Oczyszczanie za pośrednictwem markerów powierzchniowych komórek iPS z reprogramowalnego modelu myszy
September 6th, 2014
Mysi fibroblast embrionalny może być przeprogramowany w indukowane pluripotencjalne komórki macierzyste z niską wydajnością poprzez wymuszoną ekspresję czynników transkrypcyjnych Oct-4, Sox-2, Klf-4, c-Myc. Rzadkimi produktami pośrednimi reakcji przeprogramowania są FACS izolowane przez znakowanie przeciwciałami przeciwko producentom powierzchni komórek Thy-1.2, Ssea-1 i Epcam.
Ogólnym celem tej procedury jest wyizolowanie rzadkich produktów pośrednich przeprogramowania z kultur przeprogramowujących fibroblastów embrionalnych myszy. Osiąga się to poprzez pierwsze wyprowadzenie mysich fibroblastów embrionalnych z zarodków E 13,5 reprogramowalnego szczepu myszy. W drugim etapie mysie fibroblasty embrionalne o niskim pasażu są wysiewane w indukowanych pluripotencjalnych pożywkach macierzystych lub komórkach IPS uzupełnionych doksycykliną, aby zainicjować proces przeprogramowywania.
Następnie komórki są zbierane w wybranych punktach czasowych podczas przeprogramowania i znakowane przeciwciałami przeciwko określonym markerom powierzchniowym komórki. Ostatecznie, rzadkie produkty pośrednie przeprogramowania mogą być izolowane przez fakty w celu dalszej analizy eksperymentalnej. Główną zaletą tej techniki istniejących metod jest to, że badania mechanistyczne można przeprowadzić na rzadkich produktach pośrednich przeprogramowywania przy braku komórek opornych na proces przeprogramowywania, które stanowią większość populacji Aby wygenerować embrionalny mysz, fibroblasty lub mes rozpocząć od przeniesienia rogu macicy w dniu embrionalnym 13,5 do 10-centymetrowej naczynia do hodowli tkankowej zawierającej 10 mililitrów sterylnego PBS.
Następnie użyj wysterylizowanych nożyczek chirurgicznych, aby pociąć róg na pojedyncze kawałki, z których każdy zawiera jeden zarodek. Następnie, pod mikroskopem preparacyjnym w kapturze do hodowli tkankowej, użyj wysterylizowanych kleszczy, aby ostrożnie usunąć otoczkę macicy i dodatkową błonę embrionalną otaczającą każdy zarodek i przenieś każdy ogołocony zarodek do indywidualnych 10-centymetrowych szalek z 10 mililitrami świeżego PBS. Następnie należy usunąć głowę, kończyny, ogon i narządy wewnętrzne każdego zarodka za pomocą kleszczy.
W razie potrzeby zamroź głowy w pojedynczych 1,5-mililitrowych probówkach w celu genotypowania. Przenieś każdy tułów na nowe, indywidualne 10-centymetrowe płytki i użyj dwóch ostrzy chirurgicznych, aby zmielić każdy zarodek przez dwie minuty. Trawić kawałki tkanek w 200 mikrolitrach trypsyny EDTA przez trzy do pięciu minut w temperaturze pokojowej, a następnie dodatkowe dwie minuty mielenia.
Następnie dezaktywuj próbkę za pomocą dwóch mililitrów metamfetaminy i przenieś zawiesinę komórkową do 15-mililitrowej probówki za pomocą pipety o pojemności 1000 mikrolitrów. Następnie mechanicznie zdysocjuj tkankę za pomocą delikatnego pipetowania, a następnie przenieś roztwór komórkowy do 10-centymetrowego naczynia pokrytego żelatyną. Dodaj dodatkowe 10 mililitrów pożywki metamfetaminy do kultury.
Po 24 do 48 godzinach płytka powinna być gęsto pokryta MEF-ami, aby przeprogramować MEF-y, najpierw rozmrozić zamrożoną kulturę metamfetaminy o niskim pasażu w łaźni wodnej o temperaturze 37 stopni Celsjusza, a następnie przenieść zawartość do probówki zawierającej 10 mililitrów wstępnie podgrzanej pożywki metamfetaminy. Po odwirowaniu komórek ponownie zawieś osad w 12 mililitrach świeżej pożywki metamfetaminy i przenieś zawiesinę komórek do naczynia hodowlanego T 75 pokrytego żelatyną. Po okresie rekonwalescencji od 24 do 48 godzin umyj MEF-y PBS, a następnie odłącz komórki trzema mililitrami trypsyny EDTA na trzy do pięciu minut w temperaturze 37 stopni Celsjusza.
Następnie zatrzymaj trawienie enzymatyczne za pomocą pięciu mililitrów metamfetaminy i dalej dysocjuj komórki poprzez delikatne mieszanie z 10-mililitrową pipetą. Następnie przeprogramuj mets, wysiewając komórki na nowej żelatynie, pokryj kolby T 75 w proporcji 6,7 razy 10 do trzecich komórek na centymetr kwadratowy w 12 mililitrach pożywki IPSC zawierającej dwa mikrogramy na mililitr doksycykliny przez pierwsze sześć dni. Zastępować pożywkę co drugi dzień świeżą pożywką IPSE uzupełnioną doksycykliną, zbierając produkty pośrednie przeprogramowania w wymaganych punktach czasowych przez oderwanie EDTA trypsyny, jak właśnie wykazano dla każdej zebranej zawiesiny pośredniej.
Umyj komórki w PBS. Następnie resus. Zawieś granulki na nośniku faksowym w celu znakowania przeciwciał, aby uzyskać w pełni przeprogramowane kultury IPSC.
Hoduj komórki w pożywkach IPSC wolnych od doksycykliny przez kolejne cztery do siedmiu dni, aby oznaczyć przeprogramowane komórki. Zebrane półprodukty należy oznaczyć odpowiednimi przeciwciałami, które są przedmiotem zainteresowania. Po 10 minutach delikatnie postukaj w probówki, aby ponownie zawiesić komórki, a następnie umieść probówki na lodzie na dodatkowe 10 minut.
Po drugiej inkubacji umyj komórki w 10 mililitrach zimnego PBS na probówkę. Następnie ostrożnie odessać supernatant i ponownie zawiesić granulki w odpowiedniej objętości podłoża etykietowego uzupełnionego szpilką paskową P wielkości 7 na lodzie. Po 20 minutach umyj komórki w kolejnych 10 zimnych PBS i ponownie zawieś granulki komórek w pożywce etykietującej uzupełnionej jodkiem propidyny.
Odfiltrować wszelkie grudki komórek, przepuszczając zawiesinę przez sitko o średnicy 70 mikrometrów, a następnie przenieść komórki do odpowiednich probówek faksowych na lodzie. Do kontroli kompensacji. Resus zawiesić fiolkę kriogeniczną z komórkami IPS utrzymywanymi na napromieniowanym mes w 800 mikrolitrach buforu znakującego.
Odłożenie na bok 200 mikrolitrów komórek do nieoznakowanej kontroli kontrolnej. Następnie podziel pozostałą zawiesinę komórek między trzy 15-mililitrowe probówki do jednokolorowych kontroli i oznacz próbki, jak właśnie pokazano, aby przeanalizować produkty pośrednie za pomocą cytometrii przepływowej. Zacznij od ustawienia bramki na wykresie rozrzutu do przodu po boku, aby wykluczyć zanieczyszczenia.
Następnie użyj wysokości rozproszenia do przodu w stosunku do obszaru rozproszenia do przodu, aby wykluczyć agregacje i kanał PI w stosunku do rozproszenia do przodu. Aby zabramkować na ujemnych komórkach pod napięciem PI. Użyj nieoznaczonych ogniw, aby wyregulować napięcia dla siedmiu kanałów Pacific Blue FITC i PSI.
Idealnie umieszczając populację komórek na dolnym końcu odpowiedniego kanału. Następnie ustaw bramki z nieoznakowanymi komórkami kontrolnymi, aby rozdrobnić przeprogramowane kultury w dniu trzecim, szóstym i dziewiątym. Populacje SSEA jedna ujemna komórka TH 1,2 dodatnia, SSEA jedna ujemna komórka TH 1,2 ujemna i przeprogramowane produkty pośrednie SSEA jedna dodatnia komórka TH 1,2 ujemna.
Następnie dalej podziel dzień dziewiąty SSEA na jedną dodatnią frakcję TH 1,2 ujemną z wykresem SSEA jeden w porównaniu z EPAM. Używając nieoznakowanych bramek kontrolnych rysujących wokół komórek dodatnich EPAM i komórek ujemnych EPAM, jak pokazano tutaj. Na koniec zbierz komórki w jednym do dwóch mililitrów nośnika komórkowego IPS.
Po indukcji doksycykliny mity o przeprogramowaniu ulegają wyraźnym zmianom morfologicznym około szóstego dnia. Zaczynają pojawiać się wczesne kolonie, takie jak plamy, które nadal rosną wraz z dalszą hodowlą. Dobry eksperyment z przeprogramowaniem zaowocuje ponad 500 koloniami na T 75, początkowo obsianymi pięciokrotnie 10 do piątymi komórkami, a założone kultury IPS będą miały charakterystyczne kolonie w kształcie kopuły i będą w większości pozbawione zróżnicowanych komórek.
Zmiany morfologiczne i molekularne podczas przeprogramowania znajdują odzwierciedlenie w zmianach w ekspresji powierzchni komórki uda 1.2 SSEA jeden, a ostatecznie epca. Podczas gdy MES są przeważnie dodatnie dla uda 1,2 i ujemne dla innych markerów, do trzeciego dnia duża część komórek zaczęła regulować ekspresję uda 1,2, a bardzo mała podgrupa stała się SSEA jeden dodatni. Rzeczywisty produkt pośredni przeprogramowania dla tego punktu czasowego w szóstym i dziewiątym dniu, zwiększony odsetek komórek dodatnich SSEA one, zwykle znacznie powyżej 10%, można wykryć około 12 dnia.
Można wykryć podzbiór komórek SSEA z jednym dodatnim, które również są dodatnie. Dla epca. Uznane hodowle komórkowe IPS w dobrej wierze będą zdecydowanie pozytywne.
Dla SSEA one i EPCA Próbując tej procedury, należy pamiętać, aby używać tylko map dolnych pasaży, które zostały wcześniej odpowiednio zgenotypowane.
Przegląd
To badanie opisuje procedurę izolowania rzadkich pośredników reprogramacji z fibroblastów zarodkowych myszy (MEF) podczas ich przemiany w indukowane pluripotencjalne komórki macierzyste (iPSC). Proces obejmuje stosowanie specyficznych czynników transkrypcyjnych i oznaczanie przeciwciałami, aby ułatwić identyfikację i izolację tych pośredników.
Kluczowe elementy badania
Obszar nauki
- Biologia komórek macierzystych
- Reprogramacja komórek
- Cytometria przepływowa
Tło
- Indukowane pluripotencjalne komórki macierzyste (iPSC) mogą być generowane z komórek somatycznych.
- Fibroblasty zarodkowe myszy (MEF) służą jako model do badania reprogramacji.
- Czynniki transkrypcyjne Oct-4, Sox-2, Klf-4 i c-Myc są krytyczne dla reprogramacji.
- Izolacja pośredników reprogramacji umożliwia przeprowadzenie badań mechanizumu.
Cel badania
- Izolować rzadkie pośredniki reprogramacji z MEF.
- Analizę tych pośredników dla lepszego zrozumienia procesu reprogramacji.
- Poprawić efektywność generowania iPSC.
Stosowane metody
- Pochodzenie MEF z zarodków E 13.5.
- Wysiew MEF w mediach iPSC uzupełnionych doksycykliną.
- Zbieranie komórek w określonych punktach czasowych i oznaczanie przeciwciałami.
- Izolacja pośredników za pomocą cytometrii przepływowej.
Główne wyniki
- Udana izolacja pośredników reprogramacji przy użyciu specyficznych markerów.
- Identyfikacja odrębnych populacji komórek na różnych etapach reprogramacji.
- Demonstracja zdolności do przeprowadzania badań mechanizumu na izolowanych pośrednikach.
- Lepsze zrozumienie dynamiki reprogramacji w MEF.
Wnioski
- Metoda umożliwia efektywną izolację pośredników reprogramacji.
- Uzyskane informacje mogą poprawić efektywność generowania iPSC.
- Przyszłe badania mogą wykorzystać te pośredniki do głębszego zrozumienia mechanizmu.
Często zadawane pytania
Executive Industry Relevance
Purification of iPS cell intermediates using cell surface markers enables mechanistic de-risking of reprogramming workflows, addressing a key bottleneck in stem cell-based discovery. This approach enhances predictive confidence in early-stage cell fate decisions and supports robust target validation for regenerative medicine and disease modeling portfolios. Isolating rare intermediates allows for precise interrogation of reprogramming dynamics, informing risk-adjusted advancement in cell therapy pipelines.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Enables mechanistic studies on reprogramming intermediates free from refractory cell populations.
- Supports functional validation of pluripotency-associated markers during cell fate transitions.
- Facilitates pathway clarification by tracking marker expression changes over time.
- Improves predictive confidence in selecting reprogramming factors and conditions.
Screening & Assay Development
- Provides validated cell populations for downstream phenotypic screening and assay development.
- Standardizes isolation of defined intermediates, enhancing reproducibility across experiments.
- Generates quantitative outputs via flow cytometry for robust assay readouts.
- Enables scalable preparation of intermediates for compound evaluation or genetic perturbation studies.
Translational & Preclinical Research
- Aligns reprogramming intermediates with disease-relevant cell states for translational modeling.
- Supports continuity from discovery through preclinical validation by enabling mechanistic studies on defined cell populations.
- Reduces biological ambiguity in preclinical models by isolating homogeneous cell states.
Pipeline & Workflow Integration
This cell surface marker-based purification method integrates at the interface of early discovery and preclinical research, bridging mechanistic studies with translational applications.
- Discovery Biology: Enables hypothesis testing on reprogramming efficiency and marker dynamics.
- Screening: Delivers reproducible, marker-defined cell populations for assay readiness and quantitative analysis.
- Analytics: Provides flow cytometry-based measurements to compare reprogramming stages and conditions.
- Translational Research: Facilitates alignment of in vitro intermediates with in vivo disease or developmental states.
- Enterprise Reuse: Establishes a reusable workflow for isolating rare cell populations across multiple projects.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence and reduces mechanistic ambiguity in cell reprogramming studies.
- Operational Value: Standardizes cell isolation and improves reproducibility across R&D teams.
- Strategic Value: Informs go/no-go decisions by enabling robust target validation and pathway analysis.
- Portfolio Impact: Supports risk-adjusted prioritization of cell-based therapeutic and modeling programs.
Implementation Considerations
- Requires expertise in flow cytometry and cell surface marker selection.
- Demands access to high-quality antibodies and analytical instrumentation.
- Necessitates cross-team standardization of gating strategies and marker panels.
- May require adaptation for different cell types or reprogramming systems.
- Dependent on availability of isogenic, well-characterized starting cell populations.
