Immunofluorescencyjna metoda charakteryzacji komórek przełyku Barretta

Ogólnym celem poniższego eksperymentu jest ocena wpływu leczenia farmakologicznego na strukturę komórkową i lokalizację białek w komórkach BE. Osiąga się to poprzez inkubację komórek BE wyhodowanych na szklanych szkiełkach nakrywkowych z wybranym lekiem w standardowych warunkach hodowli komórkowej. W drugim kroku należy inkubować leczone komórki z utrwalaczem, który zachowuje strukturę i lokalizację białka.

Następnie utrwalone komórki BE są inkubowane sekwencyjnie z pierwszorzędowymi i znakowanymi fluorescencyjnie przeciwciałami drugorzędowymi w celu wizualizacji zmian w wybranym białku docelowym za pomocą mikroskopii fluorescencyjnej, uzyskuje się wyniki, które pokazują, jak leczenie farmakologiczne komórek BE zmienia lokalizację białka i strukturę komórki w oparciu o wizualizację barwienia immunofluorescencyjnego. Chociaż ta metoda może zapewnić wgląd w przełyk Barretta, może być również stosowana do innych systemów, w tym raka i normalnych komórek. Rozpocznij tę procedurę od umieszczenia 18-milimetrowych szkiełek nakrywkowych na szklanej szalce Petriego i przelać je w autoklawie.

Następnie przenieś szkiełka nakrywkowe autoklawu do 12-dołkowego naczynia do hodowli tkankowych za pomocą sterylnej szklanej pipety podłączonej do rurki próżniowej. Po tym umyciu okładka ślizga się ze sterylnym PBS i pożywką. Następnie trypsyna.

Unieśmiertelnione komórki liczą komórki za pomocą automatycznego licznika komórek lub cytometru hemo, a następnie rozcieńczają komórki w pożywce hodowlanej do stężenia od 20 000 do 40 000 komórek na mililitr. Następnie umieść jeden mililitr komórek w każdej studzience zawierającej szkiełko nakrywkowe. Aby uzyskać całkowitą liczbę komórek od 20 000 do 40 000 komórek na studzienkę, użyj sterylnej końcówki pipety, aby delikatnie docisnąć szkiełko nakrywkowe do dna studzienki, aby upewnić się, że komórki przyczepią się do szkiełka nakrywkowego.

Aby leczyć komórki BE, rozcieńczyć wybrany lek w pożywce o temperaturze 37 stopni Celsjusza do pożądanego stężenia, dobrze wymieszając, kilkakrotnie odwracając probówkę lub używając mieszalnika wirowego. Rozpocznij leczenie 24 godziny po początkowym umieszczeniu komórek BE, aby umożliwić przymocowanie komórek do okładki Slip teraz wstępnie oznaczone płytki próbek leku i nośnika za pomocą pisaka laboratoryjnego, aby odróżnić porównanie od kontroli. Na dodatkowym szkiełku nakrywkowym komórek B należy potraktować 0,1% nośnikiem rozcieńczonym w pożywce hodowlanej.

Następnie umieść komórki w inkubatorze do hodowli komórkowych w temperaturze 37 stopni Celsjusza, 5% dwutlenku węgla i wilgotności 98%. Teraz, po pożądanym czasie inkubacji leczenia farmakologicznego, odessać pożywkę i szybko zmyć szkiełka nakrywkowe jednym XPBS w temperaturze pokojowej. Następnie odessać PBS i dodać jeden mililitr PBS zawierającego 4% PFA do każdej studzienki i inkubować w temperaturze pokojowej przez 30 minut.

Następnie zassać 4%P-F-A-P-B-S Umyj szkiełka z pokrywy trzy razy po pięć minut, za każdym razem za pomocą PBS w temperaturze pokojowej. W razie potrzeby przechowuj szkiełka nakrywkowe przez tydzień w PBS i 0,1% PFA w temperaturze czterech stopni Celsjusza. Aby przepuszczalne oczy, utrwalone komórki PFA, aby umożliwić przeciwciału dostęp do celów wewnątrzkomórkowych, inkubować komórki z 50 milimolowym chlorkiem amonu rozcieńczonym w PBS przez 10 minut w temperaturze pokojowej.

Następnie umyj je PBS o temperaturze pokojowej raz przez pięć minut. Zmniejszy to tło, aby zapobiec niespecyficznemu wiązaniu przeciwciał z białkami komórkowymi. Inkubować komórki BE przez 30 minut w 100 do 300 mikrolitrach PBS zawierających 0,1% troponiny i 0,5% BSA.

Następnie przygotuj kwadratowe naczynie do testów biologicznych, układając dno komory mokrymi ręcznikami papierowymi i kładąc warstwę perfum na wierzchu. Oznacz perfumy pisakiem laboratoryjnym, aby zidentyfikować szkiełka nakrywkowe. Delikatnie przenieś komórki szkiełek osłonowych skierowane do góry na parametr za pomocą kleszczy i igły strzykawki.

Teraz rozcieńczyć pierwszorzędowe przeciwciało w PBS zawierające zarówno 0,5% BSA, jak i 0,1% saponiny, delikatnie usunąć roztwór blokujący. Używając tkanki laboratoryjnej, dodaj 100 mikrolitrów roztworu przeciwciała pierwszorzędowego i inkubuj komórki przez noc w temperaturze czterech stopni Celsjusza. Następnego dnia.

Umyć szkiełka trzykrotnie PBS zawierającym 0,5% BSA i 0,1% troponiny przez pięć minut za każdym razem w temperaturze pokojowej. Następnie rozcieńczyć przeciwciało drugorzędowe sprzężone ze znacznikiem fluorescencyjnym w PBS zawierającym 0,5% BSA i 0,1% ponentu. Dodać 100 mikrolitrów rozcieńczonego przeciwciała do każdego szkiełka nakrywkowego i inkubować komórki przez dwie godziny w temperaturze pokojowej Po dwóch godzinach.

Umyj szkiełka nakrywkowe trzy razy po pięć minut, za każdym razem w PBS zawierającym 0,5% BSA i 0,1% troponiny. Usunąć bufor do płukania i dodać od 100 do 300 mikrolitrów PBS do szkiełek nakrywkowych. Delikatnie podnieś szkiełko nakrywkowe za pomocą kleszczyków i zetrzyj PBS za pomocą chusteczki laboratoryjnej lub ręcznika papierowego.

Następnie dodać 15 mikrolitrów odpowiedniego nośnika montażowego Antify zawierającego DPI do szkiełka nakrywkowego. Umieść odwrócone szkiełko nakrywkowe na szklanym szkiełku mikroskopowym komórkami skierowanymi w dół. Następnie umieść szkiełka w folderze na szkiełka i trzymaj je z dala od bezpośredniego światła przez noc w temperaturze pokojowej, aby umożliwić utwardzenie się podłoża Antify.

Po związaniu podłoża Antify preparaty można przechowywać w temperaturze czterech stopni Celsjusza lub minus 20 stopni Celsjusza do czasu wizualizacji mikroskopowej. Na tym etapie wyjmij szkiełka do przechowywania z minus 20 stopni Celsjusza lub czterech stopni Celsjusza i pozwól im ogrzać się do temperatury pokojowej. Włącz mikroskop i rtęciową lampę łukową.

Umieść szkiełko mikroskopowe z szkiełkiem nakrywkowym skierowanym w stronę obiektywu na stoliku mikroskopu. Następnie wybierz filtr DAPI i otwórz migawkę. Ustaw ostrość obiektywu, patrząc przez okulary, aż pojawi się obraz.

Ponieważ wszystkie komórki zostały wybarwione dpi, jądra powinny być łatwo obserwowane. Zbierz obrazy za pomocą odpowiedniego oprogramowania do przetwarzania obrazu, na tym rysunku szkiełka nakrywkowe z CPC i CPD były traktowane nośnikiem lub jednym mikromolowym inhibitorem SRC. SKI 6 0 6 przez 24 godziny be komórki zostały następnie utrwalone i wybarwione.

Zgodnie z opisanym protokołem, beta-katenina oznaczona kolorem zielonym została uwidoczniona przy użyciu specyficznego przeciwciała i przeciwciała drugorzędowego sprzężonego z LOR 4 88, podczas gdy jądro wybarwiono DPI oznaczonym kolorem niebieskim. Zwróć uwagę na zmianę lokalizacji beta-kateniny od jądra do błony komórkowej. Po leczeniu preparatem SKI 6 0 6.

Po obejrzeniu tego filmu powinieneś dobrze zrozumieć, jak immunoenzymacyjnie barwić przełyk Barretta w celu zbadania lokalizacji białka lub struktury komórki.