Name: Pobieranie i ekstrakcja DNA śliny do sekwencjonowania nowej generacji (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-08-27T15:00:00.000+00:00
Duration: 6 min 58 s
Description: Poznaj metodę ekstrakcji wysokiej jakości DNA genomowego z całej śliny do zastosowań sekwencjonowania. Protokół obejmuje lizę komórek, usuwanie RNA i białek oraz oczyszczanie DNA.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Ta praca została sfinansowana przez National Institutes of Health R01 (wsparcie DC009453 dla CWB).

UWAGA: Przed oddaniem próbek śliny wszyscy uczestnicy wyrazili świadomą zgodę zgodnie z wytycznymi dotyczącymi leczenia ludzi w Nationwide Children's Hospital.
1. Pobieranie i przechowywanie śliny
<ol>
	<li>Przed pobraniem śliny upewnij się, że usta pacjenta są wolne od jedzenia lub innych obcych substancji, przepłukując usta wodą i unikając jedzenia lub picia przez 30 minut przed pobraniem próbki.</li>
	<li>Otwórz probówkę wirówkową o pojemności 15 ml z 2,5 ml buforu stabilizującego DNA2, upewniając się, że nie dotykasz wnętrza nasadki lub probówki, i poproś badanego, aby wypluł 2,5 ml śliny do roztworu buforowego. Uwaga: Pobranie więcej niż 2,5 ml śliny może prowadzić do degradacji próbki z powodu niewystarczającego stosunku próbki do buforu stabilizującego DNA. Zebranie zbyt małej ilości śliny zmniejszy oczekiwane plony z protokołu. Aby ocenić objętość zbierania, użyj ponumerowanych gradientów z boku tuby.</li>
	<li>Załóż nakrętkę i mieszaj przez odwrócenie, aż mieszanina się zhomogenizuje. Energiczne potrząsanie nie jest konieczne. Próbki należy przechowywać w temperaturze pokojowej w celu krótkotrwałego przechowywania lub w temperaturze 4 °C w przypadku długotrwałego przechowywania (>3 miesiące).</li>
</ol>
2. Wstępne przygotowania i liza komórek
<ol>
	<li>Przed rozpoczęciem ekstrakcji podgrzej łaźnię wodną do temperatury 37 °C i przygotuj wiadro na lód. Do każdej wyekstrahowanej próbki potrzebne będą trzy stożkowe probówki wirówkowe o pojemności 15 ml. Trzy probówki będą używane do przechowywania komórki i osadu białkowego, końcowego wyekstrahowanego gDNA oraz supernatantów izopropanolu i etanolu.</li>
	<li>Pobrać próbki z magazynu i kilkakrotnie odwrócić próbki, a następnie wirować ze średnią prędkością przez 15 sekund.</li>
	<li>Dozować 2,5 ml próbki do czystej probówki wirówkowej o pojemności 15 ml i dodać 5 ml roztworu do lizy komórek. Wymieszać próbkę 50 razy przez odwrócenie i inkubować w temperaturze pokojowej przez 30 minut.</li>
</ol>
3. Usuwanie RNA
<ol>
	<li>Dodać 40 μl roztworu RNazy A o stężeniu 100 mg/ml i inkubować w temperaturze 37 °C przez 15 minut.</li>
	<li>Wyjąć próbkę z łaźni wodnej o temperaturze 37 °C i schłodzić na lodzie przez 3 minuty.
	<ol>
		<li>Po inkubacji RNazy A zwiększyć temperaturę łaźni wodnej do 65 °C dla etapu rehydratacji DNA w protokole.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
4. Usuwanie białek i lipidów
<ol>
	<li>Dodać 50 μl roztworu proteinazy K o stężeniu 20 mg/ml, kilkakrotnie wymieszać przez inwersję i inkubować w temperaturze pokojowej przez co najmniej 30 minut. Uwaga: Jest to możliwy punkt wstrzymania protokołu. Po dodaniu roztworu proteinazy K próbka może być przechowywana w temperaturze 4 °C do czasu zakończenia ekstrakcji. Nie wykazano, aby przechowywanie w temperaturze 4 °C przez okres do 24 godzin miało znaczący wpływ na wydajność ekstrakcji lub jakość DNA. Długotrwałe przechowywanie na tym etapie nie zostało ocenione.</li>
	<li>Dodać 1,7 ml roztworu do wytrącania białek, energicznie wirować przez 20 sekund z dużą prędkością i umieścić na lodzie na 10 minut.</li>
	<li>Po schłodzeniu próbek na lodzie przez 10 minut, odwirować przez 10 minut w temperaturze 3 000 x g i temperaturze 4 °C. Wytrącone białka muszą uformować szczelną osadkę, aby kontynuować. Jeśli osad nie jest szczelny lub roztwór jest nadal mętny, próbki można schłodzić na lodzie jeszcze przez 5 minut i powtórzyć wirowanie. Próbki muszą być przechowywane na lodzie, aby zapewnić szczelne osady.</li>
</ol>
5. Izolacja i oczyszczanie gDNA
<ol>
	<li>Do czystej probówki wirówkowej o pojemności 15 ml odmierzyć pipetą 5 ml izopropanolu i 8 μl czystego roztworu glikogenu o stężeniu 20 mg/ml.</li>
	<li>Wlać supernatant zawierający gDNA z kroku 4.3 do probówki zawierającej roztwór izopropanolu i glikogenu, pozostawiając wytrącone osady białkowe. Po dodaniu supernatantu delikatnie wymieszać próbkę 50 razy przez odwrócenie i odwirować przez 30 minut w temperaturze 3 000 x g i w temperaturze 4 °C.</li>
	<li>Powoli wlewać supernatant do czystej probówki o pojemności 15 ml. Po usunięciu supernatantu dodać 1 ml 70% etanolu, aby umyć osad, kilkakrotnie powoli kołysząc i delikatnie przesuwając etanol po wytrąconym osadzie. Zatrzymać etanol w probówce.</li>
	<li>Po wstępnym przemyciu odwirować próbkę przez 1 minutę w temperaturze 2 000 x g i temperaturze 20 °C. Ten etap wirowania może być przeprowadzony w temperaturze 4 °C lub 20 °C. Nie wykazano znaczącego wpływu temperatury na tym etapie.</li>
	<li>Po wstępnym przepłukaniu i odwirowaniu osadu, powoli wylać płuczkę etanolem z probówki i wyrzucić, a następnie wykonać drugie płukanie, powtarzając kroki 5.3 i 5.4.</li>
	<li>Po usunięciu supernatantu z drugiego przemycia, pozostawić granulkę do wyschnięcia na powietrzu przez 15 minut.
	<ol>
		<li>Jeśli próbka nie wyschła całkowicie, suszyć na powietrzu przez kolejne 15 minut.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
6. Rehydratacja gDNA
<ol>
	<li>Po wyschnięciu próbki dodaj 300 μl Tris-EDTA, aby ponownie uwodnić wysuszone granulki gDNA.</li>
	<li>Wirować próbkę przez 5 sekund ze średnią prędkością i umieścić w gorącej łaźni wodnej o temperaturze 65 °C na 1 godzinę.</li>
	<li>Wyjąć próbki z łaźni wodnej i inkubować O/N w temperaturze RT. 
	UWAGA: Wszystkie użyte produkty i odczynniki są wymienione w Tabeli materiałów, a także w Tabeli 4.</li>
</ol>

<ol><li>Quinque, D., Kittler, R., Kayser, M., Stoneking, M., Nasidze, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Evaluation+of+saliva+as+a+source+of+human+DNA+for+population+and+association+studies%5BTitle%5D)+AND+%22Analytical+Biochemistry%22%5BJournal%5D)">Evaluation of saliva as a source of human DNA for population and association studies.</a> Analytical Biochemistry. 353, 272-277 (2006).</li>
<li>Min, J. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High+mircosatellite+and+SNP+genotyping+success+rates+established+in+a+large+number+of+genomic+DNA+samples+extracted+from+mouth+swabs+and+genotypes%5BTitle%5D)+AND+%22Twin+Research+and+Human+Genetics%22%5BJournal%5D)">High mircosatellite and SNP genotyping success rates established in a large number of genomic DNA samples extracted from mouth swabs and genotypes.</a> Twin Research and Human Genetics. 9, 501-506 (2006).</li>
<li>Dlugos, D. J., Scattergood, T. M., Ferraro, T. N., Berrettinni, W. H., Buono, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Recruitment+rates+and+fear+of+phlebotomy+in+pediatric+patients+in+a+genetic+study+of+epilepsy%5BTitle%5D)+AND+%22Epilepsy+%26+Behavior%22%5BJournal%5D)">Recruitment rates and fear of phlebotomy in pediatric patients in a genetic study of epilepsy.</a> Epilepsy & Behavior. 6, 444-446 (2005).</li>
<li>Etter, J. F., Neidhart, E., Bertand, S., Malafosse, A., Bertrand, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Collecting+saliva+by+mail+for+genetic+and+cotinine+analyses+in+participants+recruited+through+the+internet%5BTitle%5D)+AND+%22European+Journal+of+Epidemiology%22%5BJournal%5D)">Collecting saliva by mail for genetic and cotinine analyses in participants recruited through the internet.</a> European Journal of Epidemiology. 20, 833-838 (2005).</li>
<li>Hansen, T. V., Simonsen, M. K., Nielsen, F. C., Hundrup, Y. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Collection+of+blood%2C+saliva%2C+and+buccal+cell+samples+in+a+pilot+study+on+the+danish+nurse+cohort%3A+Comparison+of+the+response+rate+and+quality+of+genomic+DNA%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Epidemiol+Biomarkers+Prev%22%5BJournal%5D)">Collection of blood, saliva, and buccal cell samples in a pilot study on the danish nurse cohort: Comparison of the response rate and quality of genomic DNA.</a> Cancer Epidemiol Biomarkers Prev. 16, 2072-2076 (2007).</li>
<li>Van Schie, R. C. A. A., Wilson, M. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Saliva%3A+A+convenient+source+of+DNA+for+analysis+of+bi-allelic+polymorphisms+of+fc%CE%B3+receptor+iia+%28cd32%29+and+fc%CE%B3+receptor+iiib+%28cd16%29%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Immunological+Methods%22%5BJournal%5D)">Saliva: A convenient source of DNA for analysis of bi-allelic polymorphisms of fcγ receptor iia (cd32) and fcγ receptor iiib (cd16).</a> Journal of Immunological Methods. 208, 91-101 (1997).</li>
<li>Dawes, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Estimates%2C+from+salivary+analyses%2C+of+the+turnover+time+of+oral+mucosal+epithelium+in+humans+and+the+number+of+bacteria+in+an+edentulous+mouth%5BTitle%5D)+AND+%22Archives+of+Oral+Biology%22%5BJournal%5D)">Estimates, from salivary analyses, of the turnover time of oral mucosal epithelium in humans and the number of bacteria in an edentulous mouth.</a> Archives of Oral Biology. 48, 329-336 (2003).</li>
<li>Bahlo, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Saliva-derived+DNA+performs+well+in+large-scale%2C+high-density+single-nucleotide+polymorphism+microarray+studies%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Epidemiol+Biomarkers+Prev%22%5BJournal%5D)">Saliva-derived DNA performs well in large-scale, high-density single-nucleotide polymorphism microarray studies.</a> Cancer Epidemiol Biomarkers Prev. 19, 794-798 (2010).</li>
<li>Hu, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genotyping+performance+between+saliva+and+blood-derived+genomic+dnas+on+the+dmet+array%3A+A+comparison%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+ONE%22%5BJournal%5D)">Genotyping performance between saliva and blood-derived genomic dnas on the dmet array: A comparison.</a> PLoS ONE. 7 (3), e33968(2012).</li>
<li>Simmons, T. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Increasing+genotype-phenotype+model+determinism%3A+Application+to+bivariate+reading%2Flanguage+traits+and+epistatic+interactions+in+language-impaired+families%5BTitle%5D)+AND+%22Human+Heredity%22%5BJournal%5D)">Increasing genotype-phenotype model determinism: Application to bivariate reading/language traits and epistatic interactions in language-impaired families.</a> Human Heredity. 70, 232-244 (2010).</li>
<li>Zeugin, J. A., Hartley, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ethanol+precipitation+of+DNA%5BTitle%5D)+AND+%22Focus%22%5BJournal%5D)">Ethanol precipitation of DNA.</a> Focus. 7, 1-2 (1985).</li>
<li>Li, H., Durbin, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fast+and+accurate+short+read+alignment+with+Burrows-Wheeler+Transform%5BTitle%5D)+AND+%22Bioinformatics%22%5BJournal%5D)">Fast and accurate short read alignment with Burrows-Wheeler Transform.</a> Bioinformatics. 25, 1754-1760 (2009).</li>
<li>McKenna, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Genome+Analysis+Toolkit%3A+a+MapReduce+framework+for+analyzing+next-generation+DNA+sequencing+data%5BTitle%5D)+AND+%22Genome+Res%22%5BJournal%5D)">The Genome Analysis Toolkit: a MapReduce framework for analyzing next-generation DNA sequencing data.</a> Genome Res. 20, 1297-1303 (2010).</li>
<li>DePristo, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+framework+for+variation+discovery+and+genotyping+using+next-generation+DNA+sequencing+data%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Genetics%22%5BJournal%5D)">A framework for variation discovery and genotyping using next-generation DNA sequencing data.</a> Nature Genetics. 43, 491-498 (2011).</li>
</ol>

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Obecna procedura to zoptymalizowany protokół ekstrakcji DNA, który znacznie poprawił wydajność DNA o wysokiej masie cząsteczkowej w porównaniu ze standardowymi metodami, bez uszczerbku dla jakości DNA. Krytycznym etapem, który miał największy wpływ na wydajność, był etap 5.2, który obejmuje dłuższy etap wirowania podczas wytrącania etanolu niż jakikolwiek opublikowany protokół omówiony tutaj, z wyjątkiem jednego, który nie był szeroko rozpowszechniony11. Nie wykryto żadnych zmian w jakości DNA związanych z tym...

Uzyskanie wysokiej jakości DNA do badań genetycznych na ludziach jest niezbędne w procesie odkrywania genów choroby. Krew, choć wymaga inwazyjnej procedury, a także jest droższa niż pobieranie śliny, jest preferowana do tworzenia nieśmiertelnych linii komórkowych jako nieskończonego źródła DNA lub iPSC do badań funkcjonalnych, a czasami DNA krwi jest używane, gdy linie komórkowe nie są dostępne. Jednak uzyskanie krwi wymaga wyszkolonego flebotomi, a krew ma krótszy okres półtrwania niż ślina1. DNA ze śliny jest tańsze i łatwiejsze do uzyskania, ponieważ można je pobrać i wysłać pocztą bez konieczności korzystania z usług flebotomi, zwiększając w ten sposób potencjalne pule pacjentów daleko poza obszar oddziaływania szpitali i laboratoriów2. Rekrutacja do badania może ulec poprawie, gdy uczestnicy mają możliwość oddania próbki śliny zamiast krwi3, 4. Obawy dotyczące ilości i jakości DNA ze śliny mogły ograniczyć jego powszechne stosowanie, pomimo licznych badań, ostatnich badań wykazujących przydatność całej śliny, ze średnią 4,3 x 105 komórek na mililitr, do badań DNA nad starszymi metodami wymazów z policzka, które nie uzyskały znacznych ilości śliny2, 3, 4, 5, 6. Chociaż istnieje skromna literatura wskazująca na przydatność całego DNA pochodzącego ze śliny do zastosowań genotypowania, w tym metod opartych na mikromacierzach8, 9, 10, żadne badania nie analizowały sekwencjonowania nowej generacji (NGS). Celem optymalizacji całego protokołu ekstrakcji DNA ze śliny była maksymalizacja ilości i jakości do zastosowań genetycznych w opłacalny sposób, który można łatwo wdrożyć w laboratoriach z powszechnie stosowanymi odczynnikami i materiałami eksploatacyjnymi.
Ekstrakcja DNA ze śliny wymaga kilku procedur: 1) zbieranie i przechowywanie, 2) liza komórek, 3) leczenie RNazą, 4) wytrącanie białka, 5) wytrącanie etanolu, 6) ponowne nawodnienie DNA. Roztwór buforu stabilizującego DNA, opisany wcześniej2, działa prawidłowo bez zmian. Nie podjęto żadnych prób optymalizacji etapów leczenia RNazą i ponownego nawodnienia DNA. Dla każdego pozostałego etapu zidentyfikowano kilka zmiennych, które mogą mieć wpływ na plon. Każda zmienna była manipulowana indywidualnie, a poprawa plonu i jakości była oceniana statystycznie. W przypadku zmiennych, które wykazały poprawę wydajności i/lub jakości DNA, optymalne wartości zostały uwzględnione w końcowym protokole.

<table><tbody><tr><td>15 ml probówki wirówkowe</td><td>Fisher</td><td>12-565-268</td><td></td></tr><tr><td>Roztwór do lizy komórek</td><td>Qiagen</td><td>158908</td><td></td></tr><tr><td>Proteinaza K</td><td>Sigma</td><td>P6556</td><td></td></tr><tr><td>Roztwór do wytrącania białek</td><td>Qiagen</td><td>158912</td><td></td></tr><tr><td>Izopropanol</td><td>Fisher</td><td>A416-4</td><td></td></tr><tr><td>Glikogen</td><td>EZ-BioResearch</td><td>S1003</td><td></td></tr><tr><td>70% etanol</td><td>Fisher</td><td>04-355-305</td><td></td></tr><tr><td>Tris-EDTA (TE)</td><td>Fisher</td><td>BP2473-1</td><td></td></tr><tr><td>NaCl</td><td>Fisher</td><td>AC194090010</td><td></td></tr><tr><td>Tris HCl</td><td>Fisher</td><td>BP1757-100</td><td></td></tr><tr><td>EDTA (0,5 m) Roztwór</td><td>Fisher</td><td>03-500-506</td><td></td></tr><tr><td>Dodecylosiarczan sodu</td><td>Fisher</td><td>BP166-100&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Analogowy mikser wirowy</td><td>Fisher</td><td>02-215-365</td><td></td></tr><tr><td>Wirówka 5810R</td><td>Eppendorf</td><td>5811 000.010</td><td></td></tr></tbody></table>

pobieranie i ekstrakcja dna śliny do sekwencjonowania nowej generacji

Collection and Extraction of Saliva DNA for Next Generation Sequencing

Preferowanym źródłem DNA w badaniach nad genetyką człowieka jest krew lub linie komórkowe pochodzące z krwi, ponieważ te źródła dostarczają dużych ilości DNA wysokiej jakości. Jednak ekstrakcja DNA ze śliny może dać wysokiej jakości DNA z niewielką lub żadną degradacją/fragmentacją, które jest odpowiednie dla różnych testów DNA bez kosztów flebotomisty i można je nawet uzyskać pocztą. Jednak w chwili obecnej w literaturze nie przedstawiono protokołów pobierania/ekstrakcji DNA ze śliny do sekwencjonowania nowej generacji. Protokół ten optymalizuje parametry pobierania/przechowywania śliny i ekstrakcji DNA, aby były wystarczającej jakości i ilości dla testów DNA o najwyższych standardach, w tym genotypowania mikromacierzy i sekwencjonowania nowej generacji.

W celu określenia optymalnych parametrów ekstrakcji DNA przeprowadzono serię parzystych ekstrakcji DNA. Pojedynczą próbkę śliny podzielono, a każdą porcję przetestowano z jedną z dwóch możliwych wartości dla danej zmiennej. Wykonano co najmniej osiem powtórzeń każdego testu parzystego (np. pojedyncza próbka śliny została podzielona na aalikwoty w celu przetestowania ekstrakcji z początkową inkubacją w 50 °C oraz bez niej). Optymalizacja opierała się na czterech standardowych miernikach: całkowitej wydajności DNA...

Ekstrakcja DNA ze śliny może stanowić łatwo dostępne źródło DNA o wysokiej masie cząsteczkowej, z niewielką lub żadną degradacją/fragmentacją. Protokół ten zapewnia zoptymalizowane parametry pobierania/przechowywania śliny i ekstrakcji DNA, aby były wystarczającej jakości i ilości dla dalszych testów DNA o wysokich wymaganiach jakościowych.

Pobieranie i ekstrakcja DNA śliny do sekwencjonowania nowej generacji

The preferred source of DNA in human genetics research is blood, or cell lines derived from blood, as these sources yield large quantities of high quality ...

Ogólnym celem tej procedury jest wyizolowanie wysokiej jakości DNA genomowego z całej śliny. Jest to osiągane poprzez wstępną lizę komórek w celu uwolnienia DNA. Drugim krokiem procedury jest usunięcie zanieczyszczeń w postaci RNA i białek.Trzecim krokiem jest wytrącenie genomowego DNA oraz usunięcie wszelkich pozostałych zanieczyszczeń lub domieszek. Ostatnim etapem jest rehydratacja genomowego DNA w celu wykorzystania go w dalszych analizach, takich jak PCR i sekwencjonowanie. W końcowym etapie spektrofotometria i amplifikacja mogą potwierdzić wysoką jakość uzyskanego genomowego DNA.Główną zaletą tej techniki w porównaniu z zestawami do pobierania jest znacząca redukcja kosztów bez utraty wydajności. Na pół godziny przed pobraniem śliny badani powinni wypłukać usta wodą, a następnie powstrzymać się od spożywania pokarmów i napojów do momentu pobrania próbki. Aby pobrać próbkę, należy poprosić badanego o wyplucie dokładnie 2,5 milliliters śliny do probówki o pojemności 15 milliliter zawierającej 2,5 milliliters buforu do stabilizacji DNA.Nie dotykać wnętrza probówki ani wnętrza zakrętki. W trakcie tego procesu probówkę należy zakręcić i homogenizować mieszaninę poprzez odwracanie, a nie wstrząsanie. Następnie próbkę należy przechowywać w temperaturze pokojowej w krótkim terminie lub w temperaturze 4 °C do trzech miesięcy.Przygotowania obejmują rozgrzanie kąpieli wodnej do 37 °C oraz przygotowanie trzech probówek o pojemności 15 ml. Należy rozpocząć od kilkukrotnego odwrócenia próbki, a następnie poddać ją wirowaniu w mikserze typu vortex z umiarkowaną prędkością przez 15 sekund. Następnie należy przenieść 2,5 ml próbki do jednej z probówek.Do aلیکwoty dodaj pięć mililitrów roztworu do lizy komórek i wymieszaj go z próbką, odwracając probówkę 50 razy. Po wymieszaniu próbki pozostaw ją na 30 minut w celu inkubacji. Po pół godzinie w temperaturze pokojowej dodaj 40 µL RNA A o stężeniu 100 mg/mL do roztworu z lizowanymi komórkami.Następnie szybko odwróć probówkę pięć razy. Inkubuj reakcję RNA w temperaturze 37°C przez 15 minut. Następnie schłodź probówkę na lodzie przez trzy minuty.W tym momencie należy zwiększyć temperaturę kąpieli wodnej do 65 °C. Następnie należy wyjąć probówkę z lodu. Dodać 50 µL proteinazy K i wymieszać, a następnie inkubować reakcję przez 30 minut w temperaturze pokojowej lub od 16 do 24 godzin w temperaturze 4 °C.Następnie dodaj 1,7 ml roztworu do wytrącania białek i mieszaj próbkę w wirówce vortex przez 20 sekund z wysoką prędkością. Po tym czasie schładzaj próbkę na lodzie przez 10 minut. Po schłodzeniu odwiruj próbkę przez 10 minut przy 3000 Gs i temperaturze 4 °C.Jeśli osad nie jest zwarty, chłodź próbkę przez kolejne pięć minut, a następnie ponownie wiruj ją przez pięć minut. Powtarzaj ten proces do czasu uzyskania zwartego osadu, cały czas utrzymując próbkę w niskiej temperaturze.Izolację DNA należy rozpocząć od przygotowania czystej probówki o pojemności 15 ml zawierającej 5 ml izopropanolu oraz 8 µl roztworu glikogenu o stężeniu 20 mg/ml. Następnie do probówki należy przelać nadsącz z odwirowanej próbki. Osad należy odrzucić, a próbkę wymieszać 50 razy poprzez odwracanie probówki.Następnie odwiruj próbkę z prędkością 3000 Gs w temperaturze czterech stopni Celsjusza przez 30 minut. Przelej nadsącz do innej czystej probówki o pojemności 15 mililitrów, oddzielając go od osadu. Dodaj jeden mililitr 70% etanolu i delikatnie mieszaj próbkę, kołysząc probówką na boku przez 30 sekund.Następnie odwiruj roztwór etanolu przez minutę przy 2000 Gs w temperaturze 4 °C lub 20 °C. Usuń nadsącz, powoli go zlewając, a następnie dodaj więcej etanolu do osadu. Delikatnie wymieszaj zawartość ręcznie i powtórz wirowanie.Następnie ponownie powoli odlej etanol. Podczas płukania osad może stać się luźny. Jeśli się oderwie, należy dopilnować, aby pozostał w roztworze etanolu i nie przywarł do ścianek ani do zakrętki probówki.Podczas tego płukania nie odwracać probówki. Po płukaniu etanolem pozostawić probówkę do wyschnięcia na powietrzu przez 15 do 30 minut. Następnie rehydratować osad genomowego DNA, dodając najpierw 300 µL tris EDTA.Następnie wymieszaj próbkę na wirówce typu vortex z średnią prędkością przez pięć sekund i przenieś ją do kąpieli wodnej o temperaturze 65 °C na jedną godzinę. Po podgrzaniu w kąpieli pozostaw próbkę do inkubacji przez noc w temperaturze pokojowej. Następnego dnia DNA będzie gotowe do użycia; elektroforeza żelowa próbek DNA wyekstrahowanego ze śliny wykazuje odpowiednie prążki o wysokiej masie cząsteczkowej, bez rozmycia świadczącego o degradacji DNA. Etap usuwania RNA jest niezbędny i bardzo skuteczny.Po trawieniu RNA stosunek absorbancji przy 260 nm do 280 nm wynosi średnio 1,74. Co istotne, DNA nadaje się do sekwencjonowania wysokoprzepustowego. Zestaw do wzbogacania celów zastosowano do 24 próbek, celując w 2,6 megabazy DNA; w jednej ścieżce sekwencjonowano 12 próbek z kodami kreskowymi.Wszystkie 24 próbki charakteryzowały się wysoką jakością danych NGS, co pozwoliło na zidentyfikowanie rzadkich polimorfizmów pojedynczego nukleotydu. Po obejrzeniu tego filmu powinni Państwo posiadać gruntowną wiedzę na temat sposobu izolacji wysokiej jakości DNA genomicznego z całej śliny.

collection-and-extraction-of-saliva-dna-for-next-generation-sequencing

Research

JoVE Journal

Medicine

Medycyna

Zbieranie i ekstrakcja DNA z śliny do sekwencjonowania nowej generacji

Biorąc pod uwagę pobieranie próbek śliny do przyszłych zastosowań klinicznych, opracowano sondę ultrafiltracyjną w formie lizaka (LLUF), dopasowaną do ludzkiej jamy ustnej. Bezpośrednia analiza niestrawionej śliny za pomocą spektrometrii mas NanoLC-LTQ wykazała zdolność sond LLUF do usuwania dużych białek oraz białek o wysokiej zawartości, co zwiększyło wykrywalność peptydów o niskiej zawartości.

Próbkowanie peptydomu ludzkiej śliny z wykorzystaniem sondy ultrafiltracyjnej o kształcie lizaka: uproszczenie i usprawnienie detekcji peptydów w klinicznej spektrometrii mas

Sekwencjonowanie amplikonów bisulfitowych (BSAS) to metoda ilościowego określania metylacji cytozyny w docelowych regionach genomu. Metoda ta wykorzystuje konwersję wodorosiarczynów w połączeniu z amplifikacją PCR regionów docelowych przed sekwencjonowaniem nowej generacji w celu uzyskania bezwzględnej oceny ilościowej metylacji DNA na poziomie specyficznym dla zasady.

Ukierunkowana analiza metylacji DNA za pomocą sekwencjonowania nowej generacji

Ten manuskrypt opisuje zautomatyzowane podejście do wyboru rozmiaru żelu do oczyszczania fragmentów DNA do sekwencjonowania nowej generacji. Technologia Ranger zapewnia pełną automatyzację całego procesu ładowania żelem agarozowym, analizy elektroforetycznej i odzyskiwania docelowych fragmentów DNA, co pozwala na uzyskanie wysokiej przepustowości i wysokiej jakości bibliotek sekwencjonowania nowej generacji.

Zautomatyzowany wybór wielkości żelu w celu poprawy jakości bibliotek sekwencjonowania nowej generacji przygotowanych na podstawie próbek wody środowiskowej

Opisujemy wydajną, solidną i opłacalną metodę ekstrakcji kwasu nukleinowego z wymazów w celu scharakteryzowania społeczności bakteryjnych za pomocą sekwencjonowania amplikonów genu 16S rRNA. Metoda ta pozwala na zastosowanie wspólnego podejścia do przetwarzania wielu typów próbek i uwzględnia szereg dalszych procesów analitycznych.

Wydajna ekstrakcja kwasów nukleinowych i sekwencjonowanie genu 16S rRNA w celu scharakteryzowania społeczności bakteryjnych

Metagenomics została wykorzystana do zbadania mikrobiomu paszy dla bydła na kiszonkę. Analizę przeprowadzono za pomocą sekwencjonowania typu shotgun. Podejście to wykorzystano do scharakteryzowania składu zbiorowiska mikrobiologicznego w paszy dla bydła.

Analiza metagenomiczna kiszonki

Przedstawiono porównanie i optymalizację dwóch metod wzbogacania DNA organelek roślinnych: tradycyjne wirowanie różnicowe i frakcjonowanie całkowitego gDNA w oparciu o status metylacji. Oceniamy otrzymaną ilość i jakość DNA, wykazujemy wydajność w sekwencjonowaniu nowej generacji z krótkim odczytem i omawiamy potencjał zastosowania w sekwencjonowaniu pojedynczych cząsteczek z długim odczytem.

Optymalizacja i analiza porównawcza metod wzbogacania organelek DNA roślin odpowiednich do sekwencjonowania nowej generacji

Tutaj opisujemy prosty protokół do generowania profili odcisków palców DNA poprzez amplifikację locus VNTR D1S80 z DNA komórki nabłonkowej.

Zastosowanie odcisków palców DNA przy użyciu locus D1S80 w klasach laboratoryjnych

Opisany tutaj jest protokół ekstrakcji DNA z wykorzystaniem kulek magnetycznych do produkcji wysokiej jakości ekstrakcji DNA od komarów. Ekstrakcje te są odpowiednie dla dalszego podejścia do sekwencjonowania nowej generacji.

Protokół ekstrakcji DNA komarów oparty na kulkach magnetycznych do sekwencjonowania nowej generacji

Ten protokół szczegółowo opisuje kompleksowe podejście do hodowli, sekwencjonowania i hybrydowego składania genomu de novo bakterii moczowych. Zapewnia powtarzalną procedurę generowania kompletnych, kolistych sekwencji genomu przydatnych w badaniu zarówno chromosomalnych, jak i pozachromosomalnych elementów genetycznych przyczyniających się do kolonizacji dróg moczowych, patogenezy i rozprzestrzeniania się oporności na środki przeciwdrobnoustrojowe.

Hybrydowe składanie genomu de novo w celu generowania kompletnych genomów bakterii moczowych przy użyciu technologii sekwencjonowania krótkiego i długiego odczytu

Przedstawiamy zoptymalizowaną metodę ekstrakcji DNA z odkażonej plwociny przy użyciu metody ekstrakcji opartej na matrycy w połączeniu z oczyszczaniem kulek magnetycznych w celu dalszego ukierunkowanego sekwencjonowania Mycobacterium tuberculosis.

Ekstrakcja DNA oparta na matrycy do ukierunkowanego sekwencjonowania nowej generacji na odkażonych próbkach plwociny

Poznaj metodę ekstrakcji wysokiej jakości DNA genomowego z całej śliny do zastosowań sekwencjonowania. Protokół obejmuje lizę komórek, usuwanie RNA i białek oraz oczyszczanie DNA.

Pobieranie i ekstrakcja DNA śliny do sekwencjonowania nowej generacji

Przeglądaj więcej filmów