Name: Procedura małej objętości do pomiaru stężenia wirusa z wody (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2015-02-03T13:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 28 s
Description: Poznaj metodę małej objętości do koncentracji adenowirusa z wody przy użyciu szklanego filtru celulozowego i techniki wtórnej koncentracji Sea Light. Technika ta umożliwia szybką ocenę zmiennych koncentracji w próbkach wody kranowej.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

Chcielibyśmy podziękować Dr. Nicholasowi J. Ashboltowi i Dr. G. Shay Foutowi za ich recenzję manuskryptu.

1. Przygotowanie szkła i obudów filtrów
<ol style="margines po lewej: 40px;">
	<li>O ile nie zaznaczono inaczej, sterylizować wszystkie naczynia szklane, obudowy filtrów i roztwory w temperaturze 121 °C przez 15 minut. Aby zapewnić sterylność, przed sterylizacją zakryj wszystkie otwory lub odsłonięte powierzchnie folią aluminiową lub papierem zabezpieczonym taśmą.</li>
	<li>Zmontować aparat filtracyjny, mocując obudowę filtra (średnica 47 mm) do kolby Erlenmeyera z ramieniem bocznym o pojemności 1 l. Wymagane filtry zbiorcze: Elektrododatnie/elektroujemne filtry tarczowe o średnicy 47 mm.</li>
	<li>Przygotować 1 l 1,5% ekstraktu wołowego (flokulującego; wytwarzającego cząsteczki kłaczków, gdy pH roztworu jest obniżone do 3,5 lub nieflokulującego; który nie agreguje się przy pH 3,5), z 0,05 M glicyny, rozpuszczając 15 g ekstraktu wołowego w 1 l wody dejonizowanej i dodając 3,75 g glicyny. 
	UWAGA: Ekstrakty wołowe nieflokulujące będą wymagały dodania celitu przed trzecim zagęszczeniem.</li>
	<li>Dodać dodatek elucji polifosforan sodu do ekstraktu wołowego w stężeniu 0,1%.</li>
	<li>Dodaj 1 M roztwór kwasu solnego, kroplami, do mieszania ekstraktu wołowego, roztwór pH do pożądanego pH. Ekstrakt wołowy w autoklawie przez 15-30 min w temperaturze 121 °C.</li>
	<li>Odmierz 0,1 g drobnego, średniego lub dużego cellitu (do stosowania tylko z ekstraktem wołowym bez flokulacji).</li>
	<li>Przygotować podciśnienie/ssanie, podłączając kompatybilne rurki do kolby bocznej Erlenmeyera i do wylotu podciśnienia.</li>
</ol>
2. Przygotowanie roztworów i zapasów wirusów
<ol style="margines po lewej: 40px;">
	<li>Przygotować 1 l 1 M HCl.</li>
	<li>Przygotować 1 l 1 M NaOH.</li>
	<li>Przygotować 1x roztwór PBS (137 mM NaCl, 2,7 mM KCl, 1,47 mM K2PO4 i 4,3 mM NaH2PO4).
	<ol>
		<li>Dostosuj pH 1x PBS do 9,0 za pomocą 1 M NaOH.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Przygotować i rozcieńczyć wirusa podstawowego do 10 4-105 najbardziej prawdopodobnej liczby (MPN) ml-1, mieszając 1 ml wirusa podstawowego z 9 ml PBS (pH 7), jak opisano poprzednio 8,13. Przechowywać w temperaturze -80 °C w 1 ml porcji.
	<ol>
		<li>Sterylizuj zapas wirusa za pomocą filtrowania strzykawkowego (wielkość porów 0,22 μm) w celu usunięcia potencjalnych zanieczyszczeń.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Odchlorowana woda z kranu
	<ol>
		<li>Odmierz 1 l sterylnej wody z kranu za pomocą sterylnego cylindra z podziałką i wlej do 2-litrowej zlewki zawierającej mieszadło magnetyczne.</li>
		<li>Dodać 0,7 g tiosiarczanu sodu i mieszać, aż granulki się rozpuszczą. W razie potrzeby dostosuj pH wody z kranu do 7-7,5, używając 1 M roztworu HCl lub 1 M NaOH.</li>
		<li>Rozmrozić nakłucie wirusa (1 ml) i dodać całą objętość kolca do 1 l odchlorowanej, sterylnej wody z kranu. Mieszaj przez 10 minut.</li>
		<li>Przygotować ślepą próbę metody (odchlorowana woda z kranu bez adenowirusa) przy każdym doświadczeniu i przetwarzać w taki sam sposób, jak w przypadku próbki wzbogaconej.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
3. Przygotowanie aparatury filtrującej Millipore
<ol style="margines po lewej: 40px;">
	<li>Usuń sterylną osłonę z obudowy filtra. Upewnij się, że górna miska obudowy filtra jest prawidłowo dopasowana do dolnego sitka filtra, aby uniknąć wycieku próbki podczas filtracji.</li>
	<li>Usunąć sterylną pokrywę z 1 l kolby Erlenmeyera. Upewnij się, że korek jednostki filtrującej ściśle przylega do górnego otworu kolby Erlenmeyera, tworząc dobre uszczelnienie.</li>
	<li>Wyjmij górną miskę jednostki filtrującej z dolnego sitka filtra i umieść elektrododatni dysk filtra o średnicy 47 mm prostopadle na sicie za pomocą sterylnych kleszczyków. Przymocuj miskę obudowy filtra do dolnej osłony i zablokuj na miejscu, przekręcając w kierunku przeciwnym do ruchu wskazówek zegara.</li>
</ol>
4. Filtracja wody z kranu (stężenie pierwotne)
<ol style="margines po lewej: 40px;">
	<li>Odmierz 100 ml wody z kranu z dodatkiem wirusa za pomocą sterylnego cylindra z podziałką.</li>
	<li>Wlej 100 ml wzbogaconej wirusem wody z kranu do obudowy filtra zawierającej plisowany filtr szklano-celulozowy o średnicy 47 mm lub filtr tarczowy z nanotlenku glinu/włókna szklanego.</li>
	<li>Pozwól, aby woda powoli przepływała przez filtr. Zastosuj delikatne odkurzenie, aby usunąć pozostałe pozostałości wody z kranu z powierzchni filtra.</li>
	<li>W przypadku stosowania trypsyny dodaj 5 ml 0,25% trypsyny do powierzchni filtrującej i inkubuj przez 5 minut.</li>
	<li>Umyj trypsynę z powierzchni filtra za pomocą 50 ml sterylnej wody dejonizowanej.</li>
</ol>
5. Usuwanie wirusa z filtra
<ol style="margines po lewej: 40px;">
	<li>Wyjąć obudowę filtra z 2-litrowej kolby Erlenmeyera i umieścić ją w kolbie bocznej o pojemności 250 ml.</li>
	<li>Odmierz 100 ml ekstraktu wołowego za pomocą cylindra miarowego. Powoli wlej 100 ml ekstraktu wołowego do obudowy filtra.</li>
	<li>Pozwolić, aby ekstrakt wołowy przelał się przez filtr, wychwytując ekstrakt wołowy w małej (250 ml) kolbie Erlenmeyera. Zastosuj próżnię, aby przeciągnąć resztki ekstraktu wołowego z filtra.</li>
</ol>
6. Drugorzędna koncentracja celitu
<ol style="margines po lewej: 40px;">
	<li>Przenieść kolby zawierające wymyte wirusy na płytkę mieszającą. Dodaj sterylny magnetyczny pręt mieszający i umieść na talerzu mieszającym, mieszając, aby uzyskać lekki wir.</li>
	<li>Dodać 0,1 g proszku celite do 100 ml ekstraktu z wołowiny i pozostawić celite do rozproszenia. Umieść sterylną sondę pH w ekstrakcie wołowym.</li>
	<li>Dodaj kroplami 1 M HCl do ekstraktu wołowego, aby osiągnąć pH 4,0. Pozostaw do powolnego mieszania przez 10 minut.</li>
	<li>Umieścić filtr wstępny o średnicy 47 mm na obudowie filtra (jak opisano powyżej) za pomocą kolby Erlenmeyera o pojemności 2 l.</li>
	<li>Wlej 100 ml mieszanki ekstraktu wołowego i celitu przez filtr wstępny. Pozwól, aby ekstrakt wołowy się przelał. Zastosuj lekkie podciśnienie, aby przeciągnąć resztki ekstraktu wołowego z filtra.</li>
	<li>Umieść metalowy zacisk rurki na końcu wylewki obudowy filtra. Przymocuj sterylną probówkę do zbierania polipropylenu o pojemności 15 ml do metalowego klipsa do probówki. Umieścić obudowę filtra z powrotem w kolbie Erlenmeyera.</li>
	<li>Dodać 5 ml 1x buforu PBS o pH 9,0 nad kelitem zebranym na filtrze wstępnym.</li>
	<li>Poczekaj, aż PBS przepłynie przez filtr wstępny. Zastosuj lekkie podciśnienie, aby przeciągnąć resztki PBS do 15 ml probówki zbiorczej.</li>
</ol>
7. Wtórne stężenie flokulacji organicznej
<ol style="margines po lewej: 40px;">
	<li>Przenieść zlewki zawierające wymytego wirusa na płytkę mieszającą. Dodaj sterylne mieszadło magnetyczne do 100 ml ekstraktu wołowego i wymieszaj, aby uzyskać lekki wir.</li>
	<li>Umieść sterylną sondę pH w ekstrakcie wołowym.</li>
	<li>Dodaj kroplami 1 M HCl do ekstraktu wołowego i dostosuj pH do 3,5. Mieszaj przez 30 min.</li>
	<li>Wlać eluat do stożkowych probówek wirówek o pojemności 250 ml i odwirować przy 2 500 x g przez 15 minut w temperaturze 4 °C.</li>
	<li>Odlewać supernatant uważając, aby nie uszkodzić osadu. Zawiesić osad w 5 ml 1x PBS, pH 9.</li>
	<li>Odwirować zawiesinę o sile 4 000 x g przez 10 minut w temperaturze 4 °C. Odlać supernatant i wyrzucić osad.</li>
	<li>Ustawić pH na 7-7,5, przefiltrować, wysterylizować przez filtr strzykawkowy 0,22 μm i zamrozić w temperaturze -80 °C.</li>
</ol>
8. Ekstrakcja wirusowych kwasów nukleinowych
<ol style="margines po lewej: 40px;">
	<li>Ekstrahuj wirusowe kwasy nukleinowe za pomocą odpowiedniego zestawu handlowego zgodnie z instrukcjami producenta.</li>
</ol>
9. AdV 40/41 qPCR
<ol style="margines po lewej: 40px;">
	<li>Stosować startery i sondy, a także profile mieszania reakcyjnego i cykli termicznych, jak opublikowano 8,13. 
	UWAGA: Szacowana granica wykrywalności dla testu wynosi około 5 jednostek qPCR na reakcję.</li>
	<li>Dodać składniki mieszanin amplifikacyjnych PCR w stężeniach w następujący sposób: 10 mM Tris (pH 8,3), 50 mM KCl, 4,5 mM MgCl2, 10 mM dNTPs, 10 μM starterów i 1 μM sondy oraz 0,5 μl polimerazy, tak aby końcowe objętości 45 μl można było dodać do odpowiedniej liczby dołków w 96-dołkowej płytce reakcyjnej PCR.</li>
	<li>Załadować 45 μl mieszaniny amplifikacyjnej PCR do każdego odpowiedniego dołka 96-dołkowej płytki do szybkiej reakcji PCR.</li>
	<li>Dodać 5 μl wyekstrahowanej próbki DNA do odpowiednich dołków płytki PCR.</li>
	<li>Przykryj płytkę z żaroodporną uszczelką pokrywy, obróć płytkę, aby przesunąć wszelkie kropelki na dno dołków płytki PCR.</li>
	<li>Ustaw cykle amplifikacji PCR w następujący sposób: 95 °C przez 10 minut, a następnie 40 cykli po 95 °C przez 15 sekund i 60 °C przez 1 minutę.</li>
</ol>
10. Analizy danych
<ol style="margines po lewej: 40px;">
	<li>Przeanalizować trzykrotne pomiary seryjnych 5-krotnych rozcieńczeń próbek w zakresie rozcieńczeń od 1:5 do 1:625 w celu określenia najbardziej prawdopodobnej liczby (MPN) cząstek wirusa, jak opisano wcześniej 8,13.</li>
	<li>Analizuj seryjne 5-krotne rozcieńczenia eksperymentalnych kolców adenowirusa w zakresie rozcieńczeń od 1:5 do 1:15,625 w celu określenia najbardziej prawdopodobnej liczby (MPN) cząstek wirusa.</li>
	<li>Korzystając z kalkulatora EPA MPN (http://www.epa.gov/nerlcwww/online.html), dostosuj kalkulator tak, aby uwzględniał rodzaj rozcieńczenia (1:5 lub 1:10), liczbę przeprowadzonych rozcieńczeń oraz liczbę powtórzonych próbek w serii rozcieńczeń.</li>
	<li>Wykonaj transformację danych w logarytmie10, a następnie znormalizuj do jednostki objętości (np. 1 ml, 100 ml itd.). Oblicz odzysk dla danego eksperymentu, dzieląc liczbę cząstek wirusa obecnych w koncentratach próbek przez liczbę cząstek wirusa obecnych w skokach doświadczalnych.</li>
	<li>Oceń wpływ różnych zmiennych eksperymentalnych (np. różne typy kalorii, zakresy pH, różne typy filtrów i różne techniki stężeń wtórnych) na odzysk AdV, wykonując parametryczne lub nieparametryczne testy statystyczne (np. sparowany test t, jedno- lub dwuczynnikowa ANOVA) w zależności od rozkładu danych i projektu eksperymentalnego.</li>
</ol>

<ol><li>Sinclair, R. G., Jones, E. L., Gerba, C. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Viruses+in+recreational+water-borne+disease+outbreaks%3A+a+review%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Applied+Microbiology%22%5BJournal%5D)">Viruses in recreational water-borne disease outbreaks: a review.</a> Journal of Applied Microbiology. 107, 1769-1780 (2009).</li>
<li>WHO. Guidelines for Safe Recreational Water Environments. , World Health Organization. Geneva. (2003).</li>
<li>Westrell, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Norovirus+outbreaks+linked+to+oyster+consumption+in+the+United+Kingdom%5BTitle%5D)+AND+%22Euro+Surveillance+%3A+Bulletin+Europeen+Sur+les+Maladies+Transmissibles+%3D+European+Communicable+Disease+Bulletin%22%5BJournal%5D)">Norovirus outbreaks linked to oyster consumption in the United Kingdom.</a> Euro Surveillance : Bulletin Europeen Sur les Maladies Transmissibles = European Communicable Disease Bulletin. 15, Norway, France, Sweden and Denmark. (2010).</li>
<li>Wong, K., Fong, T. T., Bibby, K., Molina, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Application+of+enteric+viruses+for+fecal+pollution+source+tracking+in+environmental+waters%5BTitle%5D)+AND+%22Environment+International%22%5BJournal%5D)">Application of enteric viruses for fecal pollution source tracking in environmental waters.</a> Environment International. 45, 151-164 (2012).</li>
<li>Cashdollar, J. L., Wymer, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Methods+for+primary+concentration+of+viruses+from+water+samples%3A+a+review+and+meta-analysis+of+recent+studies%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Applied+Microbiology%22%5BJournal%5D)">Methods for primary concentration of viruses from water samples: a review and meta-analysis of recent studies.</a> Journal of Applied Microbiology. 115, 1-11 (2013).</li>
<li>Ikner, L. A., Soto-Beltran, M., Bright, K. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((New+method+using+a+positively+charged+microporous+filter+and+ultrafiltration+for+concentration+of+viruses+from+tap+water%5BTitle%5D)+AND+%22Applied+and+Environmental+Microbiology%22%5BJournal%5D)">New method using a positively charged microporous filter and ultrafiltration for concentration of viruses from tap water.</a> Applied and Environmental Microbiology. 77, 3500-3506 (2011).</li>
<li>Karim, M. R., Rhodes, E. R., Brinkman, N., Wymer, L., Fout, G. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((New+electropositive+filter+for+concentrating+enteroviruses+and+noroviruses+from+large+volumes+of+water%5BTitle%5D)+AND+%22Applied+and+Environmental+Microbiology%22%5BJournal%5D)">New electropositive filter for concentrating enteroviruses and noroviruses from large volumes of water.</a> Applied and Environmental Microbiology. 75, 2393-2399 (2009).</li>
<li>McMinn, B. R., Cashdollar, J. L., Grimm, A. C., Fout, G. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Evaluation+of+the+celite+secondary+concentration+procedure+and+an+alternate+elution+buffer+for+the+recovery+of+enteric+adenoviruses+40+and+41%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Virological+Methods%22%5BJournal%5D)">Evaluation of the celite secondary concentration procedure and an alternate elution buffer for the recovery of enteric adenoviruses 40 and 41.</a> Journal of Virological Methods. 179, 423-428 (2012).</li>
<li>Katzenelson, E., Fattal, B., Hostovesky, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Organic+flocculation%3A+an+efficient+second-step+concentration+method+for+the+detection+of+viruses+in+tap+water%5BTitle%5D)+AND+%22Applied+and+Environmental+Microbiology%22%5BJournal%5D)">Organic flocculation: an efficient second-step concentration method for the detection of viruses in tap water.</a> Applied and Environmental Microbiology. 32, 638-639 (1976).</li>
<li>Fout, G. S., Schaefer, F. W. 3rd, Messer, J. W., Dahling, D. R. ICR microbial laboratory manual. 178, US Environmental Protection Agency. Washington, D.C. (1996).</li>
<li>Calgua, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Development+and+application+of+a+one-step+low+cost+procedure+to+concentrate+viruses+from+seawater+samples%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Virological+Methods%22%5BJournal%5D)">Development and application of a one-step low cost procedure to concentrate viruses from seawater samples.</a> Journal of Virological Methods. 153, 79-83 (2008).</li>
<li>Calgua, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Detection+and+quantification+of+classic+and+emerging+viruses+by+skimmed-milk+flocculation+and+PCR+in+river+water+from+two+geographical+areas%5BTitle%5D)+AND+%22Water+Research%22%5BJournal%5D)">Detection and quantification of classic and emerging viruses by skimmed-milk flocculation and PCR in river water from two geographical areas.</a> Water Research. 47, 2797-2810 (2013).</li>
<li>McMinn, B. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Optimization+of+adenovirus+40+and+41+recovery+from+tap+water+using+small+disk+filters%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Virological+Methods%22%5BJournal%5D)">Optimization of adenovirus 40 and 41 recovery from tap water using small disk filters.</a> Journal of Virological Methods. 193 (2), 284-290 (2013).</li>
<li>Brinkman, N. E., Haffler, T. D., Cashdollar, J. L., Rhodes, E. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Evaluation+of+methods+using+celite+to+concentrate+norovirus%2C+adenovirus+and+enterovirus+from+wastewater%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Virological+Methods%22%5BJournal%5D)">Evaluation of methods using celite to concentrate norovirus, adenovirus and enterovirus from wastewater.</a> Journal of Virological Methods. 193, 140-146 (2013).</li>
<li>Albinsson, B., Kidd, A. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Adenovirus+type+41+lacks+an+RGD+alpha%28v%29-integrin+binding+motif+on+the+penton+base+and+undergoes+delayed+uptake+in+A549+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Virus+Research%22%5BJournal%5D)">Adenovirus type 41 lacks an RGD alpha(v)-integrin binding motif on the penton base and undergoes delayed uptake in A549 cells.</a> Virus Research. 64, 125-136 (1999).</li>
<li>He, C., Lian, J. S., Jiang, Q. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Electronic+structures+and+hydrogen+bond+network+of+high-density+and+very+high-density+amorphous+ices%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Physical+Chemistry.+B%22%5BJournal%5D)">Electronic structures and hydrogen bond network of high-density and very high-density amorphous ices.</a> The Journal of Physical Chemistry. B. 109, 19893-19896 (2005).</li>
<li>Sedmak, G., Bina, D., Macdonald, J., Couillard, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nine-year+study+of+the+occurrence+of+culturable+viruses+in+source+water+for+two+drinking+water+treatment+plants+and+the+influent+and+effluent+of+a+Wastewater+Treatment+Plant+in+Milwaukee%2C+Wisconsin%5BTitle%5D)+AND+%22%22%5BJournal%5D)">Nine-year study of the occurrence of culturable viruses in source water for two drinking water treatment plants and the influent and effluent of a Wastewater Treatment Plant in Milwaukee, Wisconsin.</a> 71, 1042-1050 (2005).</li>
<li>Soto-Beltran, M., Ikner, L. A., Bright, K. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effectiveness+of+poliovirus+concentration+and+recovery+from+treated+wastewater+by+two+electropositive+filter+methods%5BTitle%5D)+AND+%22Food+and+Environmental+Virology%22%5BJournal%5D)">Effectiveness of poliovirus concentration and recovery from treated wastewater by two electropositive filter methods.</a> Food and Environmental Virology. 5, 91-96 (2013).</li>
<li>Haramoto, E., Katayama, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Application+of+acidic+elution+to+virus+concentration+using+electropositive+filters%5BTitle%5D)+AND+%22Food+and+Environmental+Virology%22%5BJournal%5D)">Application of acidic elution to virus concentration using electropositive filters.</a> Food and Environmental Virology. 5, 77-80 (2013).</li>
<li>Lee, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Evaluation+of+electropositive+filtration+for+recovering+norovirus+in+water%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Water+and+Health%22%5BJournal%5D)">Evaluation of electropositive filtration for recovering norovirus in water.</a> Journal of Water and Health. 9, 27-36 (2011).</li>
<li>Gibbons, C. D., Rodriguez, R. A., Tallon, L., Sobsey, M. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Evaluation+of+positively+charged+alumina+nanofibre+cartridge+filters+for+the+primary+concentration+of+noroviruses%2C+adenoviruses+and+male-specific+coliphages+from+seawater%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Applied+Microbiology%22%5BJournal%5D)">Evaluation of positively charged alumina nanofibre cartridge filters for the primary concentration of noroviruses, adenoviruses and male-specific coliphages from seawater.</a> Journal of Applied Microbiology. 109, 635-641 (2010).</li>
<li>Hill, V. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Development+of+a+rapid+method+for+simultaneous+recovery+of+diverse+microbes+in+drinking+water+by+ultrafiltration+with+sodium+polyphosphate+and+surfactants%5BTitle%5D)+AND+%22Applied+and+Environmental+Microbiology%22%5BJournal%5D)">Development of a rapid method for simultaneous recovery of diverse microbes in drinking water by ultrafiltration with sodium polyphosphate and surfactants.</a> Applied and Environmental Microbiology. 71, 6878-6884 (2005).</li>
<li>Polaczyk, A. L., Roberts, J. M., Hill, V. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Evaluation+of+1MDS+electropositive+microfilters+for+simultaneous+recovery+of+multiple+microbe+classes+from+tap+water%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Microbiological+Methods%22%5BJournal%5D)">Evaluation of 1MDS electropositive microfilters for simultaneous recovery of multiple microbe classes from tap water.</a> Journal of Microbiological Methods. 68, 260-266 (2007).</li>
<li>Rhodes, E. R., Hamilton, D. W., See, M. J., Wymer, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Evaluation+of+hollow-fiber+ultrafiltration+primary+concentration+of+pathogens+and+secondary+concentration+of+viruses+from+water%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Virological+Methods%22%5BJournal%5D)">Evaluation of hollow-fiber ultrafiltration primary concentration of pathogens and secondary concentration of viruses from water.</a> Journal of Virological Methods. 176, 38-45 (2011).</li>
<li>Melnick, J. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Round+robin+investigation+of+methods+for+the+recovery+of+poliovirus+from+drinking+water%5BTitle%5D)+AND+%22Applied+and+Environmental+Microbiology%22%5BJournal%5D)">Round robin investigation of methods for the recovery of poliovirus from drinking water.</a> Applied and Environmental Microbiology. 47, 144-150 (1984).</li>
<li>Schwab, K. J., De Leon, R., Sobsey, M. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Concentration+and+purification+of+beef+extract+mock+eluates+from+water+samples+for+the+detection+of+enteroviruses%2C+hepatitis+A+virus%2C+and+Norwalk+virus+by+reverse+transcription-PCR%5BTitle%5D)+AND+%22Applied+and+Environmental+Microbiology%22%5BJournal%5D)">Concentration and purification of beef extract mock eluates from water samples for the detection of enteroviruses, hepatitis A virus, and Norwalk virus by reverse transcription-PCR.</a> Applied and Environmental Microbiology. 61, 531-537 (1995).</li>
</ol>

Brak sprzecznych interesów finansowych. 
Poglądy wyrażone w tym artykule są poglądami autorów i niekoniecznie odzwierciedlają poglądy lub politykę Agencji Ochrony Środowiska Stanów Zjednoczonych. Wzmianka o nazwach handlowych lub produktach komercyjnych nie stanowi poparcia ani rekomendacji do użycia.

Filtry elektrododatnie są przydatne w zagęszczaniu wirusów z wody; Filtry te mogą jednak różnić się strukturą i składem, co z kolei może zmienić ich skuteczność. Problem ten potęguje fakt, że struktury i ładunki kapsydu różnią się w zależności od szczepu wirusa, co wymaga dostosowania technik koncentracji w celu zapewnienia optymalnego powrotu do zdrowia 15. Dzięki prostym modyfikacjom istniejących technik zagęszczania (np. filtry elektrododatnie, elucja ekstraktu wołowego) można osiągnąć bardziej efe...

Ludzkie wirusy jelitowe są ważnymi czynnikami wywołującymi choroby przenoszone przez wodę 1-3, ale zazwyczaj występują w niewielkich ilościach w skażonych wodach środowiska, co utrudnia ich wykrycie bez stężenia. Procedury stosowane do koncentracji wirusów zazwyczaj obejmują etap filtracji, po którym następuje elucja filtra i wtórne zagęszczenie eluatu z filtra. Powszechna procedura filtracji opiera się na użyciu naładowanych membran, takich jak filtry elektrododatnie (ostatnio omówione w 4,5). Filtry te polegają na wychwytywaniu wirusów zawieszonych w wodzie za pomocą oddziaływań elektrostatycznych między powierzchnią filtra (naładowaną dodatnio) a docelowymi cząstkami wirusa (naładowanymi ujemnie). Dwa filtry elektrododatnie, które są dostępne na rynku, opierają się na tej technologii, filtry szkło/celuloza i filtry nano-tlenku glinu/włókna szklanego. Koszty filtrów szkło/celuloza są do 10 razy wyższe niż w przypadku nanotlenku glinu/włókna szklanego, co ogranicza użycie filtrów szkło/celuloza do rutynowego monitorowania wirusów. Ostatnie badania wykazały, że różnice między tymi dwoma filtrami są nominalne w odzyskiwaniu enterowirusów z otaczającej wody 6,7, co uzasadnia zastosowanie tańszej alternatywy filtra. Badano inne opcje filtrów, takie jak filtry elektroujemne i filtry z watą szklaną, jednak albo wymagają one wstępnego uzdatniania wody źródłowej (filtry elektroujemne), albo nie są dostępne na rynku (filtry z waty szklanej). Rozwój procedur koncentracji wirusa koncentrował się głównie na optymalizacji technik zatężania pierwotnego (filtrów) w celu poprawy odzyskiwania wirusa z wody. Jednak procedury wtórnego zatężania, które zwykle zmniejszają objętość eluantu z 1 l do mililitrów, mogą również mieć znaczący wpływ na powrót do zdrowia wirusa 8.
Wtórne stężenie wirusów jelitowych zazwyczaj opiera się na czynniku flokulującym, takim jak niektóre rodzaje ekstraktu z wołowiny (flokulacja organiczna) lub flokulacja odtłuszczonego mleka 9-12, aby usunąć cząsteczki wirusa z powierzchni filtrów. Ostatnio inna procedura wtórnego zatężania z użyciem ekstraktu z wołowiny w połączeniu z dodatkiem celitu (drobnej cząstki) okazała się obiecująca w odzyskiwaniu adenowirusa, enterowirusa i norowirusa 8,13,14. Koncentracja celitu działa na podobnych zasadach jak w przypadku metody flokulacji organicznej, ponieważ cząsteczki wirusa przyczepiają się do cząstek (kłaczków lub kelitu) i są z nich uwalniane poprzez zmianę pH roztworu zawiesiny. Porównania między tymi dwiema technikami koncentracji drugorzędowej oceniano w odzyskiwaniu kolczastego adenowirusa (AdV) typu 40 i 41 8. W badaniu tym stwierdzono, że dwie techniki koncentracji drugorzędowej były statystycznie podobne w odzyskiwaniu adenowirusów. Jednak metoda flokulacji organicznej wymaga 30 minut inkubacji przy pH 3,5, podczas gdy technika kelityczna wymaga krótszej inkubacji (10 minut) przy pH 4,0. Flokulacja organiczna wymaga również użycia drogiego sprzętu laboratoryjnego (wirówek) do zbierania cząstek kłaczków podczas zagęszczenia trzeciorzędowego, natomiast technika kelitowa wykorzystuje tylko podstawowy sprzęt laboratoryjny (filtracja próżniowa) do oddzielania cząstek celitu od zawiesiny.
Pewne kombinacje filtrów i technik wtórnej elucji mogą również wpływać na odzyskiwanie wirusa. W jednym z badań stwierdzono, że pewne kombinacje technik koncentracji pierwotnej (filtry elektrododatnie) i wtórnej (flokulacja celitowa lub organiczna) miały znaczący wpływ na powrót do zdrowia adenowirusa 13. Wyniki te sugerują, że konieczna jest optymalizacja w celu optymalnego odzyskania docelowego wirusa z danej matrycy wodnej przy użyciu tych technik. Optymalizacja jest czasochłonnym, żmudnym procesem, którego wielu badaczy aktywnie unika, ponieważ oceniane są liczne zmienne (typ/marka filtra, roztwór elucyjny pH, kalituacja/flokulacja organiczna).
Na potrzeby tego badania opracowano procedurę pozwalającą na określenie optymalnych warunków koncentracji wirusa z wody przy użyciu wzbogaconych ludzkich szczepów adenowirusa 40 i 41. Przypuszczalnie, ponieważ każdy typ wirusa wykazuje unikalną morfologię kapsydu i specyficzny ładunek kapsydu, może być konieczne zoptymalizowanie protokołów koncentracji dla każdego celu wirusa w celu osiągnięcia optymalnej odbudowy wirusa. Niniejsze badanie przedstawia podejście do stężenia AdV 40 i 41 poprzez: 1) ocenę odzysku wirusa w wodzie z kranu przy użyciu elektrododatnich dysków filtracyjnych, a następnie 2) ocenę ustalonej metody flokulacji organicznej w porównaniu z techniką celitową jako stężenie wtórne oraz 3) ocenę elucyjnych dla stężenia trzeciorzędowego.

<table><tbody><tr><td>Adenowirus 40 zapas</td><td>ATCC</td><td>VR-931</td><td></td></tr><tr><td>Adenowirus 41 zapas</td><td>ATCC</td><td>VR-930</td><td></td></tr><tr><td>Tiosiarczan sodu</td><td>Fluka Chemical Co.</td><td>72051</td><td></td></tr><tr><td>Celites #577</td><td>Fluka Chemical Co.</td><td>22142</td><td></td></tr><tr><td>NanoCeram 47 mm</td><td>Argonide</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>1MDS 47 mm</td><td>3M</td><td>6408502</td><td></td></tr><tr><td>Filtr wstępny AP-20 47 mm</td><td>Millipore Corp.</td><td></td><td></td>AP2004700</tr><tr><td>Glicyna&nbsp;</td><td>Sigma</td><td>50046-1KG</td><td></td></tr><tr><td>Polifosforan sodu</td><td>Acros Organics</td><td>390930010</td><td></td></tr><tr><td>Trypsyna</td><td>Gibco</td><td>25200</td><td></td></tr><tr><td>PBS</td><td>Sigma</td><td>P5368</td><td></td></tr><tr><td>Kwas solny</td><td>Fisher</td><td>A481-212</td><td></td></tr><tr><td>BBL Ekstrakt z wołowiny</td><td>BD Biosciences</td><td>212303</td><td></td></tr><tr><td>Ekstrakt z wołowiny Difco</td><td>BD Biosciences</td><td>211520</td><td></td></tr><tr><td>ABI 7900 System PCR w czasie rzeczywistym</td><td>ABI</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>Obudowa filtra ze stali nierdzewnej</td><td>Millipore Corp.</td><td></td><td></td>XX2004720</tr><tr><td>Zestaw do ekstrakcji DNA krwi</td><td>Qiagen&nbsp;</td><td>51104</td><td></td></tr><tr>Kalkulator <td></td><td></td><td>MPN EPA</td><td>http://www.epa.gov/nerlcwww/online.html</td></tr></tbody></table>

procedura małej objętości do pomiaru stężenia wirusa z wody

A Small Volume Procedure for Viral Concentration from Water

Małe stężenie wirusów (objętości próbek 1-10 L, tutaj symulowane z wzbogaconymi próbkami wody o pojemności 100 ml) jest skutecznym, opłacalnym sposobem identyfikacji optymalnych parametrów stężenia wirusa. Wirusy mogą być zagęszczane z wody za pomocą filtracji (elektrododatniej, elektroujemnej, waty szklanej lub wykluczenia wielkości), a następnie wtórnego zatężania ekstraktem wołowym w celu uwolnienia wirusów z powierzchni filtra, a na końcu stężenia trzeciorzędowego, co daje 5-30 ml objętościowego koncentratu wirusa. W celu określenia optymalnych procedur zatężania oceniono dwa różne filtry elektrododatnie (filtr szkło/celuloza [1MDS] i filtr nano-tlenek glinu/szkło [NanoCeram]), a także różne techniki zatężania wtórnego; Technika Celite, w której oceniano trzy różne rozmiary cząstek celite (drobną, średnią i dużą), a następnie porównano tę technikę z uznaną metodą flokulacji organicznej. Oceniano również różne dodatki elucyjne pod kątem ich zdolności do zwiększania uwalniania cząstek adenowirusa (AdV) z powierzchni filtrów. Delita drobnocząsteczkowy osiągnął poziomy AdV40 i 41 podobne do uznanej metody flokulacji organicznej, gdy podczas zagęszczania wtórnego dodano kolce wirusa. Filtr szkło/celuloza odzyskał wyższe poziomy zarówno AdV40, jak i 41, w porównaniu z filtrem z nanotlenku glinu/włókna szklanego. Chociaż nie jest to statystycznie istotne, dodanie 0,1% elanowego ekstraktu wołowego z polifosforanu sodu pozwoliło odzyskać o 10% więcej cząstek AdV w porównaniu z niemodyfikowanym ekstraktem wołowym.

Wybór Celite
Przed wybraniem najlepiej sprawiającego się wariantu przetestowano trzy różne rodzaje celitu. Celity o drobnych i średnich cząstkach pozwoliły uzyskać najwyższy odzysk adenowirusów. Zastosowanie celitów o większych cząstkach doprowadziło do niższych wartości odzysku zarówno dla AdV40, jak i 41 (zakres 32%-100%) (Rysunek 1). Średnie odzyski dla adenowirusa 40 wynosiły 144% ± 52% (drobny), 115% ± 28% (średni) oraz 82% ± 53% (gruby) celit, a dla AdV41: 132% ± 39% (dr...

Opracowano podejście do identyfikacji optymalnych warunków koncentracji wirusa dla małych objętości próbek wody przy użyciu kolców ludzkiego adenowirusa. Opisane tutaj techniki są wykorzystywane do identyfikacji parametrów stężenia dla innych celów wirusowych i stosowane do eksperymentów z stężeniem wirusa na dużą skalę.

Procedura małej objętości do pomiaru stężenia wirusa z wody

Small-scale concentration of viruses (sample volumes 1-10 L, here simulated with spiked 100 ml water samples) is an efficient, cost-effective way to ...

Ogólnym celem poniższego eksperymentu jest optymalizacja odzyskiwania wirusów z wody przy użyciu techniki w małej skali, pierwotnie opracowanej w celu optymalizacji stężeń wirusów. Stwierdzono, że szklany filtr celulozowy jest najlepszym filtrem elektropozytywnym do zagęszczania adenowirusów z wody. W przypadku elucji wtórnej technikę wtórnego zagęszczania z użyciem celitu uznano za najskuteczniejszą metodę elucji adenowirusów z powierzchni filtra. Opracowana technika pozwala na odzyskanie największej ilości adenowirusów z wody z kranu, co wynika z najwyższego procentowego odzysku zaobserwowanego spośród wszystkich przetestowanych kombinacji filtrów i metod elucji.Główną zaletą tej techniki w porównaniu z istniejącymi metodami, takimi jak zagęszczanie dużych objętości, jest wykorzystanie mniejszych objętości próbek, co umożliwia szybką i łatwą ocenę wielu zmiennych związanych z koncentracją.Przygotowując się do realizacji tego protokołu, należy mieć pod ręką wszystkie wymagane roztwory, w tym przefiltrowany przez filtr 0,22 mikrona roztwór wirusowy o stężeniu od 10 do 100 000 MPN na mililitr.Zacznij od odmierzenia jednego litra sterylnej wody z kranu. Przelej ją do zlewki o pojemno

a-small-volume-procedure-for-viral-concentration-from-water

Research

JoVE Journal

Environment

Środowisko

W celu wytworzenia lentiwirusów wektory DNA są transfekowane do ludzkich komórek 293. Po zbiorze i skoncentrowaniu naddatku miano wirusa jest określane na podstawie ekspresji fluorescencji przy użyciu cytometru przepływowego.

Produkcja lentiwirusa

Szybkość wymiany wirusów w systemach morskich i słodkowodnych można oszacować za pomocą techniki redukcji i ponownego pojawienia się. Uzyskane dane pozwalają badaczom wywnioskować tempo śmiertelności mikroorganizmów indukowanej przez wirusy w systemach wodnych.

Szacowanie szybkości produkcji wirusów w systemach wodnych

Filtry z wełny szklanej były wykorzystywane do zagęszczania wirusów przenoszonych przez wodę przez liczne grupy badawcze na całym świecie. W niniejszej pracy przedstawiamy prostą metodę konstruowania filtrów z wełny szklanej i wykazujemy, że są one również skuteczne w zagęszczaniu wodnych patogenów wirusowych, bakteryjnych i pierwotniakowych.

Filtry z wełny szklanej do zagęszczania wirusów przenoszonych przez wodę oraz rolniczych patogenów odzwierzęcych

Source: Nguyen, H., et al. Growth, Purification, and Titration of Oncolytic Herpes Simplex Virus. J. Vis. Exp. (2021)This video demonstrates the purification of an oncolytic virus from infected mammalian cell cultures using nuclease treatment, sequential centrifugation, membrane filtration, and sucrose cushion centrifugation.

 Oncolytic Virus Purification from Infected Mammalian Cells 

Source: Fout, G. S., Cashdollar, J. L. EPA Method 1615. Measurement of Enterovirus and Norovirus Occurrence in Water by Culture and RT-qPCR. II. Total Culturable Virus Assay. J. Vis. Exp. (2016)This video demonstrates the use of a total culturable virus assay to quantify infectious viruses in water samples. It outlines host cell inoculation, observation of cytopathic effect, and statistical quantification of infectious virus concentration.

Quantifying Infectious Viruses in Water Samples Using an In Vitro Total Culturable Virus Assay

Źródło: Rghei, A. D., et al. Production of Adeno-Associated Virus Vectors in Cell Stacks for Preclinical Studies in Large Animal Models. J. Vis. Exp. (2021)Wideo przedstawia oczyszczanie wektorów rekombinowanego wirusa towarzyszącego adenowirusom (AAV) z surowego lizatu gospodarza przy użyciu macierzy powinowactwa opartej na heparynie. Cząsteczki wirusowe wiążą się z unieruchomioną heparyną, podczas gdy zanieczyszczenia są wypłukiwane. Bufor o wysokim stężeniu soli uwalnia nienaruszone wirusy,...

Oczyszczanie wektorów wirusów towarzyszących adenowirusom z wykorzystaniem chromatografii powinowactwa

Źródło: Fricano-Kugler, C. J., et al. Designing, Packaging, and Delivery of High Titer CRISPR Retro and Lentiviruses via Stereotaxic Injection. J. Vis. Exp. (2016).W niniejszym filmie zaprezentowano krok po kroku proces zagęszczania i oczyszczania cząstek lentiwirusowych z mieszaniny zawierającej szczątki komórek gospodarza. Procedura wykorzystuje wirowanie, filtrację oraz wytrącanie solą i PEG w celu wyizolowania cząstek wirusa przy jednoczesnym usunięciu rozpuszczalnych zanieczyszczeń.

Koncentracja i oczyszczanie cząsteczek wirusowych

Tutaj prezentujemy procedurę pomiaru całkowitej liczby wirusów zdolnych do hodowli za pomocą linii komórkowej nerki Buffalo Green Monkey. Procedura zapewnia ustandaryzowane narzędzie do pomiaru występowania zakaźnych wirusów w środowisku i wodach pitnych.

Metoda EPA 1615. Pomiar występowania enterowirusów i norowirusów w wodzie za pomocą hodowli i RT-qPCR. II. Całkowity test na obecność wirusa hodowlanego

Tutaj prezentujemy VirWaTest, który jest prostą, niedrogą i przenośną metodą koncentracji i wykrywania wirusów z próbek wody w miejscu użycia.

VirWaTest, metoda punktowa do wykrywania wirusów w próbkach wody

Stężenie wirusa z próbek wody i ścieków środowiskowych jest trudnym zadaniem, przeprowadzanym głównie w celu identyfikacji i kwantyfikacji wirusów. Chociaż opracowano i przetestowano kilka metod koncentracji wirusów, tutaj wykazujemy skuteczność ultrafiltracji i flokulacji mleka odtłuszczonego dla wirusów RNA z różnymi typami próbek.

Zagęszczenie cząstek wirusa w próbkach wody i ścieków środowiskowych przy użyciu flokulacji mleka odtłuszczonego i ultrafiltracji

Wirus związany z adenowirusem jest wytwarzany w hodowli komórek zawiesinowych i oczyszczany przez wirowanie w gradiacji gęstości podwójnego jodixanolu. Uwzględniono kroki mające na celu zwiększenie całkowitej wydajności wirusa, zmniejszenie ryzyka wytrącania się wirusa i dalszą koncentrację końcowego produktu wirusowego. Oczekiwane końcowe miana osiągają10-12 cząstek wirusa/ml i nadają się do przedklinicznego stosowania in vivo.

Produkcja kultur zawiesinowych i oczyszczanie wirusa związanego z adenowirusem za pomocą wirowania w gradicynacji gradientu gęstości jodiksanolu do zastosowań in vivo

Poznaj metodę małej objętości do koncentracji adenowirusa z wody przy użyciu szklanego filtru celulozowego i techniki wtórnej koncentracji Sea Light. Technika ta umożliwia szybką ocenę zmiennych koncentracji w próbkach wody kranowej.

Procedura małej objętości do pomiaru stężenia wirusa z wody

Przeglądaj więcej filmów