Ukierunkowane różnicowanie neuronów dopaminergicznych z ludzkich pluripotencjalnych komórek macierzystych

Ogólnym celem tej procedury jest wywołanie wysoce wydajnego różnicowania neuronów dopaminergicznych. In vitro. Osiąga się to poprzez przygotowanie hodowli adhezyjnej pojedynczych komórek ludzkich pluripotencjalnych komórek macierzystych P.

W drugim etapie pożywka do hodowli komórkowej jest przełączana na pożywkę indukcyjną neuronów w celu indukcji progenitorów płytki podłogowej. Następnie neurony dopaminergiczne są hodowane w pożywkach dojrzewających. I wreszcie, jednokomórkowe progenitory neuronów dopaminergicznych są hodowane na płytkach fibronektyny z laminatu poli L ornityny i pożywkach dojrzewających przez 30 dni.

Ostatecznie mikroskopia immunofluorescencyjna może być wykorzystana do oceny ekspresji ważnych markerów neuronów dopaminergicznych. Technika ta ma większą przewagę nad istniejącą sferą neuro w protokole neurokwasowym. Może generować bardziej jednorodną podwójną populację neuronową o wyższej wydajności.

Cztery dni po pasażu odessać pożywkę z kultur komórkowych. Odłącz komórki jednym mililitrem Accutane na studzienkę i inkubuj je w temperaturze 37 stopni Celsjusza przez pięć minut. Podczas inkubacji dodać jeden mililitr żelatyny do każdego dołka na płytce sześciodołkowej, a następnie umieścić płytkę wraz ze świeżo przygotowanymi płytkami pokrytymi żelem matri w inkubatorze.

Gdy komórki staną się częściowo pływające, należy je kilkakrotnie pipetować w górę i w dół, aby uzyskać zawiesinę pojedynczej komórki. Następnie wciągnij komórki do 15-mililitrowej probówki i odwiruj je przez trzy minuty. W temperaturze 258 g i temperaturze pokojowej zawiesić osad w odpowiedniej ilości pożywki do hodowli ludzkich pluripotencjalnych komórek macierzystych uzupełnionej surowicą i dodać tę wiwinę do końcowego stężenia dwóch milimolowców.

Następnie inkubuj komórki na płytkach pokrytych żelatyną w stosunku jeden do jednego w temperaturze 37 stopni Celsjusza przez 30 minut. Aby usunąć podajniki metamfetaminy, przenieś komórki do nowej 15-mililitrowej tuby. Rozcieńczyć je w pożywce ludzkich pluripotencjalnych komórek macierzystych, uzupełnionej surowicą i policzyć je po ponownym odwirowaniu komórek, ponownie zawiesić komórki w MT.SR jednym pożywce za pomocą thias Ivan do stężenia 180 000 komórek na mililitr

Następnie odessać matrycę z powlekanych płytek i dozować dwa mililitry komórek na dołek. 48 godzin. Po ponownym posianiu komórek na płytkach matrycowych.

Odessać pożywkę z każdej studzienki i raz przemyć komórki PBS. Następnie dodać dwa mililitry różnicowania KSR, pożywki uzupełnionej SB 4 31, 50 42 i L DN 1 9 3 1 8 9 do komórek zmieniających pożywkę codziennie od zera D do D 20, jak pokazano w tabeli w dniu 20, odessać pożywkę różnicującą i odłączyć komórki jednym mililitrem 37 stopni Celsjusza na studzienkę w temperaturze 37 stopni Celsjusza przez pięć minut. Podczas inkubacji w inkubatorze rozgrzej płytki fibronektyny z poli loryny laminy.

Następnie po Resus, zawieszając oderwane komórki w zawiesinie pojedynczej komórki, rozcieńczyć komórki w pożywce neuronalnej. Po zliczeniu odwiruj komórki i ponownie zawieś osad w B 27, pożywce różnicującej o stężeniu 1 miliona komórek na mililitr. Następnie odessać fibronektynę z płytek fibronektyny poliolowej lub lamininy.

Umyj je dwukrotnie PBS i przenieś do każdego po 400 mikrolitrów komórek. Cóż, w końcu zmień pożywkę po pierwszych 24 godzinach, a następnie co drugi dzień, aż do eksperymentalnego punktu końcowego, aby usunąć wszelkie nieprzyłączone martwe komórki. Jak pokazano na tych obrazach, ponownie posiane hodowle ludzkich pluripotencjalnych ludzkich pluripotencjalnych komórek macierzystych będą rozszerzać się jako klastry w ciągu pierwszych 48 godzin różnicowania, osiągając około 70% konfluencji.

Po różnicowaniu komórki osiągają pełną konfluencję w ciągu zaledwie trzech do czterech dni. Do 20 dnia zróżnicowane komórki przyczepiają się i rosną jako małe grudki. W ciągu następnych pięciu dni w kępach pojawiają się znacznie intensywniejsze i morfologicznie nienaruszone aksony i neuryty, tworząc pewne połączenia między kępami.

Po 11 dniach różnicowania ludzkie pluripotencjalne komórki macierzyste mogą zostać skutecznie przekształcone w prekursory płytki podłogowej. Jak pokazano na tych obrazach, prawie wszystkie komórki wyrażają prekursor płytki podłogowej, markery komórkowe zagnieżdżają się w środku, a lis A dwa i więcej. 90% komórek wykazuje ekspresję Corin O OTX dwa i LM X jeden A. Po dalszym różnicowaniu komórki prekursorowe płytki podłogowej specjalizują się w neuronach dopaminergicznych, które wyrażają TUJ jeden i TH. Te neurony dopaminergiczne mają dziewięć tożsamości, ponieważ wyrażają GK dwa i są ujemne dla kalbindyny Eksperymenty barwienia immunologicznego pokazują również, że nie ma astrocytów GFAP i bardzo mało neuronów GABA-ergicznych, co wskazuje, że różnicowanie jest specyficzne wyłącznie dla linii neuronów dopaminergicznych.

Podczas testowania tej procedury ważne jest, aby zachować spójność w codziennej hodowli komórkowej i upewnić się, że pożywka jest świeżo przygotowana z odpowiednich składników.