Name: Zastosowanie przędziorków dwuplamistych Tetranychus urticae do badań interakcji między roślinami a szkodnikami (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-07-04T13:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 53 s
Description: Poznaj protokoły zbierania przędziorków dwuplamistych Tetranychus urticae, infestacji roślin oraz kwantyfikacji uszkodzeń metodą siatki. Techniki te usprawniają badania interakcji roślina-szkodnik w entomologii.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Ten projekt został sfinansowany przez Rząd Kanady poprzez Genome Canada i Ontario Genomics Institute (OGI-046) oraz Ontario Research Fund-Global Leadership in Genomics and Life Sciences GL2-01-035 (do M.G. i V.G.). T.V.L. jest adiunktem w Funduszu Badań Naukowych Flandrii (FWO).

1. Utrzymanie populacji przędziorków
UWAGA: Przędziorki są hodowane na kalifornijskiej czerwonej fasoli (Phaseolus vulgaris).
<ol>
	<li>Uprawiaj rośliny fasoli z nasion przez 2-3 tygodnie przed inwazją.</li>
	<li>Wymieszaj te rośliny z porażonymi roślinami; dorosłe roztocza szybko skolonizują świeży materiał roślinny.</li>
	<li>Usuwaj stare porażone rośliny fasoli co 7-10 dni, zastępując je świeżymi roślinami.</li>
</ol>
2. Zbieranie dorosłych samic roztoczy
<ol>
	<li>Zbieranie roztoczy metodą prania
	<ol>
		<li>Aby zebrać roztocza, umieść świeżą roślinę fasoli w kontakcie z porażonymi roślinami na 1 do 2 dni przed eksperymentem.</li>
		<li>Użyj od 20 do 30 świeżych roślin fasoli, aby zebrać od 1,000 do 2,000 dorosłych żeńskich roztoczy</li>.
		<li>Przygotować roztwór Tween 20 o stężeniu 0,001%, używając wody z kranu o temperaturze pokojowej.</li>
		<li>Umyj porażone rośliny fasoli w roztworze Tween 20, używając 2 do 3 roślin na raz.</li>
		<li>Każda roślina jest myta 2-3 razy, aby zebrać wszystkie roztocza z liści.</li>
		<li>Wykonaj krok 2.1.4 w ciągu 10 minut, aby uniknąć śmiertelności roztoczy.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Izolacja dorosłych samic roztoczy przez filtrację zawiesiny roztoczy przez sita o określonym rozmiarze oczek
	<ol>
		<li>Przygotować sita o następujących rozmiarach oczek: 500 μm (w celu usunięcia zanieczyszczeń) i 300 μm (w celu zebrania dorosłych samic roztoczy) (rysunek 1A).</li>
		<li>Przefiltrować zawiesinę przez sito 500 μm.</li>
		<li>Ponownie przefiltrować zawiesinę przez sito 300 μm. Dorosłe samice roztoczy zostaną zachowane.</li>
		<li>Zanurz sito o średnicy 300 μm z dorosłymi samicami roztoczy w czystej wodzie z kranu, aby usunąć Tween 20.</li>
		<li>Rozłóż roztocza w jednej warstwie na dnie sita.</li>
		<li>Użyj ręcznika papierowego, aby usunąć nadmiar wody z siatki i boków sita. UWAGA: Dzieje się tak, ponieważ roztocza muszą szybko wyschnąć, aby się zregenerować.</li>
		<li>Przygotuj zespół, jak pokazano na rysunku 1B; pozwoli to roztoczom na swobodne poruszanie się, ale zapobiegnie ich ucieczce.</li>
		<li>Umieść sitko z roztoczami na sitku, które służy jako podpora.</li>
		<li>Otocz dolne sito wodą, aby zapobiec rozpraszaniu się roztoczy. UWAGA: Roztocza zaczną się regenerować po około 5 minutach. Po około 30 minutach liczba poruszających się roztoczy jest wystarczająca do rozpoczęcia zbierania (ryc. 1D). Roztocza należy zebrać w ciągu 1 godziny, ponieważ wytwarzają jedwab, który będzie przeszkadzał w zbieraniu.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
3. Inwazja roślin przez roztocza
UWAGA: Gdy dorosłe samice roztoczy wyzdrowieją, mogą być wykorzystane do infestacji roślin. Istnieją 2 metody stosowane do zarażania roślin doświadczalnych dorosłymi żeńskimi roztoczami: a) przy użyciu cienkiej szczotki (sekcja protokołu 3.1) i b) przy użyciu pompy lub przewodu próżniowego (sekcja protokołu 3.2).
<ol>
	<li>Inwazja roztoczy za pomocą szczotki 
	UWAGA: Inwazja przędziorków za pomocą pędzla służy do aplikacji do 30 roztoczy na roślinę.
	<ol>
		<li>Użyj pędzla artystycznego z miękkimi włosami w rozmiarze 00 lub mniejszym.</li>
		<li>Zwilż szczotkę wodą z kranu RT.</li>
		<li>Delikatnie zbierz roztocza z sitka za pomocą końcówki szczoteczki i przenieś je do rośliny.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Inwazja roztoczy za pomocą Pump 
	UWAGA: Porażenie roślin roztoczami zebranymi przez pompę/przewód próżniowy stosuje się, gdy stosuje się więcej niż 30 roztoczy. Do tej metody można użyć pompy próżniowej do pobierania komponentów mikroelektronicznych lub linii próżniowej. Ważne jest, aby przepływ powietrza był stały i miał wystarczającą siłę (2-4 psi).
	<ol>
		<li>Przymocuj końcówkę pipety o pojemności 1 ml do probówki, która łączy się z pompą lub przewodem próżniowym, używając rurki wirówkowej o pojemności 1,5 ml wyciętej na dole jako adapter między pompą/rurką próżniową a końcówką.</li>
		<li>Umieść kawałek ręcznika papierowego między końcówką pipety a adapterem (probówka wirówkowa o pojemności 1,5 ml). UWAGA: ma to na celu uwięzienie roztoczy wewnątrz końcówki pipety podczas procesu zasysania, a także zmniejszenie przepływu powietrza (rysunek 1C).</li>
		<li>Zbieraj roztocza bezpośrednio z sitka za pomocą końcówki pipety.</li>
		<li>Alternatywnie zbieraj roztocza jeden po drugim z porażonych liści za pomocą stereoskopu.</li>
		<li>Po zebraniu wymaganej liczby roztoczy wyjmij końcówkę pipety z tuby, upewniając się, że kawałek ręcznika papierowego z tyłu końcówki pipety nie jest naruszony.</li>
		<li>Zbierz roztocza, stukając w końcówkę pipety i zbijając roztocza razem. Następnie umieść je na liściu; W ciągu kilku sekund roztocza zaczną rozpraszać się na liściu.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
4. Rejestrowanie i ocena szkód wyrządzonych roślinom
<ol>
	<li>Rejestrowanie uszkodzeń instalacji 
	UWAGA: W przypadku A. thaliana uszkodzenia roślin ocenia się po 4 dniach żerowania roztoczy. Uszkodzenie jest rejestrowane jako całkowita powierzchnia plam chlorotycznych. W celu pomiaru uszkodzeń cała rozeta jest wycinana i skanowana. Opisane parametry skanowania dotyczą skanera Epson V30, ale będą stanowić dobry punkt wyjścia dla każdego podobnego skanera płaskiego. Utrzymuj stałe parametry skanowania dla wszystkich eksperymentów, co pozwala na porównanie między poszczególnymi przebiegami eksperymentów.
	<ol>
		<li>Przykryj łoże skanera arkuszem przezroczystości, aby zapobiec zanieczyszczeniu powierzchni skanera materiałem roślinnym.</li>
		<li>Wytnij całą rozetę i umieść ją na łożu skanera tak, aby adaksjalna (górna) strona liści była skierowana w stronę źródła światła skanera i elementu przechwytującego. Alternatywnie, jeśli rozety są zbyt gęste, aby uchwycić pojedyncze liście bez nakładania się, przed umieszczeniem na łóżku skanera rozeta powinna podzielić rozetę na pojedyncze liście lub grupy niezachodzących na siebie liści. Wiele rozet może być skanowanych jednocześnie.</li>
		<li>Przykryj rozety lub liście kawałkiem białego papieru, aby zapobiec przywieraniu i zanieczyszczeniu pokrywy skanera.</li>
		<li>Zamknij pokrywę skanera i wykonaj skanowanie z następującymi parametrami: Rozdzielczość: 1 200 dpi; Tryb koloru: Adobe RGB; Jasność: +25; Typ pliku: JPEG najwyższej jakości.</li>
		<li>Zapisz pliki obrazów do późniejszej analizy uszkodzeń.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Kwantyfikacja szkód w roślinach 
	UWAGA: Obszar uszkodzenia jest obliczany ręcznie za pomocą programu Photoshop. Ze względu na duże różnice w kształcie liści i intensywności koloru objawów w wyniku żerowania roztoczy, metody automatyczne były zawodne. W związku z tym do oceny szkód wyrządzonych przez rośliny stosuje się metodę siatki:
	<ol>
		<li>Otwórz obraz rośliny w Photoshopie.</li>
		<li>Utwórz nową warstwę, a następnie nałóż zeskanowany obraz na siatkę podziałów 0,25 mm x 0,25 mm (Widok lub Wyświetl – Pokaż – Siatka, skrót klawiaturowy Ctrl + ').</li>
		<li>Na nałożonej warstwie zaznacz uszkodzone obszary liści za pomocą kropki (użyj "Narzędzia ołówka", skrótu klawiaturowego B). Użyj jednej kropki na każdy kwadrat siatki, poniżej którego występują uszkodzenia pokrywające więcej niż połowę jednostki siatki. Rozmiar kropki jest zdefiniowany w pikselach (tj. 52 piksele na punkt).</li>
		<li>Gdy wszystkie kwadraty siatki, które pokazują uszkodzenia roślin pokrywające co najmniej połowę jednostki siatki, są oznaczone kropką, użyj narzędzia histogramu (Okno - Histogram), aby określić całkowitą liczbę pikseli na warstwie. Narzędzie histogramu pozwala zmierzyć liczbę pikseli. Ponieważ każda kropka jest reprezentowana przez stałą i znaną liczbę pikseli, narzędzie histogramu zmierzy całkowitą liczbę pikseli, reprezentującą całkowitą liczbę kropek, a co za tym idzie, całkowitą liczbę zaznaczonych kwadratów.</li>
		<li>Oblicz liczbę "kropek" oznaczonych za pomocą wzoru: 
		Liczba punktów = całkowita liczba pikseli/liczba pikseli na kropkę.</li>
		<li>Oblicz całkowity obszar uszkodzenia, mnożąc liczbę zaznaczonych punktów na obrazie przez powierzchnię 1 kwadratu siatki, ponieważ jedna kropka odpowiada jednemu kwadratowi siatki.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>

<ol><li>Jeppson, L. R., Keifer, H. H., Baker, E. W. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aJeppson%2C+LR+%22Mites+injurious+to+economic+plants%22">Mites injurious to economic plants</a>. , University of California Press. (1975).</li>
<li>Migeon, A., Dorkeld, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Spider+Mites+Web%3A+a+comprehensive+database+for+the+Tetranychidae%5BTitle%5D)+AND+%22http%3A%2F%2Fwww.montpellier.inra.fr%2FCBGP%2Fspmweb%22%5BJournal%5D)">Spider Mites Web: a comprehensive database for the Tetranychidae.</a> http://www.montpellier.inra.fr/CBGP/spmweb. , (2013).</li>
<li>Croft, B. A., Vandebaan, H. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ecological+and+Genetic-Factors+Influencing+Evolution+of+Pesticide+Resistance+in+Tetranychid+and+Phytoseiid+Mites%5BTitle%5D)+AND+%22Exp+Appl+Acarol%22%5BJournal%5D)">Ecological and Genetic-Factors Influencing Evolution of Pesticide Resistance in Tetranychid and Phytoseiid Mites.</a> Exp Appl Acarol. 4, 277-300 (1988).</li>
<li>Van Leeuwen, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mitochondrial+heteroplasmy+and+the+evolution+of+insecticide+resistance%3A+Non-Mendelian+inheritance+in+action%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Mitochondrial heteroplasmy and the evolution of insecticide resistance: Non-Mendelian inheritance in action.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 105, 5980-5985 (2008).</li>
<li>Van Leeuwen, T., Vontas, J., Tsagkarakou, A., Dermauw, W., Tirry, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Acaricide+resistance+mechanisms+in+the+two-spotted+spider+mite+Tetranychus+urticae+and+other+important+Acari%3A+A+review%5BTitle%5D)+AND+%22Insect+Biochem+Molec%22%5BJournal%5D)">Acaricide resistance mechanisms in the two-spotted spider mite Tetranychus urticae and other important Acari: A review.</a> Insect Biochem Molec. 40, 563-572 (2010).</li>
<li>Dermauw, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+cys-loop+ligand-gated+ion+channel+gene+family+of+Tetranychus+urticae%3A+Implications+for+acaricide+toxicology+and+a+novel+mutation+associated+with+abamectin+resistance%5BTitle%5D)+AND+%22Insect+Biochem+Molec%22%5BJournal%5D)">The cys-loop ligand-gated ion channel gene family of Tetranychus urticae: Implications for acaricide toxicology and a novel mutation associated with abamectin resistance.</a> Insect Biochem Molec. 42, 455-465 (2012).</li>
<li>Van Leeuwen, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Population+bulk+segregant+mapping+uncovers+resistance+mutations+and+the+mode+of+action+of+a+chitin+synthesis+inhibitor+in+arthropods%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences%22%5BJournal%5D)">Population bulk segregant mapping uncovers resistance mutations and the mode of action of a chitin synthesis inhibitor in arthropods.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences. 109, 4407-4412 (2012).</li>
<li>Dearden, P. K., Donly, C., Grbic, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Expression+of+pair-rule+gene+homologues+in+a+chelicerate%3A+early+patterning+of+the+two-spotted+spider+mite+Tetranychus+urticae%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Expression of pair-rule gene homologues in a chelicerate: early patterning of the two-spotted spider mite Tetranychus urticae.</a> Development. 129, 5461-5472 (2002).</li>
<li>Khila, A., Grbic, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Gene+silencing+in+the+spider+mite+Tetranychus+urticae%3A+dsRNA+and+siRNA+parental+silencing+of+the+Distal-less+gene%5BTitle%5D)+AND+%22Development+genes+and+evolution%22%5BJournal%5D)">Gene silencing in the spider mite Tetranychus urticae: dsRNA and siRNA parental silencing of the Distal-less gene.</a> Development genes and evolution. 217, 241-251 (2007).</li>
<li>Grbic, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mity+model%3A+Tetranychus+urticae%2C+a+candidate+for+chelicerate+model+organism%5BTitle%5D)+AND+%22BioEssays+%3A+news+and+reviews+in+molecular%2C+cellular+and+developmental+biology%22%5BJournal%5D)">Mity model: Tetranychus urticae, a candidate for chelicerate model organism.</a> BioEssays : news and reviews in molecular, cellular and developmental biology. 29, 489-496 (2007).</li>
<li>Grbic, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+genome+of+Tetranychus+urticae+reveals+herbivorous+pest+adaptations%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">The genome of Tetranychus urticae reveals herbivorous pest adaptations.</a> Nature. 479, 487-492 (2011).</li>
<li>Kliebenstein, D., Pedersen, D., Barker, B., Mitchell-Olds, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comparative+analysis+of+quantitative+trait+loci+controlling+glucosinolates%2C+myrosinase+and+insect+resistance+in+Arabidopsis+thaliana%5BTitle%5D)+AND+%22Genetics%22%5BJournal%5D)">Comparative analysis of quantitative trait loci controlling glucosinolates, myrosinase and insect resistance in Arabidopsis thaliana.</a> Genetics. 161, 325-332 (2002).</li>
<li>Abe, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Function+of+jasmonate+in+response+and+tolerance+of+Arabidopsis+to+thrip+feeding%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+%26+cell+physiology%22%5BJournal%5D)">Function of jasmonate in response and tolerance of Arabidopsis to thrip feeding.</a> Plant & cell physiology. 49, 68-80 (2008).</li>
<li>Whiteman, N. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mining+the+plant-herbivore+interface+with+a+leafmining+Drosophila+of+Arabidopsis%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+ecology%22%5BJournal%5D)">Mining the plant-herbivore interface with a leafmining Drosophila of Arabidopsis.</a> Molecular ecology. 20, 995-1014 (2011).</li>
<li>Goodspeed, D., Chehab, E. W., Min-Venditti, A., Braam, J., Covington, M. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Arabidopsis+synchronizes+jasmonate-mediated+defense+with+insect+circadian+behavior%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Arabidopsis synchronizes jasmonate-mediated defense with insect circadian behavior.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 109, 4674-4677 (2012).</li>
<li>Kim, J. H., Lee, B. W., Schroeder, F. C., Jander, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+of+indole+glucosinolate+breakdown+products+with+antifeedant+effects+on+Myzus+persicae+%28green+peach+aphid%29%5BTitle%5D)+AND+%22The+Plant+journal+%3A+for+cell+and+molecular+biology%22%5BJournal%5D)">Identification of indole glucosinolate breakdown products with antifeedant effects on Myzus persicae (green peach aphid).</a> The Plant journal : for cell and molecular biology. 54, 1015-1026 (2008).</li>
<li>Adio, A. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Biosynthesis+and+defensive+function+of+Ndelta-acetylornithine%2C+a+jasmonate-induced+Arabidopsis+metabolite%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+Cell%22%5BJournal%5D)">Biosynthesis and defensive function of Ndelta-acetylornithine, a jasmonate-induced Arabidopsis metabolite.</a> Plant Cell. 23, 3303-3318 (2011).</li>
<li>Li, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+tomato+homolog+of+CORONATINE-INSENSITIVE1+is+required+for+the+maternal+control+of+seed+maturation%2C+jasmonate-signaled+defense+responses%2C+and+glandular+trichome+development%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+Cell%22%5BJournal%5D)">The tomato homolog of CORONATINE-INSENSITIVE1 is required for the maternal control of seed maturation, jasmonate-signaled defense responses, and glandular trichome development.</a> Plant Cell. 16, 126-143 (2004).</li>
<li>Kant, M. R., Ament, K., Sabelis, M. W., Haring, M. A., Schuurink, R. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Differential+timing+of+spider+mite-induced+direct+and+indirect+defenses+in+tomato+plants%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+Physiol%22%5BJournal%5D)">Differential timing of spider mite-induced direct and indirect defenses in tomato plants.</a> Plant Physiol. 135, 483-495 (2004).</li>
<li>Schneider, C. A., Rasband, W. S., Eliceiri, K. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((NIH+Image+to+ImageJ%3A+25+years+of+image+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Methods%22%5BJournal%5D)">NIH Image to ImageJ: 25 years of image analysis.</a> Nat Methods. 9, 671-675 (2012).</li>
</ol>

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Ten film pokazuje protokoły stosowane do izolowania i zarażania roślin dużą liczbą dorosłych żeńskich roztoczy. Chociaż przedstawiliśmy ten protokół przy użyciu A. thaliana, może on być stosowany w dowolnym systemie interakcji roślina-przędziorek, a obecnie jest z powodzeniem stosowany również na roślinach pomidorów i winorośli (Vitis vinifera). Protokół daje powtarzalne wyniki, wskazujące, że zebrane roztocza są w porównywalnym stanie fizjologicznym (ryc. 3).
<p class="jove_content...

Interakcja między roślinami a szkodnikami to temat o dużym znaczeniu naukowym i ekonomicznym. Historycznie badano go zarówno przy użyciu roślin uprawnych (takich jak pomidor), jak i rośliny modelowej, A. thaliana. W obu przypadkach podatność roślin na zwierzęta roślinożerne można zmierzyć albo bezpośrednio poprzez ocenę fenotypu rośliny po ataku roślinożerców, albo pośrednio poprzez ocenę wydajności agrofagów.
Bezpośrednie pomiary podatności roślin były wcześniej wykorzystywane dla wielu gatunków szkodników owadzich przy użyciu różnych metod. Na przykład roślinożerność larw lepidoptera mierzy się jako oszacowanie porcji tkanki roślinnej spożywanej przez Plutella xylostella (diamentowa) lub Trichoplusia ni (chwytacz kapusty) gołym okiem za pomocą siatki12. Istnieją również metody, które wykorzystują cyfrowe obrazowanie uszkodzeń liści z późniejszą ilościową analizą obrazu. Metody te zastosowano w badaniach interakcji A. thaliana z Frankliniella occidentalis (wciornastki zachodnie)13, Scaptomyza flava (drosophila kopiąca liście)14 i T. ni15.
Pośrednie pomiary podatności roślin są szeroko stosowane w badaniach interakcji między roślinami a szkodnikami. Na przykład podatność A. thaliana na mszycę brzoskwiniową Myzus persicae roślinożerną jest zwykle oceniana poprzez analizę płodności szkodników i opis ogólnej morfologii rośliny po interakcji16,17. Innym typowym pośrednim wskaźnikiem podatności A. thaliana na agrofaga jest ocena suchej lub mokrej masy roślinożercy. Parametr ten jest powszechnie stosowany do charakterystyki roślinożerności lepidotera, takich jak Pieris rapae (mały biały), P. xylostella lub T. ni w stadium larwalnym lub poczwarkowym15,17.
Przędziorki żywią się zawartością komórkową. Uszkodzenia wywołane przez roztocza są rozpoznawane jako zbiór chlorotycznych plam o kolorze od białego do bladozielonego. Podatność żywiciela rośliny na roślinożerność przędziorków była wcześniej oceniana albo pośrednio, poprzez analizę wydajności przędziorków w ciągu kilku dni po inwazji18,19, albo bezpośrednio przy użyciu ogólnej morfologii roślin kilka tygodni po inwazji18 lub przy użyciu cyfrowego obrazowania liści wystawionych na działanie roztoczy przez kilka dni z późniejszą automatyczną analizą obrazu19. Metody te były opracowywane i wykorzystywane do badań interakcji między roślinami pomidora a T. urticae i zazwyczaj wykorzystywały niewielką liczbę przędziorków (5-15 na zabieg), które zbierano z mieszanej populacji roztoczy i umieszczano na powierzchni liści za pomocą szczotki z miękkiego włosia. Jednak metody te nie nadają się do badań, w których konieczne jest zastosowanie większej liczby roztoczy. Ponadto, podczas gdy bezpośrednie przetwarzanie obrazów liści w oprogramowaniu do analizy obrazu, takim jak Adobe Photoshop (San Jose, CA) lub ImageJ20, może być wykorzystywane do analizy uszkodzeń pomidorów, protokoły te wymagają modyfikacji, aby można je było zastosować do liści, które mają większy współczynnik odbicia powierzchni lub są lekko zabarwione i mają dobrze widoczne trichomy (np. A. thaliana), które zakłócają automatyczną selekcję chlorotycznych plam oznaczających uszkodzenie rośliny. Co więcej, stadium rozwojowe przędziorków, które można łatwo wykorzystać poprzednimi metodami, jest ograniczone do najbardziej rozpowszechnionych i łatwych do zidentyfikowania dorosłych samic i wyklucza wykorzystanie innych etapów rozwojowych.
Pierwszym krytycznym krokiem w kierunku wysokoprzepustowej analizy interakcji roślina-przędziorek jest ustanowienie powtarzalnych, prostych i solidnych protokołów do walki z przędziorkami i wiarygodnej oceny wyników interakcji.
W tym filmie opisana jest skuteczna metoda szybkiego i łatwego zbierania dużej liczby dorosłych samic roztoczy, ich zastosowanie na eksperymentalnym żywicielu rośliny, oraz ocena szkód spowodowanych żerowaniem przędziorków. Przedstawiony protokół umożliwia szybkie i efektywne pobranie setek osobników na każdym etapie rozwoju (jaja, larwy, nimfy, dorosłe samce i samice), które mogą być wykorzystane do późniejszej aplikacji eksperymentalnej. Ponadto protokoły te można zastosować do dowolnej rośliny żywicielskiej roztoczy, ale są one wyraźnie wykazane w przypadku A. thaliana.

<table><tbody><tr><td>Materiał roślinny:</td><td></td><td></td><td></td></tr> <tr><td>kalifornijska czerwona fasola</td><td>Stokes, Thorold, ON, Kanada</td><td></td><td>2 tygodnie, dobrze zaatakowana przędziorkami 2 lub 3 dni przed użyciem. Można stosować inne odmiany Phaseolus vulgaris.</td></tr><tr><td>Chemikalia:</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Tween 20</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P9416</td><td>1% roztwór podstawowy jest przygotowany w celu uproszczenia porcjowania</td></tr><tr><td>Woda</td><td></td><td></td> z kranu <td>W temperaturze pokojowej szok cieplny i zimny wpływa na przeżywalność i wydajność roztoczy</td></tr><tr><td>Inne materiały i sprzęt:</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Plastikowa taca</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Zestaw nożyczek</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Zlewki</td><td></td><td></td><td></td>2 L</tr><tr><td>Ręczniki</td><td></td><td></td><td></td>papierowe</tr><tr><td>Zestawy sit</td><td>Wyprodukowano we własnym zakresie</td><td></td><td>Dostępne są szczegółowe instrukcje</td></tr><tr><td>Cienka szczoteczka</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Pipety</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Końcówki</td><td></td><td></td> do pipet <td>0,2 i 1 ml</td></tr><tr><td>Probówki wirówkowe 1,5 ml</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Pompa</td><td></td><td></td> powietrza <td>Pompa typu akwariowego z odwróconym przepływem powietrza. Można użyć linii próżniowej. Wymagany spadek ciśnienia wynosi ok. 2-4 psi</td></tr><tr><td>Skaner stereoskopowy</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td>Epson</td><td>V30</td><td>Każdy skaner płaski umożliwiający niezbędny stopień kontroli nad jakością skanowania. Do naszych eksperymentów używamy Epson V30.</td></tr><tr><td>Komputer</td><td></td><td></td> z <td>systemem Windows lub OS X, który jest kompatybilny ze skanerem i oprogramowaniem Adobe Photoshop.</td></tr><tr><td>Oprogramowanie Adobe Photoshop</td><td>Adobe Systems Inc., San Jose, CA, USA</td><td>różne</td><td>Dowolna wersja z dołączonym narzędziem Histogram.</td></tr></tbody></table>

zastosowanie przędziorków dwuplamistych tetranychus urticae do badań interakcji między roślinami a szkodnikami

Application of Two-spotted Spider Mite Tetranychus urticae for Plant-pest Interaction Studies

Przędziorek dwuplamisty, Tetranychus urticae, jest wszechobecnym polifagicznym stawonogiem roślinożercą, który żywi się niezwykle szerokim wachlarzem gatunków, z ponad 150 wartościami ekonomicznymi. Jest głównym szkodnikiem upraw szklarniowych, zwłaszcza psiankowatych i dyniowatych (np. pomidorów, bakłażanów, papryki, ogórków, cukinii) i roślin ozdobnych szklarniowych (np. róż, chryzantem, goździków), jednorocznych upraw polowych (takich jak kukurydza, bawełna, soja i buraki cukrowe) oraz w uprawach wieloletnich (lucerna, truskawki, winogrona, cytrusy i śliwki)1,2. Oprócz ekstremalnej polifagii, która czyni go ważnym szkodnikiem rolniczym, T. urticae ma tendencję do rozwijania odporności na szeroką gamę insektycydów i akarycydów, które są stosowane do jego zwalczania3-7.
T. urticae jest doskonałym organizmem doświadczalnym, ponieważ ma szybki cykl życia (7 dni w temperaturze 27 °C) i może być łatwo utrzymywany w dużym zagęszczeniu w laboratorium. Opracowano metody oznaczania ekspresji genów (w tym hybrydyzacji in situ i barwienia przeciwciał) oraz inaktywacji ekspresji endogennych genów przędziorków za pomocą interferencji RNA8-10. Ostatnio opisano sekwencję całego genomu T. urticae, co stworzyło okazję do rozwoju tego roślinożercy jako organizmu modelowego o równoważnych zasobach genomowych, które już istnieją w niektórych roślinach żywicielskich (Arabidopsis thaliana i pomidor Solanum lycopersicum)11. Łącznie te organizmy modelowe mogą dostarczyć informacji na temat molekularnych podstaw interakcji między roślinami a szkodnikami.
Tutaj opisana jest skuteczna metoda szybkiego i łatwego zbierania dużej liczby dorosłych samic roztoczy, ich zastosowania na eksperymentalnym żywicielu rośliny, oraz oceny uszkodzeń roślin spowodowanych żerowaniem przędziorków. Przedstawiony protokół umożliwia szybkie i efektywne pobranie setek osobników na każdym etapie rozwoju (jaja, larwy, nimfy, dorosłe samce i samice), które mogą być wykorzystane do późniejszej aplikacji eksperymentalnej.

Wykorzystując od 20 do 30 zainfekowanych roślin fasoli, można zebrać około 2 000 dorosłych samic roztoczy za pomocą sit. Czas potrzebny na zainfekowanie 10 roślin przez 20 roztoczy na roślinę wynosi około 15 min w przypadku użycia pędzelka do przenoszenia roztoczy. Połączenia metod zbierania i aplikacji przedstawiono na Rysunku 2.
Niniejszy protokół pozwala na uzyskanie powtarzalnych wyników w zakresie uszkodzeń roślin, wykazując, że zebrane roztocza znajdują się w podobnym st...

Opracowano protokoły do efektywnego przygotowania jednorodnych próbek przędziorków, inwazji eksperymentalnych roślin i oceny uszkodzeń roślin, wymaganych do badań interakcji roślina-szkodnik.

Zastosowanie przędziorków dwuplamistych Tetranychus urticae do badań interakcji między roślinami a szkodnikami

The two-spotted spider mite, Tetranychus urticae, is a ubiquitous polyphagous arthropod herbivore that feeds on a remarkably broad array of species, with ...

Ogólnym celem niniejszej procedury jest szybkie i niezawodne pozyskanie przędziorków na określoną stadię rozwojową. Osiąga się to poprzez uprzednie namnożenie przędziorków na roślinach fasoli. Następnie roślinę eksperymentalną zakaża się samicami przędziorków za pomocą pędzelka lub pompy, w zależności od liczby osobników, które mają zostać naniesione na pojedynczą roślinę.Ostatnim krokiem jest ręczna kwantyfikacja uszkodzeń roślin z wykorzystaniem metody siatki w programie do edycji grafiki. Ostatecznie stosuje się analizę statystyczną, aby wykazać różnice w podatności poszczególnych linii lub ekotypów roślin na żerowanie przędziorków. Główną zaletą tej techniki w porównaniu z istniejącymi metodami jest zapewnienie wydajnego sposobu szybkiego i łatwego gromadzenia dużej liczby dorosłych samic przędziorków, ich aplikacja na eksperymentalną roślinę żywiciela oraz ocena uszkodzeń rośliny spowodowanych żerowaniem roztoczy.Przedstawiony protokół umożliwia szybkie i wydajne pozyskanie setek osobników na dowolnym etapie rozwoju, które mogą zostać wykorzystane w późniejszych zastosowaniach eksperymentalnych. Aby rozpocząć, należy wyhodować rośliny fasoli czerwonej z Kalifornii z nasion przez dwa do trzech tygodni przed infestacją, a następnie wymieszać je z roślinami zainfekowanymi. Dorosłe roztocza szybko skolonizują świeży materiał roślinny.Co siedem do 10 dni usuwaj stare, zainfekowane rośliny fasoli i zastępuj je nowymi roślinami, aby zebrać roztocza metodą płukania. Jeden do dwóch dni przed eksperymentem umieść zdrową roślinę fasoli w kontakcie z roślinami zainfekowanymi. Wykorzystaj od 20 do 30 zdrowych roślin fasoli, aby zebrać od 1000 do 2000 dorosłych samic roztoczy.W dniu eksperymentu odetnij rośliny fasoli zaatakowane przez roztocza u podstawy, a następnie myj zainfekowane rośliny fasoli, po dwie lub trzy sztuki naraz, w 0.001% roztworze tween 20. Każdą roślinę należy umyć dwa lub trzy razy, aby zebrać wszystkie roztocza z liści.Prace należy przeprowadzić w ciągu 10 minut, aby uniknąć śmiertelności roztoczy. Następnie należy przygotować sito o oczkach 500 µm do usunięcia zanieczyszczeń oraz sito o oczkach 300 µm do wyłapania dorosłych samic roztoczy. Zawiesinę należy przefiltrować przez sito 500 µm, a następnie ponownie przefiltrować ją przez sito 300 µm.Dorosłe samice roztoczy zostają zatrzymane, jeśli w sicie nagromadzi się zbyt dużo piany. W takim przypadku można je delikatnie wypłukać pod wolnym strumieniem wody z kranu w temperaturze pokojowej. Zanurz sito o oczkach 300 µm z dorosłymi samicami roztoczy w czystej wodzie z kranu, aby usunąć Tween 20, a następnie rozłóż roztocza w jednej warstwie na dnie sita.Użyj ręcznika papierowego, aby usunąć nadmiar wody z siatki i boków sita, tak aby roztocza mogły szybko wyschnąć i dojść do siebie. Następnie umieść sito z roztoczami na górze sita służącego jako podpora. Otocz dolne sito wodą, aby zapobiec rozprzestrzenianiu się roztoczy.Umożliwi to swobodne poruszanie się roztoczy, jednocześnie zapobiegając ich ucieczce. Do aplikacji do 30 roztoczy na roślinę wykorzystuje się metodę szczotkową. Należy użyć miękkiego, okrągłego pędzla artystycznego w rozmiarze 00 lub mniejszym.Zmocz pędzel w wodzie z kranu o temperaturze pokojowej. Za pomocą końcówki pędzla delikatnie zbierz roztocza z sita i przenieś je na roślinę. W przypadku zastosowania więcej niż 30 roztoczy, zebranych za pomocą linii odsysającej pompy próżniowej, uzyskuje się infekcję rośliny.W tej metodzie należy przymocować końcówkę pipety o pojemności 1 ml do rurki podłączonej do pompy lub linii próżniowej, wykorzystując do tego probówkę wirówkową o pojemności 1,5 ml. Odciętą część probówki należy zastosować jako adapter między rurką próżniową pompy a końcówką, a pomiędzy końcówką pipety a adapterem należy umieścić kawałek ręcznika papierowego. Ma to na celu zatrzymanie roztoczy wewnątrz końcówki pipety podczas procesu aspiracji, a także zmniejszenie przepływu powietrza, aby umożliwić bezpośrednie zbieranie roztoczy z sita za pomocą końcówki pipety.Alternatywnie można zbierać roztocza pojedynczo z zainfekowanych liści przy użyciu stereoskopu. Po zebraniu wymaganej liczby roztoczy należy wyjąć końcówkę pipety z probówki, dbając o to, aby kawałek ręcznika papierowego znajdujący się z tyłu końcówki pipety pozostał nienaruszony.Zbierz roztocza, delikatnie uderzając końcówką pipety, aby skupić je w jedną grupę. Następnie umieść je na liściu. W ciągu kilku sekund roztocza zaczną rozprzestrzeniać się po powierzchni liścia.Aby zarejestrować uszkodzenia rośliny, należy przykryć szybę skanera folią przeźroczystą, aby zapobiec zanieczyszczeniu powierzchni urządzenia materiałem roślinnym. Wyciąć całą rozetę i umieścić ją na szybie skanera.Strona adaksjalna liści powinna być skierowana w stronę skanera. Dzięki źródłu światła i elementowi rejestrującemu można skanować jednocześnie wiele rozet. Alternatywnie, jeśli rozety są zbyt gęste, aby zarejestrować pojedyncze liście bez ich nakładania się, należy przed umieszczeniem ich na skanerze podzielić rozetę na pojedyncze liście lub grupy liści, które się nie nakładają, używając do tego precyzyjnych nożyczek.Przykryj rozetki lub liście kawałkiem białego papieru, aby zapobiec ich przywieraniu do pokrywy skanera oraz zanieczyszczeniu urządzenia. Zamknij pokrywę skanera i wykonaj skanowanie z rozdzielczością 1 200 DPI, jasnością ustawioną na +25 oraz typem pliku JPEG w maksymalnej jakości. Zapisz pliki obrazów do późniejszej analizy uszkodzeń.Aby określić stopień uszkodzenia rośliny, otwórz obraz rośliny w programie Photoshop. Utwórz nową warstwę. Następnie nałóż na zeskanowany obraz siatkę o oczkach 25 mm na 25 mm.Podziały 25 milimetrów na nałożonej warstwie. Oznacz uszkodzone obszary liścia kropką za pomocą narzędzia ołówka. Postaw jedną kropkę w każdym kwadracie poniższej siatki, w którym uszkodzenie obejmuje więcej niż połowę jednostki siatki.Rozmiar kropki jest określony w pikselach. Po zaznaczeniu kropką wszystkich pól siatki, w których uszkodzenia roślin obejmują co najmniej połowę jednostki siatki, wykorzystano narzędzie histogramu, aby określić liczbę pikseli na warstwie reprezentującej liczbę kropek, a tym samym całkowitą liczbę zaznaczonych pól.Oblicz liczbę zaznaczonych punktów, dzieląc całkowitą liczbę pikseli przez liczbę pikseli przypadających na jeden punkt. Oblicz całkowitą powierzchnię uszkodzeń, mnożąc liczbę zaznaczonych punktów na obrazie przez powierzchnię kwadratu siatki, przyjmując, że jeden punkt odpowiada jednemu kwadratowi siatki. Wykres ten przedstawia powierzchnię uszkodzeń zmierzoną u trzytygodniowych roślin AANA.Cztery dni po naniesieniu 20 samic przędziorków. Wyniki uszkodzeń roślin są powtarzalne, co wykazuje, że zebrane przędziorki znajdują się w podobnym stanie fizjologicznym i nadają się do badań nad interakcjami między rośliną a przędziorkami. Wykres ten przedstawia powierzchnię uszkodzeń zmierzoną na trzytygodniowych roślinach AANA cztery dni po naniesieniu 20 samic przędziorków.Jako przykład zastosowania eksperymentalnego, oceniono naturalną zmienność i podatność na przędziorki w trzech sesjach poprzez naniesienie 20 samic przędziorków na roślinę za pomocą mokrego pędzla i odnotowanie uszkodzeń cztery dni po infestacji. Ilościowe dane dotyczące uszkodzeń można przedstawić w formie wykresu słupkowego lub wykresu pudełkowego oraz przeanalizować za pomocą odpowiedniej metody statystycznej. W tym przykładzie podatność na przędziorki różni się znacząco pomiędzy sesjami.Etapy izolacji i infestacji można przeprowadzić w ciągu 30 minut, w zależności od liczby próbek i wybranego schematu pracy. Należy pamiętać, że roztocza nie powinny przebywać w roztworze 20 przez więcej niż 10 minut. Izolacja z wykorzystaniem systemu przesiewowego może służyć do uzyskiwania frakcji roztoczy na różnych etapach rozwoju, co można wykorzystać w wielu eksperymentach, nie tylko w dziedzinie interakcji między szkodnikiem a rośliną, ale także w fizjologii rozwoju i biologii molekularnej.

application-two-spotted-spider-mite-tetranychus-urticae-for-plant

Research

JoVE Journal

Environment

Środowisko

Zastosowanie przędziorka dwuplamkowatego Tetranychus urticae do badań nad interakcjami roślina-szkodnik

Niniejszy artykuł demonstruje i omawia techniki stosowane do badania wrażliwości na pestycydy oraz wykrywania oporności na pestycydy kontaktowe i systemiczne u szkodników z grupy stawonogów.

Bioanalizy w monitorowaniu oporności na insektycydy

Niniejszy film wyjaśnia mechanizmy odporności rośliny żywicielskiej na roślinożerność oraz demonstruje test bez wyboru (no-choice test), który pozwala oszacować względny wkład antybiozy i tolerancji w odporność gatunków Brachiaria na spittlebugi.

Charakterystyka mechanizmów odporności na roślinożerców: przykład pluskwiaków piankowych na gatunkach Brachiaria

Ten manuskrypt opisuje wielospektralny czujnik optyczny, który skutecznie wykrywał uszkodzenia bawełny na początku sezonu, sztucznie zainfekowanej różnymi gęstościami populacji przędziorków dwuplamistych.

Teledetekcyjna ocena uszkodzeń przędziorków dwuplamistych na bawełnie szklarniowej

Tutaj opisujemy różne etapy związane z opartym na wiedzy rozwojem skutecznego środka mykosektycydowego, w tym izolację, identyfikację, badania przesiewowe i wybór "najlepiej dopasowanego" grzyba entomopatogenicznego, Metarhizium anisopliae, do zwalczania szkodników owadzich w rolnictwie.

Rozwój Metarhizium anisopliae jako mykosektycydu: od izolacji do wydajności polowej

Tablice życia pozwalają na ilościowe określenie źródeł i wskaźników śmiertelności w populacjach owadów oraz przyczyniają się do zrozumienia, przewidywania i manipulowania dynamiką populacji w agroekosystemach. Przedstawiono metody prowadzenia i analizy kohortowych tablic trwania życia w terenie dla owadów z siedzącymi niedojrzałymi stadiami życia.

Metodyka opracowywania tablic życia owadów siedzących w terenie z wykorzystaniem mączlika (Bemisia tabaci) w układzie bawełnianym jako systemu modelowego

Prezentowany tutaj jest protokół do określania liczby wciornastków i drobnych drapieżników owadów pirackich w uprawach w wielu terminach w doświadczeniach polowych. Przedstawiono również, w jaki sposób określić skuteczność taktyki zarządzania przeciwko wciornastkom i ocenić korzyści płynące z drapieżnictwa przez drobne robaki pirackie.

Pobieranie próbek w celu oszacowania gatunków Frankliniella, wciornastków kwiatowych i drapieżników z gatunku Orius w doświadczeniach terenowych

Micro-CT to nieniszczące narzędzie, które może analizować struktury roślin w trzech wymiarach. Niniejszy protokół opisuje przygotowanie próbki w celu wykorzystania mikro-CT do analizy struktury i funkcji roślin pasożytniczych. Aby podkreślić zalety tej metody w połączeniu z określonymi preparatami, stosuje się różne gatunki.

Wykorzystanie mikrotomografii komputerowej do analizy interakcji pasożytniczych między rośliną a żywicielem

Ten protokół przedstawia zoptymalizowany system testów biologicznych z oderwanymi liśćmi do oceny skuteczności grzybów entomopatogenicznych (EPF) przeciwko mszycy musztardowej (Lipaphis erysimi (Kalt.)), owadowi partenogenetycznemu. Metoda ta przedstawia w zarysie proces gromadzenia danych podczas eksperymentów na szalce Petriego, umożliwiając naukowcom konsekwentne mierzenie zjadliwości EPF wobec mszyc musztardowych i innych owadów partenogenetycznych.

Ocena wpływu mszyc grzybów entomopatogenicznych na owada partenogenetycznego, mszycę musztardową, Lipaphis erysimi (Kalt.)

Tutaj prezentujemy protokół ekstrakcji jadu z Trichogramma dendrolimi za pomocą sztucznego gospodarza stworzonego z folii polietylenowej i roztworu aminokwasów.

Ekstrakcja jadu z pasożytniczej osy Trichogramma dendrolimi przy użyciu sztucznego żywiciela

Protokół testu biologicznego z oderwanymi liśćmi został opracowany dla masowej hodowli wciornastków chili przy użyciu zmodyfikowanej metody oderwanych liści w szklanych pojemnikach zawierających agar, zapewniając wysoką przeżywalność i zsynchronizowany rozwój. System ten umożliwia skuteczne badania przesiewowe zjadliwości grzybów entomopatogenicznych przeciwko larwom w drugimstadium rozwojowym i zapewnia niezawodne dostarczanie wciornastków do ocen laboratoryjnych, szklarniowych i terenowych.

Ustanowienie systemu hodowli wciornastków chili (Scirtothrips dorsalis hood) do badań przesiewowych zjadliwości grzybów entomopatogenicznych

Poznaj protokoły zbierania przędziorków dwuplamistych Tetranychus urticae, infestacji roślin oraz kwantyfikacji uszkodzeń metodą siatki. Techniki te usprawniają badania interakcji roślina-szkodnik w entomologii.

Zastosowanie przędziorków dwuplamistych Tetranychus urticae do badań interakcji między roślinami a szkodnikami

Przeglądaj więcej filmów