Name: Uśrednianie kolców glikoproteiny otoczki wirusowej z rekonstrukcji kriotomografii elektronowej przy użyciu Jsubtomo (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-10-21T13:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 29 s
Description: Poznaj metodę uśredniania kolców glikoprotein wirusowych z rekonstrukcji kriotomografii elektronowej przy użyciu Jsubtomo. Technika umożliwia badanie białek błonowych w ich naturalnym środowisku z rozdzielczością 35 angstremów.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

Ta praca była wspierana przez Akademię Fińską (130750 i 218080 do J.T.H.), Wellcome Trust (090532/Z/09/Z; 089026/Z/09/Z do T.A.B.) oraz przez MRC (MR/J007897/1 do J.T.H i T.A.B; MR/L009528/1 do T.A.B.).

<ol><li>Nickell, S., Mihalache, O., Beck, F., Hegerl, R., Korinek, A., Baumeister, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Structural+analysis+of+the+26S+proteasome+by+cryoelectron+tomography%5BTitle%5D)+AND+%22Biochemical+and+biophysical+research+communications%22%5BJournal%5D)">Structural analysis of the 26S proteasome by cryoelectron tomography.</a> Biochemical and biophysical research communications. 353 (1), 115-120 (2007).</li>
<li>Goldie, K. N., Wedig, T., Mitra, A. K., Aebi, U., Herrmann, H., Hoenger, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dissecting+the+3-D+structure+of+vimentin+intermediate+filaments+by+cryo-electron+tomography%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+structural+biology%22%5BJournal%5D)">Dissecting the 3-D structure of vimentin intermediate filaments by cryo-electron tomography.</a> Journal of structural biology. 158 (3), 378-385 (2007).</li>
<li>Cheng, Y., Boll, W., Kirchhausen, T., Harrison, S. C., Walz, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cryo-electron+tomography+of+clathrin-coated+vesicles%3A+structural+implications+for+coat+assembly%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+molecular+biology%22%5BJournal%5D)">Cryo-electron tomography of clathrin-coated vesicles: structural implications for coat assembly.</a> Journal of molecular biology. 365 (3), (2007).</li>
<li>Grünewald, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Three-dimensional+structure+of+herpes+simplex+virus+from+cryo-electron+tomography%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Three-dimensional structure of herpes simplex virus from cryo-electron tomography.</a> Science. 302 (5649), 1396-1398 (2003).</li>
<li>Murphy, G. E., Leadbetter, J. R., Jensen, G. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+situ+structure+of+the+complete+Treponema+primitia+flagellar+motor%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">In situ structure of the complete Treponema primitia flagellar motor.</a> Nature. 442 (7106), 1062-1064 (2006).</li>
<li>Medalia, O., Weber, I., Frangakis, A., Nicastro, D., Gerisch, G., Baumeister, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Macromolecular+architecture+in+eukaryotic+cells+visualized+by+cryoelectron+tomography%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Macromolecular architecture in eukaryotic cells visualized by cryoelectron tomography.</a> Science. 298 (5596), 1209-1213 (2002).</li>
<li>Heymann, J. B., Cardone, G., Winkler, D. C., Steven, A. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Computational+resources+for+cryo-electron+tomography+in+Bsoft%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+structural+biology%22%5BJournal%5D)">Computational resources for cryo-electron tomography in Bsoft.</a> Journal of structural biology. 161 (3), 232-242 (2008).</li>
<li>Kremer, J., Mastronarde, D., McIntosh, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Computer+visualization+of+three-dimensional+image+data+using+IMOD%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+structural+biology%22%5BJournal%5D)">Computer visualization of three-dimensional image data using IMOD.</a> Journal of structural biology. 116 (1), 71-76 (1996).</li>
<li>Castaño-Díez, D., Kudryashev, M., Arheit, M., Stahlberg, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dynamo%3A+a+flexible%2C+user-friendly+development+tool+for+subtomogram+averaging+of+cryo-EM+data+in+high-performance+computing+environments%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+structural+biology%22%5BJournal%5D)">Dynamo: a flexible, user-friendly development tool for subtomogram averaging of cryo-EM data in high-performance computing environments.</a> Journal of structural biology. 178 (2), 139-151 (2012).</li>
<li>Hrabe, T., Chen, Y., Pfeffer, S., Cuellar, L. K., Mangold, A. -V., Förster, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((PyTom%3A+a+python-based+toolbox+for+localization+of+macromolecules+in+cryo-electron+tomograms+and+subtomogram+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+structural+biology%22%5BJournal%5D)">PyTom: a python-based toolbox for localization of macromolecules in cryo-electron tomograms and subtomogram analysis.</a> Journal of structural biology. 178 (2), 177-188 (2012).</li>
<li>Fernández, J. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Computational+methods+for+electron+tomography%5BTitle%5D)+AND+%22%22%5BJournal%5D)">Computational methods for electron tomography.</a> 43 (10), Micron (Oxford, England). 1010-1030 (2012).</li>
<li>Briggs, J. A. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Structural+biology+in+situ--the+potential+of+subtomogram+averaging%29%5BTitle%5D)+AND+%22Current+opinion+in+structural+biology%22%5BJournal%5D)">Structural biology in situ--the potential of subtomogram averaging).</a> Current opinion in structural biology. 23 (2), 261-267 (2013).</li>
<li>Frangakis, A. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+of+macromolecular+complexes+in+cryoelectron+tomograms+of+phantom+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Identification of macromolecular complexes in cryoelectron tomograms of phantom cells.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 99 (22), 14153-14158 (2002).</li>
<li>Zanetti, G., Briggs, J. A. G., Grünewald, K., Sattentau, Q. J., Fuller, S. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cryo-electron+tomographic+structure+of+an+immunodeficiency+virus+envelope+complex+in+situ%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+pathogens%22%5BJournal%5D)">Cryo-electron tomographic structure of an immunodeficiency virus envelope complex in situ.</a> PLoS pathogens. 2 (8), (2006).</li>
<li>Liu, J., Bartesaghi, A., Borgnia, M. J., Sapiro, G., Subramaniam, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Molecular+architecture+of+native+HIV-1+gp120+trimers%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Molecular architecture of native HIV-1 gp120 trimers.</a> Nature. 455 (7209), (2008).</li>
<li>Meyerson, J. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Determination+of+molecular+structures+of+HIV+envelope+glycoproteins+using+cryo-electron+tomography+and+automated+sub-tomogram+averaging%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+visualized+experiments+%3A+JoVE%22%5BJournal%5D)">Determination of molecular structures of HIV envelope glycoproteins using cryo-electron tomography and automated sub-tomogram averaging.</a> Journal of visualized experiments : JoVE. (58), (2011).</li>
<li>Baker, T. S., Olson, N. H., Fuller, S. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Adding+the+third+dimension+to+virus+life+cycles%3A+three-dimensional+reconstruction+of+icosahedral+viruses+from+cryo-electron+micrographs%5BTitle%5D)+AND+%22Microbiology+and+molecular+biology+reviews+%3A+MMBR%22%5BJournal%5D)">Adding the third dimension to virus life cycles: three-dimensional reconstruction of icosahedral viruses from cryo-electron micrographs.</a> Microbiology and molecular biology reviews : MMBR. 63 (4), 862-922 (1999).</li>
<li>Huiskonen, J. T., Butcher, S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Membrane-containing+viruses+with+icosahedrally+symmetric+capsids%5BTitle%5D)+AND+%22Current+opinion+in+structural+biology%22%5BJournal%5D)">Membrane-containing viruses with icosahedrally symmetric capsids.</a> Current opinion in structural biology. 17 (2), 229-236 (2007).</li>
<li>Liljeroos, L., Huiskonen, J. T., Ora, A., Susi, P., Butcher, S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Electron+cryotomography+of+measles+virus+reveals+how+matrix+protein+coats+the+ribonucleocapsid+within+intact+virions%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Electron cryotomography of measles virus reveals how matrix protein coats the ribonucleocapsid within intact virions.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 108 (44), (2011).</li>
<li>Arranz, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+structure+of+native+influenza+virion+ribonucleoproteins%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">The structure of native influenza virion ribonucleoproteins.</a> Science. 338 (6114), 1634-1637 (2012).</li>
<li>Karotki, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Eisosome+proteins+assemble+into+a+membrane+scaffold%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Eisosome proteins assemble into a membrane scaffold.</a> Journal of Cell Biology. 195 (5), 889-902 (2011).</li>
<li>Pietilä, M. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Virion+architecture+unifies+globally+distributed+pleolipoviruses+infecting+halophilic+archaea%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+virology%22%5BJournal%5D)">Virion architecture unifies globally distributed pleolipoviruses infecting halophilic archaea.</a> Journal of virology. 86 (9), 5067-5079 (2012).</li>
<li>Huiskonen, J. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Electron+cryotomography+of+Tula+hantavirus+suggests+a+unique+assembly+paradigm+for+enveloped+viruses%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+virology%22%5BJournal%5D)">Electron cryotomography of Tula hantavirus suggests a unique assembly paradigm for enveloped viruses.</a> Journal of virology. 84 (10), 4889-4897 (2010).</li>
<li>Bowden, T. A., Bitto, D., McLees, A., Yeromonahos, C., Elliott, R. M., Huiskonen, J. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Orthobunyavirus+ultrastructure+and+the+curious+tripodal+glycoprotein+spike%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+pathogens%22%5BJournal%5D)">Orthobunyavirus ultrastructure and the curious tripodal glycoprotein spike.</a> PLoS pathogens. 9 (5), (2013).</li>
<li>Maurer, U. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Structure+of+Herpesvirus+Fusion+Glycoprotein+B-Bilayer+Complex+Reveals+the+Protein-Membrane+and+Lateral+Protein-Protein+Interaction%5BTitle%5D)+AND+%22Structure%22%5BJournal%5D)">The Structure of Herpesvirus Fusion Glycoprotein B-Bilayer Complex Reveals the Protein-Membrane and Lateral Protein-Protein Interaction.</a> Structure. 21 (8), London, England. 1396-1405 (1993).</li>
<li>Gan, L., Ladinsky, M. S., Jensen, G. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chromatin+in+a+marine+picoeukaryote+is+a+disordered+assemblage+of+nucleosomes%5BTitle%5D)+AND+%22Chromosoma%22%5BJournal%5D)">Chromatin in a marine picoeukaryote is a disordered assemblage of nucleosomes.</a> Chromosoma. 122 (5), 377-386 (2013).</li>
<li>Scheres, S. H. W., Chen, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Prevention+of+overfitting+in+cryo-EM+structure+determination%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Prevention of overfitting in cryo-EM structure determination.</a> Nature. 9 (9), 853-854 (2012).</li>
<li>Heymann, J. B., Belnap, D. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bsoft%3A+image+processing+and+molecular+modeling+for+electron+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+structural+biology%22%5BJournal%5D)">Bsoft: image processing and molecular modeling for electron microscopy.</a> Journal of structural biology. 157 (1), 3-18 (2007).</li>
<li>Goddard, T. D., Huang, C. C., Ferrin, T. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Visualizing+density+maps+with+UCSF+Chimera%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+structural+biology%22%5BJournal%5D)">Visualizing density maps with UCSF Chimera.</a> Journal of structural biology. 157 (1), 281-287 (2007).</li>
<li>Faini, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+structures+of+COPI-coated+vesicles+reveal+alternate+coatomer+conformations+and+interactions%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">The structures of COPI-coated vesicles reveal alternate coatomer conformations and interactions.</a> Science. 336 (6087), 1451-1454 (2012).</li>
<li>Wu, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fabs+enable+single+particle+cryoEM+studies+of+small+proteins%5BTitle%5D)+AND+%22Structure%22%5BJournal%5D)">Fabs enable single particle cryoEM studies of small proteins.</a> Structure. 20 (4), London, England. 582-592 (2012).</li>
</ol>

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Wiedza na temat struktury kolców glikoproteiny wirusa na błonie wirionu jest niezbędna do zrozumienia replikacji wirusa i opracowania środków terapeutycznych do leczenia i zapobiegania zakażeniom. Kriomikroskopia elektronowa w połączeniu z uśrednianiem pojedynczych cząstek stała się najczęściej stosowaną metodą rozwiązywania struktur otoczkowych cząstek wirusa, w tym kolców glikoproteiny. Jednak ta metoda jest ograniczona do wirusów symetrycznych ikozai. Tutaj, poprzez zastosowanie kriotomografii elektronowej i uśredniania subtomogramu w Jsubtomo, nakreśliliśmy ogólny protokół określania kolców glikoproteiny na pleomorficznych wirusach otoczkowych, które nie są podatne na inne obecne metody biologii strukturalnej. Nasze reprezentatywne wyniki pokazują, że rozdzielczość tej metody jest wystarczająca, aby ujawnić wgląd w architekturę domeny, oligomeryzację i organizację wyższego rzędu kolców glikoproteiny na nienaruszonych wirionach.

Najważniejszym krokiem w ramach tego protokołu jest skonstruowanie dwóch niezawodnych modeli wyjściowych, które są statystycznie niezależne od siebie. Pomyślne wykonanie tego kroku zakłada, że kolce glikoproteiny są wystarczająco duże i nie są zbyt ciasno upakowane względem siebie, tak aby poszczególne kolce mogły być wizualnie rozpoznane i ręcznie wybrane na tomogramach, a dwa niezależne modele uśrednione. Jeśli nie jest to wykonalne, można spróbować wprowadzić dwie modyfikacje protokołu. Po pierwsze, można skonstruować dwa niezależne modele losowe, definiując najpierw dwa losowe podzbiory podtomogramów, a następnie uśredniając podtomogramy w ramach tych podzbiorów30. Po drugie, jeśli struktura izolowanego kolca została wyprowadzona w inny sposób, na przykład za pomocą krystalografii rentgenowskiej, można ją wykorzystać jako model wyjściowy. Należy jednak zachować ostrożność, aby filtrować dolnoprzepustowy ten model za pomocą odcięcia o niskiej rozdzielczości (50-70 A), ponieważ dwa wynikowe modele w następnej rundzie udoskonalania będą statystycznie niezależne tylko po przekroczeniu tej rozdzielczości. Ze względu na to zastrzeżenie zalecane jest pierwsze podejście.

Rozdzielczość możliwa do uzyskania z tego protokołu zależy od czterech głównych czynników: i. strategii zbierania danych i jakości danych wejściowych, ii. liczba subtomogramów, iii. dokładność wyrównania subtomogramów oraz iv. niejednorodność struktur. Podczas gdy pierwsze i drugie ograniczenie można w dużej mierze przezwyciężyć poprzez zastosowanie bezpośrednich detektorów elektronów o wysokim współczynniku sygnału do szumu w połączeniu z tomografią korekcyjną CTF i automatycznym gromadzeniem danych, na dokładność dopasowania dodatkowo wpływa rozmiar i kształt samej struktury będącej przedmiotem zainteresowania. W przypadku stosowania tego protokołu do małych kolców pozbawionych widocznych cech, korzystne może być związanie fragmentów Fab z kolcem w celu poprawy dokładności wyrównania, a tym samym rozdzielczości31. Wreszcie, jeżeli struktury, które mają być uśrednione, wykazują wiele konformacji, metody klasyfikacji subtomogramowej mogą być stosowane do oddzielnego uśredniania różnych konformacji. W tym celu Jsubtomo integruje się z pakietem Dynamo, oferując potężną klasyfikację subtomogramu9.

Powyższy protokół jest komplementarny do krystalografii rentgenowskiej izolowanych glikoprotein wirusowych. Struktury krystalograficzne można dopasować do średnich subtomogramowych, aby uzyskać precyzyjną orientację glikoproteiny w stosunku do błony wirionu. Zastosowanie tej metodologii bez wątpienia będzie nadal rzucać światło na strukturę i patobiologię wirusa otoczkowego.

Kriotomografia elektronowa to technika obrazowania kriomikroskopii elektronowej, pozwalająca na obliczanie trójwymiarowej (3D) rekonstrukcji złożonych próbek biologicznych. Odpowiednie próbki obejmują zarówno oczyszczone kompleksy makromolekularne1, włókna2, pokryte pęcherzyki3 i pleomorficzne wirusy błonowe4, jak i całe komórki prokariotyczne5, a nawet cienkie obszary całych komórek eukariotycznych6. Po zebraniu danych z serii nachylenia, objętości tomograficzne 3D lub tomogramy mogą być obliczane przy użyciu kilku uznanych pakietów oprogramowania, w tym Bsoft7 i IMOD8.
Dwa aspekty nieodłącznie związane z badaniem próbek biologicznych za pomocą kriotomografii elektronowej ograniczają biologiczną interpretację odpowiednich objętości tomografii. Po pierwsze, ze względu na ograniczoną dawkę elektronów, którą można zastosować do materiałów biologicznych przed wprowadzeniem znacznych uszkodzeń radiacyjnych, stosunek sygnału do szumu w danych tomograficznych jest zazwyczaj bardzo niski. Po drugie, w wyniku ograniczonej geometrii nachylenia próbki podczas zbierania danych, niektóre widoki obiektu pozostają nieobecne, co prowadzi do tak zwanego artefaktu "brakującego klina" w objętości tomografii. Jednak oba te ograniczenia można przezwyciężyć, jeśli objętość tomograficzna zawiera powtarzające się identyczne struktury, takie jak kompleksy makromolekularne, które można z powodzeniem uśrednić9-12.
Przed uśrednieniem struktur z rekonstrukcji tomogramu, obiekty zainteresowania muszą zostać znalezione i wyrównane do tej samej orientacji. Lokalizację takich struktur można osiągnąć poprzez korelację krzyżową struktury szablonowej w objętości tomografii przy użyciu podejścia często określanego jako dopasowywanie szablonów13. Szablon używany w tym procesie dopasowywania może pochodzić z kriomikroskopii elektronowej lub kriotomografii elektronowej w połączeniu z rekonstrukcją 3D lub może to być mapa gęstości symulowana na podstawie struktury atomowej. W celu realizacji tych zadań opracowano kilka pakietów obliczeniowych11.
Uśrednianie kolców glikoproteinowych wirusów błonowych, takich jak HIV-1, było szczególnie skutecznym podejściem do badania ich struktury14-16. Zrozumienie tej struktury jest niezbędne do odkrycia zarówno molekularnych podstaw interakcji wirus-gospodarz, jak i ukierunkowania rozwoju leków przeciwwirusowych i projektów szczepionek. Podczas gdy krystalografia makromolekularna jest techniką z wyboru do analizy strukturalnej o wysokiej rozdzielczości (zwykle lepszej niż 4 A) pojedynczych glikoprotein wirusowych i ich kompleksów, struktury rentgenowskie wynikające z tej metody składają się z białek wyizolowanych z naturalnego środowiska błoniastego na wirionie. W związku z tym nadal brakuje ważnych szczegółów, takich jak architektura glikoprotein wirusowych wyższego rzędu w kontekście wirionu. Z drugiej strony, kriomikroskopia elektronowa i rekonstrukcja pojedynczych cząstek całych wirusów otoczkowych jest ograniczona do wirionów o symetrii dwudziestościennej17,18. Kriotomografia elektronowa w połączeniu z wyrównaniem podobjętości stała się zatem techniką uzupełniającą pozwalającą na badanie kolców glikoprotein pleomorficznych wirusów o nieregularnych kształtach in situ.
Opracowaliśmy oprogramowanie o nazwie Jsubtomo (www.opic.ox.ac.uk/jsubtomo) do wykrywania, dopasowywania i uśredniania tomograficznych podobjętości. Jsubtomo został wykorzystany do określenia struktury wielu struktur komórkowych i wirusowych19-26. W tym miejscu przedstawiamy szczegółowy protokół, który umożliwia określenie struktur kolców na powierzchni wirusa. Aby uniknąć nadmiernego wyrafinowania uśrednionych struktur poprzez korelację szumu, przyjęto schemat udoskonalania oparty na "złotym standardzie"10,27. Na koniec omówiono strategie wizualizacji i interpretacji typowych wyników.

<table><tbody><tr><td>Jsubtomo (ver 1.3.1)</td><td>University of Oxford</td><td>n/a</td><td>www.opic.ac.uk/jsubtomo</td></tr><tr><td>Bsoft (ver 1.8.7)</td><td>NIAMS, NIH</td><td>n/a</td><td>bsoft.ws</td></tr><tr><td>UCSF Chimera</td><td>UCSF</td><td>n/a</td><td>www.cgl.ucsf.edu/chimera</td></tr></tbody></table>

uśrednianie kolców glikoproteiny otoczki wirusowej z rekonstrukcji kriotomografii elektronowej przy użyciu jsubtomo

Averaging of Viral Envelope Glycoprotein Spikes from Electron Cryotomography Reconstructions using Jsubtomo

Wirusy otoczkowe wykorzystują glikoproteiny błonowe na swojej powierzchni do pośredniczenia w wejściu do komórek gospodarza. Trójwymiarowa analiza strukturalna tych "kolców" glikoproteiny jest często trudna technicznie, ale ważna dla zrozumienia patogenezy wirusa i projektowania leków. W tym miejscu przedstawiono protokół określania struktury kolców wirusowych poprzez uśrednianie obliczeniowe danych kriotomografii elektronowej. Kriotomografia elektronowa to technika mikroskopii elektronowej stosowana do uzyskiwania trójwymiarowych rekonstrukcji objętości tomograficznej lub tomogramów pleomorficznych próbek biologicznych, takich jak wirusy błonowe, w stanie zbliżonym do natywnego, zamrożonego i uwodnionego. Tomogramy te ukazują interesujące struktury w trzech wymiarach, choć w niskiej rozdzielczości. Uśrednianie obliczeniowe podobjętości lub subtomogramów jest niezbędne do uzyskania wyższej rozdzielczości szczegółów powtarzających się motywów strukturalnych, takich jak kolce glikoproteiny wirusa. Przedstawiono szczegółowe podejście obliczeniowe do wyrównywania i uśredniania podtomogramów przy użyciu pakietu oprogramowania Jsubtomo. Podejście to umożliwia wizualizację struktury kolców glikoproteiny wirusa z rozdzielczością w zakresie 20-40 A oraz badanie badania interakcji kolca-kolca wyższego rzędu na błonie wirionu. Typowe wyniki przedstawiono dla wirusa Bunyamwera, wirusa otoczkowego z rodziny Bunyaviridae. Rodzina ta jest strukturalnie zróżnicowaną grupą patogenów stanowiących zagrożenie dla zdrowia ludzi i zwierząt.

Prezentujemy zastosowanie opisanego powyżej schematu uśredniania subtomogramów dla kompleksu glikoprotein otoczki wirusa Bunyamwera (Orthobunyavirus, Bunyaviridae) z wykorzystaniem wcześniej opublikowanego zestawu danych24. Parametry gromadzenia i doprecyzowania danych wymieniono w Tabeli 1. Jeden reprezentatywny tomogram przedstawiono na Rysunku 2.
<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Parametr (jednostka)</td>
			<td>Wartość</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gromadzenie danych</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Napięcie (kV)</td>
			<td>300</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Skalibrowane powiększenie (X)</td>
			<td>111,000</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rozmiar piksela (Å)</td>
			<td>5.4</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Szacowana dawka (e–/ Å2)</td>
			<td>100</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rozmycie (brak ostrości) (μm)</td>
			<td>4.0–4.5</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pierwsze zero CTF (Å)a</td>
			<td>26–30</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>zakres nachylenia (°)</td>
			<td>–60–60</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>próbkowanie pod kątem (°)</td>
			<td>3</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dane i udoskonalenie</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tomogramy</td>
			<td>11</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Wiriony</td>
			<td>29</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Liczba cząsteczek kwasu nukleinowego na wirion</td>
			<td>106</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Całkowita liczba nasion</td>
			<td>3,074</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Wykryto piki</td>
			<td>1,346</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Piki po usunięciu nakładania się sygnałów</td>
			<td>1,401</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Szczyty po selekcji opartej na korelacji wzajemnej</td>
			<td>1,022</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Wartości odstające uwzględnione w końcowej średniej</td>
			<td>1,022</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Symetria</td>
			<td>C3</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Próbkowanie kątowe (°)</td>
			<td>8</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Zakres rozdzielczości zastosowany w udoskonalaniu (Å)</td>
			<td>42–334</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Szacowana rozdzielczość końcowa (Å)b</td>
			<td>35</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>
Tabela 1: Statystyki zbierania i udoskonalania danych dla wirusa Bunyamwera. 
a CTF, funkcja przenoszenia kontrastu. 
b Obliczone przy użyciu korelacji powłok Fouriera między dwiema niezależnie udoskonalonymi strukturami przy progu 0,143.
<img alt="Struktura cząsteczek przypominających wirusy; obraz z kriomikroskopii elektronowej; analiza nanostruktury." fo:content-width="6in" src="/files/ftp_upload/51714/51714fig2highres.jpg" width="600" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="Rysunek 2"> 
Rysunek 2: Przekrój przez tomogram wirionów Bunyamwera. Groty strzałek wskazują widoki boczne kilku kolców widocznych na obwodzie każdego wirionu. Tomogram został poddany filtrowaniu dolnoprzepustowemu do 60 Å. Pasek skali 100 nm.
W pierwszej kolejności dopracowaliśmy model wstępny, wykorzystując 205 ręcznie wybranych kolców (Rycina 3). Trójskrotna symetria najbardziej centralnego kolca była widoczna bez nakładania jakiejkolwiek symetrii (Rycina 3B) i została wymuszona w kolejnych rundach doprecyzowania (Rycina 3C). W celu automatycznego wykrycia wszystkich kolców na powierzchniach wirionów wygenerowaliśmy 106 punktów startowych dla każdego wirionu w promieniu 43 nm i z odstępem 20 stopni (Rycina 4A), a następnie iteracyjnie dopracowaliśmy ich położenie względem błony (Rycina 4B).
<img alt="Trójwymiarowe modele powierzchni molekularnej, schemat widoku z góry i z boku, analiza strukturalna, badanie obliczeniowe." fo:content-width="6in" src="/files/ftp_upload/51714/51714fig3highres.jpg" width="600" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="Rycina 3"> 
Rycina 3: Udoskonalenie struktury początkowego szablonu. (A) Szablon uśredniony cylindrycznie (C100) skonstruowany na podstawie ręcznie zdefiniowanych pozycji kolców. (B) Uśredniona gęstość po pięciu rundach udoskonalenia bez narzuconej symetrii (C1) wykazuje kolca z cechami symetrii trzykrotnej. Rozdzielczość modelu wynosi 48 Å. (C) Średnia dla kolca została wyznaczona z rozdzielczością 41 Å po pięciu rundach udoskonalenia z symetrią trzykrotną.
<img alt="Diagram kołowy z wektorami wskazującymi kierunek, sugerujący analizę molekularną lub strukturalną." fo:content-width="6in" src="/files/ftp_upload/51714/51714fig4highres.jpg" width="600" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="Rycina 4"> 
Rycina 4: Udoskonalenie ziarn (seeds). A-B) Podzbiór ziarn przed (A) i po (B) udoskonaleniu przedstawiony na jednej gęstości wirionu z Ryciny 2. Ziarna w (B) zostały zakodowane kolorami na podstawie odpowiednich współczynników korelacji krzyżowej (niebieski – niska korelacja; czerwony – wysoka korelacja).
Do obliczenia końcowej średniej wykorzystano najlepiej korelujące fragmenty białka kolca (top 75% po usunięciu nakładających się obszarów; ~1 000 kolców). Średnia została wyznaczona z rozdzielczością 35-Å (Rysunek 5). Wykazała ona obecność trymerycznej struktury kolca w centrum, a także pewien wkład z sześciu sąsiednich kolców. Modele kompozytowe wirionów, obliczone poprzez rozmieszczenie struktury w znanych pozycjach, ujawniły rozmieszczenie kolców na powierzchni wirionu (Rysunek 6A). Okazyjnie widoczne były lokalnie uporządkowane fragmenty kolców (Rysunek 6B).
<img alt="Trójwymiarowe modele powierzchni struktury białka; widoki z góry i z boku pokazujące konfiguracje parzystą, nieparzystą oraz średnią." fo:content-width="6in" src="/files/ftp_upload/51714/51714fig5highres.jpg" width="600" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="Rysunek 5"> 
Rysunek 5: Udoskonalona struktura fragmentu warstwy białek kolca glikoproteiny po dopasowaniu szablonu. (A-B) Przedstawiono dwie mapy, „parzystą” i „nieparzystą”, zrekonstruowane z dwóch połaci danych. Obie mapy wykazują niezwykły stopień podobieństwa, co potwierdza poprawność przyjętego podejścia. Orientacja wokół długiej osi kolca jest różna, ponieważ obie mapy zostały zrekonstruowane całkowicie niezależnie od siebie. (C) Przedstawiono średnią z obu map w końcowej rozdzielczości 35 Å.
<img alt="Model struktury białka (A) i mapa gęstości (B) przedstawiające wizualizację powierzchni molekularnej." fo:content-width="6in" src="/files/ftp_upload/51714/51714fig6highres.jpg" width="600" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="Rycina 6"> 
Rycina 6: Rozmieszczenie kolców na wirionie Bunyamwera. (A) Złożony model wirionu. Wektory widoczności (pręciki) wskazują orientację kolców. Kolory określają korelację krzyżową między każdym kolcem a strukturą szablonową (niebieski – niska korelacja; czerwony – wysoka korelacja). (B) Powiększony widok uporządkowanego obszaru kolców.

Przedstawiono podejście do określania struktur kompleksów glikoprotein błony wirusowej za pomocą kombinacji kriotomografii elektronowej i uśredniania sub-tomogramu za pomocą pakietu obliczeniowego Jsubtomomo.

Uśrednianie kolców glikoproteiny otoczki wirusowej z rekonstrukcji kriotomografii elektronowej przy użyciu Jsubtomo

Enveloped viruses utilize membrane glycoproteins on their surface to mediate entry into host cells. Three-dimensional structural analysis of these ...

Ogólnym celem niniejszej procedury jest zbadanie struktur kompleksów glikoprotein obecnych na powierzchniach wirusów otoczkowych. Zostaje to osiągnięte poprzez najpierw zlokalizowanie cząsteczek wirusa w wolumenach tomograficznych, które zostały wcześniej obliczone na podstawie danych z krio-mikroskopii elektronowej. Drugim krokiem jest stworzenie dwóch statystycznie niezależnych modeli wstępnych kompleksów glikoprotein z wykorzystaniem zdefiniowanego ręcznie podzbioru danych.Następnie modele te są dopracowywane, a potem wykorzystywane do automatycznego wykrywania wszystkich kompleksów glikoprotein na cząsteczkach wirusa. Ostatnim krokiem jest udoskonalenie struktury kompleksu glikoprotein z wykorzystaniem pełnego zestawu danych. W końcowym etapie do interpretacji ostatecznej struktury wykorzystuje się narzędzia wizualizacji molekularnej.Trójwymiarowa analiza strukturalna tych glikoproteinowych kolców jest nieoceniona dla zrozumienia patogenezy wirusowej, a także w projektowaniu leków. Główną zaletą tej techniki w porównaniu z istniejącymi metodami, takimi jak krystalografia rentgenowska, jest możliwość rozwiązania struktur białek błonowych w ich naturalnym środowisku błonowym. Technika ta może pomóc w rozwiązaniu kluczowych zagadnień biologii strukturalnej.Na przykład struktura wielu wirusów posiadających otoczkę. Chociaż technika ta może dostarczyć informacji na temat kompleksów glikoprotein w tych wirusach, można ją również zastosować do innych układów, takich jak białka błonowe wbudowane w liposomy. Procedurę zaprezentują dwaj członkowie mojej grupy, Slee oraz David Bittel.Aby rozpocząć, otwórz plik autogramu w programie B show. Ręcznie zaznacz cząstki wirusa na gramach, definiując współrzędną środka cząstki wirusa za pomocą narzędzia do wybierania cząstek. Powtarzaj ten krok, aż wszystkie warianty zostaną przetworzone.Zapisz współrzędne wirusów w pliku star. Powtórz ten proces dla wszystkich tomogramów. Następnie uruchom skrypt J sub tomo py w trybie ekstrakcji. Aby wyekstrahować wiriony z subwolumenów do oddzielnych plików wolumenów, użyj zapisanych plików star jako plików wejściowych w celu wygenerowania dwóch niezależnych modeli początkowych.W pierwszej kolejności otwórz plik mapy podobjętości jajnika. Wyświetl go w oknie B. Wybierz podzbiór kolców w podobjętościach Varian, definiując współrzędną środka kolca za pomocą narzędzia do selekcji cząsteczek (particle picking tool), dostępnego w oknie narzędziowym.Powtarzaj ten krok, aż zostaną przetworzone wszystkie wyraźnie odróżnialne kolce. Zapisz współrzędne kolców w pliku star. Powtarzaj ten krok, aż przetworzonych zostanie około 200 kolców glikoproteinowych.Po przypisaniu widoków do wariantów zgodnie z opisem w protokole tekstowym, utwórz maskę przestrzeni rzeczywistej za pomocą J sub tomo. Create mask py. Następnie wygeneruj maskę przestrzeni odwrotnej za pomocą J sub tomo create wedge mask py.Maska przestrzeni odwrotnej służy do wykluczenia obszarów w regionie brakującego klina (missing wedge), wynikających z tomograficznego gromadzenia danych w jednej osi. Następnie należy utworzyć dwie wstępne średnie za pomocą programu J.Sub tomo create averages.PY, używając zapisanego pliku selekcji jako pliku wejściowego.Aby zredukować szum w początkowych średnich, należy iteracyjnie dopasować i uśrednić dwa wcześniej wygenerowane modele za pomocą J sub tomo iterate gold PY. Szczegółowe informacje dotyczące obu etapów tego procesu znajdują się w protokole tekstowym. Stopień symetrii w strukturze należy ocenić poprzez analizę wynikowego pliku mapy z filtrem dolnoprzepustowym w kyira. Na przykład, jeśli kolec jest kompleksem trymerycznym, powinna być widoczna symetria trójskładnikowa.Kontynuuj dopracowywanie struktury zgodnie ze szczegółami opisanymi w protokole tekstowym. Następnie wygeneruj ziarna rozmieszczone równomiernie na powierzchni Varian w celu dopasowania szablonu i przypisz ziarnom początkowy wektor widoku, uruchamiając JVs py. Wykorzystaj wcześniej wygenerowane pliki star jako pliki wejściowe i wygeneruj około 1,5 raza więcej ziaren niż oczekiwana liczba kolców.Ten wektor widoku przybliża kierunek kolca znajdującego się najbliżej każdego punktu nasienia. Następnie, analogicznie jak wcześniej, wygeneruj dwie niezależne średnie powierzchni wirusa. Potem doprecyzuj położenie punktów nasienia zgodnie ze szczegółami zawartymi w protokole tekstowym.Na koniec, za pomocą jvs.py wygeneruj pliki znaczników com dla udoskonalonych plików gwiazd startowych. Przeanalizuj ziarna, otwierając pliki CMM oraz powiązane pliki map wirionów w programie kyira.Należy upewnić się, że doprecyzowane ziarna są prawidłowo wyrównane względem błony wirusa. Doprecyzowane markery można pokolorować na podstawie ich współczynników korelacji wzajemnej. Automatycznie zlokalizuj wszystkie kolce w podobjętościach wariantów, stosując dopasowywanie lokalnych wzorców wokół doprecyzowanych ziaren. Wyrównaj i uśrednij zlokalizowane kolce, wykorzystując średnie wygenerowane z podzbioru ręcznie wybranych kolców jako wzorce początkowe. Dodatkowe szczegóły dotyczące tego procesu znajdują się w protokole tekstowym. Aby zwizualizować wyniki, otwórz doprecyzowaną strukturę kolca w programie kyira w celu wizualizacji.Przejdź do dopasowania struktur atomowych. Następnie stwórz model kompozytowy wirionu, korzystając z j Subo Create model DO py. Na koniec otwórz model kompozytowy w celu wizualizacji w kyira.Wstępny model doprecyzowano, wykorzystując 205 ręcznie wybranych kolców. Trójskrotna symetria najbardziej centralnego kolca była widoczna bez nakładania jakiejkolwiek symetrii i została zastosowana w kolejnych rundach doprecyzowania w celu ręcznego wykrycia wszystkich kolców na powierzchniach Varian. Dla każdego wionu wygenerowano 106 punktów startowych w promieniu 43 nanometrów i z odstępem 20 stopni, a ich pozycje były iteracyjnie doprecyzowane względem błony.Do obliczenia końcowej średniej wykorzystano najlepiej korelujące fragmenty białka S (spike). Średnia została wyznaczona z rozdzielczością 35 angstremów. Ujawniła ona trymeryczną strukturę białka S w centrum, a także pewien wkład z sześciu sąsiednich białek S.Modele kompozytowe wariów, obliczone poprzez umieszczenie struktury w znanych pozycjach, ujawniły rozmieszczenie kolców na powierzchni wariów. Okazyjnie widoczne były lokalnie uporządkowane skupiska kolców. Podczas przeprowadzania tej procedury ważne jest korzystanie wyłącznie z najlepszych danych oraz dokładne sprawdzanie wszystkich wyników pośrednich.Po wykonaniu tej procedury struktury krystalografii rentgenowskiej mogą zostać dopasowane do końcowej średniej, aby uzyskać dokładniejszy obraz oddziaływań białko-białko. Po obejrzeniu tego filmu powinni Państwo mieć dobrą wiedzę na temat uśredniania struktur glikoprotein otoczki wirusowej przy użyciu programu J Omo.

averaging-viral-envelope-glycoprotein-spikes-from-electron

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Immunologia i infekcje

Średnia wartość białek wirusowych otoczki wirusowej z rekonstrukcji tomografii elektronowo-kryogenicznej przy użyciu Jsubtomo

Protokół opisuje wysokoprzepustowe podejście do wyznaczania struktur białek błonowych z wykorzystaniem krio-tomografii elektronowej oraz trójwymiarowego przetwarzania obrazów. Obejmuje on szczegóły przygotowania preparatów, gromadzenia danych, ich przetwarzania i interpretacji, a kończy się opracowaniem reprezentatywnego celu dla tej metody, jakim jest glikoproteina otoczki HIV-1. Procedury obliczeniowe zostały zaprojektowane w sposób umożliwiający badaczom i studentom pracę zdalną oraz wkład w...

Wyznaczanie struktur molekularnych glikoprotein otoczki HIV z wykorzystaniem krioelektronowej tomografii i zautomatyzowanego uśredniania subtomogramów

Niniejszy artykuł opisuje metodę uzyskiwania trójwymiarowej (3D) struktury cząsteczek zmontowanych helikalnie przy użyciu krio-mikroskopii elektronowej. W niniejszym protokole wykorzystujemy zgromadzenia kapsydów HIV-1, aby zilustrować szczegółową procedurę rekonstrukcji 3D w celu uzyskania mapy gęstości za pomocą iteracyjnej metody rekonstrukcji helikalnej w przestrzeni rzeczywistej.

Struktura zgromadzeń kapsydu HIV-1 określona za pomocą kriomikroskopii elektronowej i iteracyjnej helikalnej rekonstrukcji w przestrzeni rzeczywistej

Przedstawiamy protokół zbierania i przetwarzania krio-tomogramów elektronowych całych mitochondriów. Technika ta zapewnia szczegółowy wgląd w strukturę, funkcję i organizację dużych kompleksów białek błonowych w natywnych błonach biologicznych.

Wizualizacja dimerów syntazy ATP w mitochondriach za pomocą kriotomografii elektronowej

Przedstawiamy protokół, jak wykorzystać wysokoprzepustową tomografię krioelektronową do określenia wysokiej rozdzielczości struktur in situ maszyn molekularnych. Protokół pozwala na przetwarzanie dużych ilości danych, pozwala uniknąć typowych wąskich gardeł i skraca przestoje zasobów, pozwalając użytkownikowi skupić się na ważnych kwestiach biologicznych.

Korzystanie z Tomoauto: protokół dla wysokowydajnej zautomatyzowanej tomografii krioelektronowej

Ten artykuł opisuje, jak efektywnie wykorzystać trzy platformy przetwarzania cryo-EM, tj. cryoSPARC v3, RELION-3 i Scipion 3, aby stworzyć pojedynczy i solidny przepływ pracy mający zastosowanie do różnych zestawów danych o pojedynczych cząstkach do określania struktury w wysokiej rozdzielczości.

Solidny przebieg przetwarzania w mikroskopii krioelektronowej jednocząsteczkowej (cryo-EM) z cryoSPARC, RELION, i Scipion

Tutaj opisane są protokoły przygotowania zestawów wirusów odpowiednich do analizy ciekłego EM i krio-EM w nanoskali przy użyciu transmisyjnej mikroskopii elektronowej.

Postęp w obrazowaniu w wysokiej rozdzielczości zespołów wirusów w cieczach i lodzie

Obecny protokół opisuje zdalne pozyskiwanie danych za pomocą tomografii krioelektronowej o wysokiej rozdzielczości za pomocą Tomo5 oraz późniejsze przetwarzanie danych i uśrednianie subtomogramowe za pomocą emClarity. Apoferrytyna jest używana jako przykład do zilustrowania szczegółowych procesów krok po kroku w celu uzyskania struktury krio-ET o rozdzielczości 2,86 A.

Tomografia krioelektronowa: zdalne zbieranie danych i uśrednianie subtomogramu

Ten protokół wideo ilustruje, jak wykonać skaningową tomografię elektronową mikroskopii transmisyjnej na próbkach wirusologicznych. Dla optymalnych rezultatów próbki przygotowuje się przez zamrażanie pod wysokim ciśnieniem i późniejszą podstawienie zamrożenia.

Skaningowa transmisyjna tomografia elektronowa w wirusologii: obrazowanie 3D próbek zamrożonych i zamrożonych pod wysokim ciśnieniem

W artykule przedstawiono protokół przetwarzania danych wirusów grypy obrazowanych za pomocą tomografii krioelektronowej oraz późniejszego uśredniania glikoproteiny hemaglutyniny subtomogramem. Protokół ten obejmuje proces krok po kroku, od wstępnego przetwarzania obrazu po ostateczne udoskonalanie modelu.

Określanie struktury hemaglutininy w rozdzielczości subnanometrowej na podstawie tomografii krioelektronowej wirusów grypy

Virochip to panwirulowa macierz mikroukładów zaprojektowana do jednoczesnego wykrywania wszystkich znanych wirusów, a także nowych wirusów, w oparciu o konserwatywną homologię sekwencji. W niniejszym materiale demonstrujemy, jak przeprowadzić badanie z użyciem Virochip w celu analizy próbek klinicznych pod kątem obecności wirusów znanych i nieznanych.

Wykorzystanie panwirusej macierzy mikroarray (Virochip) do przesiewowego badania próbek klinicznych w kierunku patogenów wirusowych

Poznaj metodę uśredniania kolców glikoprotein wirusowych z rekonstrukcji kriotomografii elektronowej przy użyciu Jsubtomo. Technika umożliwia badanie białek błonowych w ich naturalnym środowisku z rozdzielczością 35 angstremów.

Uśrednianie kolców glikoproteiny otoczki wirusowej z rekonstrukcji kriotomografii elektronowej przy użyciu Jsubtomo

Przeglądaj więcej filmów