Opracowanie urządzenia dielektroforetycznego do elektrod grafenowych 3D

Niniejszy protokół przedstawia procedury wytwarzania trójwymiarowego laminowanego papieru grafenowego oraz mikro urządzenia elektrodowego, a także metody eksperymentalne służące do manipulowania koralikami polistyrenowymi lub komórkami biologicznymi za pomocą elektroforezy DI lub DEP wewnątrz urządzenia. Od tego momentu będziemy określać dielektroforezę jako DEP. Wytwarzanie urządzeń odbywa się poprzez naprzemienne układanie warstw papieru grafenowego o grubości 50 µm oraz N minus jednej warstwy polimerowej taśmy czułej na nacisk o grubości 100 µm, co pozwala uzyskać elektrody sygnałowe i masowe w proporcji pół na pół.

Warstwy są prasowane, przycinane, a następnie przez całą strukturę wiercona jest mikrootwór. Na koniec, za pomocą srebrnego epoksydu, do dwóch końców urządzenia przymocowuje się dwa miedziane wyprowadzenia. Drugim krokiem jest przygotowanie pożywki do DEP o pożądanej przewodności.

Kuleczki polistirenowe są następnie zawieszane w tym roztworze medium przy określonym stosunku objętości. Trzecim i ostatnim krokiem jest załadowanie przygotowanej zawiesiny kuleczek do urządzenia, zamocowanie go na stoliku mikroskopu, podłączenie urządzenia do generatora funkcji i ostatecznie zainicjowanie DEP. Na koniec należy użyć mikroskopu do zarejestrowania odpowiedzi DEP oraz zbadania właściwości komórek lub cząsteczek poprzez dalszą analizę.

Grafen jest wszechstronnym materiałem wykorzystywanym ze względu na swoją wytrzymałość oraz właściwości termiczne i elektryczne. Niniejszy protokół wykorzystuje niedrogi papier grafenowy jako przewodzącą warstwę elektrody w trójwymiarowym mikro urządzeniu dielektroforetycznym, które jest w stanie rozróżniać cząsteczki i komórki w zastosowaniach takich jak określanie grupy krwi czy diagnostyka medyczna komórek chorobowych. Do zalet tego mikro urządzenia z elektrodą z papieru grafenowego należą łatwiejszy proces wytwarzania, wyższa przepustowość próbek oraz wszechstronność geometryczna.

Trójwymiarowe niejednorodne pole elektrokinetyczne umożliwia manipulowanie dużymi objętościami próbek za pomocą sił dielektroforetycznych (DP), które wyróżniają się zdolnością do rozróżniania polaryzowalnych cząstek i komórek na podstawie ich wewnętrznych właściwości chemicznych i morfologicznych. Zmontuj laminowane urządzenie, używając papieru grafenowego oraz taśmy. W tym przypadku zastosowano hydrofobowy papier grafenowy o grubości 75 µm od komercyjnego producenta oraz dwustronną taśmę wrażliwą na nacisk o grubości 100 µm.

Najpierw należy wyciąć z papieru grafenowego za pomocą skalpela i linijki prostokąty o wymiarach 6,7 cm na 1,5 cm, a następnie za pomocą nożyczek pociąć dwustronną taśmę wrażliwą na nacisk na pięć pasków o wymiarach 1,3 cm na około 5 cm. Połóż pierwszą warstwę papieru grafenowego na czystym szkiełku przedmiotowym. Powoli przykryj jeden koniec papieru grafenowego jednym paskiem taśmy, pozostawiając około 2 mm marginesu, aby zapewnić izolację między dwiema sąsiednimi warstwami papieru grafenowego.

Umieść drugą warstwę papieru grafenowego na górze taśmy. Przesuń ją względem pierwszej warstwy papieru grafenowego. Wywrzyj umiarkowany nacisk z góry, aby zapewnić dobre przyleganie między warstwami.

Powtórz powyższe dwa kroki dla pozostałych warstw, upewniając się, że zarówno warstwa górna, jak i dolna stanowią papier grafenowy. Użyj nożyczek, aby usunąć nadmiar taśmy z krawędzi urządzenia, pozostawiając niewielki margines około jednego milimetra, aby zapewnić szczelną izolację między warstwami papieru grafenowego. Przeprowadź szybki test izolacji za pomocą multimetru, umieszczając sondy dodatnią i ujemną na wyprowadzeniach elektrycznych po przeciwnych stronach urządzenia.

Wysoka rezystancja rzędu setek kiloomów wskazuje na dobrą izolację między warstwami. Laminowana struktura jest teraz gotowa do wiercenia mikrootworu. Używamy mikrofrezarki do wykonania mikrootworu w laminowanej strukturze.

W tym przypadku używamy freza mikro z średnicą 700 micron i długością ostrza bliską 2,1 millimeter. Wybór freza mikro zależy od średnicy mikro-otworu oraz grubości urządzenia. Unieruchom strukturę laminowaną na stole do mikro-wiercenia za pomocą zacisków, ustaw frez bezpośrednio nad strukturą za pomocą sterowania komputerowego, a następnie skieruj sprężone powietrze na urządzenie. Rozpocznij obrót freza, a następnie powoli opuść go do i przez środek struktury laminowanej.

Zatrzymaj się na głębokości nieco większej niż głębokość struktury laminowanej, aby zapewnić dokładne usunięcie pozostałości z nowego otworu. Poruszaj frezem w górę i w dół kilkakrotnie przez mikro otwór, aby wygładzić wewnętrzną ściankę.

Wewnętrzna powierzchnia mikrosodka powinna być jak najbardziej pionowa i czysta. Aby uzyskać optymalne gradienty pola elektrycznego i przepuszczalność światła przez mikrosodek, należy pociąć standardowe miedziane druty o rozmiarze 32 gauge na dwa odcinki o długości trzech centymetrów i zagiąć dwa kąty proste w odległości dwóch centymetrów. Ręcznie wymieszać około 0,75 mm srebrnej epoksydy przewodzącej składnika A oraz około 0,75 mm składnika B.

W niewielkim pojemniku przytwierdź przewody, ostrożnie nakładając epoksyd srebrowy na końcówki oraz pomiędzy wszystkie trzy warstwy papieru grafenowego, aby zapewnić dobry kontakt między warstwami. Następnie umieść jednocentymetrowy odcinek przewodu pomiędzy dowolnymi dwiema warstwami i lekko je ściśnij, aby usunąć nadmiar epoksydu i zapewnić dobry kontakt elektryczny. Powtórz czynność po drugiej stronie laminowanej struktury.

Umieść całe urządzenie na stojaku i wstaw do suszarki w celu wysuszenia przez noc w temperaturze 70 °C i pod ciśnieniem jednego atmosfery. Wyjmij urządzenie z suszarki i sprawdź izolację elektryczną pomiędzy przewodami elektrod. Następnie przygotowujemy roztwory o różnym zakresie przewodności, mieszając w różnych proporcjach gotowy roztwór mannitolu o stężeniu 290 mOsm/L oraz PBS.

Są to proste roztwory dobrane w celu przybliżonego naśladowania buforu do hodowli komórkowych. Istnieje liniowa korelacja między stosunkiem objętości tych dwóch roztworów a przewodnością wynikowego roztworu. W celu przygotowania mediów o określonej przewodności, należy zmieszać kuleczki Polystar lub komórki biologiczne z roztworem mediów w stosunku objętościowym od 1:100, pipetując 10 µL kuleczek Polystar oraz 1 mL roztworu mediów do fiolki z próbką.

Dokładnie wymieszaj próbkę za pomocą vortexera. Przymocuj urządzenie do szkiełka przedmiotowego z umiarkowanym naciskiem, używając zmodyfikowanych klamer papierowych lub odpowiednika. Podstawa powinna znajdować się wystarczająco blisko mikrootworu, aby uszczelnić laminowaną strukturę ze szkiełkiem przedmiotowym, zapobiegając wyciekowi próbki.

Należy kontrolować siłę docisku zacisku, aby nie odkształcić urządzenia, co mogłoby negatywnie wpłynąć na geometrię studni i drogę światła. Przeciąć szkiełko przedmiotowe o grubości 0,5 mm za pomocą diamentowego przecinaka do szkła, dobierając szerokość tak, aby ledwo przykrywało mikrostudnię. Przyciąć szkiełko do odpowiedniego rozmiaru i odłożyć na bok. Używając mikroszydrzyki, powoli wstrzyknąć około 1 µL zawiesiny kulek polistyrenowych do mikrostudni. Aby uniknąć wprowadzenia pęcherzyków powietrza, powtórzyć wstrzykiwanie w przypadku ich pojawienia się, dbając o to, by nie uszkodzić ostrym igłami ścianek mikrostudni. Napełnić mikrostudnię z niewielkim nadmiarem i natychmiast nasunąć przygotowane szkiełko przykrywowe na mikrostudnię, aby usunąć nadmiar cieczy, zapobiec odparowaniu i zapewnić powtarzalność objętości.

Dla każdego eksperymentu przymocuj kompletne laminowane urządzenie mikroprzepływowe do stolika mikroskopu i podłącz generator funkcji. Za pomocą klipsów krokodylkowych połącz urządzenia z miedzianymi przewodami, a następnie za pomocą oprogramowania mikroskopu dostrój ostrość, aby wyraźnie widzieć mikrowsadkę. W centrum ekranu ustaw wartości od 100 Hz do 10 MHz oraz 15 V.

Do urządzenia przyłożono sygnał szczytowy. Kuleczki obserwowano w mikrododatku przy 10-krotnym powiększeniu, w odległości od 1 do 200 mikronów nad powierzchnią szkiełka przedmiotowego. Kliknij przycisk, aby rozpocząć nagrywanie i akwizycję obrazu z kamery.

Uruchom sygnał generatora funkcji dwie sekundy po rozpoczęciu nagrywania obrazu z kamery. Obrazy są zapisywane cyfrowo w częstotliwości od jednej do pięciu klatek na sekundę przez około pięć minut w celu późniejszej analizy intensywności. Po zakończeniu eksperymentu usuń urządzenie i zdemontuj zaciski.

Oczyść zarówno szkiełko przedmiotowe, jak i urządzenie w wodzie z mydłem. Następnie dokładnie wypłucz. W przypadku braku pola elektrycznego cząstki osiadają na dnie urządzenia wyłącznie pod wpływem grawitacji. W polu elektrycznym o częstotliwości około jednego kilohertza dodatnie zachowanie DEP objawia się ruchem w górę gradientu pola, w kierunku papieru grafenowego.

Elektrody na krawędziach mikrootworów obserwuje się przy polach elektrycznych powyżej 100 kHz oraz w zakresie megahertzowym. Odnotowano ujemną dielektroforezę (DEP), objawiającą się ruchem kulek w dół gradientu pola elektrycznego w kierunku centrum mikrootworu. To trójwymiarowe mikro urządzenie z elektrodą z papieru grafenowego dostarczyło wyników eksperymentalnych w bliskiej zgodności zarówno z teoretycznie przewidywanym zachowaniem, jak i z wcześniej raportowanymi wynikami eksperymentalnymi.

Wytwarzanie urządzeń jest niezwykle wszechstronne. Przedstawione protokoły można łatwo dostosować do urządzeń z większą liczbą warstw lub z zastosowaniem innych materiaów. Niniejszy film szczegółowo opisuje seryjną produkcję trójwymiarowego mikro urządzenia DEP.

Jednak w przyszłych zastosowaniach zawiesiny cząstek lub komórek mogłyby być stale przepływać przez mikrootwór urządzenia, aby uzyskać większą wydajność. Przykładem wszechstronności sortowania DEP jest fakt, że chłonący wodę papier grafenowy mógłby jednocześnie pełnić funkcję elektrody i filtra w koncentratorach cząstek lub komórek, a nawet służyć jako elektrokinetyczne czujniki biochemiczne. Po obejrzeniu tego filmu widzowie powinni posiadać dobrą wiedzę na temat tego, jak wykonać wielowarstwowy papier grafenowy oraz mikro urządzenie z elektrodą, a także jak obsługiwać to urządzenie w celu przeprowadzenia eksperymentów z cząstkami lub komórkami.