Test funkcjonalny do badania łączenia luk; Elektroporacja ogniw adherentnych na tlenku indu i cyny

Elektroporacja to technika, w której prąd elektryczny jest podawany do żywych komórek w celu otwarcia przejściowych porów na błonie komórkowej. Przez te pory barwniki i inne cząsteczki, które normalnie nie przechodzą przez błonę komórkową, mogą dostać się do komórki, pory szybko się zamykają, bez uszkodzenia komórki. Opiszemy, w jaki sposób ogniwa przylegające mogą być elektroporowane podczas wzrostu na szkiełku, które jest częściowo pokryte przewodzącym prąd elektryczny i przezroczystym materiałem.

Materiał to tlenek indu i cyny, a ponieważ przewodzi prąd elektryczny, otwiera pory, które umożliwiają barwnikowi przedostanie się do komórki. Następnie można zbadać, czy komórki mają połączenia szczelinowe, czy nie, a ile połączeń szczelinowych to małe kanały, które łączą wnętrza sąsiednich komórek i umożliwiają przejście małych cząsteczek. Od dawna wiadomo, że komunikacja węzłowa ma wiele ważnych funkcji w komórce, w tym transformację nowotworową i przerzuty.

Witamy w prezentacji projektów ogniw o tym, jak wykonać elektroporację ogniw adherentnych za pomocą Insitu. To zdjęcie pokazuje, co będziemy w stanie zrobić, że barwnik fluorescencyjny luźny dla żółtego został wprowadzony do komórek rosnących na przezroczystym i przewodzącym szkle. Do tej linii linia jest lepiej widoczna przy kontraście fazowym.

Oto jest. Widać, że barwnik dyfundował przez połączenia szczelinowe z komórek po lewej stronie, które zostały załadowane barwnikiem przez elektroporację do komórek po prawej. W wyniku tego gradientu komórek fluorescencyjnych są trypy.

Inizowane, a następnie przenoszone do probówki w wirówce. Bardzo ważne jest, aby komórki były dobrze rozłożone podczas wzrostu w komorze. Z tego powodu najlepiej jest odwirować komórki, aby usunąć wszelkie ślady trypsyny.

Pożywka ze śladowymi ilościami trypsyny jest odsysana z komórek, jest ponownie zawieszana w około jednym mililitrze pożywki wzrostowej, a następnie siana w komorze. Pipeta zawiera zawiesinę komórek, zdejmij pokrywę z komory i pipetuj komórki kroplami do komory, aby ułatwić jej przenoszenie. Komora umieszczona jest na sześciocentymetrowej szalce Petriego.

Komora wraca do inkubatora, aby komórki mogły rosnąć. Platerowane komórki będą się dobrze rozprzestrzeniać i będą rosły, stykając się ze sobą i tworząc połączenia szczelinowe. Gdy ogniwa są gotowe do parady elektrycznej, ustaw generator impulsów insitu na żądane warunki.

Zapoznaj się z instrukcją, aby zapoznać się z opisem prostego procesu konfiguracji. Po ustawieniu napięcia na insitu zaświeci się czerwona lampka na klawiaturze. Wyjmij dwie podgrzane butelki DMEM bez wapnia z łaźni wodnej, jedna to DMEM bez wapnia, ale z dializowaną surowicą, a druga to DMEM.

Bez wapnia należy przygotować pipety, luźniej naładować je do pipety na żółto. Zamiast westchnienia wyjmij komórki z inkubatora. Usunąć pożywkę, odwracając ją najpierw w zlewce do płukania.

Następnie, wklepując go w płyn do mycia tkanek raz za pomocą DMEM bez wapnia, nie próbuj usuwać absolutnie całego DMEM, ponieważ komórki mogą wyschnąć. Ostrożnie dodaj żółty Lucyfer do bariery, aby nie przeszkadzać komórkom, ale na tyle szybko, aby komórki nie wyschły. Użyj 200 mikrolitrów na każdą połowę komory.

Załóż pokrywkę na komorę insitu, a następnie załaduj ją do suwaka. Upewnij się, że końcowe zaczepy komory pasują do szczelin suwaka, naciskając suwak. Włóż komorę do uchwytu komory.

Naciśnij przycisk impulsowy na klawiaturze generatora impulsów. Dioda LED na generatorze impulsów i na uchwycie komory będzie migać na czerwono podczas procesu elektroporacji, a następnie migać na zielono, wskazując, że cykl inicjacyjny został zakończony. Pociągnij suwak z powrotem pod uchwyt komory i wyjmij komorę.

Odessaj większość żółtego Lucyfera, aby użyć go ponownie, ale uważaj, aby nie wysuszyć komórek. Dodaj DMEM bez wapnia. W przypadku dializowanej surowicy surowica pomaga porowatemu zamknąć komorę, która wraca do inkubatora, aby nastąpiło przeniesienie żółtego Lucyfera przez połączenia szczelinowe.

Czas musi być spójny w każdym eksperymencie. Norma to trzy minuty. Odlej pożywkę do zlewki na odpady.

Dodaj 4% roztwór utrwalający formaldehyd za pomocą pasty lub pipety, Odczekaj w temperaturze pokojowej przez co najmniej dwie minuty. Odlej formaldehyd i spłucz kilka razy. W przypadku PBS ogniwa są przymocowane do szkła, więc nie ma niebezpieczeństwa, że odczepią się podczas prania.

Aby móc zobaczyć komórki w kontraście fazowym, ważne jest, aby umieścić szkiełko nakrywkowe na górze komory. Wypełnij komorę PBS, tworząc dumną łąkotkę. Unikając pęcherzyków powietrza, umieść szkiełko nakrywkowe.

Nie martw się, jeśli PBS się przeleje Po prostu wchłonij dodatkowy PBS na tkankę. Potrzebujesz odwróconego mikroskopu fluorescencyjnego, najlepiej z kontrastem fazowym i blokiem filtrującym do żółtego Lucyfera. W obszarze kontrastu fazowego poszukaj krawędzi obszaru poddanego elektroporacji.

Zobaczysz dwie linie pod komórkami fluorescencyjnymi. Na połowie zjeżdżalni będzie intensywnie fluoryzować. Linia najbliższa świecącym ogniwom jest krawędzią obszaru poddanego elektroporacji.

Wszelka fluorescencja poza tym jest spowodowana przenoszeniem lucer yellow przez połączenia szczelinowe. Na przykład, ten obraz komórek nabłonkowych pokazuje komórki, które były elektro po lewej stronie obrazu, przenosząc żółty Lucyfer do sąsiednich komórek nieelektroporowanych, tworząc gradient świecących komórek od krawędzi powłoki przewodzącej w prawo. Na tym obrazie przedstawiono tę samą klatkę komórek w kontraście fazowym.

Zauważ, że linię X widać bardzo wyraźnie. Ilościowy pomiar tego, jak bardzo nastąpił transfer złącza szczelinowego, można wykonać ręcznie, pracując z obrazami fluorescencyjnymi i obrazami kontrastu fazowego ogniw elektroporowanych. Gwiazdy wzdłuż krawędzi obszaru przewodzącego są uważane za komórki dawcze.

Zostały one poddane elektroporacji i pobrane luzem na kolor żółty. Przekazują luc na żółty do sąsiednich komórek po prawej stronie, które przekazują go dalej. Jeszcze dalej w malejących ilościach.

Stosunek kropek do gwiazd 41 do ośmiu w tym przypadku może dać liczbę do porównania, jak rozległy jest transfer węzłowy w tym przypadku. 5.1 to indeks skrzyżowania szczeliny. Alternatywą dla ręcznego znakowania i liczenia ogniw jest użycie oprogramowania do analizy obrazu w celu zmierzenia względnej ilości świecenia wzdłuż niewybranej strony obramowania ogniwa elektroporowanego.

Ogniwa te nie mają połączeń szczelinowych. Oto prawa krawędź obszaru poddanego elektroporacji. Należy pamiętać, że nie ma gradientu fluorescencji, co wskazuje na brak połączeń szczelinowych pod wpływem kontrastu fazowego.

Możesz wyraźnie zobaczyć wszystkie komórki. Zwróć uwagę, że linia X jest również wyraźnie widoczna. W tym przykładzie.

Wszystkie komórki w komorze zostały pobudzone naskórkowym czynnikiem wzrostu EGF, a 10 minut później utrwalone i zbadane pod kątem łuku fosfonowego. Zauważ, że poplamione ogniwa po prawej stronie nie zostały poddane elektroporacji, a ogniwa po lewej stronie aż do tej linii zostały poddane elektroporacji. Komórki niepoddane elektroporacji wykazują brązowe zabarwienie przeciwciałem phospho irk i immunoperoksydazą.

Elektroporowane komórki nie wykazują barwienia, ponieważ elektroporowany peptyd fosforowy zablokował domenę SSH two chwytania drugiego i zahamował fosforylację irk EGF. Zwróć uwagę, że obszar o długości od trzech do czterech komórek po prawej stronie linii, w którym komórki nie były elektryczne, ale nie wykazują zabarwienia. Są to komórki, które nabyły peptyd blokujący od swoich elektroporowanych sąsiadów poprzez połączenia szczelinowe.

Jest to najmocniejszy możliwy dowód na to, że hamowanie sygnału musi być spowodowane przez peptyd i nie może być artefaktem elektroporacji. Ponieważ ogniwa te nie są elektroporowane, jest to ten sam ramka, którą pokazano pod kontrastem fazowym. Zwróć uwagę na brak jakichkolwiek zmian w morfologii po elektroporacji.

U niektórych pacjentów komunikacja węzłowa może być ilościowa, precyzyjnie w wielu różnych hodowanych komórkach. Wprowadzenie peptydów w celu przerwania określonych szlaków sygnałowych jest skutecznym podejściem do oceny znaczenia w żywych komórkach interakcji białek, białek, które zostały zidentyfikowane z oczyszczonymi białkami. Może to być pierwszy ważny krok w rozwoju leków peptydowych.