Prosty test behawioralny do badania funkcji wzrokowych u Xenopus laevis

Ogólnym celem niniejszej procedury jest zbadanie funkcji wzrokowych kijanek poprzez rejestrację czasu, jaki zwierzę spędza w połowie zbiornika testowego pokrytej kolorem czarnym. W tym celu w pierwszej kolejności hoduje się kijanki do stadiów od 45 do 50. Drugim krokiem jest przygotowanie zbiornika, który w połowie jest czarny, a w połowie biały, wraz z kamerą do analizy behawioralnej.

Następnie umieść drugi zbiornik z kijanką w zbiorniku zewnętrznym. Dla każdej kijanki zarejestruj zachowanie sterowane wzrokiem w miarę zmiany tła w jej środowisku. Ostatnim krokiem jest przeprowadzenie ekstrakcji siatkówki u kijanek, a następnie powtórzenie testu behawioralnego.

Ostatecznie dane z tego prostego i niedrogiego testu są wykorzystywane do wykazania, że kijanki wykazują preferencję do pływania po jednej stronie zbiornika zamiast po drugiej podczas testów widzenia fototopowego. Główną zaletą stosowania tej metody w porównaniu z innymi technikami, takimi jak reakcja optokinetyczna czy test odruchowego wygięcia ogona, jest fakt, że jest to tania i prosta metoda wykorzystująca sprzęt dostępny w większości laboratoriów. Aby przygotować kijanki, należy najpierw pozyskać zapłodnione embriony xenopus, a następnie umieścić je w naczyniach Petri o średnicy 60 mm z roztworem Mark's, zmodyfikowanym roztworem Ringera lub MMR rozcieńczonym 10-krotnie w stężeniu 50 µg/mL.

Umieść embriony od stadium blastuli do stadium płytki nerwowej w roztworze antybiotyku gentamycyny. Stadia od drugiego do piętnastego w temperaturze 18 stopni Celsjusza w szalkach Petriego. Gdy embriony osiągną stadium nowej wnęki (neural cup) w okolicach 27 do 30, przenieś je do 0,1 XMMR bez antybiotyków, aby umożliwić wzrost bakterii jelitowych.

Gdy kijanki osiągną stadium żerowania, około stadium 45, przenieś je do szalek Petriego o średnicy 100 mm z 0.1 XMMR. Następnego dnia podaj im nadsącz z proszku z pokrzywy. Po tygodniu w szalce Petriego o średnicy 100 mm napełnij zbiornik o pojemności pół galona wodą dla żab.

Przenieś zwierzęta do zbiornika i kontynuuj harmonogram karmienia nadsączem z proszku z pokrzywy, jednak zmieniaj wodę tylko dwa do trzech razy w tygodniu. Gdy zwierzęta znajdą się w zbiornikach o pojemności pół galona, utrzymuj je w cyklu 12 godzin światła i 12 godzin ciemności, z włączaniem świateł o godzinie 6:00 rano. Przed przeprowadzeniem testów ustaw zbiornik o pojemności pół galona z badanymi osobnikami na białej powierzchni na noc, co najmniej na 12 godzin przed badaniem. Analiza behawioralna powinna być przeprowadzona w cichym miejscu o niskim natężeniu ruchu, przy standardowym oświetleniu fluorescencyjnym.

Przygotuj dwa zagnieżdżone zbiorniki testowe o pojemności pół galona, ustawiając je na zewnętrznych narożnikach przyszłego zbiornika wewnętrznego. Użyj pisaka permanentnego, aby zaznaczyć linię wody na wysokości pięciu centymetrów nad dnem. W przypadku zbiornika wewnętrznego zidentyfikuj również wszelkie wgłębienia w jego wnętrzu.

Wypełnij je obojętnym związkiem, aby zapobiec przebywaniu w nich kijanek. Teraz zwróć uwagę na drugi zewnętrzny zbiornik. W następnym kroku przygotuj czarną taśmę izolacyjną oraz białą chusteczkę higieniczną.

Użyj taśmy, aby zakryć zewnętrzną stronę jednej połowy zbiornika, a papieru ryżowego, aby zakryć zewnętrzną stronę drugiej połowy, jak pokazano tutaj. Po przygotowaniu zbiorników, ustaw obrotowy stół do inokulacji i umieść na nim zagnieżdżone zbiorniki. Ustaw statyw i kamerę internetową tak, aby kamera mogła obrazować wnętrze zbiorników z góry.

Podłącz kamerę internetową do komputera z oprogramowaniem do przechwytywania i odtwarzania wideo. Włącz kamerę i przygotuj się do rozpoczęcia nowego nagrania. Następnie przykryj kamerę oraz zbiorniki lekką bawełnianą tkaniną.

Aby ograniczyć bodźce zewnętrzne docierające do kijanek, należy użyć luminometru i sprawdzić, czy natężenie światła pod tkaniną mieści się w przedziale od 35 do 50 cd/m². Analizę behawioralną rozpoczyna się od wyjęcia wewnętrznego zbiornika testowego. Należy napełnić go wodą dla żab do poziomu pięciu centymetrów.

Za pomocą siatki przenieś zwierzę z pojemnika o pojemności pół galona do wewnętrznego zbiornika testowego przy komputerze. Upewnij się, że oprogramowanie do rejestracji jest uruchomione i nagrywa obszar testowy w celu prowadzenia dokumentacji. Zapisz imię zwierzęcia, datę oraz godzinę na kartce papieru.

Umieść to pod kamerą w celu rejestracji. Po wykonaniu tej czynności ustaw czasomierz na dwie minuty. Następnie ustaw zewnętrzny zbiornik na obrotowym stole tak, aby czarna strona znajdowała się po prawej stronie.

Teraz umieść zbiornik testowy w zbiorniku zewnętrznym. W obszarze rejestracji zasłoń kurtynę i korzystając z ekranu komputera, sprawdź orientację zbiornika zewnętrznego. Upewnij się, że wideo jest nagrywane i uruchom stoper.

Po sygnale dźwiękowym minutnika pozostaw osłonę w tej samej pozycji i wyjmij wewnętrzny zbiornik testowy. Następnie obróć zewnętrzny zbiornik o 180 stopni tak, aby czarna strona znalazła się po lewej stronie. Włóż zbiornik testowy z powrotem do zewnętrznego zbiornika i uruchom dwuminutowy minutnik.

Ponownie wyjmij wewnętrzny zbiornik. Obróć zewnętrzny zbiornik o 180 stopni i wymieniaj wewnętrzny zbiornik co dwie minuty, powtarzając tę czynność łącznie 10 razy. Po zakończeniu przerwij nagrywanie wideo.

Przenieś kijankę z powrotem do zbiornika o pojemności pół galona. Przygotuj mikroskop do przeprowadzenia badania retinol ex sodomy. Wypełnij 60 mm szalkę Petriego 1% agarosem rozpuszczonym w 0,1 XMMR i pozostaw do zestalenia.

Wytnij z agarosu mały prostokątny fragment o rozmiarze kijanki. Po przygotowaniu do dalszych działań, wyjmij zwierzę testowe i umieść je w 0,02% Trica. Kontynuuj, gdy zwierzę przestanie reagować na uciśnięcie ogona pęsetą numer trzy.

Następnie przenieś zwierzę do naczynia. Dalej zamocuj szalkę Petriego na mikroskopie. Przygotuj pęsetę, aby unieruchomić zwierzę z jednej strony.

Po przeciwnej stronie, używając igły o rozmiarze 25 G, przebij skórę za grzbietową częścią oka pod kątem 45 stopni, ostrożnie wprowadź do otworu pęsetę nr 5 i przetnij nerw wzrokowy, unikając przecięcia znajdującej się obok żyły. Odsuń nerw na bok i wyjmij pęsetę po zakończeniu zabiegu. Pozostaw zwierzę do rekonwalescencji, umieszczając je w 100 mm szalce Petriego z 0,7 XMMR i 50 µg/mL.

Gentamycynę przez 20 minut. Następnie przenieść kijankę do zbiornika regeneracyjnego z wodą dla żab. Umieścić zbiornik na białej powierzchni w celu przygotowania do testów.

Pozostawić zwierzę do odpoczynku na noc. Następnego ranka przeprowadzić test behawioralny w celu oceny funkcji wzrokowych. Niniejszy film przedstawia reprezentatywne dane dla tego eksperymentu.

Po lewej stronie znajdują się zwierzęta przed operacją, a po prawej te same zwierzęta po przerwaniu aksonów siatkówki w obu oczach. Wskazuje na to schemat w dolnych rogach. Woda została wzburzona, aby pokazać, że nie dodano niczego, co mogłoby odpychać zwierzęta od czarnej strony lub przyciągać je do białej strony.

Kijanki przed operacją reagują na kolor tła w czasie krótszym niż 30 sekund, podczas gdy kijanki niewidome pływają bez celu po zbiorniku. Wykres ten przedstawia procent czasu spędzonego w obszarach białych i czarnych dla jednego osobnika w trzech warunkach. Po pierwsze, zwierzę było obserwowane przy użyciu testu przed przeprowadzeniem jakiejkolwiek operacji.

Przez dwa kolejne dni po przecięciu prawego nerwu wzrokowego obserwowano zachowanie zwierzęcia podczas dwudniowych testów. Ostatecznie, po przecięciu obu nerwów wzrokowych, przeprowadzono jeszcze dwa dni obserwacji z wykorzystaniem tego testu. Zwierzę spędzało więcej czasu po białej stronie zbiornika, gdy przynajmniej jeden nerw wzrokowy był nienaruszony.

Po obejrzeniu tego filmu powinni Państwo mieć dobrą wiedzę na temat tego, jak badać wzrok kijanek, wykorzystując proste odczynniki i sprzęt dostępny w większości laboratoriów zajmujących się żabami. Powodzenia w eksperymentach.