Analizator komórek oparty na impedancji w czasie rzeczywistym jako narzędzie do wyznaczania szlaków molekularnych zaangażowanych w neurotoksyczność i neuroprotekcję w linii komórek neuronalnych

Ogólnym celem tej procedury jest wykorzystanie techniki opartej na impedancji do śledzenia ochrony cyto linii komórkowej neuronów w czasie rzeczywistym w celu określenia udziału drugich szlaków przekaźnikowych w procesie ochrony. Osiąga się to poprzez najpierw hodowlę linii komórek neuronalnych w warunkach proliferacyjnych w analizatorze komórek w czasie rzeczywistym opartym na impedancji. W drugim kroku, potencjalnie istotne.

Drugie szlaki przekaźnikowe są hamowane farmakologicznie przed poddaniem linii komórkowej leczeniu neuroprotekcyjnemu. Następnie stan linii komórek neuronalnych jest śledzony za pomocą analizatora komórek w czasie rzeczywistym w różnych warunkach eksperymentalnych. Ostatecznie analiza statystyczna może być wykorzystana do oceny udziału w czasie rzeczywistym szlaków drugiego przekaźnika w ochronie komórek neuronalnych.

Główną przewagą tej techniki nad istniejącymi metodami, takimi jak testy neurotoksyczności w punkcie końcowym, jest to, że pozwala ona na ocenę ochrony Tito i toksyczności Tito w liniach komórek neuronalnych w czasie rzeczywistym i w warunkach wolnych od znacznika. Metoda ta może pomóc odpowiedzieć na szybkie pytania w dziedzinie neurobiologii molekularnej, przyczyniając się do bardziej przepustowej oceny potencjalnych związków neuroprotekcyjnych in vitro oraz zapewniając wgląd w mechanizmy molekularne zaangażowane w neuroprotekcję. Na przykład tutaj ludzkie komórki nerwiaka zarodkowego S-K-N-S-H są używane z PBS, a następnie trypsyna komórek przez pięć minut w temperaturze 37 stopni Celsjusza.

Usuń trypsynę przez odwirowanie, a następnie ponownie zawieś komórki w 10 mililitrach pożywki proliferacyjnej. Po zliczeniu komórek rozcieńczyć komórki do stężenia trzy razy od 10 do piątego na mililitr z większą ilością pożywki proliferacyjnej, a następnie zrównoważyć każdą studzienkę EPL 96 ze 100 mikrolitrami pożywki proliferacyjnej w kapturze do hodowli tkankowych w temperaturze pokojowej. Po 30 minutach włóż EPL 96 do stacji analizatora komórek w czasie rzeczywistym w inkubatorze dwutlenku węgla w temperaturze 37 stopni Celsjusza i uruchom oprogramowanie analizatora komórek w czasie rzeczywistym.

Następnie na stronie układu wybierz odpowiednie studzienki do eksperymentu i wprowadź typ komórki, numer komórki oraz nazwy i stężenia interesujących związków chemicznych w polach edycji na stronie oprogramowania do harmonogramu, ponieważ krok pierwszy jest wstępnie ustawiony. W przypadku pomiaru tła wybierz opcję dodaj krok i ustaw krok drugi, aby mierzyć indeks komórki co 15 minut przez 96 godzin. Następnie kliknij przycisk Start, aby rozpocząć krok pierwszy i zmierzyć impedancję tła nośnika.

Teraz usuń EPL i dodaj 100 mikrolitrów zawiesiny komórek nerwiaka zarodkowego. Do każdej studzienki eksperymentalnej delikatnie zakręć EPL 96, aby równomiernie pokryć dołki, a następnie inkubuj płytkę w temperaturze pokojowej w kapturze do hodowli tkankowej, aby komórki mogły się uspokoić po pół godzinie, załaduj EPL 96 z powrotem do stacji analizatora komórek w czasie rzeczywistym i rozpocznij krok drugi. Aby monitorować wartości indeksu komórek w całym eksperymencie, wyświetl krzywe komórek na stronie wykresu i nieprzetworzone dane indeksu komórek na stronie indeksu komórek w ciągu 24 godzin.

Po posianiu komórek przerwij eksperyment i wyjmij płytkę ze stacji analizatora komórek w czasie rzeczywistym. Dozować jeden mikrolitr świeżo rozcieńczonych inhibitorów będących przedmiotem zainteresowania do każdej studzienki, a następnie po ponownym załadowaniu EPL 96 wznowić eksperymentalne pomiary indeksu komórek po 30 minutach, ponownie wstrzymać eksperyment i szybko, ale ostrożnie usunąć pożywkę proliferacyjną z każdej studzienki, kierując krawędź końcówki pipety do rogu studzienki, aby uniknąć przerwania przylegającej warstwy komórek. Następnie natychmiast dodaj 200 mikrolitrów pożywki do deprywacji surowicy do każdej studzienki, jeden mikrolitr świeżo rozcieńczonych związków neuroprotekcyjnych będących przedmiotem zainteresowania i jeden mikrolitr drugich inhibitorów szlaku przekaźnikowego będących przedmiotem zainteresowania do odpowiednich studzienek.

Następnie kontynuuj pomiary indeksu komórek co 15 minut przez 96 godzin, jak wcześniej ustawiono, aby przeanalizować dane, teraz wybierz znormalizowany indeks komórki i znormalizowane funkcje czasu na stronie wykresu, aby znormalizować indeks komórki do ostatniego punktu czasu przed modyfikacjami kultury komórkowej. Aby zmniejszyć różnice między eksperymentami. Podświetl dołki na stronie wykresu dla interesujących warunków eksperymentalnych i kliknij przycisk Dodaj, aby wykreślić znormalizowane krzywe indeksu komórek.

Następnie wyeksportuj dane eksperymentalne dla wszystkich punktów czasowych indeksu komórkowego ze strony oprogramowania do indeksowania komórek do pliku arkusza kalkulacyjnego w celu analizy statystycznej różnic w wartościach indeksu komórkowego w różnych warunkach leczenia w określonych punktach czasowych. Zaznacz wartości indeksu komórek w odpowiednich punktach czasowych w wyeksportowanym pliku arkusza kalkulacyjnego. Na koniec przeanalizuj wartości indeksu komórkowego dla wybranych punktów czasowych za pomocą jedno- lub dwukierunkowej analizy wariancji, a następnie testu post hoc Za pomocą oprogramowania statystycznego bodźce neurotoksyczne do komórek prowadzą do spadku wartości indeksu komórkowego w tym miejscu, wzrostu indeksu komórkowego, gdy komórki S-K-N-S-H są hodowane w pożywce proliferacyjnej i spadku indeksu komórkowego, po którym następuje stabilizacja na nowych niższych poziomach po Przełączenie komórek na pożywkę deprywacyjną surowicy pokazano na tych wykresach.

Neuroprotekcyjne działanie dwóch agonistów receptora serotoninowego i pięciu mikromolowych, DOI i 20 mikromolowych IDE dodanych, gdy komórki były karmione surowicą pozbawioną surowicy, można zaobserwować pożywkę. Ważnym pytaniem w badaniach neuroprotekcji jest to, czy wpływ na proliferację komórek przyczynia się do obserwowanego wpływu związku na przeżycie komórek. Na tym wykresie pokazano brak wpływu leczenia pięcioma mikromolowymi DOI na proliferację komórek SKNS, co sugeruje, że proliferacja nie przyczynia się do obserwowanego efektu neuroprotekcyjnego.

Na tym ostatnim wykresie można zaobserwować wpływ leczenia 10 mikromolami początkowego inhibitora kinazy fosfatydylowej LY 2 9 4 0 0 2 na przeżycie komórek oraz neuroprotekcyjne działanie DOI na pozbawione surowicy komórki SK NSH. LY 2 9 4 0 0 2 zapobiegał neuroprotekcyjnemu działaniu DOI na etapie deprywacji surowicy, ale wykazywał również pewne działanie toksyczne. Po obejrzeniu tego filmu powinieneś dobrze zrozumieć, jak śledzić ochronę CTO w linii komórek neuronalnych za pomocą analizatora komórek w czasie rzeczywistym oraz nakreślić udział drugich szlaków przekaźnikowych w ochronie.