Podstawowe elementy techniczne zamrażania-pękania/wytrawiania przez zamrożenie w biologicznej mikroskopii elektronowej

Celem następującego eksperymentu jest wykonanie repliki preparatu biologicznego lub innego materiału z platyny i węgla w celu badania za pomocą transmisyjnej mikroskopii elektronowej. Aby to osiągnąć, preparaty przygotowane jako repliki pojedyncze i podwójne poddaje się ultraszybkiemu zamrażaniu, aby ograniczyć tworzenie się kryształków lodu. Następnie zamrożony preparat jest rozłupywany za pomocą zdalnego manipulatora w temperaturach ciekłego azotu w wysokiej próżni, co powoduje pęknięcie błony w obrębie dwuwarstwy lipidowej, tworząc powierzchnię zewnętrzną oraz powierzchnię proksymalną względem strony cytoplazmatycznej.

Jako opcjonalny dodatkowy krok. Cechy struktury podłoża mogą zostać ujawnione poprzez trawienie wody z powierzchni złamanego preparatu poprzez ustawienie ramienia mikrotomu chłodzącego nad stołem z preparatem w celu wytworzenia różnicy temperatur, co powoduje sublimację wody z powierzchni. Następnie, poprzez naparowanie węgla i platyny na powierzchnię złamania, tworzona jest replika.

Oryginalna próbka zostaje strawiona z repliki, która jest przenoszona na siatkę do transmisyjnej mikroskopii elektronowej. Ostatecznie metoda mrożenia z frakturowaniem i trawieniem (freeze fracture freeze etch) jest wykorzystywana do obrazowania trójwymiarowych szczegółów strukturalnych błon komórkowych, układów molekularnych oraz nanomateriałów podczas badania za pomocą transmisyjnego mikroskopu elektronowego. Główną zaletą tej techniki nad istniejącymi metodami, takimi jak badanie ultracienkich przekrojów, jest możliwość obserwacji interesujących obiektów w trzech wymiarach z rozdzielczością mikroskopii elektronowej.

Ta metoda może pomóc w odpowiedzi na kluczowe pytania z dziedziny biologii komórkowej, molekularnej oraz nanotechnologii, takie jak charakterystyka wymiarowa i strukturalna błon komórkowych oraz organizacja macierzy molekularnych i nanomateriałowych. Pierwszy pomysł na tę metodę pojawił się, gdy zauważyłem, że podobne badania przeprowadzono na eukariotycznych protistach, przynosząc istotne odkrycia, jednak poświęcono ograniczoną uwagę odpowiednim zagadnieniom w kontekście zdrowia ludzi. Rozpocznij tę procedurę od przygotowania preparatów biologicznych do mrożenia i fraktury (freeze fracture freeze edge), zgodnie z opisem w protokole tekstowym.

Za pomocą pęsety precyzyjnej i/lub igieł strzykawkowych o małej średnicy wybierz złote lub miedziane podstawki do próbek o rozmiarze i kształcie odpowiednim dla przetwarzanej próbki. Umieść małe fragmenty próbki na górnej powierzchni metalowej podstawki. W przypadku pojedynczych replik ogranicz zawartość cieczy w próbce do lepistej, lekko kleistej konsystencji, odsączając ciecz z krawędzi podstawki za pomocą papieru filtracyjnego.

Użyj igieł strzykawkowych o małej średnicy, aby utworzyć kopiec tkanki na kikutu dla replik podwójnych. Odwróć drugi kikut, ustaw go dokładnie nad pierwszym i delikatnie przyłóż do powierzchni preparatu, tworząc tak zwaną „kanapkę”.

Nie należy wyciskać próbki z przestrzeni między dwoma trzpieniami. Następnie należy napełnić dwa izolowane naczynia duo ciekłym azotem. Pierwsze naczynie mieści metalowy słupek z małym wgłębieniem, który służy do skraplania niewielkiej objętości gazowego propanu z dostępnego w sprzedaży cylindra.

Drugie naczynie to pojemnik przechowawczy z przegrodą, służący do krótkotrwałego utrzymywania zamrożonych próbek w ciekłym azocie. Propanu należy używać wyłącznie pod wyciągiem chemicznym certyfikowanym do takiego zastosowania. Należy zadbać o uniknięcie zewnętrznych źródeł zapłonu, stosować odzież ochronną przed niskimi temperaturami oraz zapewnić odpowiednią wentylację, ponieważ propan jest substancją wybuchową.

Kontakt może spowodować odmrożenia; substancja jest dusząca. Używając dyszy butli umieszczonej w studni z propanem, szeroko otwórz zawór butli i pozwól gazowi wpłynąć do studni pierwszego naczynia, gdzie jak najszybciej ulegnie on upłynnieniu. Chwyć uchwyt z preparatem za pomocą pincety precyzyjnej i zanurz go na kilka sekund w upłynnionym gazie w pierwszym naczyniu.

Następnie szybko przenieś próbki do drugiego naczynia z ciekłym azotem. Po zamrożeniu próbek przechowuj je w ciekłym azocie do momentu przeniesienia do urządzenia do mroźnego łamania. Umieść złote podstawki z próbkami w uchwycie do próbek typu książeczkowego z podwójną repliką lub w zacisku w ciekłym azocie i utrzymuj w tym stanie do czasu umieszczenia w komorze z próbkami.

Gdy w komorze zostanie osiągnięta wysoka próżnia, a stolik zostanie schłodzony do temperatury ciekłego azotu, należy wyłączyć pompę, otworzyć komorę i jak najszybciej umieścić zamontowane obsadki z próbkami na stoliku do próbek. Następnie należy włączyć pompę, ponownie wytworzyć wysoką próżnię i za pomocą elektronicznych sterowników temperatury stolika i ramienia ustawić temperaturę stolika do próbek na -100 °C. Należy również skierować ciekły azot na ramię mikrotomu, aby schłodzić je do temperatury ciekłego azotu.

Po osiągnięciu wysokiej próżni, temperaturze stołu wynoszącej -100°C oraz temperaturze ramienia mikrotomu odpowiadającej temperaturze ciekłego azotu, zdalnie otwórz podwójny uchwyt do replik próbek, powodując tym samym złamanie próbek na podstawkach. Jako opcjonalny dodatkowy krok, próbki mogą zostać poddane trawieniu w celu ujawnienia struktur pod powierzchnią po złamaniu. Aby przeprowadzić trawienie, użyj żyletki zamocowanej w uchwycie na ramieniu mikrotomu, aby zeskrobać powierzchnię próbek. Ustaw chłodne ramię mikrotomu nad złamanymi powierzchniami na od jednej do kilku minut, aby przeprowadzić sublimację wody w celu odsłonięcia rzeczywistych powierzchni komórkowych, macierzy pozakomórkowej i/lub kompleksów molekularnych.

Następnie należy uruchomić armatkę elektronową lub oporową do naparowania platyny i węgla, aby nanieść cienką warstwę platyny i węgla na przełamaną powierzchnię pod kątem od 30 do 45 stopni. Zazwyczaj wymaga to około 15 do 20 sekund; w ten sam sposób należy uruchomić armatkę elektronową lub oporową do węgla i naparować cienką warstwę węgla na powierzchnię przełamanego preparatu bezpośrednio z góry, pod kątem 90 stopni, aby zapewnić wsparcie dla repliki. Po zakończeniu replikacji, cieniowania i stabilizacji węgla proces ten również zazwyczaj zajmuje około 15 do 20 sekund.

Wyłączyć pompę próżniową oraz komorę, a następnie wyjąć uchwyt preparatu z instrumentu. Używając pęsety precyzyjnej, wyjąć każdy złoty stożek z preparatem z zacisku do podwójnych replik i pozostawić do rozmrożenia przez kilka sekund, po czym delikatnie opuścić stożek na powierzchnię wody w płytce do testów. Manipulować replikami, używając cienkiej pętli drucianej lub konwencjonalnej miedzianej siatki do mikroskopu elektronowego trzymanej pęsetą precyzyjną, a następnie przenieść je do drugiej płytki do testów zawierającej 5% dichromian sodu w 50% kwasie siarkowym na okres od jednej do kilku godzin. Kąpiel ta trawi materiał biologiczny preparatu z repliki.

Po zakończeniu trawienia przenieś replikę z powrotem na czystą powierzchnię wody, a następnie pobierz ją na standardową miedzianą siatkę do mikroskopii elektronowej. Przechowuj siatki z replikami w ogólnodostępnych pudełkach do siatek, w których pozostaną one stabilne przez lata. Po ostrożnym obchodzeniu się lub podczas badania ultrastruktury mrożonych złomów i replik trawionych, oglądaj repliki w transmisyjnym mikroskopie elektronowym przy napięciu przyspieszającym, zazwyczaj od 50 do 80 kilowoltów.

Należy zarejestrować odpowiednie obrazy na standardowej kliszce TEM lub za pomocą cyfrowej kamery o wysokiej rozdzielczości znajdującej się w błonie komórkowej u podstawy każdego organizmu eukariotycznego. Rzęska i wici stanowią układ cząsteczek związanych z błoną, zorganizowanych w pasma ENC okalające trzastek rzęski, znane jako naszyjnik rzęskowy. Specjalistyczne układy cząsteczek błonowych pojawiają się na brzegu luminalnym komórek nabłonkowych w trakcie kiliogenezy.

Te macierze cząsteczek reprezentują pierwotne naszyjniki rzęsek, które znajdują się u podstawy powstających i dojrzałych rzęsek. Różne badania mrożenia i łamania tkanek nabłonkowych ujawniają złożoną organizację anastomozyjących struktur pasm i rowków otaczających wierzchołkowy aspekt granic przeciwbocznych. Przełom przez błony komórkowe nabłonka ukazuje powierzchnie przełomu plazmatycznego dla połączeń ścisłych, które występują w formie pasm, podczas gdy pozakomórkowe powierzchnie przełomu wykazują komplementarne rowki.

Złącza szczelinowe pojawiają się w preparatach mrożenia z frakturacją w różnych tkankach i są reprezentowane przez gęste układy cząsteczek na powierzchniach fraktury plazmatycznej oraz odpowiadające im wgłębienia na powierzchni fraktury zewnątrzkomórkowej. Przedstawione tutaj obrazy stanowią przykład szybkiego mrożenia z głębokim trawieniem i cieniowaniem obrotowym. Komórka nabłonkowa została rozłamana przez cytoplazmę, a powierzchnia fraktury plazmatycznej jest widoczna za grotami strzałek.

Prawdziwa powierzchnia komórki ujawniona po następnym trawieniu. Po opanowaniu tej techniki można ją wykonywać w cyklach trwających około trzech godzin, co przy prawidłowym przeprowadzeniu pozwala uzyskać od jednego do trzech preparatów. Podczas realizacji tej procedury należy pamiętać, że poszczególne etapy są ze sobą ściśle powiązane, a błąd na jednym z nich może sprawić, że wynik po wywołaniu będzie nieprzydatny do badania i oceny.

Technika ta utorowała drogę badaczom z dziedziny biologii komórkowej i molekularnej do zgłębiania tego, w jaki sposób mutacje genetyczne powodują anomalie strukturalne w komórkach, prowadząc do stanów patologicznych i chorób.