Name: Prosty test behawioralny do badania funkcji wzrokowych u Xenopus laevis (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-06-12T15:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 34 s
Description: Poznaj prosty test behawioralny do oceny funkcji wzrokowych u kijanek Xenopus laevis. Ta metoda pozwala badać preferencje wizualne i przetwarzanie bodźców wzrokowych w modelu neurobiologicznym.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Ta praca została sfinansowana z grantów z National Institutes of Health: EY015748, EY017964 (MEZ) i EY019517 (ASV). Praca ta była również wspierana przez grant Research to Prevent Blindness Unrestricted dla Oddziału Okulistyki i Lions of Central New York. Chcielibyśmy również podziękować naszemu zootechnikowi, Matthew Mellini, za jego doskonałą opiekę nad zwierzętami i za udział w tym filmie.

Opieka nad zwierzętami
Kijanki Xenopus laevis użyte w tym badaniu były hodowane, hodowane i leczone zgodnie z procedurami zatwierdzonymi przez IACUC Uniwersytetu Medycznego Upstate oraz Przewodnik po opiece i użytkowaniu zwierząt laboratoryjnych.
1. Ustawienie przed zachowaniem: Kijanki
<ol>
	<li>Pozyskać zapłodnione zarodki Xenopus z dostępnego na rynku źródła lub zapłodnić oocyty in vitro, jak opisano wcześniej6.</li>
	<li>Umieścić blastulę na zarodkach w stadium płytki nerwowej w temperaturze 18 °C na 60 mm szalkach Petriego zawierających 0,1X MMR [10 X Zmodyfikowany roztwór Ringera Marca (MMR) (10 mM MgCl2; 20 mM KCl; 20 mM CaCl2 ; 50 mM HEPES; 1 M NaCl; dostosowany do pH 7,5, autoklawowany i przechowywany w temperaturze pokojowej)] z 50 μg/ml antybiotyku gentamycyny. Zmieniaj 0,1 raza MMR każdego dnia i usuń martwe zarodki.</li>
	<li>Gdy zarodki osiągną stadium Nieuwkoop i Faber ~27 - 307, zamień zarodki na 0,1X MMR bez antybiotyku, aby umożliwić wzrost bakterii jelitowych.</li>
	<li>Hoduj kijanki, aż osiągną etap karmienia (etap 45) i przenieś je na 100-milimetrowe szalki Petriego wypełnione 0,1X MMR. Podawaj im supernatant z pokrzywy w proszku co drugi dzień przez tydzień, zmieniając 0,1 razy MMR w międzydniu.</li>
	<li>Po tygodniu na szalce Petriego o średnicy 100 mm przenieś zwierzęta do półgalonowych zbiorników wypełnionych wodą z żab [0,5 g/l natychmiastowego oceanu i 2 mM dwuzasadowego fosforanu sodu (Na2HPO4: mw 141,96) pH 6,8]. Karm je jak w kroku 2.4, ale zmieniaj wodę tylko 2-3 razy w tygodniu, gdy woda jest mętna. Utrzymuj zwierzęta w 12-godzinnym cyklu światła/12 ciemnych świateł, gdy światła włączają się o 6 rano.</li>
	<li>Umieść półgalonowy zbiornik z osobami badanymi na białej powierzchni, takiej jak podkładka stołu laboratoryjnego, co najmniej 12 godzin O/N, przed badaniem.</li>
	<li>Przetestuj kijanki na etapach od 45 do 50, jak opisano w kroku 3 poniżej.</li>
</ol>
2. Wstępna konfiguracja zachowania: Sprzęt
<ol>
	<li>Odłóż na bok obszar laboratorium na test zachowania. Powinien znajdować się w cichym miejscu o małym natężeniu ruchu ze standardowym oświetleniem fluorescencyjnym.</li>
	<li>Przygotuj zbiorniki do testów dla zwierząt. 
	Zagnieżdżone, półgalonowe zbiorniki testowe składają się z dwóch części: zbiornika wewnętrznego, który pomieści wodę i kijanki; i zewnętrzny zbiornik z bodźcem wizualnym.
	<ol>
		<li>W przypadku zbiornika wewnętrznego zrób mały znak na zewnętrznych rogach za pomocą sharpie, 5 cm od dna; to jest linia wodna (Rysunek 1A, zielona przerywana linia).</li>
		<li>Również w przypadku zbiornika wewnętrznego napełnij wgłębienia w zbiorniku (w rogach i środku) obojętnym związkiem, takim jak elastomer Sylgard. UWAGA: Kijanki pozostaną w tych obszarach, jeśli nie zostaną wypełnione.</li>
		<li>W przypadku zbiornika zewnętrznego przykryj dokładnie jedną połowę zewnętrznej części jednego zbiornika czarną taśmą izolacyjną, a drugą połowę białą bibułą Rysunek 1B.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Umieść zbiorniki na talerzu obrotowym do zaszczepiania.</li>
	<li>Ustaw kamerę internetową/statyw tak, aby znajdowała się nad zbiornikami testowymi. Dostosuj kamerę, aby umożliwić wizualizację obszaru testowego, jak pokazano na rysunku 1C.</li>
	<li>Podłącz kamerę internetową do komputera z zainstalowanym oprogramowaniem QuickTime Player5. Włącz kamerę. W programie QuickTime Player, w obszarze Plik, wybierz opcję "Nowe nagranie filmu". Konfiguracja testu zachowania będzie od razu widoczna na komputerze.</li>
	<li>Ułóż lekką bawełnianą szmatkę na całym zestawie, aby zredukować zewnętrzne sygnały, które mogą wpływać na zachowanie kijanki, a także zmniejszyć odbite światło na powierzchni wody.</li>
	<li>Upewnij się, że luminancja pod tkaniną wynosi 35-50 cd/m2.</li>
</ol>
3. Test zachowania
<ol>
	<li>Napełnij wewnętrzny zbiornik testowy do 5 cm znaku wodnego wykonanego w kroku 1.2.1 wodą z żab.</li>
	<li>Za pomocą małej siatki delikatnie przenieś zwierzę do wewnętrznego zbiornika testowego.</li>
	<li>Otwórz oprogramowanie QuickTime na komputerze i korzystając z zewnętrznego zbiornika jako przewodnika, upewnij się, że kamera jest w stanie wizualizować i rejestrować obszar testowy.</li>
	<li>Napisz imię zwierzęcia, datę i godzinę na kartce papieru i nagraj za pomocą aparatu.</li>
	<li>Umieść zbiornik testowy w zbiorniku zewnętrznym czarną stroną zbiornika po prawej stronie rysunku 2.</li>
	<li>Rozpocznij nagrywanie filmu natychmiast po ustawieniu zbiornika i ustawieniu timera na 2 min.</li>
	<li>Gdy zegar wyda sygnał dźwiękowy, wyjmij wewnętrzny zbiornik testowy, obróć zewnętrzny zbiornik o 180° i umieść wewnętrzny zbiornik testowy w zbiorniku zewnętrznym. Uruchom minutnik. Uwaga: strona powinna teraz znajdować się po drugiej stronie.</li>
	<li>Powtórz krok 3.7, jeszcze osiem razy, co daje w sumie dziesięć prób. Użyj rysunku 2 jako przewodnika, odhaczając każdą próbę.</li>
	<li>Powtórz test zachowania w dwóch oddzielnych dniach.</li>
</ol>
4. Aksotomia siatkówki
<ol>
	<li>Umieść zwierzę w 0,02% tricaine, aż przestanie reagować na uszczypnięcie ogona kleszczami #3.</li>
	<li>Rozpuść 1% agarozy w 0,1X MMR, a następnie dodaj do szalki Petriego o średnicy 60 mm. Po schłodzeniu zrób małe prostokątne wgłębienie w agarozie i dodaj kijankę do divot z odrobiną 0,02% tricainy, aby zwierzę było częściowo zanurzone w płynie.</li>
	<li>Przebij skórę pod kątem 45 stopni za grzbietową częścią oka igłą 25 G, jednocześnie opierając zwierzę o kleszcze po przeciwnej stronie.</li>
	<li>Uważając, aby nie przeciąć żyły, która leży obok nerwu wzrokowego, ostrożnie sięgnij do otworu kleszczami #5, odetnij nerw wzrokowy i odwróć go na bok. Jeśli wystąpi silne krwawienie z powodu przypadkowego przecięcia tętnicy, szybko umieść zwierzę w 2% tricaine w celu eutanazji. UWAGA: 2% roztwór tricainy może powodować drętwienie u ludzi. Z tym roztworem należy obchodzić się w rękawiczkach.</li>
	<li>Aby wyzdrowieć zwierzę po operacji, umieść zwierzę na 100-milimetrowej szalce Petriego z 0,7X MMR i 50 μg/ml gentamycyny na 20 minut. Następnie przenieś kijankę do zbiornika regeneracyjnego z wodą z żabą. Niech zwierzę odpoczywa O/N.</li>
	<li>Następnego ranka przetestuj funkcję wzrokową zgodnie z powyższym opisem (kroki 3.1-3.9).</li>
</ol>
5. Analizuj wyniki
<ol>
	<li>Po zakończeniu prób zmierz czas, przez jaki kijanka pozostaje po czarnej stronie zbiornika.
	<ol>
		<li>Ręcznie view filmy za pomocą oprogramowania, które wyświetla czas i umożliwia częste wstrzymywanie. Spójrz na czas wyświetlania wideo. Zapisz początek dwuminutowej próby, kiedy zbiornik wewnętrzny pomyślnie zagnieżdża się w zbiorniku zewnętrznym i jest ustawiony do kwadratu w polu widzenia kamery.</li>
		<li>Użyj pozycji oczu kijanki, aby określić, po której stronie zbiornika pływają zwierzęta. Określ przejście z jednej strony zbiornika na drugą tylko wtedy, gdy oba oczy przekroczą czarno-białą linię.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Zapisz początek i koniec każdego interwału (w sekundach), który zwierzę spędza po czarnej stronie. Wstrzymaj i przewiń wideo do tyłu, aby zapewnić dokładność. Suma sekund w każdej próbie.</li>
	<li>Wprowadź te liczby do załączonego arkusza zachowania. Arkusz obliczy stosunek czasu, jaki zwierzę spędziło po białej stronie, odejmując czas spędzony po czarnej stronie zbiornika od całkowitej próby trwającej 120 sekund i dzieląc przez całkowity czas w sekundach [(120 – całkowita liczba sekund spędzonych po czarnej stronie)/120 sekund]. Arkusz uśrednia ten współczynnik dla wszystkich 10 prób.</li>
	<li>Użyj testu T-studenta, sparowanego, dwustronnego rozkładu, aby określić, czy próby między dniami są istotne (P ≤ 0,05).</li>
</ol>

<ol><li>Maurer, C. M., Huang, Y. Y., Neuhauss, S. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Application+of+zebrafish+oculomotor+behavior+to+model+human+disorders%5BTitle%5D)+AND+%22Rev+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Application of zebrafish oculomotor behavior to model human disorders.</a> Rev Neurosci. 22 (1), 5-16 (2011).</li>
<li>Solessio, E., Scheraga, D., Engbretson, G. A., Knox, B. E., Barlow, R. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Circadian+modulation+of+temporal+properties+of+the+rod+pathway+in+larval+Xenopus%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurophysiol%22%5BJournal%5D)">Circadian modulation of temporal properties of the rod pathway in larval Xenopus.</a> J Neurophysiol. 92 (5), 2672-2684 (2004).</li>
<li>Moriya, T., Kito, K., Miyashita, Y., Asami, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Preference+for+background+color+of+the+Xenopus+laevis+tadpole%5BTitle%5D)+AND+%22J+Exp+Zool%22%5BJournal%5D)">Preference for background color of the Xenopus laevis tadpole.</a> J Exp Zool. 276 (5), 335-344 (1996).</li>
<li>Viczian, A. S., Solessio, E. C., Lyou, Y., Zuber, M. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Generation+of+functional+eyes+from+pluripotent+cells%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Biol%22%5BJournal%5D)">Generation of functional eyes from pluripotent cells.</a> PLoS Biol. 7 (8), (2009).</li>
<li>Choi, R. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cone+degeneration+following+rod+ablation+in+a+reversible+model+of+retinal+degeneration%5BTitle%5D)+AND+%22Invest+Ophthalmol+Vis+Sci%22%5BJournal%5D)">Cone degeneration following rod ablation in a reversible model of retinal degeneration.</a> Invest Ophthalmol Vis Sci. 52 (1), 364-373 (2011).</li>
<li>Viczian, A. S., Zuber, M. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tissue+determination+using+the+animal+cap+transplant+%28ACT%29+assay+in+Xenopus+laevis%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Tissue determination using the animal cap transplant (ACT) assay in Xenopus laevis.</a> J Vis Exp. 16 (39), (2010).</li>
<li><a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=%22Normal+table+of+Xenopus+laevis+%28Daudin%29+%3A+a+systematical+and+chronological+survey+of+the+development+from+the+fertilized+egg+till+the+end+of+metamorphosis%22">Normal table of Xenopus laevis (Daudin) : a systematical and chronological survey of the development from the fertilized egg till the end of metamorphosis</a>. Nieuwkoop, P. D., Faber, J. , Garland Pub. New York. (1994).</li>
<li>Blackiston, D., Shomrat, T., Nicolas, C. L., Granata, C., Levin, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+second-generation+device+for+automated+training+and+quantitative+behavior+analyses+of+molecularly-tractable+model+organisms%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">A second-generation device for automated training and quantitative behavior analyses of molecularly-tractable model organisms.</a> PLoS One. 5 (12), (2010).</li>
<li>Rosemberg, D. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Differences+in+spatio-temporal+behavior+of+zebrafish+in+the+open+tank+paradigm+after+a+short-period+confinement+into+dark+and+bright+environments%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Differences in spatio-temporal behavior of zebrafish in the open tank paradigm after a short-period confinement into dark and bright environments.</a> PLoS One. 6 (5), (2011).</li>
<li>Dong, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Visual+Avoidance+in+Xenopus+Tadpoles+is+Correlated+With+the+Maturation+of+Visual+Responses+in+the+Optic+Tectum%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurophysiol%22%5BJournal%5D)">Visual Avoidance in Xenopus Tadpoles is Correlated With the Maturation of Visual Responses in the Optic Tectum.</a> J Neurophysiol. 101 (2), 803-815 (2009).</li>
<li>Lan, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Noggin+Elicits+Retinal+Fate+In+Xenopus+Animal+Cap+Embryonic+Stem+Cells%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cells%22%5BJournal%5D)">Noggin Elicits Retinal Fate In Xenopus Animal Cap Embryonic Stem Cells.</a> Stem Cells. 27 (9), 2146-2152 (2009).</li>
<li>De Robertis, E. M., Kuroda, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dorsal-ventral+patterning+and+neural+induction+in+Xenopus+embryos%5BTitle%5D)+AND+%22Annu+Rev+Cell+Dev+Biol%22%5BJournal%5D)">Dorsal-ventral patterning and neural induction in Xenopus embryos.</a> Annu Rev Cell Dev Biol. 20, 285-308 (2004).</li>
</ol>

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Przedstawiamy tutaj prosty test behawioralny sterowany wzrokiem, który można łatwo wykonać w mniej niż tydzień przez minimalnie przeszkolony personel laboratoryjny. Podczas gdy inne testy wymagają specjalistycznego sprzętu i wiedzy specjalistycznej w zakresie zachowania zwierząt, ten test pozwala na szybki test w celu określenia funkcji wzrokowych. Inny test behawioralny, test unikania wizualnego, został opracowany w celu określenia, w jaki sposób tectum przyczynia się do percepcji wzrokowej w Xenopus10</su...

Xenopus laevis zostały użyte jako organizm modelowy do badania tworzenia oczu. Oczy rozwijają się szybko, osiągając dojrzałość w mniej niż tydzień w celu przetestowania genów lub szlaków, które mają wpływ na rozwój i funkcjonowanie wzroku. Aby przetestować funkcje wzrokowe, wykorzystano odpowiedź optokinetyczną i optomotoryczną odpowiednio u kijanek danio pręgowanego i Xenopus 1,2 . Ponieważ oczy kijanek Xenopus są stosunkowo mniejsze niż danio pręgowanego, test ten wymaga użycia specjalistycznego sprzętu i przeszkolonego personelu do wykrycia subtelnego machania ogonem i ruchu gałek ocznych u Xenopus. Bardziej solidnym zachowaniem w Xenopus jest preferencja do pływania w zbiorniku z białym tłem, co jest opisane w niniejszym3. Po umieszczeniu kijanki w półczarnym/półbiałym zbiorniku, wstępnie metamorficzna kijanka szybko przepływa na białą stronę zbiornika. Wcześniej używaliśmy tego testu do określenia, czy oczy pochodzące z komórek pluripotencjalnych są funkcjonalne4. Tutaj przedstawiamy szczegółową wersję tego testu, którą można wykorzystać do przetestowania funkcji wzrokowej premetamorficznych kijanek Xenopus.
Ten test jest prostszy niż test odpowiedzi optomotorycznej, ponieważ wymaga jedynie zamontowanej kamery cyfrowej, oprogramowania kamery cyfrowej i standardowego sprzętu, który można znaleźć w większości laboratoriów Xenopus. Ponadto nagrana odpowiedź nie wymaga specjalnego szkolenia w celu zliczania wyników. Nasze reprezentatywne wyniki pokazują, że ta sama grupa kijanek, po przejściu podwójnej aksotomii siatkówki, pływa losowo wokół zbiornika. Dołączyliśmy również wyniki testu behawioralnego z reprezentatywnej kijanki, pokazujące, w jaki sposób można przetestować jedno oko pod kątem reakcji wzrokowej. Dołączono arkusz roboczy, aby można było wprowadzać i analizować liczby uzyskane podczas testu. Ten arkusz roboczy może być użyty do określenia, czy testowane kijanki mają reakcję wzrokową.

<table><tbody><tr><td>Elastyczny zbiornik o pojemności 1/2 galona z pokrywą</td><td>eNasco</td><td>SB19271M</td><td>Rozmiar: 5-3/8" x 7" x 3-3/4"</td></tr> <tr><td>taśma</td><td></td><td></td><td></td>elektryczna</tr><tr><td>Biała bibułka</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Duży gramofon do inokulacji</td><td>VWR</td><td>50809-022</td><td>Rozmiar: Dia 114,3 x&nbsp; H 76.2 mm (4 1/2&nbsp; x&nbsp; 3")</td></tr><tr><td>Podkładka Durasorb</td><td>VWR</td><td>82004-836</td><td>Rozmiar: 43,2 x 60,1 cm (17 x 24")</td></tr><tr><td>Kimwipe</td><td>Krackeler Scientific, Inc.</td><td>1945-34155-CS</td><td></td></tr><tr><td>Statyw</td><td></td> standardowy <td>Różne Kamera</td><td></td></tr><tr><td>iSight lub kamera internetowa</td><td>Apple</td><td>M8817LL/A</td><td>Dobre dla większych kijanek, ale małe są trudne do zobaczenia</td></tr><tr><td>Komputer przenośny</td><td>Apple/PC</td><td>Różne</td><td>Użyliśmy 13-calowego MacBooka, Intel Core 2 Duo 2 GHz z systemem MacOSX Lion 10.7.5</td></tr><tr><td>MiniDV kamera handycam</td><td>SONY</td><td>DCR-HC42</td><td>Podłączony za pomocą firewire do komputera za pomocą 6-przewodowego i 4-przewodowego przewodu alfa FireWire 400&nbsp;</td></tr><tr><td>Stacja Handycam</td><td>SONY</td><td>DCRA-C121</td><td>Może być używana do podłączania przewodu ogniowego do</td></tr><tr><td>kamery Oprogramowanie QuickTime Player</td><td></td><td>Quicktime Wersja 10.1</td><td></td></tr><tr><td>Igła 26 G (długość 5/8")</td> Kleszcze <td>VWR</td><td>BD305115</td><td></td></tr><tr><td>Dumont #5</td><td>Narzędzia do nauki precyzyjnej</td><td>11295-10</td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Jednorazówki</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Siarczan gentamycyny [50 mg/ml]</td><td>Fisher Scientific</td><td>17-528Z</td><td>Przechowywany w RT</td></tr><tr><td>Sylgard 184 elastomer silikonowy</td><td>Fisher Scientific</td><td>NC9644388</td><td></td></tr><tr><td>Instant ocean</td><td>Lekarze Foster i Smith</td><td>CD-116528</td><td>Roztwór podstawowy = 100 g/L przechowywany w RT</td></tr><tr><td>Fosforan sodu dwuzasadowy</td><td>Sigma Aldrich</td><td>S0876</td><td>Roztwór podstawowy = 0,4 M przechowywany w RT</td></tr><tr><td>Zarodki zapłodnione in vitro</td><td>eNasco</td><td>LM00490MX</td><td>100 zarodków/jednostkę</td></tr></tbody></table>

prosty test behawioralny do badania funkcji wzrokowych u xenopus laevis

A Simple Behavioral Assay for Testing Visual Function in Xenopus laevis

Pomiar funkcji wzrokowych u kijanek żaby, Xenopus laevis, pozwala na badania przesiewowe w kierunku ślepoty u żywych zwierząt. Odpowiedź optokinekińska to odruchowe zachowanie oparte na widzeniu, które zaobserwowano u wszystkich badanych kręgowców. Oczy kijanki są małe, więc reakcja odwrócenia ogona została użyta jako alternatywna miara, która wymaga przeszkolonego technika do zarejestrowania subtelnej reakcji. Opracowaliśmy alternatywny test zachowania oparty na fakcie, że kijanki wolą pływać po białej stronie zbiornika, gdy zostaną umieszczone w zbiorniku zarówno po czarnej, jak i białej stronie. Przedstawiony tutaj test jest niedrogą, prostą alternatywą, która tworzy odpowiedź, którą można łatwo zmierzyć. Zestaw składa się ze statywu, kamery internetowej i zagnieżdżonych zbiorników testowych, które są łatwo dostępne w większości laboratoriów Xenopus. Ten artykuł zawiera film pokazujący zachowanie kijanek przed i po przecięciu nerwu wzrokowego. W celu zbadania funkcji jednego oka dołączamy również reprezentatywne wyniki kijanki, w której każde oko poddawane było aksotomii siatkówki w kolejnych dniach. Przyszłe badania mogą opracować zautomatyzowaną wersję tego testu do testowania wzroku wielu kijanek jednocześnie.

Wcześniejsze doniesienia wykazały, że przedmetamorficzne kijanki Xenopus preferują pływanie po białej stronie czarno-białego zbiornika; test ten nazwano testem preferencji koloru tła (Background Color Preference Assay)3. Zmodyfikowaliśmy ten test, aby w czasie krótszym niż tydzień ocenić funkcję wzrokową każdego z oczu kijanek. W ten sposób oczy mogą zostać pobrane do badania histologicznego.
Przedstawiamy tutaj, w jaki sposób reakcja ta wynika z bodźców wzrokowych. W <stro...

Kijanki Xenopus laevis preferują pływanie po białej stronie czarno-białego zbiornika. W tym zachowaniu kieruje się ich wizją. Opierając się na tym zachowaniu, przedstawiamy prosty test do testowania funkcji wzrokowej kijanek.

Prosty test behawioralny do badania funkcji wzrokowych u Xenopus laevis

Measurement of the visual function in the tadpoles of the frog, Xenopus laevis, allows screening for blindness in live animals. The optokinetic response ...

Ogólnym celem niniejszej procedury jest zbadanie funkcji wzrokowych kijanek poprzez rejestrację czasu, jaki zwierzę spędza w połowie zbiornika testowego pokrytej kolorem czarnym. W tym celu w pierwszej kolejności hoduje się kijanki do stadiów od 45 do 50. Drugim krokiem jest przygotowanie zbiornika, który w połowie jest czarny, a w połowie biały, wraz z kamerą do analizy behawioralnej.Następnie umieść drugi zbiornik z kijanką w zbiorniku zewnętrznym. Dla każdej kijanki zarejestruj zachowanie sterowane wzrokiem w miarę zmiany tła w jej środowisku. Ostatnim krokiem jest przeprowadzenie ekstrakcji siatkówki u kijanek, a następnie powtórzenie testu behawioralnego.Ostatecznie dane z tego prostego i niedrogiego testu są wykorzystywane do wykazania, że kijanki wykazują preferencję do pływania po jednej stronie zbiornika zamiast po drugiej podczas testów widzenia fototopowego. Główną zaletą stosowania tej metody w porównaniu z innymi technikami, takimi jak reakcja optokinetyczna czy test odruchowego wygięcia ogona, jest fakt, że jest to tania i prosta metoda wykorzystująca sprzęt dostępny w większości laboratoriów. Aby przygotować kijanki, należy najpierw pozyskać zapłodnione embriony xenopus, a następnie umieścić je w naczyniach Petri o średnicy 60 mm z roztworem Mark's, zmodyfikowanym roztworem Ringera lub MMR rozcieńczonym 10-krotnie w stężeniu 50 µg/mL.Umieść embriony od stadium blastuli do stadium płytki nerwowej w roztworze antybiotyku gentamycyny. Stadia od drugiego do piętnastego w temperaturze 18 stopni Celsjusza w szalkach Petriego. Gdy embriony osiągną stadium nowej wnęki (neural cup) w okolicach 27 do 30, przenieś je do 0,1 XMMR bez antybiotyków, aby umożliwić wzrost bakterii jelitowych.Gdy kijanki osiągną stadium żerowania, około stadium 45, przenieś je do szalek Petriego o średnicy 100 mm z 0.1 XMMR. Następnego dnia podaj im nadsącz z proszku z pokrzywy. Po tygodniu w szalce Petriego o średnicy 100 mm napełnij zbiornik o pojemności pół galona wodą dla żab.Przenieś zwierzęta do zbiornika i kontynuuj harmonogram karmienia nadsączem z proszku z pokrzywy, jednak zmieniaj wodę tylko dwa do trzech razy w tygodniu. Gdy zwierzęta znajdą się w zbiornikach o pojemności pół galona, utrzymuj je w cyklu 12 godzin światła i 12 godzin ciemności, z włączaniem świateł o godzinie 6:00 rano. Przed przeprowadzeniem testów ustaw zbiornik o pojemności pół galona z badanymi osobnikami na białej powierzchni na noc, co najmniej na 12 godzin przed badaniem. Analiza behawioralna powinna być przeprowadzona w cichym miejscu o niskim natężeniu ruchu, przy standardowym oświetleniu fluorescencyjnym.Przygotuj dwa zagnieżdżone zbiorniki testowe o pojemności pół galona, ustawiając je na zewnętrznych narożnikach przyszłego zbiornika wewnętrznego. Użyj pisaka permanentnego, aby zaznaczyć linię wody na wysokości pięciu centymetrów nad dnem. W przypadku zbiornika wewnętrznego zidentyfikuj również wszelkie wgłębienia w jego wnętrzu.Wypełnij je obojętnym związkiem, aby zapobiec przebywaniu w nich kijanek. Teraz zwróć uwagę na drugi zewnętrzny zbiornik. W następnym kroku przygotuj czarną taśmę izolacyjną oraz białą chusteczkę higieniczną.Użyj taśmy, aby zakryć zewnętrzną stronę jednej połowy zbiornika, a papieru ryżowego, aby zakryć zewnętrzną stronę drugiej połowy, jak pokazano tutaj. Po przygotowaniu zbiorników, ustaw obrotowy stół do inokulacji i umieść na nim zagnieżdżone zbiorniki. Ustaw statyw i kamerę internetową tak, aby kamera mogła obrazować wnętrze zbiorników z góry.Podłącz kamerę internetową do komputera z oprogramowaniem do przechwytywania i odtwarzania wideo. Włącz kamerę i przygotuj się do rozpoczęcia nowego nagrania. Następnie przykryj kamerę oraz zbiorniki lekką bawełnianą tkaniną.Aby ograniczyć bodźce zewnętrzne docierające do kijanek, należy użyć luminometru i sprawdzić, czy natężenie światła pod tkaniną mieści się w przedziale od 35 do 50 cd/m². Analizę behawioralną rozpoczyna się od wyjęcia wewnętrznego zbiornika testowego. Należy napełnić go wodą dla żab do poziomu pięciu centymetrów.Za pomocą siatki przenieś zwierzę z pojemnika o pojemności pół galona do wewnętrznego zbiornika testowego przy komputerze. Upewnij się, że oprogramowanie do rejestracji jest uruchomione i nagrywa obszar testowy w celu prowadzenia dokumentacji. Zapisz imię zwierzęcia, datę oraz godzinę na kartce papieru.Umieść to pod kamerą w celu rejestracji. Po wykonaniu tej czynności ustaw czasomierz na dwie minuty. Następnie ustaw zewnętrzny zbiornik na obrotowym stole tak, aby czarna strona znajdowała się po prawej stronie.Teraz umieść zbiornik testowy w zbiorniku zewnętrznym. W obszarze rejestracji zasłoń kurtynę i korzystając z ekranu komputera, sprawdź orientację zbiornika zewnętrznego. Upewnij się, że wideo jest nagrywane i uruchom stoper.Po sygnale dźwiękowym minutnika pozostaw osłonę w tej samej pozycji i wyjmij wewnętrzny zbiornik testowy. Następnie obróć zewnętrzny zbiornik o 180 stopni tak, aby czarna strona znalazła się po lewej stronie. Włóż zbiornik testowy z powrotem do zewnętrznego zbiornika i uruchom dwuminutowy minutnik.Ponownie wyjmij wewnętrzny zbiornik. Obróć zewnętrzny zbiornik o 180 stopni i wymieniaj wewnętrzny zbiornik co dwie minuty, powtarzając tę czynność łącznie 10 razy. Po zakończeniu przerwij nagrywanie wideo.Przenieś kijankę z powrotem do zbiornika o pojemności pół galona. Przygotuj mikroskop do przeprowadzenia badania retinol ex sodomy. Wypełnij 60 mm szalkę Petriego 1% agarosem rozpuszczonym w 0,1 XMMR i pozostaw do zestalenia.Wytnij z agarosu mały prostokątny fragment o rozmiarze kijanki. Po przygotowaniu do dalszych działań, wyjmij zwierzę testowe i umieść je w 0,02% Trica. Kontynuuj, gdy zwierzę przestanie reagować na uciśnięcie ogona pęsetą numer trzy.Następnie przenieś zwierzę do naczynia. Dalej zamocuj szalkę Petriego na mikroskopie. Przygotuj pęsetę, aby unieruchomić zwierzę z jednej strony.Po przeciwnej stronie, używając igły o rozmiarze 25 G, przebij skórę za grzbietową częścią oka pod kątem 45 stopni, ostrożnie wprowadź do otworu pęsetę nr 5 i przetnij nerw wzrokowy, unikając przecięcia znajdującej się obok żyły. Odsuń nerw na bok i wyjmij pęsetę po zakończeniu zabiegu. Pozostaw zwierzę do rekonwalescencji, umieszczając je w 100 mm szalce Petriego z 0,7 XMMR i 50 µg/mL.Gentamycynę przez 20 minut. Następnie przenieść kijankę do zbiornika regeneracyjnego z wodą dla żab. Umieścić zbiornik na białej powierzchni w celu przygotowania do testów.Pozostawić zwierzę do odpoczynku na noc. Następnego ranka przeprowadzić test behawioralny w celu oceny funkcji wzrokowych. Niniejszy film przedstawia reprezentatywne dane dla tego eksperymentu.Po lewej stronie znajdują się zwierzęta przed operacją, a po prawej te same zwierzęta po przerwaniu aksonów siatkówki w obu oczach. Wskazuje na to schemat w dolnych rogach. Woda została wzburzona, aby pokazać, że nie dodano niczego, co mogłoby odpychać zwierzęta od czarnej strony lub przyciągać je do białej strony.Kijanki przed operacją reagują na kolor tła w czasie krótszym niż 30 sekund, podczas gdy kijanki niewidome pływają bez celu po zbiorniku. Wykres ten przedstawia procent czasu spędzonego w obszarach białych i czarnych dla jednego osobnika w trzech warunkach. Po pierwsze, zwierzę było obserwowane przy użyciu testu przed przeprowadzeniem jakiejkolwiek operacji.Przez dwa kolejne dni po przecięciu prawego nerwu wzrokowego obserwowano zachowanie zwierzęcia podczas dwudniowych testów. Ostatecznie, po przecięciu obu nerwów wzrokowych, przeprowadzono jeszcze dwa dni obserwacji z wykorzystaniem tego testu. Zwierzę spędzało więcej czasu po białej stronie zbiornika, gdy przynajmniej jeden nerw wzrokowy był nienaruszony.Po obejrzeniu tego filmu powinni Państwo mieć dobrą wiedzę na temat tego, jak badać wzrok kijanek, wykorzystując proste odczynniki i sprzęt dostępny w większości laboratoriów zajmujących się żabami. Powodzenia w eksperymentach.

a-simple-behavioral-assay-for-testing-visual-function-xenopus

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Neuronauka

Prosty test behawioralny do badania funkcji wzrokowej u Xenopus laevis

Testowanie wrażliwości wizualnej u jaszczurek przy operant paradygmat klimatyzacji, która zatrudnia odtwarzania wideo losowych punktów, kinematograms i generowanych komputerowo bezkręgowców.

Badania wizualne Wrażliwość na prędkość i kierunek ruchu w Jaszczurki

Opracowaliśmy metodę odpowiedzi wizualno-motorycznej (Visual-Motor Response), aby ilościowo określić reakcję motoryczną larw zebrafish w odpowiedzi na przyrosty i spadki natężenia światła. Zbadaliśmy również mutanty wzroku zebrafish, w tym mutanty z brakiem odpowiedzi optokinetycznej (nrc), które uznano za całkowicie niewidome podczas testowania za pomocą innego badania wzroku – odruchu optokinetycznego.

Test behawioralny do pomiaru reaktywności rybek zebrafish na zmiany natężenia światła

VisioTracker to zautomatyzowany system do ilościowej analizy sprawności wzrokowej larw i niewielkich osobników dorosłych ryb, oparty na rejestracji ruchów gałek ocznych. Charakteryzuje się on pełną kontrolą nad właściwościami bodźców wzrokowych oraz analizą w czasie rzeczywistym, co umożliwia prowadzenie wysokoprzepustowych badań w takich dziedzinach jak rozwój i funkcje układu wzrokowego, farmakologia, badania obwodów neuronalnych oraz integracja sensoromotoryczna.

VisioTracker, innowacyjne zautomatyzowane podejście do analizy okulomotorycznej

Ten film opisuje test odpowiedzi optokinetycznej u danio pręgowanego. Film mierzy odruchowe ruchy gałek ocznych w oparciu o bodźce wzrokowe poruszające się i określa ostrość wzroku u danio pręgowanego.

Test odpowiedzi optokinetycznej: metoda pomiaru ostrości wzroku u danio pręgowanego

Film opisuje unikanie i testowanie metodą thigmotaxis larw danio pręgowanego. Film bada zachowanie larw danio pręgowanego w odpowiedzi na wizualny bodziec awersyjny.

Test unikania danio pręgowanego i thigmotaxsji: wysokoprzepustowa metoda badania zachowania larw w odpowiedzi na awersyjny bodziec wzrokowy

Danio pręgowany były cennym narzędziem w wielu obszarach badawczych. Tutaj demonstrujemy metodę wywoływania reakcji wzrokowej i obliczania funkcjonalnej ostrości wzroku u dorosłego danio pręgowanego.

Odpowiedź optokinetyczna jako ilościowa miara ostrości wzroku u danio pręgowanego

Prezentujemy metodę analizy elektroretinograficznej (ERG) larw danio pręgowanego z wykorzystaniem technik mikromanipulacji i elektroretinografii. Jest to prosta i nieskomplikowana metoda oznaczania funkcji wzrokowych larw danio pręgowanego in vivo.

Elektroretinogram Analiza odpowiedzi wzrokowej u larw danio pręgowanego

Kijanki Xenopus oferują unikalną platformę do badania funkcji układu nerwowego in vivo. Opisano metodologie oceny przetwarzania informacji węchowych u żywych larw Xenopus w normalnych warunkach chowu lub po urazie.

Ocena funkcjonalna szlaków węchowych u żyjących kijanek ksenopusa

Aby zbadać wzrok myszy, przeprowadziliśmy nadciągający test. Myszy umieszczono na dużej kwadratowej arenie z monitorem na suficie. Zbliżający się bodziec wizualny konsekwentnie wywoływał u myszy reakcje zamrożenia lub ucieczki.

Wykorzystanie zbliżających się bodźców wzrokowych do oceny wzroku myszy

Ten protokół ma na celu pokazanie, jak mikrowstrzykiwać mieszaninę DNA/DOTAP do pąków ocznych jednodniowych zarodków Xenopus laevis, oraz jak obrazować i rekonstruować indywidualne zielone białko fluorescencyjne (GFP) wyrażające aksonalne trzpienie wzrokowe w tektalnych śródmózgowiu nienaruszonych, żyjących kijanek Xenopus.

Mikroiniekcja DNA do zawiązków ocznych w zarodkach Xenopus laevis i obrazowanie GFP wyrażającego altanki aksonalne wzrokowe w nienaruszonych, żywych kijankach Xenopus

Zwyrodnienie neuronów zarówno w oczach, jak i mózgu w wyniku cukrzycy można zaobserwować dzięki testom behawioralnym przeprowadzonym na gryzoniach. Labirynt Y, miara poznania przestrzennego, i odpowiedź optomotoryczna, miara funkcji wzrokowych, zapewniają wgląd w potencjalne diagnozy i leczenie.

Behawioralna ocena funkcji wzrokowych poprzez reakcję optomotoryczną i funkcję poznawczą za pomocą labiryntu Y u szczurów z cukrzycą

Poznaj prosty test behawioralny do oceny funkcji wzrokowych u kijanek Xenopus laevis. Ta metoda pozwala badać preferencje wizualne i przetwarzanie bodźców wzrokowych w modelu neurobiologicznym.

Prosty test behawioralny do badania funkcji wzrokowych u Xenopus laevis

Przeglądaj więcej filmów