Procedura małej objętości do pomiaru stężenia wirusa z wody
3 lutego 2015
Opracowano podejście do identyfikacji optymalnych warunków koncentracji wirusa dla małych objętości próbek wody przy użyciu kolców ludzkiego adenowirusa. Opisane tutaj techniki są wykorzystywane do identyfikacji parametrów stężenia dla innych celów wirusowych i stosowane do eksperymentów z stężeniem wirusa na dużą skalę.
Ogólnym celem poniższego eksperymentu jest optymalizacja odzyskiwania wirusów z wody przy użyciu techniki w małej skali, pierwotnie zaprojektowanej w celu optymalizacji stężeń wirusów. Stwierdzono, że filtr z celulozy szklanej jest najlepszym filtrem elektropozytywnym do zagęszczania adenowirusów z wody. W przypadku wtórnej elucji technika wtórnego zagęszczania z wykorzystaniem celitu okazała się najlepsza do elucji adenowirusów z powierzchni filtra. Wynikowa technika pozwala na odzyskanie największej ilości adenowirusów z wody kranowej, opierając się na najwyższym procencie odzysku zaobserwowanym spośród wszystkich testowanych kombinacji filtrów i metod elucji.
Główną zaletą tej techniki w porównaniu z istniejącymi metodami, takimi jak zagęszczanie dużych objętości, jest wykorzystanie mniejszych objętości próbek, co umożliwia szybką i łatwą ocenę wielu zmiennych procesu zagęszczania.
Przygotowując się do wykonania niniejszego protokołu, należy przygotować wszystkie wymagane roztwory, w tym przefiltrowany przez filtr 0,22 mikrona roztwór wirusowy o stężeniu od 10 do 100 000 MPN na mililitr.
Zacznij od odmierzenia jednego litra sterylnej wody kranowej. Przenieś ją do zlewki o pojemności dwóch litrów z magnetycznym mieszadłem. Podczas mieszania wody dodaj 0,7 g tiosiarczanu sodu i poczekaj, aż całkowicie się rozpuści. Następnie dostosuj pH do wartości między 7 a 7,5, dodając kroplami jednomolarne roztwory zapasowe kwasu lub zasady. Następnie zaszczep wodę wirusem. Dodaj pełny 1 mL przygotowanego roztworu wirusa. Przykryj kolbę sterylną folią i pozostaw wirusa w wodzie na 10 minut w celu wymieszania.
W międzyczasie przygotuj filtr Millipore. Najpierw wyjmij go z opakowania i upewnij się, że górna misa ściśle przylega do dolnego sita. Następnie sprawdź, czy korek filtra szczelnie przylega do wylewu kolby z bocznym wylotem o pojemności 1 litra. Teraz zdejmij górną misę filtra i za pomocą pęsety umieść 47 mm elektropozytywną membranę filtracyjną dokładnie na sicie filtra. Następnie ponownie zamocuj misę i zablokuj ją, przekręcając w kierunku przeciwnym do ruchu wskazówek zegara.
Odmierz 100 ml wzbogaconej wody z kranu za pomocą sterylnego cylindra. Następnie przelej wodę do przygotowanej obudowy filtra osadzonej na kolbie o pojemności dwóch litrów. Dysk elektropozytywny w filtrze może być wykonany z plisowanej celulozy szklanej lub włókna szklanego z nano-aluminium. Można zastosować delikatną próżnię, aby przepuścić resztę wody przez filtr.
Następnie przenieś obudowę filtra do kolby z bocznym wylotem o pojemności 250 ml. Odmierz 100 ml ekstraktu wołowego i powoli wlej go na filtr. Pozwól, aby ekstrakt powoli przesiąkał, i zastosuj łagodną próżnię, aby odessać pozostałości.
Następnie należy zastosować jedną z dwóch opcji wtórnego zagęszczenia.
Aby skoncentrować wirusa za pomocą celitu, przenieś zawartość kolby o pojemności 250 mililitrów zawierającą wirusa na mieszadło magnetyczne. Za pomocą mieszadełka magnetycznego wytwórz niewielki wir. Następnie dodaj 0,1 grama proszku celitowego do 100 mililitrów ekstraktu wołowego. Pozostaw celit do rozproszenia i przygotuj się do dostosowania pH roztworów. Dodając kroplami 0,1 molarny kwas solny, obniż pH do 4,0.
Następnie należy mieszać roztwór przez 10 minut. W czasie mieszania zamocuj przefiltrowanie wstępne o pojemności 47 mililitrów do kolby o pojemności dwóch litrów. Teraz przelej 100 mililitrów mieszaniny ekstraktu wołowego i celitu przez filtr wstępny. W celu zakończenia procesu można zastosować lekką próżnię.
Następnie na końcu wylewki obudowy filtra zamocuj metalny zacisk do rurek. Do zacisku przyłącz sterylną 15 ml polipropylenową probówkę do zbierania próbek, a następnie ponownie zamontuj filtr na kolbie.
Następnie eluj wirusa z cząsteczek Celite w pięciu mililitrach 1X PBS o pH 9. Pozwól, aby większość PBS spłynęła grawitacyjnie do probówki o objętości 15 mililitrów, a pozostałą część odciągnij za pomocą lekkiej próżni. Aby skoncentrować wirusa za pomocą flokulacji organicznej, przenieś zawartość kolby o objętości 250 mililitrów zawierającej wirusa na mieszadło magnetyczne. Przy użyciu paska magnetycznego wytwórz niewielki wir. Dostosuj pH roztworu do 3,5, dodając kroplami jednomolowy kwas solny. Następnie mieszaj mieszaninę przez pół godziny. Później przenieś roztwór do sterylnej stożkowej probówki wirówkowej o objętości 250 mililitrów. Wirować roztwór przy 2 500 g przez 15 minut w temperaturze czterech stopni Celsjusza. Po wirowaniu zachowaj ostrożność podczas operowania probówkami, aby nie zaburzyć osadu. Ostrożnie odlej supernatant i resuspenduj osad w pięciu mililitrach PBS o pH 9. Upewnij się, że osad jest całkowicie rozpuszczony. Następnie odwiruj resuspensję przy 4 000 g przez 10 minut w temperaturze czterech stopni Celsjusza. Teraz zbierz supernatant zawierający skoncentrowanego wirusa. Osad można wyrzucić.
Podczas optymalizacji tego protokołu porównano trzy rodzaje celitu. Zastosowanie celitu o większych ziarnach skutkowało niższą odzyskalnością zarówno ADV 40, jak i ADV 41.
Przetestowano elucję z filtra przy pH w zakresie od 7,5 do 12, aby określić, która wartość będzie najskuteczniejsza w odzyskiwaniu cząstek ADV z filtrów. Najwyższą wydajność odzysku uzyskano przy zastosowaniu filtra szklano-celulozowego w połączeniu z wyciągiem z wołowiny przy pH 10 oraz z celitem. Wynik był taki sam dla ADV 40 i ADV 41.
Wyciąg z wołowiny przy pH 10 okazał się skuteczniejszy niż flokulacja organiczna.
Zoptymalizowaną metodę porównano z dodatkiem 25% trypsyny oraz z uzupełnieniem ekstraktu wołowego o 0,1% polifosforanu sodu. Żadna z tych metod nie poprawiła znacząco odzysku ADV.
Po opanowaniu techniki, przy prawidłowym wykonaniu, procedura ta może zająć 45 minut.
Wyświetl pełny transkrypt i uzyskaj dostęp do tysięcy filmów naukowych
Przegląd
Niniejsze badanie przedstawia metodę optymalizacji odzyskiwania wirusów z próbek wody o małej objętości, ze szczególnym uwzględnieniem ludzkiego adenowirusa. Podejście to wykorzystuje filtr z celulozy szklanej oraz technikę wtórnej koncentracji w celu zwiększenia stopnia odzysku.
Kluczowe elementy badania
Dziedzina nauki
- Wirusologia
- Nauki o środowisku
- Jakość wody
Wstęp
- Koncentracja wirusów z próbek wody ma kluczowe znaczenie dla monitoringu środowiska.
- Istniejące metody często wymagają dużych objętości próbek, co ogranicza ich wydajność.
- Optymalizacja technik odzyskiwania może poprawić wykrywanie i analizę patogenów wirusowych.
- Ludzki adenowirus służy jako model do testowania metod koncentracji.
Cel badania
- Opracowanie techniki identyfikacji optymalnych warunków koncentracji wirusa.
- Ocena różnych kombinacji filtrów i elucji w celu odzyskania adenowirusów.
- Umożliwienie szybkiej oceny zmiennych koncentracji przy użyciu małych objętości próbek.
Zastosowane metody
- Wykorzystanie szklanego filtra celulozowego do zagęszczania adenowirusów.
- Zastosowanie techniki wtórnego zagęszczania sea light do elucji.
- Porównanie różnych kombinacji filtrów i metod elucji.
- Ocena stopnia odzysku z próbek wody kranowej.
Główne wyniki
- Szklany filtr celulozowy wykazał najwyższy procent odzysku adenowirusa.
- Technika wtórnej koncentracji Sea Light skutecznie elutowała wirusa.
- Małe objętości próbek pozwoliły na szybką ocenę wielu parametrów koncentracji.
- Metoda ta okazała się wydajniejsza od tradycyjnych technik koncentracji dużych objętości.
Wnioski
- Technika ta zapewnia bardziej wydajny sposób odzyskiwania wirusów z próbek wody.
- Umożliwia ona szybkie testowanie różnych warunków zagęszczania.
- Podejście to można dostosować do innych celów wirusowych poza adenowirusami.
Najczęściej zadawane pytania
Znaczenie dla przemysłu
Optymalizacja odzyskiwania wirusów z wodnych próbek o małej objętości umożliwia szybki screening parametrów zagęszczania, wspierając wczesny etap opracowywania analiz w wirusologii środowiskowej. Metoda ta stanowi skalowalne i kosztowo efektywne podejście do oceny kombinacji filtrów i elucji, co pozwala ograniczyć wydatki zasobowe w przedklinicznych procesach wykrywania patogenów. Dzięki identyfikacji optymalnych warunków zagęszczania adenowirusów, technika ta zwiększa pewność prognostyczną w późniejszych zastosowaniach detekcyjnych.
Strategiczne zastosowania w badaniach i rozwoju biofarmaceutycznym
Wczesne odkrywanie i walidacja celu
- Wartość naukowa: Umożliwia badanie efektywności odzyskiwania wirusów w zależności od rodzaju filtrów i warunków elucji, co wspiera walidację celu w detekcji patogenów środowiskowych.
- Wartość operacyjna: Wykorzystuje małe objętości próbek (1-10 L symulowane za pomocą 100 mL) do szybkiego testowania wielu zmiennych, co przyspiesza formułowanie hipotez w celu optymalizacji koncentracji wirusów.
Przesiewy i opracowywanie testów
- Wartość naukowa: Dostarcza ilościowych danych o odzysku (procent odzysku AdV40 i AdV41) w celu ustandaryzowania analizy oraz zapewnienia powtarzalności w platformach detekcji wirusowej.
- Wartość operacyjna: Przygotowuje zwalidowane układy biologiczne (stężony wirus w objętości 5-30 mL) do dalszych zastosowań, takich jak testy zakaźności lub analizy genomiczne.
- Wartość strategiczna: Wspiera gotowość do screeningu poprzez umożliwienie szybkiego porównania filtrów elektropozytywnych (szkło/celuloza vs. nano-alumina/szkło) oraz technik wtórnego zagęszczania (celite vs. flokulacja organiczna).
Badania translacyjne i przedkliniczne
- Wartość naukowa: Wykorzystanie ludzkiego adenowirusa jako modelu istotnego z punktu widzenia choroby do oceny wydajności metody koncentracji, co wspiera translacyjny rozwój biomarkerów dla patogenów przenoszonych przez wodę.
- Wartość operacyjna: Zapewnienie ciągłości od etapu odkrycia po walidację przedkliniczną poprzez dostarczenie skoncentrowanego wirusa odpowiedniego do dalszej charakterystyki.
- Wartość strategiczna: Ułatwienie decyzji o postępach skorygowanych o ryzyko poprzez zidentyfikowanie kombinacji filtr-eluat o wysokiej wydajności odzysku (filtr szklano-celulozowy z ekstraktem wołowym przy pH 10 i sea light).
Integracja potoku i przepływu pracy
Metoda ta wpisuje się w kontinuum procesu odkrywczego – od wczesnego testowania hipotez po identyfikację wiodących czynników w detekcji patogenów środowiskowych – umożliwiając szybką iterację zmiennych stężeń przed przejściem do pracy z większymi objętościami.
- Biologia odkrywcza: Wspiera testowanie hipotez dotyczących zmiennych filtracji i elucji w celu wyjaśnienia mechanizmów uwalniania wirusów z powierzchni oraz optymalizacji wydajności odzyskiwania.
- Przesiewanie: Dostarcza gotowych do analizy koncentratów wirusowych (5-30 mL) z wynikami ilościowymi (procent odzyskania) do porównywania warunków w zależności od rodzajów filtrów i dodatków do elucji.
- Analityka: Umożliwia pomiar zmiennych zależnych (odzyskanie wirusa za pomocą qPCR lub zakaźność) w celu statystycznej oceny wpływu zmiennych niezależnych (typ filtra, pH elucji, wielkość cząstek celitu).
- Badania translacyjne: Zapewnia ciągłość przedkliniczną poprzez dostarczanie skoncentrowanego adenowirusa odpowiedniego do dalszej walidacji w hodowlach komórkowych lub modelach zwierzęcych.
- Ponowne wykorzystanie w przedsiębiorstwie: Tworzy powtarzalną możliwość optymalizacji koncentracji wirusów dla wielu celów wirusowych poza adenowirusami, co ogranicza redundantny rozwój metod.
Wpływ operacyjny i organizacyjny
- Wartość naukowa: Zwiększa pewność prognostyczną metod odzyskiwania wirusów poprzez redukcję niejednoznaczności mechanistycznej dzięki systematycznej ocenie parametrów filtracji i elucji.
- Wartość operacyjna: Poprawia standaryzację i powtarzalność dzięki zdefiniowanym etapom (elucja ekstraktem wołowym, wtórna koncentracja sea light, dostosowanie pH do 4,0) oraz mierzalnym punktom końcowym (procent odzysku AdV40 i AdV41).
- Wartość strategiczna: Usprawnia podejmowanie decyzji go/no-go w rozwoju testów detekcji patogenów poprzez identyfikację optymalnych warunków (filtr z celulozy szklanej, ekstrakt wołowy przy pH 10, sea light) zapewniających najwyższy zaobserwowany odzysk.
- Wpływ na portfolio: Wspiera priorytetyzację metod koncentracji dostosowaną do ryzyka w programach monitorowania środowiska, redukując ryzyko niepowodzeń na późnych etapach procesów detekcji patogenów.
Uwagi dotyczące implementacji
- Wymagana jest wiedza specjalistyczna z zakresu wirusologii, technik filtracji oraz precyzyjnego pipetowania w celu przygotowania próbek z dodatkiem wirusa, montażu filtrów i etapów wirowania.
- Metoda jest zależna od aparatury, w tym systemów filtracji próżniowej, mieszadeł magnetycznych, pH-metrów, wirówek (zdolnych do osiągnięcia 2,500 G i 4,000 G) oraz sterylnych wężyków i probówek do zbierania próbek.
- Konieczna jest standaryzacja przygotowania roztworów (ekstrakt wołowy, celite, HCl, PBS) oraz kontroli środowiskowych (wirowanie w 4°C, warunki sterylne) pomiędzy zespołami w celu zapewnienia powtarzalności.
- Należy uwzględnić kwestie adaptacji przy stosowaniu metody dla różnych typów wirusów lub macierzy wodnych, ponieważ wydajność odzysku może różnić się w zależności od właściwości wirusa (np. serotypu adenowirusa) i składu próbki (woda z kranu vs źródła środowiskowe).
- Ograniczenia praktyczne obejmują konieczność stosowania technik aseptycznych podczas pracy z wirusem oraz potencjalną zmienność wydajności filtrów między partiami, co może wpływać na powtarzalność elucji.
