Covalently+bound+ferritin+as+a+membrane+marker%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Membrane splitting in freeze-etching. Covalently bound ferritin as a membrane marker.</a> J Cell Biol. 45, 598-605 (1970).</li>
<li>Friend, D. S., Gilula, N. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Variations+in+tight+and+gap+junctions+in+mammalian+tissues%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Variations in tight and gap junctions in mammalian tissues.</a> J Cell Biol. 53, 758-776 (1972).</li>
<li>Branton, D. Fracture faces of frozen membranes. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aBranton%2C+D+%22ProcNatlAcadSci+USA%22">ProcNatlAcadSci USA</a>. 55, 1048-1056 (1966).</li>
<li>Heuser, J. E., Reese, T. S., Dennis, M. J., Jan, Y., Jan, L., Evans, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Synaptic+vesicleexocytosiscaptured+by+quick+freezing+and+correlated+with+quantal+transmitter+release%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Synaptic vesicleexocytosiscaptured by quick freezing and correlated with quantal transmitter release.</a> J Cell Biol. 81, 275-300 (1979).</li>
<li>Goodenough, U. W., Heuser, J. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Substructure+of+inner+dynein+arms%2C+radial+spokes%2C+and+the+central+pair%2Fprojection+complex+of+cilia+and+flagella%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Substructure of inner dynein arms, radial spokes, and the central pair/projection complex of cilia and flagella.</a> J Cell Biol. 100, 2008-2018 (1985).</li>
<li>Goodenough, U. W., Heuser, J. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Substructure+of+the+outer+dynein+arm%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Substructure of the outer dynein arm.</a> J Cell Biol. 95, 798-815 (1982).</li>
<li>Hirokawa, N., Heuser, J. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quick-freeze%2C+deep-etch+visualization+of+the+cytoskeleton+beneath+surface+differentiations+of+intestinal+epithelial+cells%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Quick-freeze, deep-etch visualization of the cytoskeleton beneath surface differentiations of intestinal epithelial cells.</a> J Cell Biol. 91, 399-409 (1981).</li>
<li>Hirokawa, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quick+freeze%2C+deep+etch+of+the+cytoskeleton%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Enzymol%22%5BJournal%5D)">Quick freeze, deep etch of the cytoskeleton.</a> Methods Enzymol. 134, 598-612 (1986).</li>
<li>Chandler, D. E., Sharp, W. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Freeze+fracture+and+freeze+etching.+Electron+Microscopy%3A+Methods+and+Protocols%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">Freeze fracture and freeze etching. Electron Microscopy: Methods and Protocols.</a> Methods in Molecular Biology. Kuo, J. ohn 1117, 95-132 (2014).</li>
<li>Severs, N. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Freeze-fracture+electron+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Protocols%22%5BJournal%5D)">Freeze-fracture electron microscopy.</a> Nature Protocols. 2, 547-576 (2007).</li>
<li>Gilula, N. B., Satir, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+ciliary+necklace.+A+ciliary+membrane+specialization%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">The ciliary necklace. A ciliary membrane specialization.</a> J Cell Biol. 53, 494-509 (1972).</li>
<li>Rohatgi, R., Snell, W. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+ciliary+membrane%5BTitle%5D)+AND+%22CurrOpin+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">The ciliary membrane.</a> CurrOpin Cell Biol. 22, 541-546 (2010).</li>
<li>Fisch, C. F., Dupuis-Williams, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ultrastructure+of+cilia+and+flagella-back+to+the+future%5BTitle%5D)+AND+%22Biol+Cell%22%5BJournal%5D)">Ultrastructure of cilia and flagella-back to the future.</a> Biol Cell. 103, 249-270 (2011).</li>
<li>Carson, J. L., Collier, A. M., Knowles, M. R., Boucher, R. C., Rose, J. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Morphometric+aspects+of+ciliary+distribution+and+ciliogenesis+in+human+nasal+epithelium%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Nat+Acad+Sci%22%5BJournal%5D)">Morphometric aspects of ciliary distribution and ciliogenesis in human nasal epithelium.</a> Proc Nat Acad Sci. 78, 6996-6999 (1981).</li>
<li>Carson, J. L., Collier, A. M., Smith, C. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((New+observations+on+the+ultrastructure+of+mammalian+conducting+airway+epithelium%3A+Application+of+liquid+propane+freezing+and+rotary+shadowing+techniques+to+freeze-fracture%5BTitle%5D)+AND+%22J+Ultrastr+Res%22%5BJournal%5D)">New observations on the ultrastructure of mammalian conducting airway epithelium: Application of liquid propane freezing and rotary shadowing techniques to freeze-fracture.</a> J Ultrastr Res. 89, 23-33 (1984).</li>
<li>Carson, J. L., Collier, A. M., Gambling, T. M., Leigh, M. W., Hu, S. S., Boat, T. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Development+organization%2C+and+function+of+tight+junctional+complexes+in+the+tracheal+epithelium+of+infant+ferrets%5BTitle%5D)+AND+%22Am+Rev+Respir+Dis%22%5BJournal%5D)">Development organization, and function of tight junctional complexes in the tracheal epithelium of infant ferrets.</a> Am Rev Respir Dis. 138, 666-674 (1988).</li>
<li>Coyne, C. B., Gambling, T. M., Boucher, R. C., Carson, J. L., Johnson, L. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Role+of+claudin+interactions+in+airway+tight+junctional+permeability%5BTitle%5D)+AND+%22Am+J+Physiol%22%5BJournal%5D)">Role of claudin interactions in airway tight junctional permeability.</a> Am J Physiol. 285, 1166-1178 (2003).</li>
<li>Carson, J. L., Collier, A. M., Hu, S. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ultrastructural+studies+of+hamster+tracheal+epithelium+in+vivo+and+in+vitro%5BTitle%5D)+AND+%22J+Ultrastr+Res%22%5BJournal%5D)">Ultrastructural studies of hamster tracheal epithelium in vivo and in vitro.</a> J Ultrastr Res. 70, 70-81 (1979).</li>
<li>Carson, J. L., Collier, A. M., Knowles, M. R., Boucher, R. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ultrastructural+characterization+of+epithelial+cell+membranes+in+normal+human+conducting+airway+epithelium%3A+A+freeze-fracture+study%5BTitle%5D)+AND+%22Am+J+Anat%22%5BJournal%5D)">Ultrastructural characterization of epithelial cell membranes in normal human conducting airway epithelium: A freeze-fracture study.</a> Am J Anat. 173, 257-268 (1985).</li>
<li>Charles, A. C., Naus, C. C. G., Zhu, D., Kidder, G. M., Dirksen, E. R., Sanderson, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Intercellular+calcium+signaling+via+gap+junctions+in+glioma+cells%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Intercellular calcium signaling via gap junctions in glioma cells.</a> J Cell Biol. 118, 195-201 (1992).</li>
<li>Sanderson, M. J., Charles, A. C., Dirksen, E. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mechanical+stimulation+and+intercellular+communication+increases+intercellular+CA2%2B+in+epithelial+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Regul%22%5BJournal%5D)">Mechanical stimulation and intercellular communication increases intercellular CA2+ in epithelial cells.</a> Cell Regul. 1, 585-596 (1990).</li>
<li>Welsch, F., Stedman, D., Carson, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effects+of+a+teratogen+on+%5B3H%5Duridine+nucleotide+transfer+between+human+embryonal+cells+and+on+gap+junctions%5BTitle%5D)+AND+%22Exp+Cell+Res%22%5BJournal%5D)">Effects of a teratogen on [3H]uridine nucleotide transfer between human embryonal cells and on gap junctions.</a> Exp Cell Res. 159, 91-102 (1985).</li>
<li>Carson, J. L., Willumsen, N. J., Gambling, T. M., Hu, S. S., Collier, A. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dynamics+of+intercellular+communication+and+differentiation+in+a+rapidly+developing+mammalian+airway+epithelium%5BTitle%5D)+AND+%22Am+J+Respir+Cell+%26+Molec+Biol%22%5BJournal%5D)">Dynamics of intercellular communication and differentiation in a rapidly developing mammalian airway epithelium.</a> Am J Respir Cell & Molec Biol. 1, 385-390 (1989).</li>
<li>Carson, J. L., Collier, A. M., Clyde, W. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ciliary+membrane+alterations+occurring+in+experimental+Mycoplasma+pneumoniae+infection%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Ciliary membrane alterations occurring in experimental Mycoplasma pneumoniae infection.</a> Science. 206, 349-351 (1979).</li>
<li>Carson, J. L., Collier, A. M., Hu, S. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ultrastructural+observations+on+cellular+and+subcellular+aspects+of+experimental+Mycoplasma+pneumoniae+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Infect+%26+Immun%22%5BJournal%5D)">Ultrastructural observations on cellular and subcellular aspects of experimental Mycoplasma pneumoniae disease.</a> Infect & Immun. 29, 1117-1124 (1980).</li>
<li>Henshaw, N. G., Carson, J. L., Collier, A. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ultrastructural+observations+of+Pneumocystis+carinii+attachment+to+rat+lung%5BTitle%5D)+AND+%22J+Infect+Dis%22%5BJournal%5D)">Ultrastructural observations of Pneumocystis carinii attachment to rat lung.</a> J Infect Dis. 151, 181-186 (1985).</li>
<li>Carson, J. L., Collier, A. M., Hu, S. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+appearance+of+compound+cilia+in+the+nasal+mucosa+of+normal+human+subjects+in+response+to+acute%2C+low+level+sulfur+dioxide+exposure%5BTitle%5D)+AND+%22Environ+Res%22%5BJournal%5D)">The appearance of compound cilia in the nasal mucosa of normal human subjects in response to acute, low level sulfur dioxide exposure.</a> Environ Res. 42, 155-165 (1987).</li>
<li>Carson, J. L., Collier, A. M., Gambling, T. M., Knowles, M. R., Boucher, R. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ultrastructure+of+airway+epithelial+cell+membranes+among+patients+with+cystic+fibrosis%5BTitle%5D)+AND+%22Hum+Pathol%22%5BJournal%5D)">Ultrastructure of airway epithelial cell membranes among patients with cystic fibrosis.</a> Hum Pathol. 21, 640-647 (1990).</li>
<li>Carson, J. L., Brighton, L. E., Collier, A. M., Bromberg, P. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Correlative+ultrastructural+investigations+of+airway+epithelium+following+experimental+exposure+to+defined+air+pollutants+and+lifestyle+exposure+to+tobacco+smoke%5BTitle%5D)+AND+%22InhalToxicol%22%5BJournal%5D)">Correlative ultrastructural investigations of airway epithelium following experimental exposure to defined air pollutants and lifestyle exposure to tobacco smoke.</a> InhalToxicol. 25, 134-140 (2013).</li>
<li>Boonstra, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Immunocytochemical+demonstrations+of+cytoplasmic+and+cell-surface+EGF+receptors+in+A431+cells+using+cryo-ultramicrotomy%2C+surface+replication%2C+freeze-etching+and+label+fracture%5BTitle%5D)+AND+%22J+Microscopy%22%5BJournal%5D)">Immunocytochemical demonstrations of cytoplasmic and cell-surface EGF receptors in A431 cells using cryo-ultramicrotomy, surface replication, freeze-etching and label fracture.</a> J Microscopy. 140, 119-129 (1985).</li>
<li>Fujimoto, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Freeze-fracture+replica+electron+microscopy+combined+with+SDS+digestion+for+cytochemical+labeling+of+integral+membrane+proteins.+Application+to+the+immunogold+labeling+of+intercellular+junctional+complexes%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Cell+Sci%22%5BJournal%5D)">Freeze-fracture replica electron microscopy combined with SDS digestion for cytochemical labeling of integral membrane proteins. Application to the immunogold labeling of intercellular junctional complexes.</a> J. Cell Sci. 108, 3443-3449 (1995).</li>
<li>Quinn, P. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+effect+of+tocopherol+on+the+structure+and+permeability+of+phosphatidylcholine+liposomes%5BTitle%5D)+AND+%22J+Control+Release%22%5BJournal%5D)">The effect of tocopherol on the structure and permeability of phosphatidylcholine liposomes.</a> J Control Release. 160, 158-163 (2012).</li>
</ol>

Autor nie ma nic do zdradzienia.

W latach następujących po jego wprowadzeniu i wprowadzeniu na rynek, procedury zamrażania, pękania/wytrawiania były szeroko stosowane do badań biologicznej struktury błony. Rzeczywiście, najlepsze perspektywy niektórych specjalizacji strukturalnych membran uzyskano w preparatach do zamrażania, pękania/wytrawiania. Badania te nie tylko przyczyniły się do zrozumienia organizacji strukturalnej membran, ale także dostarczyły informacji na temat tego, w jaki sposób struktura i funkcja są ze sobą powiązane.
<p class="jove_...

Koncepcja i praktyczne zastosowanie przetwarzania próbek biologicznych metodą zamrażania i pękania zostało wprowadzone przez Steere1 ponad pół wieku temu. Wczesna aparatura przywłaszczyła sobie różne komponenty w działającą samodzielną jednostkę1. Oryginalna aparatura została zmodyfikowana i udoskonalona w celu uzyskania dostępnych na rynku instrumentów w celu zaspokojenia krytycznej potrzeby zdalnej manipulacji, utrzymania wysokiej próżni oraz odparowania węgla i metali w celu wytworzenia repliki nadającej się do badania za pomocą transmisyjnej mikroskopii elektronowej (Rysunek 1 i Rysunek 2).
Typowy instrument składa się z komory wysokiego próżni ze stołem do pobierania próbek i ramieniem mikrotomowym o regulowanym przepływie ciekłego azotu (Rysunek 1). W komorze znajdują się również dwa pistolety elektronowe, jedno do stabilizacji parowania węgla ustawione pod kątem 90º do stopnia próbki, a drugie do cieniowania platyny/węgla pod regulowanym kątem, zwykle 15º - 45º (rysunek 2). Zasilanie urządzenia jest dostarczane do pracy pompy próżniowej, a panele elektroniczne regulują regulację temperatury i sterowanie działem elektronowym.
Pierwotnie pomyślany jako sposób na poprawę obrazowania wirusów, złamanie zamrażalne zyskało jeszcze większą popularność jako technika badania i analizy błon komórkowych i ich specjalizacji 2,3. Rzeczywiście, procedura ta była integralną częścią wyjaśnienia relacji struktura/funkcja w komórkach i tkankach, a wiele z tych badań stanowi klasyczny wkład w biologię komórkową i molekularną4-9. Głównym celem i uzasadnieniem rozwoju techniki zamrażania i pękania było ograniczenie artefaktów obserwowalnych w rozdzielczości mikroskopii elektronowej, pochodzących z chemicznego utrwalania i przetwarzania stosowanego w konwencjonalnej biologicznej mikroskopii elektronowej. W tym przypadku celem jest ograniczenie wiązania chemicznego i zamrożenie próbki z wystarczającą prędkością i często w obecności krioprotektantu, aby ograniczyć tworzenie się kryształków lodu i innych artefaktów zamrażania. Ostatnio technika ta spotkała się z ponownym zainteresowaniem biologów molekularnych i badaczy materiałoznawstwa badaniami nanocząstek i nanomateriałów.
Obrazy zamrożono-szczelinowe i wytrawione przez zamrożenie mają charakter trójwymiarowy i czasami są mylone ze skaningowymi mikrofotografiami elektronów. Jednak preparaty do pękania zamrażalnego są badane za pomocą transmisyjnej mikroskopii elektronowej, a ich głównym wkładem w badania morfologiczne o wysokiej rozdzielczości jest unikalne odwzorowanie elementów struktury/funkcji błon komórkowych. Procesja zamrażalniczo-pękająca jest inicjowana przez zamrażanie komórek i tkanek z prędkością wystarczającą do ograniczenia krystalizacji lodu i/lub przy użyciu środków krioprotekcyjnych, takich jak glicerol. Próbki są następnie pękane w próżni, a replika jest generowana przez odparowanie węgla i platyny na pękniętej powierzchni. Oryginalna próbka jest trawiona z repliki, która jest pobierana na standardową siatkę próbek EM. Inną powszechną błędną interpretacją obrazów pęknięć zamrażalniczych jest to, że przedstawiają one powierzchnie komórek. Jednak podstawowym założeniem pęknięcia zamrażalniczego jest to, że błony biologiczne są rozszczepiane przez dwuwarstwę lipidową w procesie pękania (ryc. 3). Proces ten w błonach biologicznych daje dwie powierzchnie pęknięcia, jedną, która ujawnia organizację połowy błony przylegającej do cytoplazmy, powierzchni PF, a drugą, która ujawnia połowę dwucząsteczkowej płatki błony, która przylega do środowiska zewnątrzkomórkowego, powierzchni EF. Prawdziwe powierzchnie komórek nie są reprezentowane na obrazach pęknięć zamrażalniczych, ale pojawiają się tylko wtedy, gdy stosuje się kolejny dodany etap trawienia przez zamrażanie po procedurze złamania. Aby skutecznie wytrawić wcześniej pęknięte próbki w celu odsłonięcia szczegółów powierzchni, próbki muszą być zamrażane w szybkim tempie i bez niedelektowującego się krioprotektantu. Wytrawianie wody z powierzchni pękniętej próbki, odsłaniając podstawowe cechy, odbywa się poprzez umieszczenie chłodzącego ramienia mikrotomu nad stolikiem próbki, tworząc różnicę temperatur między stolikiem trzymającym próbkę a chłodzącym ramieniem mikrotomu, co powoduje sublimację wody z powierzchni. Kiedy woda jest sublimowana z powierzchni pękniętej próbki podczas manewru zamrażania-trawienia, wówczas aspekty rzeczywistych powierzchni komórek, macierzy zewnątrzkomórkowej, struktur cytoszkieletu i zespołów molekularnych mogą zostać ujawnione w wysokiej rozdzielczości. W związku z tym wymarzanie-pękanie i wytrawianie przez wymarzanie nie są terminami zamiennymi, ale raczej odzwierciedlają proces etapowy, z których ten ostatni może nie być konieczny lub pożądany w zależności od potrzeb konkretnego badania.
Zgodnie z procedurami zamrażania-łamania/zamrażania-wytrawiania, pęknięte powierzchnie są poddawane skierowanym warstwom parowania z węgla i platyny, aby zapewnić wsparcie i kontrast obrazowy dla repliki. Parowanie obrazowania platyny/węgla może być jednokierunkowe lub obrotowe i odbywa się za pomocą pistoletów oporowych lub elektronowych. Jednokierunkowe cieniowanie pod znanym kątem, zwykle 30º - 45º, jest przydatne przy wykonywaniu niektórych obliczeń morfometrycznych. Próbki, które zostały poddane głębokiemu trawieniu, są zazwyczaj cieniowane rotacyjnie, a wynikowe obrazy tych próbek są fotograficznie odwracane w celu oceny.
Historycznym jak również obecnym celem techniki zamrażania-łamania/zamrażania-wytrawiania jest ograniczenie chemicznego utrwalania i przetwarzania artefaktów próbek, które są związane z bardziej konwencjonalnymi procedurami transmisyjnej mikroskopii elektronowej. Technika ta ma jednak istotną zaletę w postaci zdolności do nadawania trójwymiarowych szczegółów, a tym samym ułatwia pozyskiwanie danych morfometrycznych w próbkach biologicznych, materiałoznawczych i nanotechnologicznych. Procedury zamrażania i wytrawiania przez zamrażanie są złożone i wieloaspektowe, a niektóre aspekty ich stosowania są dostosowywane do potrzeb klienta. Prezentacja ta oferuje przeglądowy przegląd głównych cech procesu, a czytelnik jest odsyłany do obszernych opublikowanych protokołów 10,11 w celu omówienia szczegółów i dostosowania procesu do konkretnych potrzeb badawczych.

<table><tbody><tr><td>Balzers Instalacje do zamrażania, szczelinowania/trawienia i zamrażania</td><td>Balzers</td><td>BAF400T</td><td></td></tr><tr><td>standardowe</td><td>różni dostawcy</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Standardowe utrwalacze aldehydu</td><td>różni dostawcy</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Dwuchromian sodu</td><td>różni dostawcy</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Kwas siarkowy</td><td>różni dostawcy</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Artykuły jednorazowego użytku do odparowywania platyny/węgla</td><td>Technotrade International</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Ciekły azot</td><td>różni dostawcy</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Propan</td><td>różni dostawcy</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Materiały jednorazowego użytku do mikroskopii elektronowej</td><td>Mikroskopia elektronowa Nauki</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Nauka Transmisyjny mikroskop</td><td>elektronowy Carl Zeiss Inc.</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

podstawowe elementy techniczne zamrażania-pękania/wytrawiania przez zamrożenie w biologicznej mikroskopii elektronowej

Fundamental Technical Elements of Freeze-fracture/Freeze-etch in Biological Electron Microscopy

Freeze-fracture/freeze-etch opisuje proces, w którym próbki, zazwyczaj biologiczne lub nanomateriałowe w naturze, są zamrażane, pękane i replikowane w celu wytworzenia "odlewu" węglowego/platynowego przeznaczonego do badania za pomocą transmisyjnej mikroskopii elektronowej. Próbki są poddawane ultraszybkiemu zamrażaniu, często w obecności środków krioprotekcyjnych w celu ograniczenia tworzenia się kryształków lodu, a następnie pękaniu próbki w temperaturach chłodzonych ciekłym azotem w wysokiej próżni. Powstała w ten sposób pęknięta powierzchnia jest replikowana i stabilizowana przez odparowanie węgla i platyny pod kątem, który nadaje odlewu trójwymiarowe szczegóły powierzchni. Technika ta okazała się szczególnie pouczająca dla badań nad błonami komórkowymi i ich specjalizacjami oraz w znacznym stopniu przyczyniła się do zrozumienia formy komórkowej do powiązanej funkcji komórki. W niniejszym raporcie dokonujemy przeglądu wymagań dotyczących przyrządów i protokołu technicznego do wykonywania szczelinowania zamrażalniczego, związanej z tym nomenklatury i charakterystyki płaszczyzn pękania, wariacji na temat konwencjonalnej procedury oraz kryteriów interpretacji obrazów pęknięć zamrażalniczych. Technika ta jest szeroko stosowana do badań ultrastrukturalnych w wielu obszarach biologii komórki i jest obiecująca jako nowa technika obrazowania w badaniach molekularnych, nanotechnologicznych i materiałoznawczych.

Kluczowym założeniem interpretacji obrazów mroźnego trawienia jest to, że płaszczyzny pęknięcia przechodzą przez lipidową dwuwarstwę błon, tworząc dwie powierzchnie pęknięcia, nazywane umownie powierzchnią PF (plasma fracture-face) i powierzchnią EF (extracellular fracture-face) (Rysunek 3). Powierzchnia PF to ta połowa lipidowej dwuwarstwy błony, która przylega do cytoplazmy komórki, natomiast powierzchnia EF to połowa lipidowej dwuwarstwy błony przylegająca do środowiska pozakomórkowego. Technika mroźn...

Opisano podstawowe techniki i udoskonalenia przetwarzania próbek biologicznych i nanomateriałów do badania metodą zamrażania i pękania za pomocą transmisyjnej mikroskopii elektronowej. Technika ta jest preferowaną metodą ujawniania cech ultrastrukturalnych i specjalizacji błon biologicznych oraz uzyskiwania danych wymiarowych i przestrzennych na poziomie ultrastrukturalnym w materiałoznawstwie i produktach nanotechnologii.

Podstawowe elementy techniczne zamrażania-pękania/wytrawiania przez zamrożenie w biologicznej mikroskopii elektronowej

Freeze-fracture/freeze-etch describes a process whereby specimens, typically biological or nanomaterial in nature, are frozen, fractured, and replicated ...

Celem następującego eksperymentu jest wykonanie repliki preparatu biologicznego lub innego materiału z platyny i węgla w celu badania za pomocą transmisyjnej mikroskopii elektronowej. Aby to osiągnąć, preparaty przygotowane jako repliki pojedyncze i podwójne poddaje się ultraszybkiemu zamrażaniu, aby ograniczyć tworzenie się kryształków lodu. Następnie zamrożony preparat jest rozłupywany za pomocą zdalnego manipulatora w temperaturach ciekłego azotu w wysokiej próżni, co powoduje pęknięcie błony w obrębie dwuwarstwy lipidowej, tworząc powierzchnię zewnętrzną oraz powierzchnię proksymalną względem strony cytoplazmatycznej.Jako opcjonalny dodatkowy krok. Cechy struktury podłoża mogą zostać ujawnione poprzez trawienie wody z powierzchni złamanego preparatu poprzez ustawienie ramienia mikrotomu chłodzącego nad stołem z preparatem w celu wytworzenia różnicy temperatur, co powoduje sublimację wody z powierzchni. Następnie, poprzez naparowanie węgla i platyny na powierzchnię złamania, tworzona jest replika.Oryginalna próbka zostaje strawiona z repliki, która jest przenoszona na siatkę do transmisyjnej mikroskopii elektronowej. Ostatecznie metoda mrożenia z frakturowaniem i trawieniem (fre

fundamental-technical-elements-freeze-fracturefreeze-etch-biological

Research

JoVE Journal

Biology

Biologia

Podstawowe elementy techniczne zamrażania/zamrażania fraktury w biologicznej mikroskopii elektronowo-skaningowej

Źródło: Schönherr, S., et. al. Połączono znakowanie immunologiczne replik optogenetycznych i zamrażalniczo-łamliwych w celu zbadania specyficznego dla danych wejściowych rozmieszczenia receptorów glutaminianu w ciele migdałowatym myszy. J. Vis. Exp. (2016)Ten film demonstruje znakowanie immunologiczne pękniętych przez zamrożenie replik tkanki mózgowej myszy do mikroskopii elektronowej. Pęknięte i pokryte repliki są trawione w celu odsłonięcia receptorów. Przeciwciała pierwszorzędowe i...

Znakowanie immunologiczne białek błony neuronalnej w pękniętej przez lód próbce tkanki mózgowej myszy

Aby zachować procesy neuronalne do analizy ultrastrukturalnej, opisujemy protokół posiewu pierwotnych neuronów na siatkach mikroskopii elektronowej, po którym następuje błyskawiczne zamrażanie, co daje próbki zawieszone w warstwie lodu szklistego. Próbki te można badać za pomocą mikroskopu krioelektronowego w celu wizualizacji struktur w skali nanometrowej.

Przygotowanie neuronów pierwotnych do wizualizacji neurytów w stanie zamrożono-uwodnionym za pomocą tomografii krioelektronowej

Przedstawiamy protokół zbierania i przetwarzania krio-tomogramów elektronowych całych mitochondriów. Technika ta zapewnia szczegółowy wgląd w strukturę, funkcję i organizację dużych kompleksów białek błonowych w natywnych błonach biologicznych.

Wizualizacja dimerów syntazy ATP w mitochondriach za pomocą kriotomografii elektronowej

Kriomikroskopy elektronowe, zarówno skaningowe (SEM), jak i transmisyjne (TEM), są szeroko stosowane do charakteryzowania próbek biologicznych lub innych materiałów o wysokiej zawartości wody1. SEM/Focused Ion Beam (FIB) służy do identyfikacji interesujących cech próbek i ekstrakcji cienkiej, przezroczystej dla elektronów blaszki w celu przeniesienia do krio-TEM.

Przygotowanie próbki do mikroskopii krioelektronowej za pomocą skupionej wiązki jonów

Ten manuskrypt opisuje łatwą w użyciu i tanią metodę kriofiksacji do wizualizacji komórek zawiesinowych za pomocą transmisyjnej mikroskopii elektronowej.

Zamrażanie wgłębne: narzędzie do badań ultrastrukturalnych i immunolokalizacyjnych komórek zawiesinowych w transmisyjnej mikroskopii elektronowej

Opracowaliśmy nowatorską technikę w mikroskopii elektronowej, "flash-and-freeze", która umożliwia wizualizację dynamiki membrany z rozdzielczością czasową ms. Technika ta łączy optogenetyczną stymulację neuronów z zamrażaniem pod wysokim ciśnieniem. W tym miejscu demonstrujemy procedury i szczegółowo opisujemy protokoły.

Flash-and-Freeze: nowatorska technika uchwycenia dynamiki membrany za pomocą mikroskopii elektronowej

Tutaj prezentujemy protokół łączenia dwóch technik przetwarzania próbek, zamrażania wysokociśnieniowego i przetwarzania próbek wspomaganego mikrofalami, a następnie minimalnego zatapiania żywicy w celu pozyskiwania danych za pomocą skaningowego mikroskopu elektronowego z skupioną wiązką jonów (FIB-SEM). Wykazano to przy użyciu próbki nerwu piszczelowego myszy i Caenorhabditis elegans.

Przygotowanie próbki biologicznej poprzez zamrażanie pod wysokim ciśnieniem, wspomagane mikrofalami wzmocnienie kontrastu i minimalne zatapianie żywicy w celu obrazowania objętościowego

Używanie mielenia skupionej wiązki jonów do produkcji szklistych blaszek na siatce z zamrożonych próbek biologicznych do krioelektronowej tomografii.

Przygotowanie blaszek z szklistych próbek biologicznych przy użyciu dwuwiązkowego skaningowego mikroskopu elektronowego do kriotomografii elektronowej

Tutaj pokazujemy, jak używać urządzenia do zamrażania kanapek do szybkiego zamrażania próbek biologicznych, w tym bakterii, drożdży, hodowanych komórek, izolowanych komórek, tkanek zwierzęcych i ludzkich oraz wirusów. Pokazujemy również, jak przygotować próbki do ultracienkiego cięcia po szybkim zamrożeniu.

Szybkie zamrażanie za pomocą urządzenia do zamrażania kanapkowego w celu dobrego ultrastrukturalnego zachowania próbek biologicznych w mikroskopii elektronowej

Ten manuskrypt przedstawia metodę ręcznego zamrażania próbek biologicznych do kriogenicznej mikroskopii elektronowej z pojedynczymi cząstkami.

Ręczne zamrażanie próbek biologicznych metodą blot and plunge do kriogenicznej mikroskopii elektronowej pojedynczych cząstek

Przedstawiamy protokół izolacji i zamrażania pęcherzyków zewnątrzkomórkowych (EV) pochodzących z nowotworowych komórek urotelialnych. Technika zamrażania i pękania ujawniła średnicę i kształt pojazdów elektrycznych oraz – jako unikalną cechę – wewnętrzną organizację membran pojazdów elektrycznych. Mają one ogromne znaczenie dla zrozumienia, w jaki sposób pojazdy elektryczne oddziałują z błonami biorczymi.

Mikroskopia elektronowa zamrażalno-pękająca do analizy pęcherzyków zewnątrzkomórkowych

Poznaj technikę zamrażania-pękania i wytrawiania przez zamrożenie w mikroskopii elektronowej. Metoda ta umożliwia tworzenie replik węglowo-platynowych biologicznych próbek i nanomateriałów.

Podstawowe elementy techniczne zamrażania-pękania/wytrawiania przez zamrożenie w biologicznej mikroskopii elektronowej

Przeglądaj więcej filmów