Name: Metoda DAP-chip oczyszczona z powinowactwa DNA do określania celów genowych dla dwuskładnikowych systemów regulacyjnych bakteryjnych (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-07-21T14:00:00.000+00:00
Duration: 12 min 24 s
Description: Poznaj metodę DAP-chip do identyfikacji celów genowych regulatorów odpowiedzi bakteryjnych. Technika oparta na mikromacierzach pozwala określić miejsca wiązania w genomie bez znajomości sygnałów aktywujących.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Dziękujemy Amy Chen za pomoc w przygotowaniach do sesji zdjęciowej i za zademonstrowanie techniki. Prace przeprowadzone przez ENIGMA: Ekosystemy i Sieci Zintegrowane z Genami i Zespołami Molekularnymi (http://enigma.lbl.gov), program naukowy w Lawrence Berkeley National Laboratory, były wspierane przez Biuro Nauki, Biuro Badań Biologicznych i Środowiskowych Departamentu Energii Stanów Zjednoczonych na podstawie umowy nr 1. DE-AC02-05CH11231.

<ol><li>Galperin, M. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Diversity+of+structure+and+function+of+response+regulator+output+domains%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Opin+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Diversity of structure and function of response regulator output domains.</a> Curr Opin Microbiol. 13, 150-159 (2010).</li>
<li>Casino, P., Rubio, V., Marina, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+mechanism+of+signal+transduction+by+two-component+systems%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Opin+Struct+Biol%22%5BJournal%5D)">The mechanism of signal transduction by two-component systems.</a> Curr Opin Struct Biol. 20, 763-771 (2010).</li>
<li>Aparicio, O., Geisberg, J. V., Struhl, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chromatin+immunoprecipitation+for+determining+the+association+of+proteins+with+specific+genomic+sequences+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Protoc+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Chromatin immunoprecipitation for determining the association of proteins with specific genomic sequences in vivo.</a> Curr Protoc Cell Biol. 17 (17), (2004).</li>
<li>McCleary, W. R., Stock, J. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Acetyl+phosphate+and+the+activation+of+two-component+response+regulators%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biol+Chem%22%5BJournal%5D)">Acetyl phosphate and the activation of two-component response regulators.</a> J Biol Chem. 269, 31567-31572 (1994).</li>
<li>Novichkov, P. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((RegPrecise+web+services+interface%3A+programmatic+access+to+the+transcriptional+regulatory+interactions+in+bacteria+reconstructed+by+comparative+genomics%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Res%22%5BJournal%5D)">RegPrecise web services interface: programmatic access to the transcriptional regulatory interactions in bacteria reconstructed by comparative genomics.</a> Nucleic Acids Res. 40, 604-608 (2012).</li>
<li>Studholme, D. J., Buck, M., Nixon, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+of+potential+sigma%28N%29-dependent+promoters+in+bacterial+genomes%5BTitle%5D)+AND+%22Microbiology%22%5BJournal%5D)">Identification of potential sigma(N)-dependent promoters in bacterial genomes.</a> Microbiology. 146 (12), 3021-3023 (2000).</li>
<li>Rajeev, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Systematic+mapping+of+two+component+response+regulators+to+gene+targets+in+a+model+sulfate+reducing+bacterium%5BTitle%5D)+AND+%22Genome+Biol%22%5BJournal%5D)">Systematic mapping of two component response regulators to gene targets in a model sulfate reducing bacterium.</a> Genome Biol. 12, 99(2011).</li>
<li>Crooks, G. E., Hon, G., Chandonia, J. M., Brenner, S. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((WebLogo%3A+a+sequence+logo+generator%5BTitle%5D)+AND+%22Genome+Res%22%5BJournal%5D)">WebLogo: a sequence logo generator.</a> Genome Res. 14, 1188-1190 (2004).</li>
<li>Barbieri, C. M., Mack, T. R., Robinson, V. L., Miller, M. T., Stock, A. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Regulation+of+response+regulator+autophosphorylation+through+interdomain+contacts%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biol+Chem%22%5BJournal%5D)">Regulation of response regulator autophosphorylation through interdomain contacts.</a> J Biol Chem. 285, 32325-32335 (2010).</li>
<li>Bourret, R. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Receiver+domain+structure+and+function+in+response+regulator+proteins%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Opin+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Receiver domain structure and function in response regulator proteins.</a> Curr Opin Microbiol. 13, 142-149 (2010).</li>
<li>Gao, R., Stock, A. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Molecular+strategies+for+phosphorylation-mediated+regulation+of+response+regulator+activity%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Opin+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Molecular strategies for phosphorylation-mediated regulation of response regulator activity.</a> Curr Opin Microbiol. 13, 160-167 (2010).</li>
<li>Hung, D. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Oligomerization+of+the+response+regulator+ComE+from+Streptococcus+mutans+is+affected+by+phosphorylation%5BTitle%5D)+AND+%22J+Bacteriol%22%5BJournal%5D)">Oligomerization of the response regulator ComE from Streptococcus mutans is affected by phosphorylation.</a> J Bacteriol. 194, 1127-1135 (2012).</li>
<li>Ladds, J. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+response+regulator+Spo0A+from+Bacillus+subtilis+is+efficiently+phosphorylated+in+Escherichia+coli%5BTitle%5D)+AND+%22FEMS+Microbiol+Lett%22%5BJournal%5D)">The response regulator Spo0A from Bacillus subtilis is efficiently phosphorylated in Escherichia coli.</a> FEMS Microbiol Lett. 223, 153-157 (2003).</li>
<li>Wen, Y., Feng, J., Scott, D. R., Marcus, E. A., Sachs, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Involvement+of+the+HP0165-HP0166+two-component+system+in+expression+of+some+acidic-pH-upregulated+genes+of+Helicobacter+pylori%5BTitle%5D)+AND+%22J+Bacteriol%22%5BJournal%5D)">Involvement of the HP0165-HP0166 two-component system in expression of some acidic-pH-upregulated genes of Helicobacter pylori.</a> J Bacteriol. 188, 1750-1761 (2006).</li>
<li>Liu, X., Noll, D. M., Lieb, J. D., Clarke, N. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((DIP-chip%3A+rapid+and+accurate+determination+of+DNA-binding+specificity%5BTitle%5D)+AND+%22Genome+Res%22%5BJournal%5D)">DIP-chip: rapid and accurate determination of DNA-binding specificity.</a> Genome Res. 15, 421-427 (2005).</li>
<li>Gossett, A. J., Lieb, J. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((DNA+Immunoprecipitation+%28DIP%29+for+the+Determination+of+DNA-Binding+Specificity%5BTitle%5D)+AND+%22CSH+Protoc%22%5BJournal%5D)">DNA Immunoprecipitation (DIP) for the Determination of DNA-Binding Specificity.</a> CSH Protoc. 2008, (2008).</li>
<li>Mascher, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Streptococcus+pneumoniae+cia+regulon%3A+CiaR+target+sites+and+transcription+profile+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22J+Bacteriol%22%5BJournal%5D)">The Streptococcus pneumoniae cia regulon: CiaR target sites and transcription profile analysis.</a> J Bacteriol. 185, 60-70 (2003).</li>
<li>Park, P. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((ChIP-seq%3A+advantages+and+challenges+of+a+maturing+technology%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Genet%22%5BJournal%5D)">ChIP-seq: advantages and challenges of a maturing technology.</a> Nat Rev Genet. 10, 669-680 (2009).</li>
<li>Lefrancois, P., Zheng, W., Snyder, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((ChIP-Seq+using+high-throughput+DNA+sequencing+for+genome-wide+identification+of+transcription+factor+binding+sites%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Enzymol%22%5BJournal%5D)">ChIP-Seq using high-throughput DNA sequencing for genome-wide identification of transcription factor binding sites.</a> Methods Enzymol. 470, 77-104 (2010).</li>
<li>Ho, J. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((ChIP-chip+versus+ChIP-seq%3A+lessons+for+experimental+design+and+data+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Genomics%22%5BJournal%5D)">ChIP-chip versus ChIP-seq: lessons for experimental design and data analysis.</a> BMC Genomics. 12, 134(2011).</li>
<li>Liu, X., Lee, C. K., Granek, J. A., Clarke, N. D., Lieb, J. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Whole-genome+comparison+of+Leu3+binding+in+vitro+and+in+vivo+reveals+the+importance+of+nucleosome+occupancy+in+target+site+selection%5BTitle%5D)+AND+%22Genome+Res%22%5BJournal%5D)">Whole-genome comparison of Leu3 binding in vitro and in vivo reveals the importance of nucleosome occupancy in target site selection.</a> Genome Res. 16, 1517-1528 (2006).</li>
</ol>

Autorzy nie mają do ujawnienia konfliktu interesów.

Opisana tutaj metoda DAP-chip została z powodzeniem wykorzystana do określenia celów genowych dla kilku RR w Desulfovibrio vulgaris Hildenborough7 , z których jeden jest pokazany tutaj jako reprezentatywny wynik. W przypadku DVU3023 RR wybór docelowego genu był prosty. DVU3025 znajduje się bezpośrednio za genem RR, a geny RR i docelowe są konserwatywne w kilku gatunkach Desulfovibrio , a dodatkowo ma DVU3025 przewidywany promotor zależny od sigma54. EMSA zapewnia prostą metodę szybkiego testo...

Zdolność bakterii do przetrwania i rozwoju zależy w krytyczny sposób od tego, jak dobrze potrafią one postrzegać i reagować na zaburzenia w ich środowisku, co z kolei zależy od ich systemów transdukcji sygnału. Liczba systemów sygnalizacyjnych zakodowanych w bakterii została określona mianem jej „mikrobowego IQ” i może stanowić wskaźnik zarówno zmienności jej środowiska, jak i zdolności do wykrywania wielu sygnałów oraz precyzyjnego dostrajania reakcji1. Dwuskładnikowe systemy transdukcji sygnału (TCS) są najpowszechniejszymi systemami sygnalizacyjnymi wykorzystywanymi przez bakterie i składają się z histydynowej kinazy (HK), która wykrywa sygnał zewnętrzny i przekazuje go poprzez fosforylację do efektorowego regulatora odpowiedzi (RR)2. RR mogą posiadać różne domeny wyjściowe, a tym samym różne tryby efektorowe, jednak najczęstszą odpowiedzią jest regulacja transkrypcyjna za pośrednictwem domeny wiążącej DNA1. Sygnały wykrywane oraz odpowiadające im funkcje ogromnej większości TCS pozostają nieznane.
Choć metody in vivo, takie jak ChIP-chip, są rutynowo stosowane do wyznaczania genomowych miejsc wiązania czynników transkrypcyjnych3, mogą one być wykorzystane w przypadku bakteryjnych regulatorów odpowiedzi (RR) systemów dwuskładnikowych tylko wtedy, gdy znane są warunki lub sygnały aktywujące. Często sygnały środowiskowe aktywujące system dwuskładnikowy (TCS) są trudniejsze do ustalenia niż ich geny docelowe. Opisany tutaj test oparty na mikromacierzach in vitro może być wykorzystany do skutecznego i szybkiego wyznaczania genów docelowych oraz przewidywania funkcji TCS. Test ten wykorzystuje fakt, że RR mogą zostać ufosforylowane, a w konsekwencji aktywowane in vitro przy użyciu małocząsteczkowych donorów, takich jak fosforan acetylowy4.
W tej metodzie, nazwanej DAP-chip (chip z oczyszczaniem powinowactwa do DNA) (Rysunek 1), badany gen RR jest klonowany z tagiem His w E. coli, a następnie oczyszczone białko z tagiem wiąże się z pociętym DNA genomicznym. DNA związane z białkiem jest następnie wzbogacane poprzez oczyszczanie powinowactwa, a wzbogacone i wejściowe DNA są amplifikowane, znakowane fluorescencyjnie, łączone i hybrydyzowane z matrycą tilingową wykonaną na zamówienie dla badanego organizmu (Rysunek 1). Eksperymenty z mikromacierzy są podatne na artefakty, dlatego stosuje się dodatkowe kroki w celu optymalizacji analizy. Jednym z takich kroków jest próba wyznaczenia jednego celu dla badanego RR przy użyciu testów przesunięcia mobilności elektroforetycznej (EMSA) (patrz schemat w Rysunku 2). Następnie, po związaniu z DNA genomicznym i przeprowadzeniu etapów DAP, DNA związane z białkiem oraz DNA wejściowe są badane za pomocą qPCR, aby sprawdzić, czy pozytywny cel jest wzbogacony we frakcji związanej z białkiem w stosunku do frakcji wejściowej, co potwierdza optymalne warunki wiązania dla RR (Rysunek 2). Po hybrydyzacji z macierzą dane są analizowane w celu znalezienia szczytów o wyższej intensywności sygnału, wskazujących na loci genomiczne, w których związało się białko. Funkcje RR mogą zostać przewidziane na podstawie uzyskanych celów genowych. Docelowe loci genomiczne służą do przewidywania motywów miejsc wiązania, które są następnie walidowane eksperymentalnie za pomocą EMSA (Rysunek 2). Przewidywania funkcjonalne i cele genowe dla RR mogą być następnie rozszerzone na blisko spokrewnione gatunki kodujące ortologiczne RR poprzez przeszukiwanie tych genomów pod kątem podobnych motywów wiązania (Rysunek 2). Metoda DAP-chip może dostarczyć bogactwa informacji dla TCS, w przypadku których wcześniej ich brakowało. Metodę tę można stosować dla każdego regulatora transkrypcji, jeśli białko może zostać oczyszczone i można określić warunki wiązania DNA, a także dla każdego badanego organizmu, dla którego dostępna jest sekwencja genomu.
<img alt="Schemat procesu ekspresji genu; E. coli, ekspresja RR-His, oczyszczanie Ni-NTA, amplifikacja DNA." fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/51715/51715fig1highres.jpg" width="500" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="Rysunek 1"> 
Rysunek 1. Strategia DAP-chip (DNA-affinity-purified-chip)7. Gen RR z badanego organizmu jest klonowany wraz z His-tagiem na koniec karboksylowym do szczepu ekspresyjnego E. coli. Oczyszczone białko z His-tagiem jest aktywowane poprzez fosforylację fosforanem acetylu, a następnie mieszane z pofragmentowanym genomowym DNA. Alikwot reakcji wiązania jest zachowany jako DNA wejściowe (input), natomiast reszta poddawana jest oczyszczaniu powinowactwa przy użyciu żywicy Ni-NTA. DNA wejściowe oraz DNA związane z RR poddawane są amplifikacji całego genomu, a następnie odpowiednio znakowane barwnikami Cy3 i Cy5. Znakowane DNA są łączone i hybrydyzowane z macierzą tilingową, która jest następnie analizowana w celu określenia genów docelowych. Rysunek zmodyfikowany i przedrukowany na podstawie licencjonowanego materiału Creative Commons z7.
<img alt="Schemat analizy oddziaływań białko-DNA; etapy EMSA i qPCR dla przewidywań funkcjonalnych." fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/51715/51715fig2highres.jpg" width="500" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="Rycina 2"> 
Rycina 2. Podsumowanie schematu postępowania. W przypadku każdego oczyszczonego białka z etykietą należy rozpocząć od wyznaczenia celu za pomocą EMSA. Pozostawić białko do związania z DNA genomowym, a następnie przeprowadzić oczyszczanie z powinowactwem do DNA (DAP) oraz amplifikację całego genomu (WGA) wzbogaconego DNA oraz DNA wejściowego. Jeśli cel genowy jest znany, należy użyć qPCR, aby upewnić się, że znany cel jest wzbogacony we frakcji związanej z białkiem. Jeśli nie udało się wyznaczyć celu, należy przejść bezpośrednio do znakowania DNA i hybrydyzacji na macierzach. Jeśli nie zaobserwowano wzbogacenia w qPCR, należy powtórzyć etapy wiązania białka z gDNA oraz DAP-WGA, stosując inne ilości białka. Wykorzystać analizę macierzy do znalezienia pików i przypisania ich do genów docelowych. Użyć regionów powyżej genów docelowych do przewidywania motywów miejsc wiązania. Zweryfikować motywy eksperymentalnie za pomocą EMSA. Wykorzystać motyw do przeszukiwania genomów gatunków pokrewnych kodujących ortologi badanego RR i przewidzieć geny docelowe również w tych gatunkach. Na podstawie uzyskanych celów genowych można przewidzieć funkcję fizjologiczną RR i jego ortologów. Rycina zmodyfikowana i przedrukowana na podstawie licencji Creative Commons z7.

<table><tbody><tr><td>Kolumna HisTrapFF (kolumna Ni-Sepharose)</td><td>GE Lfe Sciences, Pittsburgh, PA, USA</td><td>17-5255-01</td><td></td></tr><tr><td>Eksplorator Akta (instrument FPLC)</td><td>GE Lfe Sciences, Pittsburgh, PA, USA</td><td></td><td></td></tr><tr><td>HiPrep 26/10 Kolumna odsalająca</td><td>GE Lfe Sciences, Pittsburgh, PA, USA</td><td>17-5087-01</td><td></td></tr><tr><td>Qiaquick Zestaw do ekstrakcji żelu</td><td>Qiagen Inc, Walencja, CA, USA</td><td>28704</td><td></td></tr><tr><td>Oligonukleotydy znakowane biotyną</td><td>Zintegrowane technologie DNA Nie</td><td>dotyczy</td><td></td></tr><tr><td>6% poliakrylamidu-0,5x TBE prefabrykowany mini żel opóźniający DNA</td><td>Life Technologies, Grand Island, NY, USA</td><td>EC63652BOX</td><td>Alternatywnie możesz wlać własny żel.</td></tr><tr><td>Membrana</td><td>nylonowa EMD Millipore, Billerica, MA, USA</td><td>INYC00010</td><td></td></tr><tr><td>Trans-Blot SD Półsucha elektroforetyczna komórka transferowa</td><td>Biorad, Hercules, CA, USA</td><td>170-3940</td><td></td></tr><tr><td>Bardzo gruby papier do bibuły, 8 x 13,5 cm</td><td>Biorad, Hercules, CA, USA</td><td>170-3967</td><td></td></tr><tr><td>Środek sieciujący UV Model XL-1000</td><td>Fisher Scientific</td><td>11-992-89</td><td></td></tr><tr><td>Zestaw do wykrywania chemiluminescencyjnego kwasu nukleinowego (Pierce)</td><td>Thermo fisher Scientific, Rockford, IL, USA</td><td>89880</td><td></td></tr><tr><td>Żywica agarozowa Ni-NTA</td><td>Qiagen Inc, Walencja, CA, USA</td><td>30210</td><td></td></tr><tr><td>Zestaw do amplifikacji całego genomu GenomePlex (bufor do fragmentacji, bufor do przygotowania biblioteki, roztwór stabilizujący bibliotekę, enzym do przygotowania biblioteki, 10-krotna amplifikacja główna mieszanka, polimeraza WGA)</td><td>Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA</td><td>WGA2-50RXN</td><td></td></tr><tr><td>Nanodrop ND-1000</td><td>Thermo Scientific, Wilmington, DE, USA</td><td>Do ilościowego oznaczania DNA</td><td></td></tr><tr><td>Perfecta Sybr Green SuperMix, z ROX</td><td>Quanta biosciences</td><td>95055-500</td><td>Można użyć dowolnej mieszanki Sybr Green PCR</td></tr><tr><td>Przezroczysta folia termozgrzewalna PlateMax Ultra do qPCR</td><td>Axygen</td><td></td><td></td></tr><tr><td colspan="4">[header]</td></tr><tr><td>96-dołkowa, przezroczysta, niskoprofilowa mikropłytka PCR</td><td>Life Technologies, Grand Island, Nowy Jork, Stany Zjednoczone</td><td>PCR-96-LP-AB-C</td><td></td></tr><tr><td>Applied Biosystems System StepOne Plus Real Time PCR</td><td>System Life Technologies, Grand Island, NY, USA</td><td>4376600</td><td>Można użyć dowolnego systemu do PCR w czasie rzeczywistym</td></tr><tr><td>Zestaw do oczyszczania Qiaquick PCR</td><td>Qiagen Inc, Walencja, CA, USA</td><td>28104</td><td>Można użyć dowolnego zestawu do czyszczenia PCR</td></tr><tr><td>Nieamers z oznaczeniem Cy3/Cy5</td><td>Trilink biotechnologies, San Diego, CA, USA</td><td>N46-0001, N46-0002</td><td></td></tr><tr><td>Polimeraza Klenowa 50 000 U/ml, 3'-5' egzo-</td><td>New England Biolabs, Ipswich, MA</td><td>M0212M</td><td></td></tr><tr><td>System hybrydyzacji</td><td>Roche-Nimblegen, Madison, WI, USA</td><td>N/A</td><td>Ta firma nie produkuje już tablic ani powiązanych elementów, więc konieczne będzie użycie alternatywnych źródeł, takich jak Agilent lub Affymetrix.</td></tr><tr><td>Mikromacierze i miksery z nadrukiem na zamówienie</td><td>Roche-Nimblegen, Madison, WI, USA</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>Zestaw do hybrydyzacji (2x bufor hybrydyzacyjny, składnik hybrydyzacyjny A, oligo wyrównujący)</td> <td>Roche-Nimblegen, Madison, WI, USA</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>Zestaw myjących (10x bufor do mycia I, II, III, 1 M DTT)</td><td>Roche-Nimblegen, Madison, WI, USA</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>Skaner mikromacierzy GenePix 4200A</td><td>Urządzenia molekularne, Sunnyvale, CA, USA</td><td>Ten model został zastąpiony lepszymi</td><td></td></tr><tr><td>Oprogramowanie do mikromacierzy GenePix Pro</td><td>Molecular Devices, Sunnyvale, CA, USA</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Nimblescan v.2.4, oprogramowanie do analizy chipów ChIP</td><td>Roche-Nimblegen, Madison, WI, USA</td><td>N/A</td><td></td></tr></tbody></table>

metoda dap-chip oczyszczona z powinowactwa dna do określania celów genowych dla dwuskładnikowych systemów regulacyjnych bakteryjnych

DNA-affinity-purified Chip (DAP-chip) Method to Determine Gene Targets for Bacterial Two component Regulatory Systems

Metody in vivo, takie jak ChIP-chip, są dobrze znanymi technikami używanymi do określania globalnych celów genów dla czynników transkrypcyjnych. Mają one jednak ograniczone zastosowanie w badaniu dwuskładnikowych systemów regulacyjnych bakterii z niescharakteryzowanymi warunkami aktywacji. Takie systemy regulują transkrypcję tylko wtedy, gdy są aktywowane w obecności unikalnych sygnałów. Ponieważ sygnały te są często nieznane, metoda oparta na mikromacierzyach in vitro opisana w tym artykule wideo może być wykorzystana do określenia celów genów i miejsc wiązania regulatorów odpowiedzi. Ta metoda oczyszczonego chipa z powinowactwem DNA może być stosowana do dowolnego oczyszczonego regulatora w dowolnym organizmie ze zsekwencjonowanym genomem. Protokół polega na umożliwieniu oczyszczonemu, znakowanemu białku związania się ze ściętym genomowym DNA, a następnie powinowactwu oczyszczającemu DNA związane z białkiem, a następnie fluorescencyjnemu znakowaniu DNA i hybrydyzacji z niestandardową macierzą kafelkową. Opisano również poprzednie kroki, które można wykorzystać do optymalizacji testu dla określonych regulatorów. Piki wygenerowane przez analizę danych tablicowych są wykorzystywane do przewidywania motywów miejsc wiązania, które są następnie weryfikowane eksperymentalnie. Przewidywania dotyczące motywów mogą być dalej wykorzystywane do określania celów genowych regulatorów odpowiedzi ortologicznej u blisko spokrewnionych gatunków. Wykazujemy możliwość zastosowania tej metody, określając cele genów i motywy miejsc wiązania, a tym samym przewidując funkcję DVU3023 regulatora odpowiedzi zależnego od sigma54 w bakterii środowiskowej Desulfovibrio vulgaris Hildenborough.

Powyższa metoda została zastosowana w celu określenia globalnych genów docelowych regulatorów odpowiedzi (RR) u modelowej bakterii redukującej siarczany Desulfovibrio vulgaris Hildenborough7. Organizm ten posiada liczne systemy dwuskładnikowe (TCS), reprezentowane przez ponad 70 RR, co wskazuje na szeroki wachlarz sygnałów, które bakteria ta wykrywa i na które reaguje. Analizy in vivo funkcji tych systemów sygnałowych są trudne do przeprowadzenia, ponieważ ich sygnały, a tym samym warunki akt...

Ten artykuł wideo opisuje metodę opartą na mikromacierzy in vitro, która pozwala określić cele genów i miejsca wiązania dla regulatorów odpowiedzi systemu dwuskładnikowego.

Metoda DAP-chip oczyszczona z powinowactwa DNA do określania celów genowych dla dwuskładnikowych systemów regulacyjnych bakteryjnych

In vivo methods such as ChIP-chip are well-established techniques used to determine global gene targets for transcription factors. However, they are of ...

Ogólnym celem poniższego eksperymentu jest określenie genomowych miejsc wiązania bakteryjnych regulatorów odpowiedzi dwuskładnikowych przy użyciu testu opartego na mikromacierzach in vitro. Osiąga się to poprzez klonowanie i oczyszczanie znakowanego białka regulatora odpowiedzi, jego aktywację poprzez fosforylację in vitro oraz wyznaczenie jednego genu docelowego za pomocą testów przesunięcia mobilności elektroforetycznej, który posłuży jako kontrola pozytywna dla kolejnych etapów analizy mikromacierzowej. W drugim kroku oczyszczone białko regulatora odpowiedzi miesza się z genomicznym DNA, co pozwala na oddzielenie DNA związanego z białkiem od DNA wejściowego za pomocą oczyszczania powinowactwa.Następnie białko-związane DNA oraz DNA wejściowe są amplifikowane, weryfikowane metodą QPCR pod kątem wzbogacenia celu genu kontroli pozytywnej we frakcji związanej z białkiem, znakowane fluorescencyjnie, łączone w pulę i hybrydyzowane z kafelkową macierzą mikroprzewodnią. W celu określenia genomicznych miejsc wiązania regulatora odpowiedzi, wyniki wskazują najbardziej prawdopodobne geny regulowane przez badany regulator odpowiedzi, a wyniki te można następnie zwalidować za pomocą analizy przesunięcia ruchomości elektroforetycznej. Główną zaletą tej techniki w porównaniu z innymi metodami, takimi jak in vivo chip chip, jest możliwość jej zastosowania nawet wtedy, gdy sygnały aktywujące i warunki dla dwuskładnikowych systemów regulacji nie są znane.Metoda ta ma ogromne znaczenie dla dziedziny sygnalizacji bakteryjnej, ponieważ ogromna większość regulatorów odpowiedzi ma nieznane geny docelowe, a niniejsza metoda pomaga w odkrywaniu złożonych sieci regulacyjnych. Procedurę tę zaprezentuje Amy Chen, asystentka badawcza z mojego laboratorium, przed rozpoczęciem procesu.Oczyszczanie rr, a konkretnie białka DVU 3 0 2 3 wykazującego ekspresję z klonowanej mieszaniny genów DVU 3 0 2 3. 0.5 picomoles białka DVU 3 0 2 3 z 100 fent moles wcześniej przygotowanego przez at inated substratu DNA w roztworze buforowym do całkowitej objętości 20 microliters. Po przygotowaniu reakcji kontrolnej bez dodatku białka, inkubować reakcje w temperaturze pokojowej na blacie przez 20 minut.Po inkubacji do reakcji wiązania należy dodać 5 µL 5x buforu do ładowania. Na wcześniej przygotowany mini żel poliakrylamidowy 6% w 0,5 XTBE należy nałożyć po 18 µL z każdej reakcji i prowadzić elektroforezę przy napięciu 100 V przez dwie godziny. Po zakończeniu elektroforezy należy wyciąć naładowaną membranę nylonową do rozmiaru żelu i namoczyć ją w 0,5 XTBE przez co najmniej 10 minut. Następnie należy wyjąć żel z kasety.Odetnij wszelkie krawędzie żelu, a następnie umieść żel i membranę pomiędzy dwoma grubymi filtrami nasączonymi 0,5 XTBE. Umieść żel i membranę w aparacie do półsuchego transferu i prowadź proces przy napięciu 20 V przez 30 minut. Następnie umieść membranę w komercyjnym urządzeniu do sieciowania promieniami UV i ustaw czas na trzy minuty; po wywołaniu transferu za pomocą zestawu do detekcji chemiluminescencyjnej, wykonaj obrazowanie przy użyciu komputera podłączonego do kamery z matrycą CCD.Należy poszukiwać przesunięcia mobilności substratu DNA w obecności rr, co wskazuje na wiązanie badanego DNA przez RR. Następnie wymieszać od dwóch do trzech mikrogramów wspólnego DNA genomicznego z 0,5 pikomola DVU 3 0 2 3 w roztworze buforowym. Po inkubacji reakcji w temperaturze 25 °C przez 30 minut, przenieść 10 µL mieszaniny do probówki o pojemności 1,5 ml i oznaczyć ją jako DNA wejściowe.Do probówki do mikrocentryfugi o pojemności 0,6 ml należy dodać 30 µL żywicy niklowej NTA aros. Próbkę wirować z prędkością 100 ×g przez jedną minutę, aby po wirowaniu zebrać żywicę na dnie probówki. Następnie należy usunąć nadsącz.Dodaj 100 µL buforu do płukania i delikatnie potrząśnij probówką, aby wymieszać zawartość. Po wirowaniu z prędkością 100 G przez dwie minuty usuń nadsącz. Dodaj pozostałe 90 µL mieszaniny reakcyjnej do żywicy niklowej NTA.Następnie inkubować próbkę w inkubatorze obrotowym przez 30 minut. Po zakończeniu odwirować próbkę z siłą 100 Gs przez dwie minuty. Po usunięciu nadsączu powtórzyć etapy płukania jeszcze trzy razy.Następnie dodaj 35 µL buforu elucyjnego do żywicy i wymieszaj za pomocą wortexa. Próbkę inkubuj na blacie w temperaturze pokojowej przez pięć minut. Po odwirowaniu próbki przenieś nadsącz do nowej probówki 1,5 ml i oznacz ją jako frakcję DNA związanego z białkiem.Następnie dodaj 35 µL buforu eluującego do wejściowego DNA po oczyszczeniu frakcji DNA wejściowego i DNA związanego z białkiem. Przenieś po 10 µL każdej z nich do oddzielnych probówek do PCR. Do każdej próbki dodaj 1 µL 10 x buforu do fragmentacji, 2 µL buforu do przygotowania biblioteki oraz 1 µL roztworu stabilizującego bibliotekę, a następnie dokładnie wymieszaj próbki za pomocą wirówki laboratoryjnej.Inkubuj próbki w termocyklerze w temperaturze 95 °C przez dwie minuty. Po zakończeniu schłodź próbki na lodzie. Następnie dodaj do próbek 1 µL enzymu do przygotowania bibliotek i wymieszaj zawartość poprzez pipetowanie.Inkubuj próbki w termocyklerze. Po inkubacji dodaj do każdej probówki 47,5 µL wody, 7,5 µL 10 x amplification master mix oraz pięć µL polimerazy. Po wymieszaniu próbek podgrzej je w termocyklerze.Przygotuj reakcje qPCR w trzech powtórzeniach dla każdego matrycowego DNA, sporządzając master mix w stężeniu 1x dla każdego z wcześniej zaprojektowanych zestawów starterów, a następnie odmierz 18 µL master mixu do każdego dołka 96-dołkowej płytki PCR. Próbki DNA wejściowego oraz DNA związanego z białkiem, po amplifikacji i oczyszczeniu, rozcieńcz wodą do stężenia 5 ng/µL i dodaj 2 µL każdej próbki do odpowiednich dołków. Następnie szczelnie zamknij płytkę za pomocą folii uszczelniającej UltraClear qPCR.Odwiruj płytkę w wirówce przy 200 GS przez jedną minutę. Po umieszczeniu płytki w cyklu urządzenia do qPCR w czasie rzeczywistym, stosując następujące warunki w celu znakowania wejściowego DNA za pomocą s si three i wzbogaconego DNA za pomocą sci five, wymieszaj 1 µg DNA z 40 µL oznakowanych S3 SCI-FI nonamerów i uzupełnij objętość wodą do 80 µL. Denaturuj próbki w temperaturze 98 °C przez 10 minut w ciemności w termocyklerze.Po zakończeniu szybko schłodź próbki na lodzie przez dwie minuty, a następnie do każdej reakcji dodaj 2 µL polimerazy 3' do 5' egzonukleazy, 5 mM dNTP oraz 8 µL wody. Po wymieszaniu inkubuj reakcje w temperaturze 37 °C przez dwie godziny w ciemności w termocyklerze. Następnie dodaj EDTA do stężenia 50 mM, aby zatrzymać reakcje, oraz roztwór NaCl do stężenia 0,5 M.Następnie przenieś do probówek o pojemności 1,5 ml zawierających 0,9 objętości izopropanolu po inkubacji w ciemności przez 10 minut. Odwiruj próbki z prędkością 12 000 g przez 10 minut. Połącz po 6 µg DNA znakowanego S3 i sci-fi w probówce o pojemności 1,5 ml i wysusz próżniowo w wirówce w niskiej temperaturze w ciemności, zakrywając pokrywę wirówki, jeśli jest ona przezroczysta.Po wyschnięciu osadów zawiesza się je w 5 µL wody. Następnie, po 15 sekundach wirowania w wstrząsace z vortexem, do próbek dodaje się 13 µL wcześniej przygotowanej 1x mieszaniny głównej roztworu do hybrydyzacji, a następnie inkubuje próbki w bloku grzewczym w temperaturze 95 °C przez pięć minut. Próbki należy wyjąć z bloku grzewczego i umieścić w systemie do hybrydyzacji w temperaturze 42 °C do momentu rozpoczęcia załadunku.Następnie umieść wcześniej przygotowany zespół szkiełka mieszającego w systemie do hybrydyzacji. Wprowadź 16 µL próbki do otworu napełniającego. Następnie uszczelnij otwory folią klejącą i włącz mieszanie w systemie. Pozostaw do hybrydyzacji na 16 do 20 godzin w temperaturze 42 °C.Wsuń preparat do narzędzia do demontażu i umieść go w naczyniu zawierającym ciepły bufor. Odlej mikser, energicznie potrząsając narzędziem do demontażu. Umieść preparat w pojemniku z 50 mililitrami buforu piorącego one i energicznie potrząsaj przez dwie minuty.Następnie powtórz poprzedni krok, używając 50 milliliters buforu płukania dwa oraz 50 milliliters buforu płukania trzy RRR DVU 3 0 2 3 shifted. Analiza QPCR regionu upstream DVU 3 0 2 5 wykazała, że region upstream DVU 3 0 2 5 jest wzbogacony w frakcji związanej z białkiem w stosunku do DNA wejściowego, co wskazuje, że warunki wiązania były odpowiednie dla DVU 3 0 2 3. Jako kontrolę negatywną wykorzystano DVU 0 0 1 3. Cztery najwyższe piki uzyskane po analizie DAP chipp wybrano jako najbardziej prawdopodobne cele dla DV 3 0 2 3.Pozytywnym celem DVU 3 0 2 5 był pierwszy otrzymany pik o najwyższej ocenie. Dwa cele genowe to dwa inne zakodowane permeazy mleczanu. Czwarty cel genowy nie znajduje się w regionie upstream, lecz w regionie międzygenowym pomiędzy dwoma genami transkrybowanymi zbieżnie, wykorzystując regiony upstream celów uzyskanych przez DAP chip meme w celu przewidzenia motywu miejsca wiązania.Motyw został dodatkowo zwalidowany poprzez wprowadzenie substytucji w konserwatywnych zasadach w obrębie motywu, co wyeliminowało przesunięcie wiązania. Zwalidowany motyw wykorzystano do przeszukania genomów innych bakterii redukujących siarczany; loci ortologiczne DVU 3 0 2 3 wybrano jako potencjalne cele genowe w przypadkach, gdy motyw znajdował się w regionach powyżej ramek odczytu, stosując sekwencje motywów przewidziane dla autologicznych rs. Wygenerowano konsensusowy motyw miejsca wiązania, który był bardzo podobny do motywu dla Divo Garris Hilton Burrow.Po obejrzeniu tego filmu powinni Państwo posiadać dobrą wiedzę na temat wykorzystania metody Daptive do wyznaczania genów docelowych dla białek regulatorowych. Metodę tę można zastosować do analizy rozmiaru wiązania dowolnego białka regulatorowego, pod warunkiem że białko to można oczyścić, a sekwencja genomu jest znana.

dna-affinity-purified-chip-dap-chip-method-to-determine-gene-targets

Research

JoVE Journal

Biology

Biologia

Metoda oznaczania genów docelowych dla bakteryjnych układów regulacyjnych dwuskładnikowych z wykorzystaniem żelu DNA-affinity-purified Chip (DAP-chip)

Przedstawiamy tutaj procedurę immunoprecypitacji chromatyny (ChIP) służącą do analizy lokalizacji w całym genomie izoform białek różniących się domeną wiążącą histony. Zastosowaliśmy ją w analizie ChIP-Seq w celu zidentyfikowania celów demetylazy histonów KDM5A/JARID1A/RBP2.

Analiza całogenomowa z wykorzystaniem metody ChIP w celu identyfikacji specyficznych dla izoform celów genowych

Ten film demonstruje test in vivo na bakteriach w celu zbadania interakcji białek wiążących RNA (RBP) z RNA. Komórki bakteryjne są przekształcane za pomocą dwóch konstruktów plazmidowych - plazmidu miejsca wiązania kodującego mRNA zawierającego fluorescencyjny gen reporterowy za miejscem wiązania RBP - podczas gdy plazmid RBP ulega ekspresji białek RBP pod kontrolą induktora. Po wzroście produkcji RBP za pośrednictwem induktora, RBP wiążą się z mRNA, powodując translacyjną represję reportera...

Test represji genu reporterowego w celu zbadania regulacji translacyjnej genu docelowego

Ten film demonstruje metodę wykrywania szczepów cyjanobakterii w próbce środowiskowej za pomocą mikromatrycy przeciwciał. Próbki zawierające różne bakterie wchodzą w interakcje z wydrukowanymi przeciwciałami, a barwienie immunologiczne przeciwciałami anty-cyjanobakterii znakowanymi fluoroforem ujawnia obecność specyficznych szczepów cyjanobakterii poprzez fluorescencję w różnych miejscach.

Technika wykrywania szczepów sinic za pomocą chipa mikromacierzy przeciwciał

Opracowaliśmy platformę mikroprzepływową do szybkiego testowania wrażliwości na antybiotyki. Płyn jest przepuszczany z dużą prędkością przez bakterie unieruchomione na dnie kanału mikroprzepływowego. W obecności stresu i antybiotyku wrażliwe szczepy bakterii szybko giną. Jednak oporne bakterie mogą przetrwać te stresujące warunki.

Badanie wrażliwości na antybiotyki wywołane stresem na chipie

Opisujemy tutaj test polegający na sprzężeniu identyfikacji metylotransferazy adeninowej DNA (DamID) z sekwencjonowaniem o wysokiej przepustowości (DamID-seq). Ta ulepszona metoda zapewnia wyższą rozdzielczość i szerszy zakres dynamiki oraz umożliwia analizowanie danych DamID-seq w połączeniu z innymi danymi sekwencjonowania o wysokiej przepustowości, takimi jak ChIP-seq, RNA-seq itp.

DamID-seq: Mapowanie interakcji białko-DNA w całym genomie poprzez wysokoprzepustowe sekwencjonowanie fragmentów DNA metylowanych adeniną

Przedstawiamy strategiczny plan i protokół identyfikacji niekodujących wariantów genetycznych wpływających na wiązanie DNA czynnika transkrypcyjnego (TF). Przedstawiono szczegółowy protokół eksperymentalny dla testu przesunięcia ruchliwości elektroforetycznej (EMSA) i testu powinowactwa DNA (DAPA) analizy wiązania TF DNA zależnego od genotypu.

Badania przesiewowe w kierunku funkcjonalnych niekodujących wariantów genetycznych przy użyciu testu przesunięcia ruchliwości elektroforetycznej (EMSA) i testu precypitacji powinowactwa DNA (DAPA)

Przewlekła białaczka limfocytowa (CLL) jest najczęstszą białaczką w zachodnim świecie. Czynniki transkrypcyjne NFAT są ważnymi regulatorami rozwoju i aktywacji w wielu typach komórek. W tym miejscu przedstawiamy protokół stosowania immunoprecypitacji chromatyny (ChIP) w ludzkich komórkach PBL w celu identyfikacji nowych genów docelowych NFAT2.

Test immunoprecypitacji chromatyny w celu identyfikacji nowych genów docelowych NFAT2 w przewlekłej białaczce limfocytowej

W tej metodzie, określamy ilościowo powinowactwo wiązania białek wiążących RNA (RBP) do pokrewnych i niepokrewnych miejsc wiązania za pomocą prostego, żywego, reporterowego testu w komórkach bakteryjnych. Test opiera się na represji genu reporterowego.

Test do ilościowego określania wiązania białka-RNA u bakterii

Immunoprecypitacja chromatyny w połączeniu z sekwencjonowaniem nowej generacji (ChIP-seq) to metoda stosowana do ustalania interakcji między czynnikami transkrypcyjnymi a kontrolowanymi przez nie sekwencjami genomowymi. Protokół ten przedstawia techniki wykonywania sekwencji ChIP-seq z biofilmami bakteryjnymi, na przykładzie biofilmu bakteryjnego Salmonella enterica Typhimurium serovar.

Odkrywanie celów regulatorowych CsgD w biofilmie Salmonelli przy użyciu immunoprecypitacji chromatyny i sekwencjonowania wysokoprzepustowego (ChIP-seq)

Różnicowe promieniste działanie kapilarne testu ligandowego (DRaCALA) może być wykorzystane do identyfikacji małych białek wiążących ligand organizmu za pomocą biblioteki ORFeome.

Identyfikacja białek wiążących małe ligandy za pomocą zróżnicowanego promieniowego działania kapilarnego testu ligandowego (DRaCALA)

Nanomaszyny oparte na DNAzyme mogą być używane do wysoce selektywnego i czułego wykrywania kwasów nukleinowych. W artykule opisano szczegółowy protokół projektowania nanomaszyn opartych na DNAzyme z rdzeniem 10-23 przy użyciu wolnego oprogramowania i ich zastosowania w wykrywaniu fragmentu wirusa Epsteina-Barr jako przykładu.

DNAzyme 10-23 - Nanomaszyny do rozpoznawania kwasów nukleinowych

Poznaj metodę DAP-chip do identyfikacji celów genowych regulatorów odpowiedzi bakteryjnych. Technika oparta na mikromacierzach pozwala określić miejsca wiązania w genomie bez znajomości sygnałów aktywujących.

Metoda DAP-chip oczyszczona z powinowactwa DNA do określania celów genowych dla dwuskładnikowych systemów regulacyjnych bakteryjnych (Wideo) | JoVE Journal

Metoda DAP-chip oczyszczona z powinowactwa DNA do określania celów genowych dla dwuskładnikowych systemów regulacyjnych bakteryjnych

Przeglądaj więcej filmów