Uśrednianie kolców glikoproteiny otoczki wirusowej z rekonstrukcji kriotomografii elektronowej przy użyciu Jsubtomo

Ogólnym celem niniejszej procedury jest zbadanie struktur kompleksów glikoprotein obecnych na powierzchniach wirusów otoczkowych. Zostaje to osiągnięte poprzez najpierw zlokalizowanie cząsteczek wirusa w wolumenach tomograficznych, które zostały wcześniej obliczone na podstawie danych z krio-mikroskopii elektronowej. Drugim krokiem jest stworzenie dwóch statystycznie niezależnych modeli wstępnych kompleksów glikoprotein z wykorzystaniem zdefiniowanego ręcznie podzbioru danych.

Następnie modele te są dopracowywane, a potem wykorzystywane do automatycznego wykrywania wszystkich kompleksów glikoprotein na cząsteczkach wirusa. Ostatnim krokiem jest udoskonalenie struktury kompleksu glikoprotein z wykorzystaniem pełnego zestawu danych. W końcowym etapie do interpretacji ostatecznej struktury wykorzystuje się narzędzia wizualizacji molekularnej.

Trójwymiarowa analiza strukturalna tych glikoproteinowych kolców jest nieoceniona dla zrozumienia patogenezy wirusowej, a także w projektowaniu leków. Główną zaletą tej techniki w porównaniu z istniejącymi metodami, takimi jak krystalografia rentgenowska, jest możliwość rozwiązania struktur białek błonowych w ich naturalnym środowisku błonowym. Technika ta może pomóc w rozwiązaniu kluczowych zagadnień biologii strukturalnej.

Na przykład struktura wielu wirusów posiadających otoczkę. Chociaż technika ta może dostarczyć informacji na temat kompleksów glikoprotein w tych wirusach, można ją również zastosować do innych układów, takich jak białka błonowe wbudowane w liposomy. Procedurę zaprezentują dwaj członkowie mojej grupy, Slee oraz David Bittel.

Aby rozpocząć, otwórz plik autogramu w programie B show. Ręcznie zaznacz cząstki wirusa na gramach, definiując współrzędną środka cząstki wirusa za pomocą narzędzia do wybierania cząstek. Powtarzaj ten krok, aż wszystkie warianty zostaną przetworzone.

Zapisz współrzędne wirusów w pliku star. Powtórz ten proces dla wszystkich tomogramów. Następnie uruchom skrypt J sub tomo py w trybie ekstrakcji. Aby wyekstrahować wiriony z subwolumenów do oddzielnych plików wolumenów, użyj zapisanych plików star jako plików wejściowych w celu wygenerowania dwóch niezależnych modeli początkowych.

W pierwszej kolejności otwórz plik mapy podobjętości jajnika. Wyświetl go w oknie B. Wybierz podzbiór kolców w podobjętościach Varian, definiując współrzędną środka kolca za pomocą narzędzia do selekcji cząsteczek (particle picking tool), dostępnego w oknie narzędziowym.

Powtarzaj ten krok, aż zostaną przetworzone wszystkie wyraźnie odróżnialne kolce. Zapisz współrzędne kolców w pliku star. Powtarzaj ten krok, aż przetworzonych zostanie około 200 kolców glikoproteinowych.

Po przypisaniu widoków do wariantów zgodnie z opisem w protokole tekstowym, utwórz maskę przestrzeni rzeczywistej za pomocą J sub tomo. Create mask py. Następnie wygeneruj maskę przestrzeni odwrotnej za pomocą J sub tomo create wedge mask py.

Maska przestrzeni odwrotnej służy do wykluczenia obszarów w regionie brakującego klina (missing wedge), wynikających z tomograficznego gromadzenia danych w jednej osi. Następnie należy utworzyć dwie wstępne średnie za pomocą programu J.Sub tomo create averages.PY, używając zapisanego pliku selekcji jako pliku wejściowego.

Aby zredukować szum w początkowych średnich, należy iteracyjnie dopasować i uśrednić dwa wcześniej wygenerowane modele za pomocą J sub tomo iterate gold PY. Szczegółowe informacje dotyczące obu etapów tego procesu znajdują się w protokole tekstowym. Stopień symetrii w strukturze należy ocenić poprzez analizę wynikowego pliku mapy z filtrem dolnoprzepustowym w kyira. Na przykład, jeśli kolec jest kompleksem trymerycznym, powinna być widoczna symetria trójskładnikowa.

Kontynuuj dopracowywanie struktury zgodnie ze szczegółami opisanymi w protokole tekstowym. Następnie wygeneruj ziarna rozmieszczone równomiernie na powierzchni Varian w celu dopasowania szablonu i przypisz ziarnom początkowy wektor widoku, uruchamiając JVs py. Wykorzystaj wcześniej wygenerowane pliki star jako pliki wejściowe i wygeneruj około 1,5 raza więcej ziaren niż oczekiwana liczba kolców.

Ten wektor widoku przybliża kierunek kolca znajdującego się najbliżej każdego punktu nasienia. Następnie, analogicznie jak wcześniej, wygeneruj dwie niezależne średnie powierzchni wirusa. Potem doprecyzuj położenie punktów nasienia zgodnie ze szczegółami zawartymi w protokole tekstowym.

Na koniec, za pomocą jvs.py wygeneruj pliki znaczników com dla udoskonalonych plików gwiazd startowych. Przeanalizuj ziarna, otwierając pliki CMM oraz powiązane pliki map wirionów w programie kyira.

Należy upewnić się, że doprecyzowane ziarna są prawidłowo wyrównane względem błony wirusa. Doprecyzowane markery można pokolorować na podstawie ich współczynników korelacji wzajemnej. Automatycznie zlokalizuj wszystkie kolce w podobjętościach wariantów, stosując dopasowywanie lokalnych wzorców wokół doprecyzowanych ziaren. Wyrównaj i uśrednij zlokalizowane kolce, wykorzystując średnie wygenerowane z podzbioru ręcznie wybranych kolców jako wzorce początkowe. Dodatkowe szczegóły dotyczące tego procesu znajdują się w protokole tekstowym. Aby zwizualizować wyniki, otwórz doprecyzowaną strukturę kolca w programie kyira w celu wizualizacji.

Przejdź do dopasowania struktur atomowych. Następnie stwórz model kompozytowy wirionu, korzystając z j Subo Create model DO py. Na koniec otwórz model kompozytowy w celu wizualizacji w kyira.

Wstępny model doprecyzowano, wykorzystując 205 ręcznie wybranych kolców. Trójskrotna symetria najbardziej centralnego kolca była widoczna bez nakładania jakiejkolwiek symetrii i została zastosowana w kolejnych rundach doprecyzowania w celu ręcznego wykrycia wszystkich kolców na powierzchniach Varian. Dla każdego wionu wygenerowano 106 punktów startowych w promieniu 43 nanometrów i z odstępem 20 stopni, a ich pozycje były iteracyjnie doprecyzowane względem błony.

Do obliczenia końcowej średniej wykorzystano najlepiej korelujące fragmenty białka S (spike). Średnia została wyznaczona z rozdzielczością 35 angstremów. Ujawniła ona trymeryczną strukturę białka S w centrum, a także pewien wkład z sześciu sąsiednich białek S.

Modele kompozytowe wariów, obliczone poprzez umieszczenie struktury w znanych pozycjach, ujawniły rozmieszczenie kolców na powierzchni wariów. Okazyjnie widoczne były lokalnie uporządkowane skupiska kolców. Podczas przeprowadzania tej procedury ważne jest korzystanie wyłącznie z najlepszych danych oraz dokładne sprawdzanie wszystkich wyników pośrednich.

Po wykonaniu tej procedury struktury krystalografii rentgenowskiej mogą zostać dopasowane do końcowej średniej, aby uzyskać dokładniejszy obraz oddziaływań białko-białko. Po obejrzeniu tego filmu powinni Państwo mieć dobrą wiedzę na temat uśredniania struktur glikoprotein otoczki wirusowej przy użyciu programu J Omo.