Name: Test funkcjonalny do badania łączenia luk; Elektroporacja ogniw adherentnych na tlenku indu i cyny (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-10-18T15:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 2 s
Description: Poznaj metodę elektroporacji ogniw adherentnych na tlenku indu i cynu do badania komunikacji międzykomórkowej przez złącza szczelinowe. Technika ta umożliwia wprowadzanie barwników i analizę funkcji złączy w żywych komórkach.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Dziękujemy Lowellowi Cochranowi za fachową pomoc w filmowaniu. Z wdzięcznością dziękujemy za pomoc finansową Kanadyjskich Instytutów Badań nad Zdrowiem (CIHR), Kanadyjskiej Fundacji Raka Piersi (CBCF, Ontario Chapter), Kanadyjskiej Rady Badań nad Naukami Przyrodniczymi i Inżynierią (NSERC), Kanadyjskiego Sojuszu Badań nad Rakiem Piersi, Ontario Centers of Excellence, Breast Cancer Action Kingston oraz funduszu Clare Nelson Bequest Fund poprzez dotacje dla LR. SG był stypendystą NSERC. MG był wspierany przez stypendium podoktorskie z US Army Breast Cancer Program, Ministerstwa Badań i Innowacji Prowincji Ontario oraz Komitetu Doradczego ds. Badań Queen's University.

1. Powlekanie komórek w komorach elektroporacyjnych
<ol>
	<li>W kapturze z przepływem laminarnym trypsynizuj komórki przy użyciu sterylnej techniki, jak zwykle. 
	UWAGA: Bardzo ważne jest, aby przez odwirowanie usunąć wszelkie ślady trypsyny, ponieważ mogą one utrudniać rozprzestrzenianie się komórek na szkle, stąd powstawanie adherenów i połączeń szczelinowych.</li>
	<li>Odpipetować 1 ml zawiesiny komórek w sterylnych komorach do elektroporacji wyposażonych w elektroporator in situ (rysunek 1) i umieścić w inkubatorze o temperaturze 37 oCi temperaturze 37 oC. 
	UWAGA: Adhezja komórek może być poprawiona poprzez powlekanie fibronektyną, kolagenem, polilizyną lub klejem komórkowym i tkankowym (patrz tabela materiałów).</li>
	<li>Kiedy komórki utworzą zlewającą się warstwę, są gotowe do badania GJIC.</li>
</ol>
2. Procedura elektroporacji
Elektroporacja do badania GJIC może być przeprowadzona na zewnątrz okapu laminarnego, ponieważ trwa tylko kilka minut. Jeśli do konkretnego eksperymentu wymagane są dłuższe czasy inkubacji, można je przeprowadzić w całości w okapie z przepływem laminarnym. We wszystkich przypadkach komory, w których hodowane są komórki, muszą być sterylne.
<ol>
	<li>Przygotuj 5 mg/ml żółtego roztworu Lucyfer: Rozpuść 10 mg proszku LY (dostarczonego z elektroporatorem) w 2 ml pożywki bezwapniowej. W przypadku eksperymentów, które wymagają dłuższego czasu inkubacji, przefiltruj roztwór i przechowuj w temperaturze 4oC.</li>
	<li>Odessać pożywkę wzrostową i umyć komórki pożywką bezwapniową, uważając, aby nie zarysować monowarstwy ani nie wysuszyć komórek. Jeśli komórki są wysuszone, zwykle mają ciemniejsze jądra i odbierają LY bez elektroporacji. Efekt ten jest bardziej wyraźny w środkowej części szkiełka, która jest bardziej narażona na przeciągi powietrza (ryc. 4F).</li>
	<li>Za pomocą pipetora Eppendorf odpipetuj roztwór barwnika do komórek (400 μl na całą komorę) na krawędzi komory, uważając, aby nie dotknąć warstwy komórek.</li>
	<li>Umieść komorę w uchwycie dostarczonym z elektroporatorem i zastosuj impuls o odpowiedniej sile (patrz Dyskusja).</li>
	<li>Ostrożnie odessać część roztworu LY. Można go ponownie użyć do mniej ważnych eksperymentów.</li>
	<li>Dodaj bezwapniowy DMEM zawierający 10% biolizowanej surowicy.</li>
	<li>Inkubować komórki przez 3-5 minut w inkubatorze, aby umożliwić transfer barwnika przez połączenia szczelinowe. 
	UWAGA: Włączenie dializowanej surowicy w tym momencie pomaga w zamknięciu porów.</li>
	<li>Umyj niewbudowany barwnik bezwapniowym DMEM do obserwacji żywych komórek. Alternatywnie, komórki można utrwalić na tym etapie, poprzez dodanie 4% formaldehydu do studzienki, a następnie przemyte PBS (sól fizjologiczna buforowana fosforanami). We wszystkich przypadkach pranie musi usunąć całe tło. 
	UWAGA: We wstępnych eksperymentach mających na celu określenie optymalnych warunków, jeśli napięcie jest zbyt niskie, można pozwolić komórkom zregenerować się w inkubatorze przez kilka minut i elektrorazować to samo szkiełko po raz drugi, aby zaoszczędzić na kosztach szkiełek.</li>
</ol>
3. Badanie mikroskopowe
<ol>
	<li>Obserwuj komórki pod wpływem oświetlenia fluorescencyjnego, używając mikroskopu odwróconego wyposażonego w filtr odpowiedni dla używanego barwnika. Dla żółtego Lucyfera wzbudzenie wynosi 423 nm, emisja 555 nm, filtr WBV do mikroskopu Nikon IX70.</li>
	<li>Wyeliminuj efekty łąkotki, umieszczając szklane szkiełko nakrywkowe na plastikowej studzience, po napełnieniu jej do góry płynem, w celu zbadania morfologii komórki w kontraście fazowym. Aby uzyskać lepsze zdjęcia, studzienkę można odczepić od szkiełka, a szkiełko nakrywkowe umieścić na ramie. W przypadku komórek stałych studzienka może być wypełniona glicerolem w celu obserwacji mikroskopowej, natomiast w przypadku żywych komórek należy ją wypełnić pożywką wzrostową. 
	UWAGA: Mycie i fotografowanie jest łatwiejsze, jeśli komórki są utrwalane formaldehydem po przeniesieniu barwnika (krok 2.7 powyżej). Jeśli komórki nie są utrwalone, fluorescencja jest eliminowana z komórek w ciągu około 60 minut, w zależności od typu komórki, napięcia i ilości wprowadzonego LY, podczas gdy w komórkach stałych fluorescencja jest utrzymywana przez kilka godzin. Jednak fluorescencja zanika lub rozprasza się po inkubacji O/N, nawet w komórkach stałych. Z tego powodu zdjęcia muszą być wykonane zaraz po elektroporacji (Ryc. 2).</li>
</ol>
4. Kwantyfikacja komunikacji międzykomórkowej
<ol>
	<li>Sfotografuj komórki za pomocą obiektywu 20x przy fluorescencji i kontraście fazowym (ryc. 3).</li>
	<li>Zidentyfikuj i oznacz gwiazdką elektroporowane ogniwa na granicy z obszarem nieelektroporowanym (Rysunek 2, strzałka, krawędź elektroporacji).</li>
	<li>Zidentyfikuj i oznacz kropką fluoryzujące ogniwa po stronie nieelektroporowanej, w których barwnik przeniósł się przez połączenia szczelinowe (rysunki 3A i 3B).</li>
	<li>Podziel całkowitą liczbę ogniw fluoryzujących na obszarze nieelektroporowanym przez liczbę ogniw elektroporowanych wzdłuż krawędzi (rysunki 3A i 3B). 
	UWAGA: Transfer z co najmniej 200 ciągłych elektroporowanych ogniw granicznych jest obliczany dla każdego eksperymentu. Otrzymana liczba jest wartością GJIC.</li>
</ol>

<ol><li>Raptis, L., et al. Electroporation of Adherent Cells in Situ for the Study of Signal Transduction and Gap Junctional Communication. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aRaptis%2C+L+%22Electroporation+protocols%22">Electroporation protocols</a>. , The Humana Press Inc. edited by S Li 167-183 (2008).</li>
<li>Giorgetti-Peraldi, S., Ottinger, E., Wolf, G., Ye, B., Burke, T. R., Shoelson, S. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cellular+effects+of+phosphotyrosine-binding+domain+inhibitors+on+insulin+receptor+signalling+and+trafficking%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Cellular effects of phosphotyrosine-binding domain inhibitors on insulin receptor signalling and trafficking.</a> Mol Cell Biol. 17, 1180-1188 (1997).</li>
<li>Boccaccio, C., Ando, M., Tamagnone, L., Bardelli, A., Michielli, P., Battistini, C., Comoglio, P. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Induction+of+epithelial+tubules+by+growth+factor+HGF+depends+on+the+STAT+pathway%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Induction of epithelial tubules by growth factor HGF depends on the STAT pathway.</a> Nature. 391, 285-288 (1998).</li>
<li>Bardelli, A., Longati, P., Gramaglia, D., Basilico, C., Tamagnone, L., Giordano, S., Ballinari, D., Michieli, P., Comoglio, P. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Uncoupling+signal+transducers+from+oncogenic+MET+mutants+abrogates+cell+transformation+and+inhibits+invasive+growth%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Nat+Acad+Sci+USA%22%5BJournal%5D)">Uncoupling signal transducers from oncogenic MET mutants abrogates cell transformation and inhibits invasive growth.</a> Proc Nat Acad Sci USA. 95, 14379-14383 (1998).</li>
<li>Gambarotta, G., Boccaccio, C., Giordano, S., Ando, M., Stella, M. C., Comoglio, P. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ets+up-regulates+met+transcription%5BTitle%5D)+AND+%22Oncogene%22%5BJournal%5D)">Ets up-regulates met transcription.</a> Oncogene. 13, 1911-1917 (1996).</li>
<li>Arulanandam, R., Vultur, A., Raptis, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transfection+techniques+affecting+Stat3+activity+levels%5BTitle%5D)+AND+%22Anal+Biochem%22%5BJournal%5D)">Transfection techniques affecting Stat3 activity levels.</a> Anal Biochem. 338 (1), 83-89 (2005).</li>
<li>Boussiotis, V. A., Freeman, G. J., Berezovskaya, A., Barber, D. L., Nadler, L. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Maintenance+of+human+T+cell+anergy%3A+blocking+of+IL-2+gene+transcription+by+activated+Rap1%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Maintenance of human T cell anergy: blocking of IL-2 gene transcription by activated Rap1.</a> Science. 278 (5335), 124-128 (1997).</li>
<li>Brownell, H. L., Firth, K. L., Kawauchi, K., Delovitch, T. L., Raptis, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+novel+technique+for+the+study+of+Ras+activation%3B+electroporation+of+%5Balpha-32%5DGTP%5BTitle%5D)+AND+%22DNA+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">A novel technique for the study of Ras activation; electroporation of [alpha-32]GTP.</a> DNA Cell Biol. 16, 103-110 (1997).</li>
<li>Tomai, E., Vultur, A., Balboa, V., Hsu, T., Brownell, H. L., Firth, K. L., Raptis, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+situ+electroporation+of+radioactive+compounds+into+adherent+cells%5BTitle%5D)+AND+%22DNA+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">In situ electroporation of radioactive compounds into adherent cells.</a> DNA Cell Biol. 22, 339-346 (2003).</li>
<li>Raptis, L., Vultur, A., Tomai, E., Brownell, H. L., Firth, K. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+situ+electroporation+of+radioactive+nucleotides%3A+assessment+of+Ras+activity+and+32P-labelling+of+cellular+proteins%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Biology+A+Laboratory+Handbook%2C+Celis%2C+Ed%22%5BJournal%5D)">In situ electroporation of radioactive nucleotides: assessment of Ras activity and 32P-labelling of cellular proteins.</a> Cell Biology A Laboratory Handbook, Celis, Ed. 43, 329-339 (2006).</li>
<li>Nakashima, N., Rose, D., Xiao, S., Egawa, K., Martin, S., Haruta, T., Saltiel, A. R., Olefsky, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+functional+role+of+crk+II+in+actin+cytoskeleton+organization+and+mitogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biol+Chem%22%5BJournal%5D)">The functional role of crk II in actin cytoskeleton organization and mitogenesis.</a> J Biol Chem. 274, 3001-3008 (1999).</li>
<li>Raptis, L., Firth, K. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Electroporation+of+adherent+cells+in+situ%5BTitle%5D)+AND+%22DNA+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Electroporation of adherent cells in situ.</a> DNA Cell Biol. 9, 615-621 (1990).</li>
<li>Marais, R., Spooner, R. A., Stribbling, S. M., Light, Y., Martin, J., Springer, C. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+cell+surface+tethered+enzyme+improves+efficiency+in+gene-directed+enzyme+prodrug+therapy%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">A cell surface tethered enzyme improves efficiency in gene-directed enzyme prodrug therapy.</a> Nat Biotechnol. 15, 1373-1377 (1997).</li>
<li>Nielsen, M. S., Nygaard, A. L., Sorgen, P. L., Verma, V., Delmar, M., Holstein-Rathlou, N. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Gap+junctions%5BTitle%5D)+AND+%22Compr+Physiol%22%5BJournal%5D)">Gap junctions.</a> Compr Physiol. 2 (3), 1981-2035 (2012).</li>
<li>Geletu, M., Trotman-Grant, A., Raptis, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mind+the+gap%3B+regulation+of+gap+junctional%2C+intercellular+communication+by+the+SRC+oncogene+product+and+its+effectors%5BTitle%5D)+AND+%22Anticancer+Res%22%5BJournal%5D)">Mind the gap; regulation of gap junctional, intercellular communication by the SRC oncogene product and its effectors.</a> Anticancer Res. 32 (10), 4245-4250 (2012).</li>
<li>Vinken, M., Vanhaecke, T., Papeleu, P., Snykers, S., Henkens, T., Rogiers, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Connexins+and+their+channels+in+cell+growth+and+cell+death%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Signal%22%5BJournal%5D)">Connexins and their channels in cell growth and cell death.</a> Cell Signal. 18 (5), 592-600 (2006).</li>
<li>Fouly, M. H., Trosko, J. E., Chang, C. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Scrape-loading+and+dye+transfer%3A+A+rapid+and+simple+technique+to+study+gap+junctional+intercellular+communication%5BTitle%5D)+AND+%22Exp+Cell+Res%22%5BJournal%5D)">Scrape-loading and dye transfer: A rapid and simple technique to study gap junctional intercellular communication.</a> Exp Cell Res. 168, 430-442 (1987).</li>
<li>Raptis, L., Brownell, H. L., Firth, K. L., MacKenzie, L. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+novel+technique+for+the+study+of+intercellular%2C+junctional+communication%3B+electroporation+of+adherent+cells+on+a+partly+conductive+slide%5BTitle%5D)+AND+%22DNA+%26+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">A novel technique for the study of intercellular, junctional communication; electroporation of adherent cells on a partly conductive slide.</a> DNA & Cell Biol. 13, 963-975 (1994).</li>
<li>Anagnostopoulou, A., Cao, J., Vultur, A., Firth, K. L., Raptis, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Examination+of+gap+junctional%2C+intercellular+communication+by+in+situ+electroporation+on+two+co-planar+indium-tin+oxide+electrodes%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Oncol%22%5BJournal%5D)">Examination of gap junctional, intercellular communication by in situ electroporation on two co-planar indium-tin oxide electrodes.</a> Mol Oncol. 1, 226-231 (2007).</li>
<li>Tomai, E., Brownell, H. L., Tufescu, T., Reid, K., Raptis, S., Campling, B. G., Raptis, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+functional+assay+for+intercellular%2C+junctional+communication+in+cultured+human+lung+carcinoma+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Lab+Invest%22%5BJournal%5D)">A functional assay for intercellular, junctional communication in cultured human lung carcinoma cells.</a> Lab Invest. 78, 639-640 (1998).</li>
<li>Tomai, E., Brownell, H. L., Tufescu, T., Reid, K., Raptis, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Gap+junctional+communication+in+lung+carcinoma+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Lung+Cancer%22%5BJournal%5D)">Gap junctional communication in lung carcinoma cells.</a> Lung Cancer. 23, 223-231 (1999).</li>
<li>Geletu, M., Chaize, C., Arulanandam, R., Vultur, A., Kowolik, C., Anagnostopoulou, A., Jove, R., Raptis, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Stat3+activity+is+required+for+gap+junctional+permeability+in+normal+epithelial+cells+and+fibroblasts%5BTitle%5D)+AND+%22DNA+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Stat3 activity is required for gap junctional permeability in normal epithelial cells and fibroblasts.</a> DNA Cell Biol. 28, 319-327 (2009).</li>
<li>Geletu, M., Arulanandam, R., Greer, S., Trotman-Grant, A., Tomai, E., Raptis, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Stat3+is+a+positive+regulator+of+gap+junctional+intercellular+communication+in+cultured%2C+human+lung+carcinoma+cells%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Cancer%22%5BJournal%5D)">Stat3 is a positive regulator of gap junctional intercellular communication in cultured, human lung carcinoma cells.</a> BMC Cancer. 12, 605(2012).</li>
<li>Brownell, H. L., Narsimhan, R., Corbley, M. J., Mann, V. M., Whitfield, J. F., Raptis, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ras+is+involved+in+gap+junction+closure+in+mouse+fibroblasts+or+preadipocytes+but+not+in+differentiated+adipocytes%5BTitle%5D)+AND+%22DNA+%26+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Ras is involved in gap junction closure in mouse fibroblasts or preadipocytes but not in differentiated adipocytes.</a> DNA & Cell Biol. 15, 443-451 (1996).</li>
<li>Weber, P. A., Chang, H. C., Spaeth, K. E., Nitsche, J. M., Nicholson, B. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+permeability+of+gap+junction+channels+to+probes+of+different+size+is+dependent+on+connexin+composition+and+permeant-pore+affinities%5BTitle%5D)+AND+%22Biophys+J%22%5BJournal%5D)">The permeability of gap junction channels to probes of different size is dependent on connexin composition and permeant-pore affinities.</a> Biophys J. 87 (2), 958-973 (2004).</li>
<li>Graham, F. L., vander Eb, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+new+technique+for+the+assay+of+infectivity+of+human+Adenovirus+5+DNA%5BTitle%5D)+AND+%22Virology%22%5BJournal%5D)">A new technique for the assay of infectivity of human Adenovirus 5 DNA.</a> Virology. 52, 456-467 (1973).</li>
<li>Arulanandam, R., Vultur, A., Cao, J., Carefoot, E., Truesdell, P., Elliott, B., Larue, L., Feracci, H., Raptis, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cadherin-cadherin+engagement+promotes+survival+via+Rac%2FCdc42+and+Stat3%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Cancer+Res+7%22%5BJournal%5D)">Cadherin-cadherin engagement promotes survival via Rac/Cdc42 and Stat3.</a> Mol Cancer Res 7. , 1310-1327 (2009).</li>
<li>Williams, E. J., Dunican, D. J., Green, P. J., Howell, F. V., Derossi, D., Walsh, F. S., Doherty, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Selective+inhibition+of+growth+factor-stimulated+mitogenesis+by+a+cell-permeable+Grb2-binding+peptide%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Biol.+Chem%22%5BJournal%5D)">Selective inhibition of growth factor-stimulated mitogenesis by a cell-permeable Grb2-binding peptide.</a> J. Biol. Chem. 272, 22349-22354 (1997).</li>
<li>Raptis, L., Brownell, H. L., Vultur, A. M., Ross, G., Tremblay, E., Elliott, B. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Specific+inhibition+of+Growth+Factor-stimulated+ERK1%2F2+activation+in+intact+cells+by+electroporation+of+a+Grb2-SH2+binding+peptide%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Growth+Differ%22%5BJournal%5D)">Specific inhibition of Growth Factor-stimulated ERK1/2 activation in intact cells by electroporation of a Grb2-SH2 binding peptide.</a> Cell Growth Differ. 11, 293-303 (2000).</li>
<li>Meda, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Assaying+the+molecular+permeability+of+connexin+channels%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">Assaying the molecular permeability of connexin channels.</a> Methods Mol Biol. 154, 201-224 (2001).</li>
<li>Hofgaard, J. P., Mollerup, S., Holstein-Rathlou, N. H., Nielsen, M. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantification+of+gap+junctional+intercellular+communication+based+on+digital+image+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Am+J+Physiol+Regul+Integr+Comp+Physiol%22%5BJournal%5D)">Quantification of gap junctional intercellular communication based on digital image analysis.</a> Am J Physiol Regul Integr Comp Physiol. 297 (2), R243-R247 (2009).</li>
<li>Raptis, L., Lamfrom, H., Benjamin, T. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Regulation+of+cellular+phenotype+and+expression+of+polyomavirus+middle+T+antigen+in+rat+fibroblasts%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Regulation of cellular phenotype and expression of polyomavirus middle T antigen in rat fibroblasts.</a> Mol Cell Biol. 5, 2476-2486 (1985).</li>
<li>Raptis, L., Marcellus, R. C., Whitfield, J. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High+membrane-associated+protein+kinase+C+activity+correlates+to+tumorigenicity+but+not+anchorage-independence+in+a+clone+of+mouse+NIH+3T3+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Exp+Cell+Res%22%5BJournal%5D)">High membrane-associated protein kinase C activity correlates to tumorigenicity but not anchorage-independence in a clone of mouse NIH 3T3 cells.</a> Exp Cell Res. 207, 152-154 (1993).</li>
<li>Vultur, A., Cao, J., Arulanandam, R., Turkson, J., Jove, R., Greer, P., Craig, A., Elliott, B. E., Raptis, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell+to+cell+adhesion+modulates+Stat3+activity+in+normal+and+breast+carcinoma+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Oncogene%22%5BJournal%5D)">Cell to cell adhesion modulates Stat3 activity in normal and breast carcinoma cells.</a> Oncogene. 23, 2600-2616 (2004).</li>
<li>Vultur, A., Arulanandam, R., Turkson, J., Niu, G., Jove, R., Raptis, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Stat3+is+required+for+full+neoplastic+transformation+by+the+Simian+Virus+40+Large+Tumor+antigen%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Biol+Cell%22%5BJournal%5D)">Stat3 is required for full neoplastic transformation by the Simian Virus 40 Large Tumor antigen.</a> Mol Biol Cell. 16, 3832-3846 (2005).</li>
</ol>

Autor korespondencyjny jest wynalazcą patentu posiadanego przez Queen's University, który został licencjonowany przez Cell Projects Inc. Firma ani Uniwersytet nie miały wpływu na treść artykułu.

Krytyczne kroki w protokole
Materiał poddany elektroporacji Czystość materiału, który ma być poddany elektroporacji, jest bardzo ważna. Jeśli komórki są bardzo płaskie, należy użyć wyższych stężeń barwnika śledzącego (do 20 mg/ml dla LY) i w takich przypadkach czystość jest jeszcze ważniejsza niż w komórkach o bardziej kulistym kształcie1. Oprócz LY zastosowano wiele różnych innych barwników lub cząsteczek niepermedycznych, takich jak seria barwników Alexa do wyk...

Przyłożenie prądu elektrycznego do komórki powoduje powstawanie porów na błonie komórkowej w procesie zwanym elektroporacją. Pory umożliwiają przechodzenie przez błonę różnych niepermeanowanych cząsteczek. Pole elektryczne może być precyzyjnie kontrolowane, dzięki czemu powstałe pory są bardzo małe i szybko się zamykają, przy minimalnym zakłóceniu fizjologii komórkowej. Co ciekawe, przylegające komórki mogą być hodowane na szkiełku pokrytym przewodzącym i przezroczystym tlenkiem indu i cyny (ITO) i elektroporowane in situ, czyli na powierzchni, na której rosną, bez odłączania w celu elektroporacji w zawiesinie. Komórki mogą bardzo dobrze rosnąć na tej powierzchni, a ponieważ są przyczepione i przedłużone, możliwa jest szczegółowa obserwacja mikroskopowa. Korzystając z tej techniki, małe cząsteczki niepermeanizowane mogą być wprowadzane natychmiast i zasadniczo do 100% komórek, co sprawia, że technika ta jest szczególnie odpowiednia do badań nad aktywacją składników szlaku po stymulacji receptora ligandem (omówione w1).
Elektroporacja była najczęściej używana do wprowadzania DNA (zwana również elektrotransfekcją). Jednak elektroporacja in situ może być cenna dla wprowadzenia wielu różnych cząsteczek, takich jak peptydy2-4, oligonukleotydy, takie jak antysensowne RNA, dwuniciowe oligonukleotydy wabiące DNA hamujące wiązanie czynników transkrypcyjnych lub siRNA3,5,6, radioaktywne nukleotydy7-10, białka1112 lub proleki13. Po elektroporacji komórki mogą być poddawane lizie do analiz biochemicznych lub utrwalane i barwione przeciwciałami.
Przewodząca powłoka ITO jest bardzo cienka, 800-1000A, dzięki czemu wzrost komórek nie jest zakłócany przez różnicę wysokości dwóch powierzchni, ponieważ komórki rosną na krawędzi powłoki przewodzącej. Ma to tę zaletę, że ogniwa nieelektroporowane mogą być hodowane obok ogniw elektroporowanych, które służą jako kontrole. To samo podejście można zastosować do badania komunikacji międzykomórkowej (GJIC), jak opisano w filmie.
Połączenia szczelinowe to kanały łączące wnętrza sąsiednich komórek14. Komunikacja międzykomórkowa w szczelinie odgrywa ważną rolę w tworzeniu guza i przerzutach, podczas gdy onkogeny, takie jak Src, hamują GJIC15,16. Aby zbadać GJIC, barwnik fluorescencyjny, taki jak żółty Lucyfer (LY), jest często wprowadzany do hodowanych komórek poprzez mikroiniekcję lub skrobanie17, a dyfuzja barwnika do sąsiednich komórek jest obserwowana pod mikroskopem w świetle fluorescencyjnym. Techniki te jednak niezmiennie powodują uszkodzenie komórek. Opisujemy teraz technikę, w której komórki są hodowane na szkiełku podstawowym, które jest częściowo pokryte ITO18. Impuls elektryczny został zastosowany w obecności LY (lub innych barwników) powodując jego wnikanie do komórek rosnących na przewodzącej części szkiełka, podczas gdy migrację barwnika do sąsiednich, nieelektroporowanych komórek obserwowano mikroskopowo poprzez oświetlenie fluorescencyjne. Aby uniknąć zakłócania wrażliwych ogniw, które mogą mieć tendencję do odłączania się od monowarstwy, zaprojektowano zespół, który nie wymagał umieszczania elektrody na ogniwach w celu doprowadzenia prądu elektrycznego19. Podejście to oferuje możliwość ilościowego oznaczania GJIC w dużej liczbie komórek, bez żadnych wykrywalnych zaburzeń metabolizmu komórkowego, na co wskazuje brak wpływu na długość fazy G1 po stymulacji surowicy12, wzrost poziomów białka protoonkogenu fos (Raptis, niepublikowane) lub dwóch kinaz związanych ze stresem komórkowym, świnia p38 lub kinaza JNK/SAPK1. Podejście to umożliwiło zbadanie związku między poziomami ekspresji onkogenu, transformacji i GJIC18, a także wpływu Src i Stat3 na GJIC w różnych typach komórek, w tym w komórkach świeżo wyhodowanych z próbek guza płuc20-23. Ponadto, elektroporacja in situ z opisanym układem, który nie ma górnej elektrody, została z powodzeniem zastosowana do wykazania zamknięcia złącza szczelinowego po różnicowaniu adipocytarnym, chociaż przyłączenie komórkowe do podłoża jest na tym etapie zmniejszone19,24.

<table><tbody><tr><td>DMEM</td><td>Cellgro http://www.cellgro.com/</td> <td>50-013-PB</td><td></td></tr><tr><td>DMEM bez Hyklonu Wapnia</td><td>(Thermo scientific: http://www.thermoscientific.com)</td><td>SH30319-01</td><td></td></tr><tr><td>Surowica cielęca dawcy&nbsp;</td><td>PAA: http://www.paa.com/</td> <td>Kat.# B15-008</td><td></td></tr><tr><td>Surowica bydlęca</td><td>PAA: http://www.paa.com/</td> <td>Kat.# A15-751</td><td></td></tr><tr><td>Aparat do elektroporacji</td><td>Cell Projects Ltd Wielka Brytania: http://www.cellprojects.com/</td> <td>ACE-100</td><td></td></tr><tr><td>Chambers</td><td>Cell Projects Ltd Wielka Brytania</td><td>ACE-04-CC</td><td>4-dołkowy</td></tr><tr><td>Chambers</td><td>Cell Projects Ltd Wielka Brytania</td><td>ACE-08-CC</td><td>8-dołkowy</td></tr><tr><td>Lucifer Yellow</td><td>Cell Projects Ltd Wielka Brytania</td><td>ACE-25-LY</td><td>Wysoka czystość</td></tr><tr><td>CelTak</td><td>BD Biosciences</td><td>354240</td><td>Klej komórkowy i tkankowy</td></tr><tr><td>Fibronektyna</td><td>Sigma Aldrich</td><td>F1141</td><td></td></tr><tr><td>Kolagen</td><td>BD Biosciences</td><td>354236</td><td></td></tr><tr><td>Polilizyna</td><td>Sigma Aldrich</td><td>P8920</td><td></td></tr></tbody></table>

test funkcjonalny do badania łączenia luk; elektroporacja ogniw adherentnych na tlenku indu i cyny

A Functional Assay for Gap Junctional Examination; Electroporation of Adherent Cells on Indium-Tin Oxide

W tej technice, komórki są hodowane na szkiełku podstawowym, które jest częściowo pokryte tlenkiem indu i cyny (ITO), przezroczystym, przewodzącym prąd elektryczny materiałem. Różne cząsteczki, takie jak peptydy lub oligonukleotydy, mogą być wprowadzane do zasadniczo 100% komórek w sposób nietraumatyczny. Tutaj opisujemy, w jaki sposób można je wykorzystać do badania komunikacji międzykomórkowej, węzłowej. Żółcień lucyfera wnika do komórek, gdy impuls elektryczny, przyłożony do przewodzącej powierzchni, na której rosną, powoduje tworzenie się porów przez błonę komórkową. To jest elektroporacja. Komórki rosnące na nieprzewodzącej powierzchni szkła bezpośrednio przylegającej do elektroporowanego obszaru nie pobierają żółtego Lucyfera przez elektroporację, ale pozyskują barwnik fluorescencyjny, gdy jest on do nich przekazywany przez złącza szczelinowe, które łączą je z elektroporowanymi ogniwami. Wyniki transferu barwnika z komórki do komórki można obserwować pod mikroskopem przy oświetleniu fluorescencyjnym. Technika ta pozwala na precyzyjne ilościowe określenie komunikacji na skrzyżowaniach szczelinowych. Ponadto może być stosowany do wprowadzania peptydów lub innych cząsteczek nieprzepuszczalnych, a przenoszenie małych elektroporowanych peptydów przez złącza szczelinowe w celu zahamowania sygnału w sąsiednich, nieelektroporowanych komórkach jest potężną demonstracją hamowania sygnału.

Rycina 2 przedstawia komórki nabłonkowe wątroby szczura T51B22, poddane elektroporacji barwnikiem LY i sfotografowane w świetle fluorescencyjnym (panel A i B) lub w kontraście fazowym (C), po utrwaleniu i przemyciu. Na panelu A krawędź obszaru poddanego elektroporacji zaznaczono na czerwono. Gradient fluorescencji po prawej stronie czerwonej linii oznacza transport przez połączenia szczelinowe. Na Ryciniach 3A i 3B przedstawiono ilościową ocenę komunikacji prz...

Ta prezentacja demonstruje metodę, za pomocą której elektroporacja przylegających, hodowanych komórek jest używana do badania komunikacji międzykomórkowej, połączeniowej, podczas gdy komórki rosną na szkiełku pokrytym przewodzącym i przezroczystym tlenkiem indu i cyny.

Test funkcjonalny do badania łączenia luk; Elektroporacja ogniw adherentnych na tlenku indu i cyny

In this technique, cells are cultured on a glass slide that is partly coated with indium-tin oxide (ITO), a transparent, electrically conductive material. ...

Elektroporacja to technika, w której do żywych komórek przykłada się prąd elektryczny w celu otwarcia przejściowych porów w błonie komórkowej. Przez te pory do wnętrza komórki mogą wniknąć barwniki i inne cząsteczki, które normalnie nie przenikają przez błonę komórkową; pory te szybko się zamykają, nie powodując uszkodzenia komórki. Opiszemy, w jaki sposób można przeprowadzić elektroporację komórek adherentnych podczas ich wzrostu na szkiełku, które jest częściowo pokryte materiałem przewodzącym prąd i przezroczystym.Materiał ten stanowi tlenek indu i cyny, który dzięki przewodzeniu prądu elektrycznego otwiera pory umożliwiające wniknięcie barwnika do komórki. Pozwala to na zbadanie, czy komórki posiadają połączenia szczelinowe oraz w jakiej liczbie; są to niewielkie kanały łączące wnętrza sąsiednich komórek i umożliwiające transport małych cząsteczek. Od dawna wiadomo, że komunikacja poprzez połączenia szczelinowe pełni szereg istotnych funkcji w komórce, w tym bierze udział w transformacji nowotworowej i przerzutowaniu.Witamy w prezentacji projektów komórkowych na temat przeprowadzania elektroporacji komórek adherentnych przy użyciu urządzenia Insitu. Na tym obrazie widać, co udało nam się osiągnąć: barwnik fluorescencyjny w kolorze żółtym został wprowadzony do komórek rosnących na przezroczystym i przewodzącym szkle. Do tej linii; linia jest lepiej widoczna w kontraście fazowym.Oto wynik. Można zauważyć, że barwnik przedostał się przez połączenia szczelinowe z komórek po lewej stronie, które zostały załadowane barwnikiem metodą elektroporacji, do komórek po prawej stronie. Skutkuje to powstaniem gradientu fluorescencji w komórkach poddanych trypsynizacji.Następnie przeniesiono je do probówki do wirowania. Bardzo ważne jest, aby komórki były dobrze rozłożone podczas wzrostu w komorze. Z tego powodu najlepiej jest poddać komórki wirowaniu w celu usunięcia wszelkich śladów trypsyny.Medium zawierający ślady trypsyny zostaje odessany, a komórki resuspensowane w około jednym mililitrze pożywki wzrostowej, a następnie naniesione do komory. Pipeta zawiera zawiesinę komórek; należy zdjąć pokrywkę z komory i nanosić komórki pipetą kroplami do wnętrza komory, aby ułatwić jej transport. Komora zostaje umieszczona w sześciocentymetrowej szalce Petriego.Komorę umieszcza się ponownie w inkubatorze w celu hodowli komórek. Wysiane komórki odpowiednio się rozprzestrzenią, a następnie urosną tak, by ze sobą stykać i tworzyć połączenia szczelinowe. Gdy komórki będą gotowe do elektroparady, należy ustawić generator impulsów in situ zgodnie z pożądanymi warunkami.Opis prostego procesu konfiguracji znajduje się w instrukcji obsługi. Po ustawieniu napięcia na urządzeniu insitu zapali się czerwona lampka na klawiaturze. Wyjmij z kąpieli wodnej dwie ogrzane butelki DMEM bez wapnia: jedną zawierającą DMEM bez wapnia z dializowaną surowicą oraz jedną z samym DMEM.W przypadku braku wapnia, przygotować pipety i nabić do pipetora końcówki żółte. Zamiast sygnału, wyjąć komórki z inkubatora. Najpierw usunąć medium, odwracając naczynie nad zlewkiem do płukania.Następnie należy osuszyć tkankę, przykładając do niej chusteczkę, a potem przemyć ją raz medium DMEM bez wapnia; nie należy starać się usunąć całkowicie całego DMEM, ponieważ komórki mogą wyschnąć. Ostrożnie nanieść Lucifer yellow na barierę w taki sposób, aby nie zakłócić rozmieszczenia komórek, ale wystarczająco szybko, by komórki nie wyschły. Do każdej połowy komory należy użyć 200 µL.Nałóż pokrywkę na komorę in situ, a następnie umieść ją w suwaku. Popychając suwak, upewnij się, że wypusty na końcach komory pasują do gniazd w suwaku. Wsuń komorę do uchwytu komory.Naciśnij przycisk impulsu na klawiaturze generatora impulsów. Dioda LED na generatorze impulsów oraz na uchwycie komory będzie migać na czerwono podczas procesu elektroporacji, a następnie zacznie migać na zielono, sygnalizując zakończenie cyklu inicjującego. Przesuń suwak z powrotem pod uchwyt komory i wyjmij komorę.Odssać większość barwnika Lucifer yellow w celu jego ponownego wykorzystania, uważając jednak, aby nie doprowadzić do wyschnięcia komórek. Dodać DMEM bez wapnia. W przypadku zastosowania serum dializowanego, serum pomaga w zamknięciu porów; komorę należy umieścić z powrotem w inkubatorze, aby umożliwić transfer Lucifer yellow poprzez połączenia szczelinowe.Czas trwania musi być spójny pomiędzy poszczególnymi eksperymentami. Standardem są trzy minuty. Odlać pożywkę do zlewki z odpadami.Za pomocą pasty lub pipety dodać 4% roztwór utrwalający z formaldehydem i odczekać w temperaturze pokojowej co najmniej dwie minuty. Odlać formaldehyd i przepłukać kilka razy buforem PBS; komórki są w ten sposób przytwierdzone do szkła, więc istnieje niewielkie ryzyko ich odklejenia podczas płukania.Aby móc obserwować komórki w kontraście fazowym, należy nałożyć na komorę szkiełko nakrywkę. Napełnij komorę PBS w taki sposób, aby utworzył się wypukły menisk. Następnie, unikając pęcherzyków powietrza, nałóż szkiełko nakrywkę.Nie przejmuj się, jeśli PBS przeleje się z naczynia. Nadmiar PBS należy wchłonąć ręcznikiem papierowym. Będziesz potrzebować odwróconego mikroskopu fluorescencyjnego, najlepiej z kontrastem fazowym i blokiem filtrów do Lucifer yellow. W trybie kontrastu fazowego zlokalizuj krawędź obszaru poddanego elektroporacji.Pod wpływem fluorescencji widoczne będą dwie linie komórek. Połowa preparatu będzie intensywnie fluorescować. Linia znajdująca się najbliżej świecących komórek wyznacza krawędź obszaru poddanego elektroporacji.Każda fluorescencja poza tym obszarem wynika z transportu lucer yellow poprzez połączenia szczelinowe. Na przykład, ten obraz komórek nabłonkowych pokazuje komórki poddane elektroporacji po lewej stronie obrazu, które przekazują Lucifer yellow do sąsiednich komórek niepoddanych elektroporacji, tworząc gradient świecących komórek od krawędzi powłoki przewodzącej w stronę prawą. Ten obraz przedstawia ten sam kadr komórek w kontraście fazowym.Należy zauważyć, że linia X jest bardzo wyraźnie widoczna. Ilościowy pomiar zakresu transferu przez połączenia szczelinowe można przeprowadzić ręcznie, analizując obrazy fluorescencyjne i w kontraście fazowym elektroporowanych komórek. Gwiazdki wzdłuż krawędzi obszaru przewodzącego oznaczają komórki donora.Zostały one poddane elektroporacji, w wyniku czego pobrały wolny lucyferazy dla koloru żółtego. Przekazują lucyferazę dla koloru żółtego do sąsiednich komórek po prawej stronie, które przekazują ją dalej. Dzieje się to w coraz mniejszych ilościach.Stosunek kropek do gwiazdek, wynoszący w tym przypadku 41 do ośmiu, pozwala wyznaczyć wartość służącą do porównania zakresu transferu przez połączenia szczelinowe w danym przypadku. Wskaźnik połączeń szczelinowych wynosi 5,1. Alternatywą dla ręcznego znakowania i liczenia komórek jest wykorzystanie oprogramowania do analizy obrazu w celu zmierzenia względnej intensywności świecenia wzdłuż nieelektroporowanej strony granicy komórki.Komórki te nie posiadają połączeń szczelinowych. Tutaj widoczna jest prawa krawędź obszaru poddanego elektroporacji. Należy zauważyć, że brak gradientu fluorescencji w kontraście fazowym wskazuje na brak połączeń szczelinowych.Wszystkie komórki są wyraźnie widoczne. Należy zauważyć, że w tym przykładzie linia X jest również wyraźnie widoczna.Wszystkie komórki w komorze zostały stymulowane czynnikiem wzrostu naskórka EGF, a po 10 minutach utrwalone i poddane badaniu w kierunku fosfo-arc. Należy zauważyć, że barwione komórki po prawej stronie nie zostały poddane elektroporacji, natomiast komórki po lewej stronie, aż do tej linii, zostały poddane elektroporacji. Komórki niepoddane elektroporacji wykazują brązowe barwienie z użyciem przeciwciała anty-fosfo-irk oraz immunoperoksydazy.Komórki poddane elektroporacji nie wykazują barwienia, ponieważ elektroporowany fosfopeptyd zablokował domenę SH2 białka Grb2 i zahamował fosforylację ERK indukowaną przez EGF. Zwróć uwagę na obszar o szerokości trzech do czterech komórek po prawej stronie linii, w którym komórki nie były elektroporowane, a mimo to nie wykazują barwienia. Są to komórki, które pobrały peptyd blokujący od sąsiednich komórek poddanych elektroporacji poprzez połączenia szczelinowe.Jest to najsilniejszy możliwy dowód na to, że zahamowanie sygnału musi być spowodowane przez peptyd i nie może być artefaktem elektroporacji. Ponieważ komórki te nie zostały poddane elektroporacji, jest to ten sam kadr przedstawiony w kontraście fazowym. Należy zwrócić uwagę na brak jakichkolwiek zmian w morfologii po elektroporacji.W przypadku niektórych pacjentów komunikacja poprzez połączenia szczelinowe może być precyzyjnie określona ilościowo w szerokim zakresie hodowli komórkowych. Wprowadzanie peptydów w celu przerwania specyficznych szlaków sygnalizacyjnych jest potężnym podejściem do oceny w żywych komórkach znaczenia białek oraz oddziaływań białko-białko, które zostały zidentyfikowane przy użyciu oczyszczonych białek. Może to być pierwszy ważny krok w rozwoju leków peptydomimetycznych.

a-functional-assay-for-gap-junctional-examination-electroporation

Research

JoVE Journal

Biology

Biologia

Przetłumacz z en na pl. Zachowaj wszystkie tagi HTML i formatowanie dokładnie. Wypisz tylko tłumaczenie.

Funkcjonalne badanie połączeń przestrzennych; Elektroporacja przylegających komórek na tlenku indu-cyny

Przedstawimy sposób badania wpływu pojedynczej mutacji punktowej na funkcję kanału jonowego.

Mutageneza i analiza funkcjonalna kanałów jonowych heterologicznie eksprymowanych w komórkach ssaków

Niezawodna metoda wysokowydajnej ekspresji in vitro i następującego po niej zapisu elektrofizjologicznego rekombinowanych napięciowo zależnych kanałów jonowych w hodowlach ludzkich komórek embrionalnej nerki (HEK-293T).

Zoptymalizowana strategia transfekcji dla ekspresji i rejestracji elektrofizjologicznej rekombinowanych napięciowo zależnych kanałów jonowych w komórkach HEK-293T

Opisano test częstotliwości adhezji służący do pomiaru kinetyki oddziaływań receptor-ligand w sytuacjach, gdy obie cząsteczki są zakotwiczone na powierzchniach oddziałujących komórek. Ten oparty na mechanice test został zilustrowany z wykorzystaniem ludzkiego erytrocyta poddanego ciśnieniu za pomocą mikropipety jako sensora adhezji oraz integryny αLβ2 i cząsteczki adhezyjnej międzykomórkowej 1 jako oddziałujących receptorów i ligandów.

Analiza częstotliwości adhezji w celu badania kinetyki in situ międzykomórkowych oddziaływań molekularnych w obrębie złączy komórkowych

Opisujemy tutaj, jak wykonać mikroiniekcję pojedynczej komórki Lucyfera Żółtego, aby zobrazować komunikację komórkową poprzez połączenia szczelinowe w żywych komórkach, i podajemy kilka przydatnych wskazówek. Oczekujemy, że ten artykuł pomoże każdemu ocenić stopień sprzężenia komórkowego z powodu funkcjonalnych połączeń szczelinowych. Wszystko, co tu opisano, można by w zasadzie zaadaptować do innych barwników fluorescencyjnych o masie cząsteczkowej poniżej 1000 daltonów.

Mikroiniekcja jednokomórkowa do analizy komunikacji komórkowej

Ten protokół omawia Wykrywanie Impedancji Elektrycznej Komórki, metodę rejestrowania i analizy widma impedancji przylegających komórek do ilościowego określenia przyczepienia, proliferacji, ruchliwości i reakcji komórkowych na bodźce farmakologiczne i toksyczne. Położono nacisk na wykrywanie przepuszczalności śródbłonka oraz ocenę kontaktów komórka-komórka i komórka-substrat.

Wykrywanie impedancji substratu elektrycznego podłoża komórkowego w celu ilościowego określenia proliferacji śródbłonka, funkcji bariery i ruchliwości

Ten protokół opisuje technikę przenoszenia barwnika metodą skalpela i fluorescencyjnego, która mierzy komunikację międzykomórkową poprzez kanały połączeń szczelinowych. Komunikacja międzykomórkowa ze skrzyżowaniem szczelinowym jest głównym procesem komórkowym, w którym utrzymywana jest homeostaza tkanek, a zakłócenie tej sygnalizacji komórkowej ma niekorzystne skutki zdrowotne.

Komunikacja międzykomórkowa ze skrzyżowaniem szczelinowym: funkcjonalny biomarker do oceny niekorzystnych skutków toksyn i toksyn oraz korzyści zdrowotnych produktów naturalnych

Dostosowaliśmy przepuszczalną mikroporowatą wkładkę membranową do naśladowania mikrośrodowiska guza (TME). Model składa się z mieszanej hodowli komórek, pozwala na uproszczone generowanie wysoce wzbogaconych pojedynczych populacji komórek bez użycia znakowania fluorescencyjnego lub sortowania komórek oraz pozwala na badanie komunikacji międzykomórkowej w obrębie TME w warunkach normalnych lub stresowych.

Naśladownictwo mikrośrodowiska guza: prosta metoda generowania wzbogaconych populacji komórek i badania komunikacji międzykomórkowej

Tutaj prezentujemy protokół dla nowatorskiego testu komunikacji międzykomórkowej z połączeniem szczelinowym, przeznaczonego do wysokoprzepustowych badań przesiewowych substancji chemicznych modulujących złącze szczelinowe w celu odkrycia leków i oceny toksykologicznej.

Test komunikacji międzykomórkowej z jodkowo-żółtą fluorescencyjną przerwą białkową-złącze szczelinowe

Nabłonek jelitowy zapewnia nie tylko wchłanianie składników odżywczych, ale także ochronę przed szkodliwymi substancjami. Najbardziej wierzchołkowo-nabłonkowe połączenie międzykomórkowe, czyli połączenie ścisłe, reguluje przepuszczalność substancji rozpuszczonej i jonów parakomórkowych. W tym miejscu opisano protokół przygotowania arkuszy błony śluzowej oraz oceny selektywności jonowej połączeń ścisłych techniką komory usingowej.

Funkcjonalna ocena bariery połączeń ścisłych jelit i przepuszczalności jonów w tkance natywnej techniką komory ussingowej

Tutaj prezentujemy protokół do wyrażania białek połączeniowych w oocytach Xenopus i rejestrowania prądu połączeniowego między dwoma przypisanymi oocytami za pomocą komercyjnego wzmacniacza zaprojektowanego do zapisów napięcia z dwoma oocytami w trybie pomiaru wysokiego prądu bocznego.

Rejestrowanie prądu złącza szczelinowego z oocytów Xenopus

Elektroporacja porowatego podłoża (PSEP) łączy spójne, wysokowydajne dostarczanie z wysoką żywotnością ogniw. Wprowadzenie pomiarów transnabłonkowej impedancji elektrycznej (TEEI) zapewnia wgląd w pośrednie procesy PSEP i pozwala na dostarczanie bez etykietowania. W tym artykule omówiono metodę jednoczesnego przeprowadzania eksperymentów z dostarczaniem PSEP i analizy pomiarów TEEI.

Elektroporacja na bazie porowatego podłoża z monitorowaniem transepitelalnej impedancji elektrycznej

Poznaj metodę elektroporacji ogniw adherentnych na tlenku indu i cynu do badania komunikacji międzykomórkowej przez złącza szczelinowe. Technika ta umożliwia wprowadzanie barwników i analizę funkcji złączy w żywych komórkach.

Test funkcjonalny do badania łączenia luk; Elektroporacja ogniw adherentnych na tlenku indu i cyny

Przeglądaj więcej filmów