Metoda DAP-chip oczyszczona z powinowactwa DNA do określania celów genowych dla dwuskładnikowych systemów regulacyjnych bakteryjnych

Ogólnym celem poniższego eksperymentu jest określenie genomowych miejsc wiązania bakteryjnych regulatorów odpowiedzi dwuskładnikowych przy użyciu testu opartego na mikromacierzach in vitro. Osiąga się to poprzez klonowanie i oczyszczanie znakowanego białka regulatora odpowiedzi, jego aktywację poprzez fosforylację in vitro oraz wyznaczenie jednego genu docelowego za pomocą testów przesunięcia mobilności elektroforetycznej, który posłuży jako kontrola pozytywna dla kolejnych etapów analizy mikromacierzowej. W drugim kroku oczyszczone białko regulatora odpowiedzi miesza się z genomicznym DNA, co pozwala na oddzielenie DNA związanego z białkiem od DNA wejściowego za pomocą oczyszczania powinowactwa.

Następnie białko-związane DNA oraz DNA wejściowe są amplifikowane, weryfikowane metodą QPCR pod kątem wzbogacenia celu genu kontroli pozytywnej we frakcji związanej z białkiem, znakowane fluorescencyjnie, łączone w pulę i hybrydyzowane z kafelkową macierzą mikroprzewodnią. W celu określenia genomicznych miejsc wiązania regulatora odpowiedzi, wyniki wskazują najbardziej prawdopodobne geny regulowane przez badany regulator odpowiedzi, a wyniki te można następnie zwalidować za pomocą analizy przesunięcia ruchomości elektroforetycznej. Główną zaletą tej techniki w porównaniu z innymi metodami, takimi jak in vivo chip chip, jest możliwość jej zastosowania nawet wtedy, gdy sygnały aktywujące i warunki dla dwuskładnikowych systemów regulacji nie są znane.

Metoda ta ma ogromne znaczenie dla dziedziny sygnalizacji bakteryjnej, ponieważ ogromna większość regulatorów odpowiedzi ma nieznane geny docelowe, a niniejsza metoda pomaga w odkrywaniu złożonych sieci regulacyjnych. Procedurę tę zaprezentuje Amy Chen, asystentka badawcza z mojego laboratorium, przed rozpoczęciem procesu.

Oczyszczanie rr, a konkretnie białka DVU 3 0 2 3 wykazującego ekspresję z klonowanej mieszaniny genów DVU 3 0 2 3. 0.5 picomoles białka DVU 3 0 2 3 z 100 fent moles wcześniej przygotowanego przez at inated substratu DNA w roztworze buforowym do całkowitej objętości 20 microliters. Po przygotowaniu reakcji kontrolnej bez dodatku białka, inkubować reakcje w temperaturze pokojowej na blacie przez 20 minut.

Po inkubacji do reakcji wiązania należy dodać 5 µL 5x buforu do ładowania. Na wcześniej przygotowany mini żel poliakrylamidowy 6% w 0,5 XTBE należy nałożyć po 18 µL z każdej reakcji i prowadzić elektroforezę przy napięciu 100 V przez dwie godziny. Po zakończeniu elektroforezy należy wyciąć naładowaną membranę nylonową do rozmiaru żelu i namoczyć ją w 0,5 XTBE przez co najmniej 10 minut. Następnie należy wyjąć żel z kasety.

Odetnij wszelkie krawędzie żelu, a następnie umieść żel i membranę pomiędzy dwoma grubymi filtrami nasączonymi 0,5 XTBE. Umieść żel i membranę w aparacie do półsuchego transferu i prowadź proces przy napięciu 20 V przez 30 minut. Następnie umieść membranę w komercyjnym urządzeniu do sieciowania promieniami UV i ustaw czas na trzy minuty; po wywołaniu transferu za pomocą zestawu do detekcji chemiluminescencyjnej, wykonaj obrazowanie przy użyciu komputera podłączonego do kamery z matrycą CCD.

Należy poszukiwać przesunięcia mobilności substratu DNA w obecności rr, co wskazuje na wiązanie badanego DNA przez RR. Następnie wymieszać od dwóch do trzech mikrogramów wspólnego DNA genomicznego z 0,5 pikomola DVU 3 0 2 3 w roztworze buforowym. Po inkubacji reakcji w temperaturze 25 °C przez 30 minut, przenieść 10 µL mieszaniny do probówki o pojemności 1,5 ml i oznaczyć ją jako DNA wejściowe.

Do probówki do mikrocentryfugi o pojemności 0,6 ml należy dodać 30 µL żywicy niklowej NTA aros. Próbkę wirować z prędkością 100 ×g przez jedną minutę, aby po wirowaniu zebrać żywicę na dnie probówki. Następnie należy usunąć nadsącz.

Dodaj 100 µL buforu do płukania i delikatnie potrząśnij probówką, aby wymieszać zawartość. Po wirowaniu z prędkością 100 G przez dwie minuty usuń nadsącz. Dodaj pozostałe 90 µL mieszaniny reakcyjnej do żywicy niklowej NTA.

Następnie inkubować próbkę w inkubatorze obrotowym przez 30 minut. Po zakończeniu odwirować próbkę z siłą 100 Gs przez dwie minuty. Po usunięciu nadsączu powtórzyć etapy płukania jeszcze trzy razy.

Następnie dodaj 35 µL buforu elucyjnego do żywicy i wymieszaj za pomocą wortexa. Próbkę inkubuj na blacie w temperaturze pokojowej przez pięć minut. Po odwirowaniu próbki przenieś nadsącz do nowej probówki 1,5 ml i oznacz ją jako frakcję DNA związanego z białkiem.

Następnie dodaj 35 µL buforu eluującego do wejściowego DNA po oczyszczeniu frakcji DNA wejściowego i DNA związanego z białkiem. Przenieś po 10 µL każdej z nich do oddzielnych probówek do PCR. Do każdej próbki dodaj 1 µL 10 x buforu do fragmentacji, 2 µL buforu do przygotowania biblioteki oraz 1 µL roztworu stabilizującego bibliotekę, a następnie dokładnie wymieszaj próbki za pomocą wirówki laboratoryjnej.

Inkubuj próbki w termocyklerze w temperaturze 95 °C przez dwie minuty. Po zakończeniu schłodź próbki na lodzie. Następnie dodaj do próbek 1 µL enzymu do przygotowania bibliotek i wymieszaj zawartość poprzez pipetowanie.

Inkubuj próbki w termocyklerze. Po inkubacji dodaj do każdej probówki 47,5 µL wody, 7,5 µL 10 x amplification master mix oraz pięć µL polimerazy. Po wymieszaniu próbek podgrzej je w termocyklerze.

Przygotuj reakcje qPCR w trzech powtórzeniach dla każdego matrycowego DNA, sporządzając master mix w stężeniu 1x dla każdego z wcześniej zaprojektowanych zestawów starterów, a następnie odmierz 18 µL master mixu do każdego dołka 96-dołkowej płytki PCR. Próbki DNA wejściowego oraz DNA związanego z białkiem, po amplifikacji i oczyszczeniu, rozcieńcz wodą do stężenia 5 ng/µL i dodaj 2 µL każdej próbki do odpowiednich dołków. Następnie szczelnie zamknij płytkę za pomocą folii uszczelniającej UltraClear qPCR.

Odwiruj płytkę w wirówce przy 200 GS przez jedną minutę. Po umieszczeniu płytki w cyklu urządzenia do qPCR w czasie rzeczywistym, stosując następujące warunki w celu znakowania wejściowego DNA za pomocą s si three i wzbogaconego DNA za pomocą sci five, wymieszaj 1 µg DNA z 40 µL oznakowanych S3 SCI-FI nonamerów i uzupełnij objętość wodą do 80 µL. Denaturuj próbki w temperaturze 98 °C przez 10 minut w ciemności w termocyklerze.

Po zakończeniu szybko schłodź próbki na lodzie przez dwie minuty, a następnie do każdej reakcji dodaj 2 µL polimerazy 3' do 5' egzonukleazy, 5 mM dNTP oraz 8 µL wody. Po wymieszaniu inkubuj reakcje w temperaturze 37 °C przez dwie godziny w ciemności w termocyklerze. Następnie dodaj EDTA do stężenia 50 mM, aby zatrzymać reakcje, oraz roztwór NaCl do stężenia 0,5 M.

Następnie przenieś do probówek o pojemności 1,5 ml zawierających 0,9 objętości izopropanolu po inkubacji w ciemności przez 10 minut. Odwiruj próbki z prędkością 12 000 g przez 10 minut. Połącz po 6 µg DNA znakowanego S3 i sci-fi w probówce o pojemności 1,5 ml i wysusz próżniowo w wirówce w niskiej temperaturze w ciemności, zakrywając pokrywę wirówki, jeśli jest ona przezroczysta.

Po wyschnięciu osadów zawiesza się je w 5 µL wody. Następnie, po 15 sekundach wirowania w wstrząsace z vortexem, do próbek dodaje się 13 µL wcześniej przygotowanej 1x mieszaniny głównej roztworu do hybrydyzacji, a następnie inkubuje próbki w bloku grzewczym w temperaturze 95 °C przez pięć minut. Próbki należy wyjąć z bloku grzewczego i umieścić w systemie do hybrydyzacji w temperaturze 42 °C do momentu rozpoczęcia załadunku.

Następnie umieść wcześniej przygotowany zespół szkiełka mieszającego w systemie do hybrydyzacji. Wprowadź 16 µL próbki do otworu napełniającego. Następnie uszczelnij otwory folią klejącą i włącz mieszanie w systemie. Pozostaw do hybrydyzacji na 16 do 20 godzin w temperaturze 42 °C.

Wsuń preparat do narzędzia do demontażu i umieść go w naczyniu zawierającym ciepły bufor. Odlej mikser, energicznie potrząsając narzędziem do demontażu. Umieść preparat w pojemniku z 50 mililitrami buforu piorącego one i energicznie potrząsaj przez dwie minuty.

Następnie powtórz poprzedni krok, używając 50 milliliters buforu płukania dwa oraz 50 milliliters buforu płukania trzy RRR DVU 3 0 2 3 shifted. Analiza QPCR regionu upstream DVU 3 0 2 5 wykazała, że region upstream DVU 3 0 2 5 jest wzbogacony w frakcji związanej z białkiem w stosunku do DNA wejściowego, co wskazuje, że warunki wiązania były odpowiednie dla DVU 3 0 2 3. Jako kontrolę negatywną wykorzystano DVU 0 0 1 3. Cztery najwyższe piki uzyskane po analizie DAP chipp wybrano jako najbardziej prawdopodobne cele dla DV 3 0 2 3.

Pozytywnym celem DVU 3 0 2 5 był pierwszy otrzymany pik o najwyższej ocenie. Dwa cele genowe to dwa inne zakodowane permeazy mleczanu. Czwarty cel genowy nie znajduje się w regionie upstream, lecz w regionie międzygenowym pomiędzy dwoma genami transkrybowanymi zbieżnie, wykorzystując regiony upstream celów uzyskanych przez DAP chip meme w celu przewidzenia motywu miejsca wiązania.

Motyw został dodatkowo zwalidowany poprzez wprowadzenie substytucji w konserwatywnych zasadach w obrębie motywu, co wyeliminowało przesunięcie wiązania. Zwalidowany motyw wykorzystano do przeszukania genomów innych bakterii redukujących siarczany; loci ortologiczne DVU 3 0 2 3 wybrano jako potencjalne cele genowe w przypadkach, gdy motyw znajdował się w regionach powyżej ramek odczytu, stosując sekwencje motywów przewidziane dla autologicznych rs. Wygenerowano konsensusowy motyw miejsca wiązania, który był bardzo podobny do motywu dla Divo Garris Hilton Burrow.

Po obejrzeniu tego filmu powinni Państwo posiadać dobrą wiedzę na temat wykorzystania metody Daptive do wyznaczania genów docelowych dla białek regulatorowych. Metodę tę można zastosować do analizy rozmiaru wiązania dowolnego białka regulatorowego, pod warunkiem że białko to można oczyścić, a sekwencja genomu jest znana.