Zastosowanie przędziorków dwuplamistych Tetranychus urticae do badań interakcji między roślinami a szkodnikami

Ogólnym celem niniejszej procedury jest szybkie i niezawodne pozyskanie przędziorków na określoną stadię rozwojową. Osiąga się to poprzez uprzednie namnożenie przędziorków na roślinach fasoli. Następnie roślinę eksperymentalną zakaża się samicami przędziorków za pomocą pędzelka lub pompy, w zależności od liczby osobników, które mają zostać naniesione na pojedynczą roślinę.

Ostatnim krokiem jest ręczna kwantyfikacja uszkodzeń roślin z wykorzystaniem metody siatki w programie do edycji grafiki. Ostatecznie stosuje się analizę statystyczną, aby wykazać różnice w podatności poszczególnych linii lub ekotypów roślin na żerowanie przędziorków. Główną zaletą tej techniki w porównaniu z istniejącymi metodami jest zapewnienie wydajnego sposobu szybkiego i łatwego gromadzenia dużej liczby dorosłych samic przędziorków, ich aplikacja na eksperymentalną roślinę żywiciela oraz ocena uszkodzeń rośliny spowodowanych żerowaniem roztoczy.

Przedstawiony protokół umożliwia szybkie i wydajne pozyskanie setek osobników na dowolnym etapie rozwoju, które mogą zostać wykorzystane w późniejszych zastosowaniach eksperymentalnych. Aby rozpocząć, należy wyhodować rośliny fasoli czerwonej z Kalifornii z nasion przez dwa do trzech tygodni przed infestacją, a następnie wymieszać je z roślinami zainfekowanymi. Dorosłe roztocza szybko skolonizują świeży materiał roślinny.

Co siedem do 10 dni usuwaj stare, zainfekowane rośliny fasoli i zastępuj je nowymi roślinami, aby zebrać roztocza metodą płukania. Jeden do dwóch dni przed eksperymentem umieść zdrową roślinę fasoli w kontakcie z roślinami zainfekowanymi. Wykorzystaj od 20 do 30 zdrowych roślin fasoli, aby zebrać od 1000 do 2000 dorosłych samic roztoczy.

W dniu eksperymentu odetnij rośliny fasoli zaatakowane przez roztocza u podstawy, a następnie myj zainfekowane rośliny fasoli, po dwie lub trzy sztuki naraz, w 0.001% roztworze tween 20. Każdą roślinę należy umyć dwa lub trzy razy, aby zebrać wszystkie roztocza z liści.

Prace należy przeprowadzić w ciągu 10 minut, aby uniknąć śmiertelności roztoczy. Następnie należy przygotować sito o oczkach 500 µm do usunięcia zanieczyszczeń oraz sito o oczkach 300 µm do wyłapania dorosłych samic roztoczy. Zawiesinę należy przefiltrować przez sito 500 µm, a następnie ponownie przefiltrować ją przez sito 300 µm.

Dorosłe samice roztoczy zostają zatrzymane, jeśli w sicie nagromadzi się zbyt dużo piany. W takim przypadku można je delikatnie wypłukać pod wolnym strumieniem wody z kranu w temperaturze pokojowej. Zanurz sito o oczkach 300 µm z dorosłymi samicami roztoczy w czystej wodzie z kranu, aby usunąć Tween 20, a następnie rozłóż roztocza w jednej warstwie na dnie sita.

Użyj ręcznika papierowego, aby usunąć nadmiar wody z siatki i boków sita, tak aby roztocza mogły szybko wyschnąć i dojść do siebie. Następnie umieść sito z roztoczami na górze sita służącego jako podpora. Otocz dolne sito wodą, aby zapobiec rozprzestrzenianiu się roztoczy.

Umożliwi to swobodne poruszanie się roztoczy, jednocześnie zapobiegając ich ucieczce. Do aplikacji do 30 roztoczy na roślinę wykorzystuje się metodę szczotkową. Należy użyć miękkiego, okrągłego pędzla artystycznego w rozmiarze 00 lub mniejszym.

Zmocz pędzel w wodzie z kranu o temperaturze pokojowej. Za pomocą końcówki pędzla delikatnie zbierz roztocza z sita i przenieś je na roślinę. W przypadku zastosowania więcej niż 30 roztoczy, zebranych za pomocą linii odsysającej pompy próżniowej, uzyskuje się infekcję rośliny.

W tej metodzie należy przymocować końcówkę pipety o pojemności 1 ml do rurki podłączonej do pompy lub linii próżniowej, wykorzystując do tego probówkę wirówkową o pojemności 1,5 ml. Odciętą część probówki należy zastosować jako adapter między rurką próżniową pompy a końcówką, a pomiędzy końcówką pipety a adapterem należy umieścić kawałek ręcznika papierowego. Ma to na celu zatrzymanie roztoczy wewnątrz końcówki pipety podczas procesu aspiracji, a także zmniejszenie przepływu powietrza, aby umożliwić bezpośrednie zbieranie roztoczy z sita za pomocą końcówki pipety.

Alternatywnie można zbierać roztocza pojedynczo z zainfekowanych liści przy użyciu stereoskopu. Po zebraniu wymaganej liczby roztoczy należy wyjąć końcówkę pipety z probówki, dbając o to, aby kawałek ręcznika papierowego znajdujący się z tyłu końcówki pipety pozostał nienaruszony.

Zbierz roztocza, delikatnie uderzając końcówką pipety, aby skupić je w jedną grupę. Następnie umieść je na liściu. W ciągu kilku sekund roztocza zaczną rozprzestrzeniać się po powierzchni liścia.

Aby zarejestrować uszkodzenia rośliny, należy przykryć szybę skanera folią przeźroczystą, aby zapobiec zanieczyszczeniu powierzchni urządzenia materiałem roślinnym. Wyciąć całą rozetę i umieścić ją na szybie skanera.

Strona adaksjalna liści powinna być skierowana w stronę skanera. Dzięki źródłu światła i elementowi rejestrującemu można skanować jednocześnie wiele rozet. Alternatywnie, jeśli rozety są zbyt gęste, aby zarejestrować pojedyncze liście bez ich nakładania się, należy przed umieszczeniem ich na skanerze podzielić rozetę na pojedyncze liście lub grupy liści, które się nie nakładają, używając do tego precyzyjnych nożyczek.

Przykryj rozetki lub liście kawałkiem białego papieru, aby zapobiec ich przywieraniu do pokrywy skanera oraz zanieczyszczeniu urządzenia. Zamknij pokrywę skanera i wykonaj skanowanie z rozdzielczością 1 200 DPI, jasnością ustawioną na +25 oraz typem pliku JPEG w maksymalnej jakości. Zapisz pliki obrazów do późniejszej analizy uszkodzeń.

Aby określić stopień uszkodzenia rośliny, otwórz obraz rośliny w programie Photoshop. Utwórz nową warstwę. Następnie nałóż na zeskanowany obraz siatkę o oczkach 25 mm na 25 mm.

Podziały 25 milimetrów na nałożonej warstwie. Oznacz uszkodzone obszary liścia kropką za pomocą narzędzia ołówka. Postaw jedną kropkę w każdym kwadracie poniższej siatki, w którym uszkodzenie obejmuje więcej niż połowę jednostki siatki.

Rozmiar kropki jest określony w pikselach. Po zaznaczeniu kropką wszystkich pól siatki, w których uszkodzenia roślin obejmują co najmniej połowę jednostki siatki, wykorzystano narzędzie histogramu, aby określić liczbę pikseli na warstwie reprezentującej liczbę kropek, a tym samym całkowitą liczbę zaznaczonych pól.

Oblicz liczbę zaznaczonych punktów, dzieląc całkowitą liczbę pikseli przez liczbę pikseli przypadających na jeden punkt. Oblicz całkowitą powierzchnię uszkodzeń, mnożąc liczbę zaznaczonych punktów na obrazie przez powierzchnię kwadratu siatki, przyjmując, że jeden punkt odpowiada jednemu kwadratowi siatki. Wykres ten przedstawia powierzchnię uszkodzeń zmierzoną u trzytygodniowych roślin AANA.

Cztery dni po naniesieniu 20 samic przędziorków. Wyniki uszkodzeń roślin są powtarzalne, co wykazuje, że zebrane przędziorki znajdują się w podobnym stanie fizjologicznym i nadają się do badań nad interakcjami między rośliną a przędziorkami. Wykres ten przedstawia powierzchnię uszkodzeń zmierzoną na trzytygodniowych roślinach AANA cztery dni po naniesieniu 20 samic przędziorków.

Jako przykład zastosowania eksperymentalnego, oceniono naturalną zmienność i podatność na przędziorki w trzech sesjach poprzez naniesienie 20 samic przędziorków na roślinę za pomocą mokrego pędzla i odnotowanie uszkodzeń cztery dni po infestacji. Ilościowe dane dotyczące uszkodzeń można przedstawić w formie wykresu słupkowego lub wykresu pudełkowego oraz przeanalizować za pomocą odpowiedniej metody statystycznej. W tym przykładzie podatność na przędziorki różni się znacząco pomiędzy sesjami.

Etapy izolacji i infestacji można przeprowadzić w ciągu 30 minut, w zależności od liczby próbek i wybranego schematu pracy. Należy pamiętać, że roztocza nie powinny przebywać w roztworze 20 przez więcej niż 10 minut. Izolacja z wykorzystaniem systemu przesiewowego może służyć do uzyskiwania frakcji roztoczy na różnych etapach rozwoju, co można wykorzystać w wielu eksperymentach, nie tylko w dziedzinie interakcji między szkodnikiem a rośliną, ale także w fizjologii rozwoju i biologii molekularnej.