Pobieranie i ekstrakcja DNA śliny do sekwencjonowania nowej generacji

Ogólnym celem tej procedury jest ekstrakcja wysokiej jakości genomowego DNA z całej śliny. Osiąga się to poprzez pierwszą lizę komórek w celu uwolnienia DNA. Drugim etapem zabiegu jest usunięcie zanieczyszczeń RNA i białkowych.

Trzecim krokiem jest wytrącenie genomowego DNA i usunięcie wszelkich pozostałych zanieczyszczeń lub zanieczyszczeń. Ostatnim krokiem jest ponowne uwodnienie genomowego DNA do dalszych zastosowań, takich jak PCR i sekwencjonowanie. Ostatecznie spektrometria, fotometria i amplifikacja mogą wykazać, że zbiorowe genomowe DNA jest wysokiej jakości.

Główną zaletą tej techniki w porównaniu z zestawami zbiorczymi jest to, że koszty zostaną znacznie obniżone bez utraty plonów. Pół godziny przed pobraniem śliny badani powinni przepłukać usta wodą, a następnie powstrzymać się od jedzenia lub picia do czasu pobrania próbki. Aby pobrać próbkę, niech badany wypluje dokładnie 2,5 mililitra śliny do 15-mililitrowej probówki zawierającej 2,5 mililitra buforu stabilizującego DNA.

Nie dotykaj wnętrza tubki ani wnętrza nasadki. Podczas tego procesu zakryj probówkę i homogenizuj mieszaninę z inwersjami, które nie drżą. Następnie przechowuj próbkę w temperaturze pokojowej przez krótki czas lub w temperaturze czterech stopni Celsjusza przez okres do trzech miesięcy.

Przygotowania obejmują podgrzanie łaźni wodnej do 37 stopni Celsjusza i przygotowanie trzech 15-mililitrowych probówek. Zacznij od kilkukrotnego odwrócenia próbki, a następnie wiruj ją ze średnią prędkością przez 15 sekund. Przenieś 2,5 mililitra próbki do jednej z probówek.

Dodać pięć mililitrów roztworu do lizy komórek do podwielokrotności i wymieszać roztwór do lizy z próbką, odwracając probówkę 50 razy. Po wymieszaniu próbki pozostaw ją do inkubacji przez 30 minut. W temperaturze pokojowej po pół godzinie dodaj 40 mikrolitrów RNA A w stężeniu 100 miligramów na mililitr do roztworu lizatorów komórek.

Następnie szybko odwróć rurkę pięć razy. Pozwól reakcji RNA inkubować w temperaturze 37 stopni Celsjusza przez 15 minut. Następnie schłodzić probówkę na lodzie przez trzy minuty.

W tym momencie zwiększ temperaturę łaźni wodnej do 65 stopni Celsjusza. Następnie wyjmij rurkę z lodu. Dodaj 50 mikrolitrów proteinazy K i wymieszaj, pozwól reakcji inkubować w temperaturze pokojowej przez 30 minut lub 16 do 24 godzin w temperaturze czterech stopni Celsjusza.

Później dodaj 1,7 mililitra roztworu do wytrącania białek i wiruj rurkę przez 20 sekund z dużą prędkością. Następnie pozostaw próbkę do ostygnięcia na lodzie przez 10 minut. Po schłodzeniu odwirować próbkę przez 10 minut w temperaturze 3000 G i w temperaturze czterech stopni Celsjusza.

Jeśli osad nie jest szczelny, schłodzić próbkę jeszcze przez pięć minut i ponownie odwirować przez pięć minut. Powtarzaj ten proces, aż do uzyskania ściśniętego podniebienia. Zawsze utrzymuj próbkę w niskiej temperaturze.

Rozpocznij izolację DNA od przygotowania czystej 15-mililitrowej probówki z pięcioma mililitrami izopropanolu i ośmioma mikrolitrami roztworu glikogenu w stężeniu 20 miligramów na mililitr. Następnie wlać do tej probówki czynnik leżący z odwirowanej próbki. Wyrzucić osad, wymieszać próbkę 50 razy przez odwrócenie.

Następnie odwiruj próbkę w temperaturze 3000 G i w temperaturze czterech stopni Celsjusza przez 30 minut. Wlej supinat do innej czystej 15 mililitrowej rurki do granulki. Dodaj jeden mililitr 70% etanolu i kołysz ręcznie na boku przez 30 sekund.

Następnie odwirować roztwór etanolu przez minutę w temperaturze 2000 g i w temperaturze czterech lub 20 stopni Celsjusza. Wyrzuć sennet i powoli go odlewając, a następnie dodaj więcej etanolu do granulki. Rozbujaj oba ręcznie i powtórz wirowanie.

Następnie ponownie powoli odlej etanol. Podczas prania pellet może się poluzować. Jeśli się odczepi, upewnij się, że pozostaje w roztworze etanolu i nie przykleja się do boków ani pokrywy tubki.

Nie odwracaj rurki podczas tego prania. Po umyciu etanolem ustaw probówkę do wyschnięcia na powietrzu na 15 do 30 minut. Następnie ponownie uwodnić osad genomowego DNA, najpierw dodając 300 mikrolitrów tris EDTA.

Następnie wirować próbkę ze średnią prędkością przez pięć sekund i przenieść próbkę do łaźni wodnej o temperaturze 65 stopni Celsjusza na godzinę po podgrzaniu w kąpieli, pozostawić próbkę do inkubacji przez noc w temperaturze pokojowej następnego dnia DNA będzie gotowe do użycia elektroforeza żelowa śliny, próbki do ekstrakcji DNA wykazują odpowiednio. Pasma o wysokiej masie cząsteczkowej bez rozmazywania wskazującego na zdegradowane DNA. Etap usuwania RNA jest konieczny i bardzo skuteczny.

Po trawieniu RNA, stosunek 260 nanometrów do 280 nanometrów wynosi średnio 1,74. Co ważne, DNA nadaje się do sekwencjonowania wysokoprzepustowego. Zestaw do wzbogacania celu zastosowano do 24 próbek ukierunkowanych na 2,6 megazasad DNA, 12 próbek z kodami kreskowymi sekwencjonowano na linię.

Wszystkie 24 próbki miały wysokiej jakości dane NGS i można było zidentyfikować rzadkie polimorfizmy pojedynczego nukleotydu. Po obejrzeniu tego filmu powinieneś dobrze zrozumieć, jak wyodrębnić wysokiej jakości genomowe DNA z całej śliny.