Name: Ukierunkowane różnicowanie neuronów dopaminergicznych z ludzkich pluripotencjalnych komórek macierzystych (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-09-15T13:00:00.000+00:00
Duration: 6 min 40 s
Description: Poznaj protokół różnicowania neuronów dopaminergicznych A9 z ludzkich komórek macierzystych pluripotencjalnych. Ta metoda umożliwia modelowanie choroby Parkinsona i badania terapii komórkowych z wysoką wydajnością.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

Autorzy dziękują członkom laboratorium Renee Reijo Pera za pomoc podczas opracowywania tego protokołu i podczas przygotowywania tego manuskryptu. Prace te są wspierane przez wspólne laboratorium Kalifornijskiego Instytutu Medycyny Regeneracyjnej (CIRM) (CL-00518).

1. Przygotowanie pożywek hodowlanych
<ol>
	<li>Przygotować pożywkę dla mysich fibroblastów zarodkowych (MEF), łącząc następujące elementy: 445 ml DMEM, 50 ml płodowej surowicy bydlęcej (FBS) i 5 ml 100-krotnego roztworu podstawowego penicyliny/ampicyliny. Przechowywać wysterylizowane podłoże filtracyjne w temperaturze 4 °C nie dłużej niż 14 dni.</li>
	<li>Przygotować pożywkę hodowlaną hPSC zawierającą surowicę, łącząc następujące elementy: 385 ml DMEM/F12, 100 ml zamiennika surowicy nokautującej (KSR), 5 ml 100 x roztwór podstawowy aminokwasów endogennych, 5 ml 100 x roztwór podstawowy penicyliny/ampicyliny, 5 ml 100 x roztwór podstawowy merkaptoetanolu i 10 ng/ml bFGF. Przechowywać wysterylizowane podłoże filtracyjne w temperaturze 4 °C nie dłużej niż 10 dni.</li>
	<li>Przygotować pożywkę bez surowicy mTeSR1, łącząc następujące elementy: 400 ml podłoża podstawowego mTeSR1, 100 ml 5x suplementu i 5 ml 100x roztwór podstawowy penicyliny/ampicyliny. Podłoże należy przechowywać w temperaturze 4 °C nie dłużej niż 10 dni.</li>
	<li>Przygotować 10x roztwór podstawowy kolagenazy dożylnie: odważyć 0,5 g kolagenazy w mocy dożylnej, rozpuścić w 50 ml DMEM/F12 i wysterylizować filtrem. Przygotuj porcje i przechowuj je w temperaturze -20 °C przez miesiące.</li>
	<li>Przygotować 0,1% roztwór żelatyny: odważyć 0,5 g żelatyny (ze skóry bydlęcej typu B) i rozpuścić w wodzie dejonizowanej. Przechowuj wysterylizowany roztwór w autoklawie w temperaturze pokojowej przez tygodnie.</li>
	<li>Przygotować pożywkę różnicującą KSR, łącząc następujące elementy: 410 ml DMEM, 75 ml KSR, 5 ml 100 x nieistotny roztwór podstawowy aminokwasów, 5 ml 100 x roztwór podstawowy penicyliny/ampicyliny, 5 ml 100 x roztwór podstawowy -merkaptoetanolu. Przechowywać wysterylizowane podłoże filtracyjne w temperaturze 4 °C nie dłużej niż 10 dni. 
	UWAGA: KSR różni się w zależności od partii, co może mieć wpływ na skuteczność różnicowania. Dlatego lepiej jest przetestować kilka partii KSR, aby znaleźć najlepszą do zróżnicowania.</li>
	<li>Przygotować pożywkę różnicującą N2, łącząc następujące elementy: 98 ml DMEM, 1 ml 100 x suplement N2 i 1 ml 100 x roztwór podstawowy penicyliny/ampicyliny. Przechowywać wysterylizowane podłoże filtracyjne w temperaturze 4 °C nie dłużej niż 10 dni.</li>
	<li>Przygotować pożywkę różnicującą B27, łącząc następujące elementy: 480 ml pożywki neurobazalnej, 10 ml 50 x suplementu B27, 5 ml 100 x roztwór podstawowy glutamax i 5 ml 100 x roztwór podstawowy penicyliny/ampicyliny. Przechowywać wysterylizowane podłoże filtracyjne w temperaturze 4 °C nie dłużej niż 10 dni.</li>
</ol>
2. Hodowla hESC i hiPSC na komórkach zasilających MEF
H9 hESC zostały uzyskane z WiCell Research Institute, a hiPSC zostały ustanowione w laboratorium Reijo Pera poprzez retrowirusową transdukcję czynników Yamanaka OCT3/4, SOX2, KLF4 i c-MYC18.
<ol>
	<li>Co najmniej jeden dzień przed pasażem komórkowym przygotować kilka płytek żelatynowych, dodając 1 ml 0,1% żelatyny do 1 dołka z płytek 6-dołkowych i inkubować płytki w temperaturze 37 °C przez co najmniej 30 minut.</li>
	<li>Po inkubacji odessać żelatynę z płytek i napromieniować nasiona inaktywowanymi komórkami MEF na płytki o gęstości 1,6 x 105 komórek/dołek w pożywce MEF za pomocą hemocytometru do zliczenia komórek. 
	UWAGA: Opcjonalnie należy przygotować karmniki MEF już na 3 dni przed pasażem komórkowym.</li>
	<li>Komórki pasażujące jeden dzień po posiewie karmników MEF: odessać pożywkę z hPSC, dodać 1 mg/ml kolagenazy IV do komórek w dawce 1 ml/dołek i inkubować komórki w temperaturze 37 °C przez 1 godzinę.</li>
	<li>Podczas tej inkubacji należy raz przemyć karmniki MEF PBS, a następnie dodać ciepłą (37 °C) pożywkę hodowlaną hPSC zawierającą surowicę w ilości 1,5 ml/studzienkę.</li>
	<li>Po 1 godzinie postukaj kilka razy w płytkę hodowlaną, aby większość niezróżnicowanych kolonii oderwała się od płytek, podczas gdy zróżnicowane kolonie pozostaną przyczepione. Ostrożnie zbierz pływające kolonie i przenieś je do probówki o pojemności 15 ml.</li>
	<li>Delikatnie umyj płytkę ciepłym (37 °C) DMEM/F12 i przenieś DMEM/F12 do tej samej probówki o pojemności 15 ml.</li>
	<li>Odwirować probówki o masie 179 x g przez 3 minuty.</li>
	<li>Zassać pożywkę z probówek, uważając, aby nie naruszyć osadu. Dodaj ciepłą pożywkę hodowlaną hPSC, kilkakrotnie pipetuj komórki w górę i w dół, aby rozbić je na małe skupiska i dobrze wymieszać.</li>
	<li>Przenieś komórki na nowe podajniki MEF w stosunku 1:3-1:6.</li>
	<li>Zmieniaj pożywkę codziennie i przechodź komórki co 5-6 dni.</li>
</ol>
3. Przygotowanie komórek do różnicowania
<ol>
	<li>Co najmniej jeden dzień przed przygotowaniem komórek należy przygotować kilka płytek Matrigel (zazwyczaj 3 dołki z płytki 6-dołkowej). Rozcieńczyć Matrigel zimnym (4 °C) DMEM/F12 w stosunku 1:40 i dodać 1 ml Matrigelu do dołka z płytkami 6-dołkowymi. Inkubować płytki Matrigel w temperaturze 4 °C przez noc. UWAGA: Płytki Matrigel można uszczelnić preparatem Parafilm i przechowywać w temperaturze 4 °C nawet przez tydzień.</li>
	<li>Użyj komórek (patrz krok 2) 4 dni po pasażu. Usuń wszystkie zróżnicowane kolonie z płytek. Odessać pożywkę z płytki hodowlanej, dodać 1 ml akutazy do dołka i inkubować komórki w temperaturze 37 °C przez 5 minut.</li>
	<li>Podczas inkubacji przygotuj kilka płytek żelatynowych, dodając 1 ml żelatyny do 1 dołka z płytek 6-dołkowych. Umieścić te płytki oraz płytki Matrigel przygotowane dzień wcześniej w inkubatorze.</li>
	<li>Po 5-minutowej inkubacji lub gdy komórki staną się półpływające, należy kilkakrotnie pipetować komórki w górę i w dół, aby przekształcić je w pojedyncze komórki.</li>
	<li>Zebrać pojedyncze komórki do probówek o pojemności 15 ml i odwirować przy 258 x g przez 3 minuty.</li>
	<li>Zawiesić komórki odpowiednią ilością surowicy zawierającej pożywkę hodowlaną hPSC i dodać tiazowiwinę do końcowego stężenia 2 μM.</li>
	<li>Przenieść komórki na płytki pokryte żelatyną w stosunku 1:1 i inkubować komórki w temperaturze 37 °C przez 30 minut w celu usunięcia podajników MEF.</li>
	<li>Przenieść komórki do stożkowej probówki o pojemności 15 ml, dodać odpowiednią surowicę zawierającą pożywkę hPSC i policzyć komórki za pomocą hemocytometru.</li>
	<li>Odwirować komórki przy 258 x g przez 3 minuty.</li>
	<li>Podczas wirowania dodać tiazowiwinę do odpowiedniej pożywki mTeSR1, aby uzyskać stężenie 2 μM.</li>
	<li>Po odwirowaniu odessać pożywkę i dodać odpowiednią pożywkę mTeSR1 z tiazowiwiną, tak aby pozostało 1,8 x 105 komórek/ml pożywki.</li>
	<li>Wyjąć płytki Matrigel z inkubatora, odessać Matrigel i dodać 2 ml zmieszanych komórek do 1 dołka z płytek 6-dołkowych. 
	UWAGA: Gęstość komórek powinna wynosić 3,6 x 104 komórki/cm2 powierzchni.</li>
	<li>Umieść płytki z powrotem w inkubatorze i pozwól komórkom przyczepić się przez 24 godziny.</li>
	<li>24 godziny po posianiu komórek, odessać starą pożywkę i dodać 2 ml nowej pożywki mTeSR1 do dołka i pozwolić komórkom rosnąć przez kolejne 24 godziny przed rozpoczęciem różnicowania.</li>
</ol>
Różnicowanie komórek
<ol>
	<li>Rozpocznij różnicowanie 48 godzin po ponownym posadzeniu komórek na płytkach Matrigel.</li>
	<li>Odessać pożywkę hodowlaną z płytki, przemyć komórki raz PBS i dodać 2 ml następującej pożywki różnicującej do dołka: pożywka różnicująca KSR uzupełniona 10 μM SB431542 i 100 nM LDN-193189. Oznacz ten dzień jako D0 zróżnicowania.</li>
	<li>Zmieniaj medium codziennie od D0 do D20. 
	UWAGA: Pożywkę można przygotować do użycia nie dłużej niż 2 dni za jednym razem.</li>
	<li>Dla D1 i D2 należy użyć następującej pożywki: pożywki różnicującej KSR uzupełnionej o 10 μM SB431542, 100 nM LDN-193189, 0,25 μM SAG, 2 μM purmorfaminę i 50 ng/ml FGF8b.</li>
	<li>Dla D3 i D4 należy użyć następującego podłoża: pożywki różnicującej KSR uzupełnionej o 10 μM SB431542, 100 nM LDN-193189, 0,25 μM SAG, 2 μM purmorfaminę, 50 ng/ml FGF8b i 3 μM CHIR99021.</li>
	<li>Dla D5 i D6 należy użyć następującej pożywki: 75% pożywki różnicującej KSR plus 25% pożywki różnicującej N2 uzupełnionej 100 nM LDN-193189, 0,25 μM SAG, 2 μM purmorfaminy, 50 ng/ml FGF8b i 3 μM CHIR99021.</li>
	<li>Dla D7 i D8 należy użyć następującej pożywki: 50% pożywki różnicującej KSR plus 50% pożywki różnicującej N2 uzupełnionej 100 nM LDN-193189 i 3 μM CHIR99021.</li>
	<li>Dla D9 i D10 należy użyć następującej pożywki: 25% pożywki różnicującej KSR plus 75% pożywki różnicującej N2 uzupełnionej 100 nM LDN-193189 i 3 μM CHIR99021.</li>
	<li>Dla D11 i D12 należy użyć następującej pożywki: pożywki różnicującej B27 uzupełnionej o 3 μM CHIR99021, 10 ng/ml BDNF, 10 ng/ml GDNF, 1 ng/ml TGF3, 0,2 mM kwasu askorbinowego i 0,1 mM cAMP.</li>
	<li>Do pozostałej części różnicowania należy użyć następującej pożywki: pożywki różnicującej B27 uzupełnionej 10 ng/ml BDNF, 10 ng/ml GDNF, 1 ng/ml TGF3, 0,2 mM kwasu askorbinowego i 0,1 mM cAMP.</li>
	<li>Przy około D16 różnicowania przygotuj płytki z poli-L-ornityną/laminą/fibronektyną. Rozcieńczyć roztwór podstawowy poli-L-ornityny zimnym (4 °C) PBS do 15 μg/ml, dodać 1 ml do 1 dołka z płytek 6-dołkowych i inkubować płytki w temperaturze 37 °C przez noc.</li>
	<li>Odessać roztwór poli-L-ornityny, umyć płytki 3 razy sterylną wodą, a następnie wysuszyć płytki na powietrzu.</li>
	<li>Rozcieńczyć roztwór podstawowy lamininy zimnym (4 °C) PBS do 1 μg/ml, dodać 1 ml do jednego dołka z płytkami 6-dołkowymi i inkubować płytki w temperaturze 37 °C przez noc.</li>
	<li>Odessać roztwór lamininy, umyć płytki 3 razy sterylną wodą, a następnie wysuszyć płytki na powietrzu.</li>
	<li>Rozcieńczyć roztwór podstawowy fibronektyny zimnym (4 °C) PBS do 2 μg/ml, dodać 1 ml do 1 dołka z płytkami 6-dołkowymi i inkubować płytki w temperaturze 37 °C przez noc.</li>
	<li>Uszczelnić płytki Parafilmem i umieścić je w temperaturze 4 °C na okres do dwóch tygodni.</li>
	<li>Po 20 dniach różnicowania należy ponownie umieścić komórki na płytkach z poli-L-ornityną/laminą/fibronektyną. Odessać pożywkę różnicującą, dodać 1 ml ciepłej (37 °C) akutazy do 1 dołka z płytek 6-dołkowych i inkubować komórki w temperaturze 37 °C przez 5 minut.</li>
	<li>Podczas inkubacji umieścić w inkubatorze płytki z poli-L-ornityną/laminą/fibronektyną.</li>
	<li>Po 5-minutowej inkubacji lub gdy komórki staną się półpływające, delikatnie pipetuj komórki w górę i w dół kilka razy, aby przekształcić je w pojedyncze komórki.</li>
	<li>Zbierz pojedyncze komórki do stożkowych probówek o pojemności 15 ml i dodaj odpowiednią ilość podłoża neurobazalnego do zliczania komórek, które będzie się różnić w zależności od ekspansji (po 11 dniach różnicowania komórki mogą rozszerzyć się 15-20 razy). Policz komórki za pomocą hemocytometru.</li>
	<li>Odwirować komórki przy 258 x g przez 3 minuty. Odessać supernatant i ponownie zawiesić komórki za pomocą pożywki różnicującej B27 tak, aby stężenie komórek wynosiło 1 x 106 komórek/ml pożywki.</li>
	<li>Odessać fibronektynę z płytek, przemyć dwukrotnie PBS i dodać 2 ml komórek do 1 dołka z płytek 6-dołkowych. 
	UWAGA: Gęstość komórek do ponownego powlekania powinna wynosić 2 x 105 komórek/cm2 powierzchni.</li>
	<li>Zmień pożywkę 24 godziny później, aby usunąć wszelkie nieprzyłączone martwe komórki.</li>
	<li>Zmieniaj podłoże co drugi dzień, aż do uzyskania pożądanych punktów czasowych dla danego eksperymentu.</li>
</ol>

<ol><li>Freed, C. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Will+embryonic+stem+cells+be+a+useful+source+of+dopamine+neurons+for+transplant+into+patients+with+Parkinson%27s+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Will embryonic stem cells be a useful source of dopamine neurons for transplant into patients with Parkinson's disease.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 99, 1755-1757 (2002).</li>
<li>Perrier, A. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Derivation+of+midbrain+dopamine+neurons+from+human+embryonic+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Derivation of midbrain dopamine neurons from human embryonic stem cells.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 101, 12543-12548 (2004).</li>
<li>Park, C. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vitro+and+in+vivo+analyses+of+human+embryonic+stem+cell-derived+dopamine+neurons%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Neurochemistry%22%5BJournal%5D)">In vitro and in vivo analyses of human embryonic stem cell-derived dopamine neurons.</a> Journal of Neurochemistry. 92, 1265-1276 (2005).</li>
<li>Buytaert-Hoefen, K. A., Alvarez, E., Freed, C. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Generation+of+tyrosine+hydroxylase+positive+neurons+from+human+embryonic+stem+cells+after+coculture+with+cellular+substrates+and+exposure+to+GDNF%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cells%22%5BJournal%5D)">Generation of tyrosine hydroxylase positive neurons from human embryonic stem cells after coculture with cellular substrates and exposure to GDNF.</a> Stem Cells. 22, Dayton, Ohio 669-674 (2004).</li>
<li>Zeng, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dopaminergic+differentiation+of+human+embryonic+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cells%22%5BJournal%5D)">Dopaminergic differentiation of human embryonic stem cells.</a> Stem Cells. 22, Dayton, Ohio 925-940 (2004).</li>
<li>Yan, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Directed+differentiation+of+dopaminergic+neuronal+subtypes+from+human+embryonic+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cells%22%5BJournal%5D)">Directed differentiation of dopaminergic neuronal subtypes from human embryonic stem cells.</a> Stem Cells. 23, 781-790 (2005).</li>
<li>Schulz, T. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Differentiation+of+human+embryonic+stem+cells+to+dopaminergic+neurons+in+serum-free+suspension+culture%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cells%22%5BJournal%5D)">Differentiation of human embryonic stem cells to dopaminergic neurons in serum-free suspension culture.</a> Stem Cells. 22, 1218-1238 (2004).</li>
<li>Park, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Generation+of+dopaminergic+neurons+in+vitro+from+human+embryonic+stem+cells+treated+with+neurotrophic+factors%5BTitle%5D)+AND+%22Neuroscience+Letters%22%5BJournal%5D)">Generation of dopaminergic neurons in vitro from human embryonic stem cells treated with neurotrophic factors.</a> Neuroscience Letters. 359, 99-103 (2004).</li>
<li>Cho, M. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Highly+efficient+and+large-scale+generation+of+functional+dopamine+neurons+from+human+embryonic+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Highly efficient and large-scale generation of functional dopamine neurons from human embryonic stem cells.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 105, 3392-3397 (2008).</li>
<li>Cooper, O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Differentiation+of+human+ES+and+Parkinson%27s+disease+iPS+cells+into+ventral+midbrain+dopaminergic+neurons+requires+a+high+activity+form+of+SHH%2C+FGF8a+and+specific+regionalization+by+retinoic+acid%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+and+Cellular+Neurosciences%22%5BJournal%5D)">Differentiation of human ES and Parkinson's disease iPS cells into ventral midbrain dopaminergic neurons requires a high activity form of SHH, FGF8a and specific regionalization by retinoic acid.</a> Molecular and Cellular Neurosciences. 45, 258-266 (2010).</li>
<li>Chambers, S. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Highly+efficient+neural+conversion+of+human+ES+and+iPS+cells+by+dual+inhibition+of+SMAD+signaling%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Biotechnology%22%5BJournal%5D)">Highly efficient neural conversion of human ES and iPS cells by dual inhibition of SMAD signaling.</a> Nature Biotechnology. 27, 275-280 (2009).</li>
<li>Sanchez-Danes, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Efficient+generation+of+A9+midbrain+dopaminergic+neurons+by+lentiviral+delivery+of+LMX1A+in+human+embryonic+stem+cells+and+induced+pluripotent+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Human+Gene+Therapy%22%5BJournal%5D)">Efficient generation of A9 midbrain dopaminergic neurons by lentiviral delivery of LMX1A in human embryonic stem cells and induced pluripotent stem cells.</a> Human Gene Therapy. 23, 56-69 (2012).</li>
<li>Fasano, C. A., Chambers, S. M., Lee, G., Tomishima, M. J., Studer, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Efficient+derivation+of+functional+floor+plate+tissue+from+human+embryonic+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Stem+Cell%22%5BJournal%5D)">Efficient derivation of functional floor plate tissue from human embryonic stem cells.</a> Cell Stem Cell. 6, 336-347 (2010).</li>
<li>Kriks, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dopamine+neurons+derived+from+human+ES+cells+efficiently+engraft+in+animal+models+of+Parkinson%27s+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Dopamine neurons derived from human ES cells efficiently engraft in animal models of Parkinson's disease.</a> Nature. 480, 547-551 (2011).</li>
<li>Xi, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Specification+of+midbrain+dopamine+neurons+from+primate+pluripotent+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cells%22%5BJournal%5D)">Specification of midbrain dopamine neurons from primate pluripotent stem cells.</a> Stem Cells. 30, 1655-1663 (2012).</li>
<li>Kirkeby, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Generation+of+regionally+specified+neural+progenitors+and+functional+neurons+from+human+embryonic+stem+cells+under+defined+conditions%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Reports%22%5BJournal%5D)">Generation of regionally specified neural progenitors and functional neurons from human embryonic stem cells under defined conditions.</a> Cell Reports. 1, 703-714 (2012).</li>
<li>Mendez, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell+type+analysis+of+functional+fetal+dopamine+cell+suspension+transplants+in+the+striatum+and+substantia+nigra+of+patients+with+Parkinson%27s+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Brain%3A+a+Journal+of+Neurology%22%5BJournal%5D)">Cell type analysis of functional fetal dopamine cell suspension transplants in the striatum and substantia nigra of patients with Parkinson's disease.</a> Brain: a Journal of Neurology. 128, 1498-1510 (2005).</li>
<li>Takahashi, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Induction+of+pluripotent+stem+cells+from+adult+human+fibroblasts+by+defined+factors%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Induction of pluripotent stem cells from adult human fibroblasts by defined factors.</a> Cell. 131, 861-872 (2007).</li>
<li>Nishimura, K., Takahashi, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Therapeutic+application+of+stem+cell+technology+toward+the+treatment+of+Parkinson%27s+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Biological+%26+Pharmaceutical+Bulletin%22%5BJournal%5D)">Therapeutic application of stem cell technology toward the treatment of Parkinson's disease.</a> Biological & Pharmaceutical Bulletin. 36, 171-175 (2013).</li>
<li>Smidt, M. P., Burbach, J. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((How+to+make+a+mesodiencephalic+dopaminergic+neuron%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews.+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">How to make a mesodiencephalic dopaminergic neuron.</a> Nature Reviews. Neuroscience. 8, 21-32 (2007).</li>
<li>Wang, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Noggin+and+bFGF+cooperate+to+maintain+the+pluripotency+of+human+embryonic+stem+cells+in+the+absence+of+feeder+layers%5BTitle%5D)+AND+%22Biochemical+and+Biophysical+Research+Communications%22%5BJournal%5D)">Noggin and bFGF cooperate to maintain the pluripotency of human embryonic stem cells in the absence of feeder layers.</a> Biochemical and Biophysical Research Communications. 330, 934-942 (2005).</li>
<li>Chen, J. K., Taipale, J., Young, K. E., Maiti, T., Beachy, P. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Small+molecule+modulation+of+Smoothened+activity%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Small molecule modulation of Smoothened activity.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 99, 14071-14076 (2002).</li>
</ol>

Autorzy oświadczają, że nie mają konkurencyjnych interesów finansowych.

Ludzkie pluripotencjalne komórki macierzyste (w tym zarówno hESC, jak i hiPSC) mogą być różnicowane in vitro w celu wytworzenia większości, jeśli nie wszystkich, typów komórek naszego ciała, w tym neuronów DA, co wykazano w poprzednich badaniach19. Tutaj, w oparciu o wiedzę z rozwoju embrionalnych neuronów dopaminergicznych20 i opublikowane protokoły z innych laboratoriów14,15, zoptymalizowaliśmy warunki hodowli neuronów DA z hESC i hiPSC. Protokół ten jest skuteczny, powtarzalny...

Neurony dopaminergiczne (DA) można znaleźć w kilku obszarach mózgu, w tym w śródmózgowiu, podwzgórzu, siatkówce i opuszkach węchowych. Neurony A9 DA w istocie czarnej pars compacta (SNpc) kontrolują zachowanie i ruch, rzutując na prążkowie w przodomózgowiu i tworząc pozapiramidowy układ ruchowy. Zwyrodnienie neuronów A9 DA prowadzi do choroby Parkinsona (PD), która jest drugą najczęstszą chorobą neurodegeneracyjną u ludzi i obecnie nieuleczalną. Terapia zastępcza jest jedną z najbardziej obiecujących strategii leczenia PD1, dlatego istnieje duże zainteresowanie pozyskiwaniem neuronów A9 DA z ludzkich pluripotencjalnych komórek macierzystych (hPSC), w tym zarówno ludzkich embrionalnych komórek macierzystych (hESC), jak i niedawno indukowanych przez człowieka pluripotencjalnych komórek macierzystych (hiPSC).
Wiele badań próbowało wyprowadzić neurony A9 DA z hPSC przy użyciu różnych metod. Najwcześniejsze doniesienia o wszystkich neuronach DA zostały wygenerowane przez stadium progenitorowe rozety neuronalnej. Poprzez wspólną hodowlęz 3-5 komórkami zrębu MS52 lub PA6 z zewnętrznymi czynnikami wzrostu lub bez nich przez 2-4 tygodnie, L. Studer i współpracownicy oraz trzy inne grupy z powodzeniem indukowali hESC do wytwarzania rozet nerwowych. Następnie wzbogacili te rozety poprzez mechaniczną preparację lub trawienie enzymatyczne w celu dalszego różnicowania. W innych raportach naukowcy wygenerowali rozety neuronalne poprzez różnicowanie kultur pływających w ciele embrionalnym (EB)6-9. Później naukowcy opracowali metodę różnicowania opartą na monowarstwach10,11, w której posiali hESC i hiPSC na matrycy pozakomórkowej, dodali różne czynniki wzrostu do hodowli, aby indukować różnicowanie hPSC do neuronów DA, co naśladuje rozwój embrionalnych neuronów DA in vivo. Chociaż we wszystkich tych badaniach uzyskano komórki eksprymujące hydroksylazę tyrozyny (TH) z pewnymi cechami neuronów DA, cały proces różnicowania jest czasochłonny i pracochłonny, ogólnie nieefektywny, a co ważniejsze, tożsamość A9 tych neuronów nie została wykazana w większości badań, z wyjątkiem jednego z ekspresją ektopową LMX1a12. Niedawno opracowano nowy protokół oparty na płytce podłogowej (FP)13-16, w którym prekursory FP z potencjałem neuronu DA były najpierw generowane przez aktywację szlaków sygnałowych sonic hedgehog i kanonicznych Wnt we wczesnym etapie różnicowania, a następnie te komórki FP zostały następnie określone w neuronach DA. Chociaż ten protokół jest bardziej wydajny, nadal występują pewne problemy; na przykład cały proces różnicowania trwa długo (co najmniej 35 dni) i jest zależny od komórki zasilającej15 lub jest zależny od EB16 lub tożsamość A9 nie została wykazana14.
Tutaj, na podstawie wiedzy z badań nad embrionalnymi neuronami DA in vivo oraz opublikowanych wyników innych badaczy, zoptymalizowaliśmy warunki hodowli dla efektywnego generowania neuronów DA zarówno z hESC, jak i hiPSC. Najpierw wygenerowaliśmy komórki prekursorowe FP poprzez aktywację kanonicznej sygnalizacji Wnt za pomocą CHIR99021 drobnocząsteczkowej i sygnalizacji sonic hedgehog za pomocą małych cząsteczek SAG i purmorfaminy. Te komórki FP wyrażają FOXA2, LMX1a, CORIN, OTX2 i NESTIN. Następnie określiliśmy te komórki FP do neuronów DA z czynnikami wzrostu, w tym BDNF, GDNF itp. Wygenerowane neurony DA są typu komórek A9, ponieważ są dodatnie dla GIRK2, a ujemne dla Calbindin17. Protokół ten jest niezależny od komórki zasilającej lub EB, wysoce wydajny i powtarzalny. Korzystając z tego protokołu, można uzyskać neurony DA w czasie krótszym niż 4 tygodnie z hESC lub hiPSC zdrowych osób do badania przeszczepu komórek lub z hiPSC pacjentów z PD do modelowania in vitro PD lub testowania potencjalnych środków terapeutycznych dla PD.

<table><tbody><tr><td>DMEM</td><td>Life Technologies</td><td>10569-010</td><td></td></tr><tr><td>FBS</td><td>Life Technologies</td><td>26140</td><td></td></tr><tr><td>penicylina/ampicylina</td><td>Life Technologies</td><td>15140-122</td><td></td></tr><tr><td>DMEM/F12</td><td>Life Technologies</td><td>10565-018</td><td></td></tr><tr><td>KSR</td><td>Life Technologies</td><td>10828-028</td><td></td></tr><tr><td>Endogenny aminokwas</td><td>Life Technologie</td><td>11140-050</td><td></td></tr><tr><td>b-merkaptoetanol</td><td>Millipore</td><td>ES-007-E</td><td></td></tr><tr><td>bFGF</td><td>R& D Systems</td><td>233-FB-025</td><td></td></tr><tr><td>mTesR1</td><td>STEMCELL Technologies</td><td>5850</td><td></td></tr><tr><td>Kolagenaza IV</td><td>Life Technologies</td><td>17104-019</td><td></td></tr><tr><td>Żelatyna</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G9391</td><td></td></tr><tr><td>Suplement N2</td><td>Life Technologies</td><td>17502-048</td><td></td></tr><tr><td>B27 suplement</td><td>Life Technologies</td><td>17504-044</td><td></td></tr><tr><td>Neurobasal</td><td>Life Technologies</td><td>21103-049</td><td></td></tr><tr><td>Glutamax</td><td>Life Technologies</td><td>35050-061</td><td></td></tr><tr><td>PBS</td><td>Life Technologies</td><td>10010-023</td><td></td></tr><tr><td>Matrigel o obniżonym czynniku wzrostu</td><td>BD Biosciences</td><td>354230</td><td></td></tr><tr><td>Accutase</td><td>MP Biomedicals</td><td>1000449</td><td></td></tr><tr><td>Tiazovivin</td><td>Santa Cruz Biotechnology</td><td>sc-361380</td><td></td></tr><tr><td>SB431542</td><td>Tocris Bioscience</td><td>1614</td><td></td></tr><tr><td>LDN-193189</td><td>Stemgent</td><td>04-0074</td><td></td></tr><tr><td>SAG</td><td>EMD Millipore</td><td>566660-1MG</td><td></td></tr><tr><td>Purmorphamine</td><td>Santa Cruz Biotechnology</td><td>sc-202785</td><td></td></tr><tr><td>FGF8b</td><td>R& D Systems</td><td>423-F8-025</td><td></td></tr><tr><td>CHIR99021</td><td>Cellagen Technology</td><td>C2447-2S</td><td></td></tr><tr><td>BDNF</td><td>R& D Systems</td><td>248-BD-025</td><td></td></tr><tr><td>GDNF</td><td>R& D Systems</td><td>212-GD-010</td><td></td></tr><tr><td>TGF-beta3</td><td>R& D Systems</td><td>243-B3-002</td><td></td></tr><tr><td>Kwas askorbinowy</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A4034</td><td></td></tr><tr><td>cAMP</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D0627</td><td></td></tr><tr><td>Mysie przeciwciało anty ludzkie NESTIN</td><td>Santa Cruz Biotechnology</td><td>sc-23927</td> 1<td>/1,000 rozcieńczenie</td></tr><tr><td>Królik anty ludzkie przeciwciało OTX2</td><td>Millipore</td><td>AB9566</td><td>1/2,000 rozcieńczenie</td></tr><tr><td>Kozioł anty ludzkie przeciwciało FOXA2</td><td>R& D Systems</td><td>AF2400</td><td>1/200 rozcieńczenie</td></tr><tr><td>królik przeciwciało przeciw ludzkiemu LMX1a</td><td>Millipore</td><td>AB10533</td><td>rozcieńczenie 1/1,000</td></tr><tr><td>Królicze przeciwciało anty ludzkie TH</td><td>Pel Freez</td><td>P40101</td><td>rozcieńczenie 1/500</td></tr><tr><td>Kurczak anty ludzkie przeciwciało TH</td><td>Milipore</td><td>AB9702</td><td>1/500 rozcieńczenie</td></tr><tr><td>Mysz anty ludzkie przeciwciało TUJ1</td><td>Covance</td><td>MMS-435P</td><td>1/,2000 rozcieńczenie</td></tr><tr><td>Królicze przeciwciało anty ludzkie GIRK2</td><td>Abcam</td><td>ab30738</td><td>1/300 rozcieńczenie</td></tr><tr><td>Królik anty ludzkie przeciwciało Calbindin</td><td>Abcam</td><td>ab25085</td><td>1/400 rozcieńczenie</td></tr><tr><td>Wirówka</td><td>Eppendorf</td><td>5804</td><td></td></tr></tbody></table>

ukierunkowane różnicowanie neuronów dopaminergicznych z ludzkich pluripotencjalnych komórek macierzystych

Directed Dopaminergic Neuron Differentiation from Human Pluripotent Stem Cells

Neurony dopaminergiczne (DA) w istocie czarnej pars compacta (znane również jako neurony A9 DA) są specyficznym typem komórek, który jest tracony w chorobie Parkinsona (PD). Istnieje duże zainteresowanie pozyskiwaniem neuronów A9 DA z ludzkich pluripotencjalnych komórek macierzystych (hPSC) do regeneracyjnej terapii zastępczej komórek w chorobie Parkinsona. Podczas rozwoju neuronalnego neurony A9 DA pochodzą z prekursorów płytki podłogowej (FP) znajdujących się w brzusznej linii środkowej ośrodkowego układu nerwowego. W tym miejscu zoptymalizowaliśmy warunki hodowli pod kątem stopniowego różnicowania hPSC do neuronów A9 DA, co naśladuje rozwój neuronów DA w zarodku. W naszym protokole najpierw opisujemy efektywne wytwarzanie komórek prekursorowych FP z hPSC przy użyciu metody małocząsteczkowej, a następnie przekształcamy komórki FP w neurony A9 DA, które mogą być utrzymywane in vitro przez kilka miesięcy. Ten skuteczny, powtarzalny i kontrolowany protokół działa dobrze w przypadku ludzkich embrionalnych komórek macierzystych (hESC) i ludzkich indukowanych pluripotencjalnych komórek macierzystych (hiPSC) od zdrowych osób i pacjentów z chorobą Parkinsona, w których można uzyskać neurony A9 DA do modelowania chorób in vitro i badań przesiewowych leków oraz terapii przeszczepu komórek in vivo w kierunku PD.

Przegląd protokołu różnicowania przedstawiono na Rysunku 1. Efektywność prezentowanego tutaj protokołu różnicowania zależy od stanu komórek wyjściowych. Dlatego kluczowe jest, aby po pierwsze usunąć wszystkie zróżnicowane kolonie przed dysocjacją hPSC do pojedynczych komórek w celu różnicowania, po drugie usunąć większość, jeśli nie wszystkie, komórki zasilające MEF poprzez inkubację komórek na płytkach powlekanych żelatyną przez 30 min oraz po trzecie wysiać pojedyncze komórki hPSC z odpowiednią gęstośc...

My, opierając się na wiedzy z biologii rozwojowej i opublikowanych badaniach, opracowaliśmy zoptymalizowany protokół do efektywnego generowania neuronów dopaminergicznych A9 śródmózgowia zarówno z ludzkich embrionalnych komórek macierzystych, jak i ludzkich indukowanych pluripotencjalnych komórek macierzystych, co byłoby przydatne do modelowania chorób i terapii zastępczej w chorobie Parkinsona.

Ukierunkowane różnicowanie neuronów dopaminergicznych z ludzkich pluripotencjalnych komórek macierzystych

Dopaminergic (DA) neurons in the substantia nigra pars compacta  (also known as A9 DA neurons) are the specific cell type that is lost in ...

Ogólnym celem niniejszej procedury jest indukcja wysoce wydajnego różnicowania neuronów dopaminergicznych in vitro. Jest to realizowane poprzez uprzednie przygotowanie hodowli adhezyjnej pojedynczych komórek ludzkich pluripotencjalnych komórek macierzystych.W drugim kroku pożywkę do hodowli komórek zmienia się na pożywkę indukującą neurony w celu indukcji progenitorów płyty dna. Następnie neurony dopaminergiczne hoduje się w pożywce dojrzewania. I na koniec, pojedyncze komórki progenitorów neuronów dopaminergicznych hoduje się przez 30 dni na płytkach laminowanych polilornityną i fibronektyną w pożywce dojrzewania.W końcowym etapie można wykorzystać mikroskopię immunofluorescencyjną do oceny ekspresji kluczowych markerów neuronów dopaminergicznych. Technika ta wykazuje znaczną przewagę nad istniejącym protokołem neurosferowym opartym na kwasach neurotroficznych. Pozwala ona na uzyskanie bardziej homogennej populacji neuronów z wyższą wydajnością.Cztery dni po pasażu odessać pożywkę z kultur komórkowych. Odczepić komórki za pomocą 1 mL Accutane na każdą studnię i inkubować je w temperaturze 37 °C przez pięć minut. Podczas inkubacji dodać 1 mL żelatyny do każdej studni płytki 6-dołko

directed-dopaminergic-neuron-differentiation-from-human-pluripotent

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Neuronauka

Dyrektywne różnicowanie neuronów dopaminergicznych z ludzkich wielopotencjalnych komórek macierzystych

Opracowaliśmy protokół indukcji neuroblastów bezpośrednio z pluripotencjalnych ludzkich embrionalnych komórek macierzystych utrzymywanych w ściśle określonych warunkach z zastosowaniem małych cząsteczek, co umożliwia pozyskanie dużej ilości ludzkich progenitorów neuronalnych oraz typów komórek neuronalnych rozwijającego się OUN w celu regeneracji tkanki nerwowej.

Efektywne wyprowadzanie ludzkich progenitorów neuronalnych i neuronów z pluripotencjalnych ludzkich embrionalnych komórek macierzystych z zastosowaniem indukcji małymi cząsteczkami

Protokoły różnicowania neuronalnego pluripotencjalnych ludzkich komórek macierzystych (hPSCs) są często czasochłonne i wymagają zaawansowanych umiejętności w hodowli komórkowej. W niniejszej pracy dostosowaliśmy procedurę różnicowania opartą na małych cząsteczkach do formatu płytek wielodobojowych, co umożliwia prostą, szybką i wydajną generację ludzkich neuronów w sposób kontrolowany.

Szybka i wydajna generacja neuronów z ludzkich pluripotencjalnych komórek macierzystych w formacie płyt wielodołkowych

Ten film pokazuje generowanie nerwowych komórek progenitorowych z nietransgenicznych i transgenicznych ludzkich pluripotencjalnych komórek macierzystych (hPSC). hPSC są różnicowane w neuronalne komórki progenitorowe za pomocą neuronalnej pożywki różnicującej. Podczas gdy różnicowanie jest indukowane w komórkach nietransgenicznych za pomocą małych cząsteczek, transgeniczne hPSC są różnicowane przez dodanie antybiotyku, który indukuje promotor dla czynnika transkrypcyjnego specyficznego dla...

Różnicowanie nietransgenicznych i transgenicznych ludzkich pluripotencjalnych komórek macierzystych w neuronalne komórki progenitorowe

Ten film pokazuje proces indukowania ludzkich pluripotencjalnych komórek macierzystych do różnicowania się w neurony poprzez transfekcję ich zmodyfikowanymi lentiwirusami przenoszącymi gen neurogennego czynnika transkrypcyjnego pod kontrolą elementu reagującego na tetracyklinę, a następnie leczenie pochodną tetracykliny i pożywką do dojrzewania.

Różnicowanie ludzkich pluripotencjalnych komórek macierzystych w neuronach przy użyciu zmodyfikowanych lentiwirusów

Ten film demonstruje różnicowanie ludzkich embrionalnych komórek macierzystych (hESC) w neurony dopaminergiczne, aby dostarczyć modelu do badania choroby Parkinsona. HESC są hodowane w pożywce do indukcji neuronalnej na płytce mikrodołkowej w celu utworzenia neurosfer 3D. Są one następnie hodowane w pożywce do indukcji neuronalnej, aby promować różnicowanie w dopaminergiczne neurony progenitorowe. Końcowe dojrzewanie neuronów zachodzi we wstawce hodowlanej w warunkach granicy faz...

Wytwarzanie dopaminergicznych organoidów neuronalnych z ludzkich embrionalnych komórek macierzystych

Ta procedura prowadzi do powstania neuronów kresomózgowiowych poprzez przejście przez punkty kontrolne, które są podobne do tych obserwowanych podczas rozwoju człowieka. Komórki mogą się spontanicznie różnicować, są wystawione na działanie czynników, które popychają je w kierunku linii neuronalnej, są izolowane i są powlekane na szkiełkach nakrywkowych, aby umożliwić końcowe różnicowanie i dojrzewanie.

Specyfikacja neuronów glutaminergicznego kresomózgowia z ludzkich pluripotencjalnych komórek macierzystych

Modyfikujemy i wdrażamy wcześniej opublikowany protokół opisujący szybkie, powtarzalne i efektywne różnicowanie ludzkich indukowanych pluripotencjalnych komórek macierzystych (hiPSC) w pobudzające neurony korowe12. W szczególności nasza modyfikacja pozwala na kontrolę gęstości komórek neuronalnych i wykorzystanie ich na układach mikroelektrod do pomiaru właściwości elektrofizjologicznych na poziomie sieci.

Szybkie różnicowanie neuronalne indukowanych pluripotencjalnych komórek macierzystych do pomiaru aktywności sieci na układach mikroelektrod

Protokół przedstawia przeprogramowanie komórek jednojądrzastych krwi obwodowej w celu wywołania nerwowych komórek macierzystych przez infekcję wirusem Sendai, różnicowanie iNSC w neurony dopaminergiczne, przeszczepianie prekursorów DA do jednostronnie uszkodzonych modeli mysich choroby Parkinsona oraz ocenę bezpieczeństwa i skuteczności prekursorów DA pochodzących z iNSC w leczeniu PD.

Generowanie indukowanych nerwowych komórek macierzystych z obwodowych komórek jednojądrzastych i różnicowanie w kierunku prekursorów neuronów dopaminergicznych do badań transplantacyjnych

W tym protokole opisujemy stabilną, wysoce efektywną strategię różnicowania do generowania postganglionowych neuronów współczulnych z ludzkich pluripotencjalnych komórek macierzystych. Model ten sprawi, że neurony będą dostępne do wykorzystania w badaniach nad wieloma zaburzeniami autonomicznymi.

Skuteczne różnicowanie zazwojowych neuronów współczulnych przy użyciu ludzkich pluripotencjalnych komórek macierzystych w warunkach hodowli bez karmienia i zdefiniowanych chemicznie

Pokazujemy automatyzację indukowanych przez człowieka hodowli pluripotencjalnych komórek macierzystych (hiPSC) i różnicowanie neuronów zgodne z automatycznym obrazowaniem i analizą.

Zautomatyzowana produkcja indukowanych przez człowieka pluripotencjalnych neuronów korowych i dopaminergicznych pochodzących z komórek macierzystych ze zintegrowanym monitorowaniem żywych komórek

Prezentowany tutaj jest prosty protokół do bezpośredniego różnicowania hemogennych komórek śródbłonka od ludzkich pluripotencjalnych komórek macierzystych w ciągu około 1 tygodnia.

Ukierunkowane różnicowanie hemogennych komórek śródbłonka z ludzkich pluripotencjalnych komórek macierzystych

Poznaj protokół różnicowania neuronów dopaminergicznych A9 z ludzkich komórek macierzystych pluripotencjalnych. Ta metoda umożliwia modelowanie choroby Parkinsona i badania terapii komórkowych z wysoką wydajnością.

Ukierunkowane różnicowanie neuronów dopaminergicznych z ludzkich pluripotencjalnych komórek macierzystych

Przeglądaj więcej filmów