Prosty test behawioralny do badania funkcji wzrokowych u Xenopus laevis

Ogólnym celem tej procedury jest przetestowanie funkcji wzrokowych kijanek poprzez zarejestrowanie czasu, jaki zwierzę spędza na połowie zbiornika testowego, który jest pokryty czernią. Osiąga się to poprzez pierwsze podniesienie kijanek do etapów od 45 do 50. Drugim krokiem jest ustawienie w połowie czarnego, w połowie białego zbiornika wraz z kamerą do testu zachowania.

Następnie umieść drugi zbiornik z kijanką w zbiorniku zewnętrznym. Dla każdego zapisu kijanki zmienia się zachowanie kierowane wizją, ponieważ tło w jego otoczeniu jest zmieniane. Ostatnim krokiem jest wykonanie exsodomii siatkówki na kijankach, a następnie powtórzenie testu zachowania.

Ostatecznie dane z tego prostego, niedrogiego testu są wykorzystywane do pokazania, że kijanki wolą pływać po jednej stronie zbiornika niż po drugiej, zgodnie z testami widzenia na górze fotograficznej. Główną zaletą stosowania tej metody w porównaniu z innymi technikami, takimi jak optyczna odpowiedź kinetyczna lub test odwrócenia ogona, jest to, że jest to niedroga, prosta metoda, która wykorzystuje sprzęt łatwo dostępny w większości laboratoriów opus. Aby przygotować kijanki, najpierw uzyskaj zapłodnione zarodki xenopus, umieść znaczniki, zmodyfikowane pierścienie lub MMR rozcieńczone przez współczynnik 10 na 60 milimetrów szalek Petriego z 50 mikrogramami na mililitr.

Antybiotyk Gentamycyna umieszcza blastulę w stadium płytki nerwowej zarodków. Etapy od drugiego do 15 w temperaturze 18 stopni Celsjusza na szalkach Petriego. Gdy zarodki osiągną nowy kubek w fazie korzystnej około 27 do 30, zmień je na 0,1 XMMR bez antybiotyków, aby umożliwić wzrost bakterii jelitowych.

Gdy kijanki osiągną etap żerowania około 45 etapu, przenieś je na 100-milimetrowe szalki Petriego z 0,1 XMMR. Następnego dnia nakarm je supernatantem w proszku z pokrzywy. Po tygodniu na 100-milimetrowej szalce Petriego napełnij zbiornik o pojemności pół galona wodą z żaby.

Przenieś zwierzęta do zbiornika i kontynuuj harmonogram karmienia supernatantem z pokrzywy w proszku, ale zmieniaj wodę tylko dwa do trzech razy w tygodniu. Kiedy zwierzęta znajdują się w zbiornikach o pojemności pół galona, utrzymuj je w 12-godzinnym cyklu świetlnym, 12-godzinnym cyklu ciemności ze światłami włączającymi się o 6:00 Przed badaniem umieść półgalonowy zbiornik z osobami badanymi na białej powierzchni przez noc przez co najmniej 12 godzin przed badaniem. Test zachowania powinien być wykonywany w cichym miejscu o małym natężeniu ruchu ze standardowym oświetleniem fluorescencyjnym.

Przygotuj dwa gniazdujące zbiorniki testowe o pojemności pół galona w zewnętrznych rogach tego, co będzie zbiornikiem wewnętrznym. Użyj Sharpie, aby zaznaczyć linię wodną na wysokości pięciu centymetrów nad dnem. Również w przypadku zbiornika wewnętrznego zidentyfikuj wszelkie wgłębienia w jego wnętrzu.

Wypełnij je obojętnym związkiem, aby zapobiec pozostawaniu w nich kijanek. Teraz zwróć uwagę na drugi zbiornik zewnętrzny. Do następnego kroku zaopatrz się w czarną taśmę izolacyjną i białą bibułę.

Użyj taśmy, aby zakryć zewnętrzną część jednej połowy zbiornika, a bibuły, aby zakryć zewnętrzną część drugiej, jak pokazano tutaj. Po przygotowaniu zbiorników ustaw gramofon do zaszczepiania i umieść na nim zagnieżdżone zbiorniki. Ustaw statyw i kamerę internetową tak, aby kamera mogła obrazować wnętrze zbiorników z góry.

Podłącz kamerę internetową do komputera za pomocą oprogramowania do przechwytywania i odtwarzania wideo. Włącz aparat i przygotuj się do nagrania nowego filmu. Następnie nałóż lekką bawełnianą szmatkę na aparat i zbiorniki.

Aby zmniejszyć zewnętrzne wskazówki do kijanek, użyj miernika luminancji i sprawdź, czy luminancja pod tkaniną wynosi od 35 do 50 świec na metr kwadratowy. Rozpocznij test zachowania, pobierając wewnętrzny zbiornik testowy. Napełnij go żabią wodą do znaku pięciu centymetrów.

Użyj siatki, aby przenieść zwierzę z półgalonowego pojemnika do wewnętrznego zbiornika testowego przy komputerze. Upewnij się, że oprogramowanie do nagrywania jest otwarte i nagrywa obszar testowy w celu prowadzenia dokumentacji. Napisz nazwę zwierzęcia, datę i godzinę na kartce papieru.

Umieść to pod kamerą w celu nagrywania. Po wykonaniu tej czynności ustaw minutnik na dwie minuty. Następnie zorientuj zewnętrzny zbiornik na talerzu obrotowym, tak aby strona znajdowała się po prawej stronie.

Teraz umieść zbiornik testowy w zbiorniku zewnętrznym. W obszarze nagrywania zamknij zasłonę i użyj ekranu komputera, aby upewnić się, że zbiornik zewnętrzny jest zorientowany. Upewnij się, że wideo jest nagrywane i uruchom minutnik.

Gdy zegar wyda sygnał dźwiękowy, przytrzymaj serwetę na miejscu i wyjmij wewnętrzny zbiornik testowy. Następnie obróć zewnętrzny zbiornik o 180 stopni, tak aby strona znajdowała się teraz po lewej stronie. Zwróć zbiornik testowy do zbiornika zewnętrznego i uruchom dwuminutowy timer.

Ponownie wyjmij zbiornik wewnętrzny. Obróć zbiornik zewnętrzny o 180 stopni i wymieniaj zbiornik wewnętrzny co dwie minuty, w sumie 10 razy. Po zakończeniu zatrzymaj nagrywanie wideo.

Przywróć kijankę do zbiornika o pojemności pół galona. Przygotuj mikroskop do wykonania retinolu ex sodomia. Napełnij 60-milimetrową szalkę Petriego 1%arosem roztopionym w 0,1 XMMR i pozwól mu zastygnąć.

Usuń mały prostokątny kawałek aros wielkości kijanki. Gdy będziesz gotowy do kontynuowania, wyjmij zwierzę testowe i umieść je w 0,02% Trica. Kontynuuj, gdy nie reaguje na uszczypnięcie ogona kleszczami numer trzy.

Następnie przenieś zwierzę do naczynia. Kontynuuj, montując szalkę Petriego na mikroskopie. Przygotuj się do podparcia zwierzęcia kleszczami z jednej strony.

Po przeciwnej stronie użyj igły o rozmiarze 25, aby przebić skórę za grzbietową częścią oka pod kątem 45 stopni, ostrożnie sięgnij do otworu z numerem pięć, kleszczami i odetnij nerw wzrokowy, unikając żyły obok niego. Odwróć nerw z drogi i wycofaj kleszcze po operacji. Odzyskaj zwierzę, umieszczając je na 100-milimetrowej szalce Petriego z 0,7 XMMR i 50 mikrogramami na mililitr.

Gentamycyna przez 20 minut. Następnie przenieś kijankę do zbiornika regeneracyjnego z wodą z żaby. Umieść zbiornik na białej powierzchni w ramach przygotowań do testowania.

Pozwól zwierzęciu odpocząć przez noc. Następnego ranka użyj testu behawioralnego, aby przetestować funkcje wzrokowe. Ten film pokazuje reprezentatywne dane dla eksperymentu.

Po lewej stronie znajdują się zwierzęta przed operacją, po prawej te same zwierzęta po przecięciu aksonów siatkówki z obu oczu. Wskazuje na to schemat w dolnych rogach. Woda została zakłócona, aby pokazać, że nie dodano nic, co mogłoby odstraszyć zwierzęta od czarnej strony lub przyciągnąć je do białej.

Kijanki przed operacją reagują na kolor tła w mniej niż 30 sekund, podczas gdy ślepe kijanki pływają bez celu wokół zbiornika. Ten wykres pokazuje procent czasu spędzonego w białych i czarnych regionach dla jednego zwierzęcia w trzech warunkach. Po pierwsze, zwierzę było obserwowane przed jakąkolwiek operacją z użyciem testu.

Przez dwa kolejne dni po przecięciu prawego nerwu wzrokowego, jego zachowanie obserwowano przez dwa dni testów. W końcu, po przecięciu obu nerwów wzrokowych, były jeszcze dwa dni obserwacji z testem. Zwierzę spędzało więcej dni po białej stronie zbiornika, gdy co najmniej jeden nerw wzrokowy był nienaruszony.

Po obejrzeniu tego filmu powinieneś dobrze zrozumieć, jak testować wzrok kijanek za pomocą prostych odczynników i sprzętu, które można znaleźć w większości żabich laboratoriów. Powodzenia w eksperymentach.