Name: Analizator komórek oparty na impedancji w czasie rzeczywistym jako narzędzie do wyznaczania szlaków molekularnych zaangażowanych w neurotoksyczność i neuroprotekcję w linii komórek neuronalnych (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-08-09T15:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 23 s
Description: Poznaj analizę impedancyjną w czasie rzeczywistym do monitorowania cytoprotekcji w liniach komórek neuronalnych. Ta metoda pozwala identyfikować szlaki drugich przekaźników zaangażowane w neuroprotekcję.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Wsparcie finansowe dla eksperymentów przedstawionych w badaniu zostało zapewnione przez program Marie Heim-Vögtlin Szwajcarskiej Narodowej Fundacji Nauki.
Dziękujemy Pani Johannie Nyffeler za opracowanie zestawu zmodyfikowanych programów MATLAB do badań przesiewowych pod kątem statystycznie istotnych różnic w danych z analizatora komórek w czasie rzeczywistym oraz dr Yama Abassi za pomocną dyskusję.

1. Przygotowanie
<ol>
	<li>Umieścić stację analizatora komórek w czasie rzeczywistym w inkubatorze do hodowli tkankowych ustawionym na temperaturę 37 °C i 5% CO2 . Wszystkie czynności związane z hodowlami komórkowymi i zabiegi farmakologiczne należy przeprowadzać w kapturze do hodowli tkankowych w sterylnych warunkach.</li>
	<li>UWAGA: Linie komórek neuronalnych wymagające innych ustawień temperatury w porównaniu ze standardowymi warunkami hodowli powinny być odpowiednio dostosowane. W przypadku słabo przylegających linii komórkowych należy użyć środków powlekających, aby ułatwić interakcję komórek ze złotymi mikroelektrodami na dnie studzienek E-Plate 96.</li>
	<li>Przygotować 1000-krotne roztwory podstawowe związków farmakologicznych do leczenia hodowli komórkowych (środki neuroprotekcyjne lub inhibitory szlaków drugiego przekaźnika w odpowiednim rozpuszczalniku – dimetylosulfotlenku lub sterylnej wodzie) i przechowywać je w temperaturze -20 °C. Rozpuszczalnik należy stosować jako nośnik w kolejnych zabiegach.</li>
	<li>Hodowla ludzkich komórek nerwiaka zarodkowego SK-N-SH w pożywce DMEM/F12 uzupełnionej 10% płodową surowicą bydlęcą (FBS) (pożywką proliferacyjną) w kolbach do hodowli komórkowych o powierzchni 175cm2 do gęstości około 75%. Utrzymuj liczbę pasaży komórkowych w zakresie (około 10 pasaży), aby zapewnić spójność między eksperymentami pod względem szybkości proliferacji komórek i odpowiedzi na cytotoksyczność. Preferowane są niższe numery przejścia.</li>
	<li>Przemyć przylegającą warstwę komórek SK-N-SH PBS i trypsynizować 0,05% roztworem trypsyny-EDTA przez 5 minut w temperaturze 37 °C. Odwirować komórki przy 170 × g przez 5 minut w celu usunięcia trypsyny. Ponownie zawiesić komórki w 10 ml pożywki proliferacyjnej. Policz komórki za pomocą licznika komórek Scepter i dostosuj liczbę komórek do 300 000 komórek/ml, rozcieńczając komórki pożywką proliferacyjną.</li>
</ol>
2. Posiewanie i proliferacja komórek SK-N-SH
<ol>
	<li>Dodać 100 μl pożywki proliferacyjnej do każdego dołka E-Plate 96 i pozostawić na 30 minut w okapie do hodowli tkankowych w temperaturze pokojowej w celu zrównoważenia. Umieścić E-Plate 96 w stacji analizatora komórek w czasie rzeczywistym w inkubatorze CO2 w temperaturze 37 °C.</li>
	<li>Uruchom oprogramowanie do analizy komórek w czasie rzeczywistym. Na stronie Układ wybierz studzienki wchodzące w skład eksperymentu i wprowadź w polach edycji informacje o typie komórki, numerze komórki, nazwach i stężeniach związków chemicznych użytych do leczenia komórek. 
	UWAGA: Do celów niniejszego protokołu zaleca się co najmniej 4 powtórzenia dla każdego zabiegu.</li>
	<li>Na stronie oprogramowania Schedule (Harmonogram) określ "Kroki" zawarte w eksperymencie, wybierając liczbę przebiegów mierzących indeks komórek i interwał między przebiegami dla każdego kroku. Ponieważ krok 1 jest z góry określony dla pomiaru tła, wybierz "Dodaj krok" i ustaw krok 2, aby mierzyć indeks komórki co 15 minut przez 96 godzin. 
	UWAGA: W przypadku zabiegów, w których spodziewane są efekty z szybką kinetyką, należy ustawić przemiatanie w krótszych odstępach czasu.</li>
	<li>Kliknij przycisk Start, aby zainicjować automatycznie określony Krok 1 i zmierzyć impedancję tła nośnika. Wartość ta jest automatycznie odejmowana przez oprogramowanie w każdym punkcie danych po dodaniu komórek do studzienek.</li>
	<li>Użyć przygotowanej wcześniej w kroku 1.5) zawiesiny komórkowej 300 000 komórek/ml w pożywce proliferacyjnej. 30 000 komórek / studzienkę do badań toksyczności komórkowej / neuroprotekcji i 15 000 komórek / studnię do badań proliferacji komórek. Wyjąć E-Plate i dodać 100 μl zawiesiny komórek na studzienkę do badań toksyczności komórek/neuroprotekcji oraz dodać 50 μl zawiesiny komórek i 50 μl pożywki proliferacyjnej na studzienkę do badań proliferacji komórek. Liczba komórek posianych w studzience musi być empirycznie zoptymalizowana dla każdej linii komórkowej.</li>
	<li>Delikatnie zakręć płytką E-Plate 96, aby równomiernie pokryć ogniwa. Pozostaw E-Plate 96 na 30 minut w okapie do hodowli tkankowej w temperaturze pokojowej, aby komórki mogły równomiernie osiąść na dnie studzienek.</li>
	<li>Włóż E-Plate 96 do stacji analizatora komórek w czasie rzeczywistym i rozpocznij krok 2 na stronie Harmonogram. Monitoruj wartości indeksu komórek przez cały czas trwania eksperymentu, wyświetlając krzywe komórek na stronie Wykres oraz nieprzetworzone dane indeksu komórek na stronie Indeks komórek w oprogramowaniu.</li>
</ol>
3. Deprywacja surowicy
<ol>
	<li>24 godziny po posianiu komórek przerwij eksperyment i wyjmij E-Plate 96 ze stacji analizatora komórek w czasie rzeczywistym. Rozcieńczyć inhibitory drugiego przekaźnika z zapasów 1,000X pożywką bez surowicy DMEM/F12 – do 200× końcowego stężenia. Na 30 minut przed rozpoczęciem cytotoksyczności należy potraktować komórki 1 μl inhibitorami drugiego szlaku przekaźnikowego, które mają być badane pod kątem ich udziału w neurotoksyczności/neuroprotekcji, w celu zahamowania odpowiednich szlaków. Zwróć E-Plate 96 do stacji i wznów eksperymentalne pomiary wskaźnika komórki.</li>
	<li>Po 30 minutach ponownie przerwij eksperyment. Ostrożnie całkowicie usunąć pożywkę proliferacyjną z dołków E-Plate 96 za pomocą pipety (lub pipety wielokanałowej), uważając, aby nie naruszyć przylegającej warstwy komórek, kierując krawędź końcówki pipety do rogu studzienki. Dodać 200 μl/studzienkę pożywki DMEM/F12 bez surowicy (pożywka deprywująca surowicę). Zapewnij szybką wymianę pożywki do hodowli komórkowych, aby zminimalizować mechaniczne poruszenie komórek.</li>
	<li>Rozcieńczyć związki, które mają być testowane pod kątem ich działania neuroprotekcyjnego, od 1,000X stock z bezsurowicowym podłożem DMEM/F12 do 200× końcowego stężenia. Dodać 1 μl związków do zbadania pod kątem ich działania neuroprotekcyjnego i 1 μl inhibitorów szlaków drugiego przekaźnika w poszczególnych studzienkach zgodnie z planem eksperymentalnym.</li>
	<li>W komórkach do badań proliferacji nie należy zmieniać podłoża. Rozcieńczone związki, które mają być badane od 1,000X do 200× końcowego stężenia w pożywce proliferacyjnej, traktować 1 μl na studzienkę i kontynuować hodowlę w pożywce proliferacyjnej.</li>
	<li>Wznów eksperyment, aby kontynuować pomiary indeksu komórek co 15 minut przez 96 godzin, jak wcześniej ustawiono.</li>
</ol>
4. Analiza danych
<ol>
	<li>W przypadku danych dotyczących neurotoksyczności/neuroprotekcji należy znormalizować indeks komórkowy do ostatniego punktu czasowego przed leczeniem farmakologicznym lub zmianą pożywki, aby zmniejszyć różnice między eksperymentami, wybierając "znormalizowany indeks komórkowy" i "normalizuj czas" na stronie wykresu.</li>
	<li>Zaznacz dołki na stronie Wykres dla interesujących warunków eksperymentalnych i kliknij "Dodaj", aby wykreślić znormalizowane krzywe indeksu komórki. Obserwuj kinetykę działania neurotoksycznego/neuroprotekcyjnego lub hamowania drugich przekaźników jako znormalizowane krzywe indeksu komórkowego w funkcji czasu.</li>
	<li>Należy obserwować krzywe indeksu komórkowego dla badanych terapii lekowych w pożywce proliferacyjnej w funkcji czasu, aby ocenić, czy wpływ na proliferację jest zaangażowany w działanie neuroprotekcyjne/neurotoksyczne.</li>
	<li>Wyeksportuj informacje eksperymentalne dla wszystkich punktów czasowych indeksu komórkowego ze strony oprogramowania do indeksu komórek do pliku Excel, aby rozpocząć ocenę statystyczną wyników 
	UWAGA: Jako pierwszy krok w analizie statystycznej zestaw zmodyfikowanych programów MATLAB, które używają testu t Welcha, z wartością p wykreśloną półlogarytmicznie, wykorzystują odwróconą oś w stosunku do skali czasu (dostarczone jako dodatkowe pliki kodu). Programy te umożliwiają wykrywanie wartości p w czasie całego eksperymentu z analizatorem komórek w czasie rzeczywistym, a tym samym pomagają w wyborze punktów czasowych do bardziej szczegółowej analizy statystycznej. Zapoznaj się z materiałami uzupełniającymi, aby uzyskać szczegółowe informacje na temat programów.</li>
	<li>W celu analizy statystycznej różnic w wartościach indeksu komórkowego w różnych warunkach leczenia w określonych punktach czasowych, wybierz wartości indeksu komórki w odpowiednich punktach czasowych z wyeksportowanego pliku Excel. Przeanalizuj wartości indeksu komórki dla wybranych punktów czasowych za pomocą jedno- lub dwuczynnikowej analizy wariancji (ANOVA), a następnie wykonaj test post-hoc przy użyciu oprogramowania statystycznego.</li>
</ol>

<ol><li>Cavallucci, V., D'Amelio, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Matter+of+life+and+death%3A+the+pharmacological+approaches+targeting+apoptosis+in+brain+diseases%5BTitle%5D)+AND+%22Curr.+Pharm.+Des%22%5BJournal%5D)">Matter of life and death: the pharmacological approaches targeting apoptosis in brain diseases.</a> Curr. Pharm. Des. 17 (3), 215-229 (2011).</li>
<li>Bull, S. HPA CHaPD 001: Review of Environmental Chemicals and Neurotoxicity. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aBull%2C+S+%22Focus+on+Neurological+Diseases%22">Focus on Neurological Diseases</a>. , Health Protection Agency. (2007).</li>
<li>Ke, N., Wang, X., Xu, X., Abassi, Y. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+xCELLigence+system+for+real-time+and+label-free+monitoring+of+cell+viability%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol.+Biol%22%5BJournal%5D)">The xCELLigence system for real-time and label-free monitoring of cell viability.</a> Methods Mol. Biol. 740, 33-43 (2011).</li>
<li>Limame, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comparative+analysis+of+dynamic+cell+viability%2C+migration+and+invasion+assessments+by+novel+real-time+technology+and+classic+endpoint+assays%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Comparative analysis of dynamic cell viability, migration and invasion assessments by novel real-time technology and classic endpoint assays.</a> PLoS One. 7 (10), e46536(2012).</li>
<li>Diemert, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Impedance+measurement+for+real-time+detection+of+neuronal+cell+death%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurosci.+Methods%22%5BJournal%5D)">Impedance measurement for real-time detection of neuronal cell death.</a> J. Neurosci. Methods. 203 (1), 69-77 (2012).</li>
<li>Kustermann, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+label-free%2C+impedance-based+real+time+assay+to+identify+drug-induced+toxicities+and+differentiate+cytostatic+from+cytotoxic+effects%5BTitle%5D)+AND+%22Toxicol+In+Vitro%22%5BJournal%5D)">A label-free, impedance-based real time assay to identify drug-induced toxicities and differentiate cytostatic from cytotoxic effects.</a> Toxicol In Vitro. 27 (5), 1589-1595 (2013).</li>
<li>Marinova, Z., Walitza, S., Grünblatt, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((5-HT2A+serotonin+receptor+agonist+DOI+alleviates+cytotoxicity+in+neuroblastoma+cells%3A+role+of+the+ERK+pathway%5BTitle%5D)+AND+%22Prog.+Neuropsychopharmacol.+Biol.+Psychiatry%22%5BJournal%5D)">5-HT2A serotonin receptor agonist DOI alleviates cytotoxicity in neuroblastoma cells: role of the ERK pathway.</a> Prog. Neuropsychopharmacol. Biol. Psychiatry. 44, 64-72 (2013).</li>
<li>González-Maeso, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hallucinogens+recruit+specific+cortical+5-HT%282A%29+receptor-mediated+signaling+pathways+to+affect+behavior%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Hallucinogens recruit specific cortical 5-HT(2A) receptor-mediated signaling pathways to affect behavior.</a> Neuron. 53 (3), 439-452 (2007).</li>
<li>Tsuchioka, M., Takebayashi, M., Hisaoka, K., Maeda, N., Nakata, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Serotonin+%285-HT%29+induces+glial+cell+line-derived+neurotrophic+factor+%28GDNF%29+mRNA+expression+via+the+transactivation+of+fibroblast+growth+factor+receptor+2+%28FGFR2%29+in+rat+C6+glioma+cells%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurochem%22%5BJournal%5D)">Serotonin (5-HT) induces glial cell line-derived neurotrophic factor (GDNF) mRNA expression via the transactivation of fibroblast growth factor receptor 2 (FGFR2) in rat C6 glioma cells.</a> J. Neurochem. 106 (1), 244-257 (2008).</li>
<li>Galante, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Differential+toxicity%2C+conformation+and+morphology+of+typical+initial+aggregation+states+of+A%CE%B21-42+and+A%CE%B2py3-42+beta-amyloids%5BTitle%5D)+AND+%22Int.+J.+Biochem.+Cell.+Biol%22%5BJournal%5D)">Differential toxicity, conformation and morphology of typical initial aggregation states of Aβ1-42 and Aβpy3-42 beta-amyloids.</a> Int. J. Biochem. Cell. Biol. 44 (11), 2085-2093 (2012).</li>
<li>Sheline, C. T., Cai, A. L., Zhu, J., Shi, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Serum+or+target+deprivation-induced+neuronal+death+causes+oxidative+neuronal+accumulation+of+Zn2%2Band+loss+of+NAD%5BTitle%5D)+AND+%22Eur.+J.+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Serum or target deprivation-induced neuronal death causes oxidative neuronal accumulation of Zn2+and loss of NAD.</a> Eur. J. Neurosci. 32, 894-904 (2010).</li>
</ol>

Koszty publikacji obecnego artykułu wideo zostały sfinansowane przez "ACEA Biosciences".

Obecny protokół przedstawia użyteczność analizatora komórek w czasie rzeczywistym do ciągłej i bezznacznikowej oceny neuroprotekcyjnego/neurotoksycznego działania związków w liniach komórek neuronalnych oraz do uzyskania wglądu w szlaki drugiego przekaźnika zaangażowane w efekt.
Mimo że narzędzie analizatora komórek w czasie rzeczywistym do badania cytotoksyczności i wpływu leków na proliferację komórek jest ogólnie uznawane, tylko w kilku badaniach zastosowano go w typach komórek związanych z...

Śmierć komórek nerwowych odgrywa kluczową rolę w patofizjologii wielu zaburzeń związanych z mózgiem1. Dostępność wiarygodnych i wysokoprzepustowych testów toksyczności in vitro ma kluczowe znaczenie dla uzyskania lepszego wglądu w mechanizmy neurotoksyczności i pomocy w wyborze cząsteczek neuroprotekcyjnych jako kandydatów terapeutycznych w procesie opracowywania leków2. Istnieje jednak wiele ograniczeń w stosunku do najczęściej stosowanych testów neurotoksyczności in vitro. Oceniają neurotoksyczność/neuroprotekcję w jednym punkcie czasowym, który nie pozwala na rozwiązanie kinetyczne; Często stosuje się znacznik lub sondę, które mogą zakłócać szlaki sygnałowe i ograniczać dodatkowe badania w tej samej populacji komórek, a także często są pracochłonne, a w wielu przypadkach nie zapewniają wglądu mechanistycznego. W niniejszym badaniu pokazujemy przydatność analizatora komórkowego opartego na impedancji w czasie rzeczywistym do określania neurotoksyczności i neuroprotekcji w linii komórek neuronalnych w czasie rzeczywistym i w warunkach wolnych od znaczników oraz do zapewnienia wglądu w dalsze mechanizmy poprzez analizę szlaków drugiego przekaźnika zaangażowanych w efekt.
Poprzednie badania potwierdziły trafność analizatora komórek w czasie rzeczywistym do określenia cytotoksyczności, jak również wpływu na proliferację komórek w liniach komórkowych w porównaniu ze standardowymi technikami3,4,5,6. Na przykład zaobserwowano dobrą korelację między odczytami standardowego testu żywotności komórek WST-1 a wartościami indeksu komórkowego w kilku punktach czasowych w warunkach podstawowej proliferacji i po dwóch różnych paradygmatach toksyczności w komórkach HeLa3. W komórkach A549 i MDA-MB-231 proliferacja i cytotoksyczność wywołane stabilizatorem mikrotubul paklitakselem wykazywały bardzo podobne wartości w ocenie za pomocą pomiarów wskaźnika komórkowego i standardowo stosowanego testu sulforodaminy B (SRB)4. W linii komórek neuronalnych unieśmiertelnionych neuronów hipokampa pomiary wskaźnika komórkowego HT-22 zostały zweryfikowane pod kątem ich zdolności do wykrywania proliferacji komórek, cytotoksyczności glutaminianu i cytoprotekcji przed szeroko stosowanym testem bromku 3-(4,5-dimetylotiazol-2-ylo)2,5-difenylotetrazoliu (MTT)5. W tym samym badaniu wyniki testu MTT i pomiary indeksu komórkowego również dobrze korelowały w pomiarze proliferacji neuronalnych komórek progenitorowych, cytotoksyczności po deprywacji czynników wzrostu i ratowaniu cytotoksyczności przez inhibitor pankaspazy QVD5. Cytotoksyczność indukowana w komórkach NIH 3T3 przez wandetanib (receptor czynnika wzrostu śródbłonka naczyniowego i inhibitor receptora naskórkowego czynnika wzrostu) wykazała podobne wyniki mierzone za pomocą wartości indeksu komórkowego lub testu wychwytu czerwieni obojętnej6.
Ostatnio korzystaliśmy z systemu analizatora komórek w czasie rzeczywistym do oceny neuroprotekcyjnych efektów agonisty receptora serotoninowego 2A (5-HT2A) (±)-2,5-dimetoksy-4-jodoamfetaminy (DOI) w linii komórek neuronalnych (komórki SK-N-SH) i przeprowadziliśmy badania przesiewowe pod kątem udziału szlaków drugiego przekaźnika poprzez monitorowanie wpływu ich chemicznego hamowania na obserwowaną neuroprotekcję7. Co ciekawe, receptor 5-HT2A ma zarówno halucynogennych, jak i niehalucynogennych agonistów (takich jak odpowiednio DOI i lisuride), które mogą aktywować zarówno wspólne, jak i odrębne szlaki drugiego przekaźnika.
Zaletą prezentowanej techniki jest to, że pozwala ona na zbieranie w czasie rzeczywistym informacji o przeżywalności komórek w ciągu kilku dni, na wytyczanie zaangażowanych ścieżek drugiego przekaźnika, na ocenę możliwego wpływu efektów proliferacji na neuroprotekcję, oraz na wybór optymalnego czasu dla dodatkowych badań punktu końcowego na tej samej populacji komórek. Schemat ideowy przepływu pracy w bieżącym protokole przedstawiono na rysunku 1.

<table><tbody><tr><td>xCELLigence&nbsp; Pakiet systemu RTCA SP</td><td>ACEA Biosciences</td><td>nr: 00380601030</td><td>Składa się z analizatora RTCA, stacji RTCA SP i jednostki sterującej RTCA</td></tr><tr><td>E-plate 96</td><td>ACEA Biosciences</td><td>Nr: 05232368001</td><td>Do hodowli komórek, wstawione do stacji RTCA</td></tr> SP <tr><td>SK-N-SH komórki ATCC</td><td>(we współpracy z LGC Standards)</td><td>HTB-11</td><td>Może być zastąpiony przez inną adherentną linię komórek neuronalnych DMEM</td></tr><tr><td>/F12&nbsp;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D8437</td><td>Pożywka do hodowli komórkowych</td></tr><tr><td>Surowica bydlęca</td> płodu <td>Life Technologies</td><td>16140-063</td><td>Suplementy proliferacji, ale nie pożywka do deprywacji surowicy</td></tr><tr><td>Kolba do hodowli tkanek T175</td><td>Sarstedt</td><td>83.1812.302</td><td>Do hodowli komórek, które zostaną później posiane na E-Plate 96</td></tr><tr><td>0,05% Trypsyna-EDTA</td><td>Life Technologies</td><td>25300-054</td><td>Do trypsynizacji komórek hodowanych w kolbach do hodowli tkankowych</td></tr><tr><td>Licznik komórek Scepter 2.0</td><td>Merck Millipore</td><td>PHCC20060</td><td>Automatyczny licznik komórek</td></tr><tr><td>Sól fizjologiczna buforowana fosforanami</td><td>Life Technologies</td><td>10010-015</td><td>Do mycia komórek</td></tr><tr><td>(&plusmn;)-DOI chlorowodorek</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D101</td><td>Agonista 5-HT2A do leczenia hodowli komórkowych</td></tr><tr><td>Chlorowodorek LY-294002</td><td>Inhibitor Sigma-Aldrich</td><td>L9908</td><td>PI3-K do leczenia hodowlami komórkowymi&nbsp;</td></tr><tr><td>Maleinian lizurydu</td><td>Tocris Bioscience</td><td>4052</td><td>Związek o agonistycznej aktywności 5-HT2A do leczenia hodowli komórkowych</td></tr><tr><td>Dimetylosulfotlenek</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D4540</td><td>Do rozpuszczania LY-294002 i maleinianu lizurydu</td></tr></tbody></table>

analizator komórek oparty na impedancji w czasie rzeczywistym jako narzędzie do wyznaczania szlaków molekularnych zaangażowanych w neurotoksyczność i neuroprotekcję w linii komórek neuronalnych

Real-Time Impedance-based Cell Analyzer as a Tool to Delineate Molecular Pathways Involved in Neurotoxicity and Neuroprotection in a Neuronal Cell Line

Wiele zaburzeń związanych z mózgiem ma w swojej patofizjologii udział w śmierci komórek neuronalnych. Ulepszone modele in vitro do badania neuroprotekcyjnego lub neurotoksycznego działania leków i związanych z nimi szlaków pomogłyby w uzyskaniu wglądu w molekularne mechanizmy neuroprotekcji/neurotoksyczności i mogłyby potencjalnie ułatwić opracowywanie leków. Jednak wiele istniejących testów toksyczności in vitro ma poważne ograniczenia – większość z nich ocenia neurotoksyczność i neuroprotekcję w jednym punkcie czasowym, nie pozwalając na obserwację przebiegu w czasie i kinetyki efektu. Ponadto ogromne znaczenie miałaby możliwość gromadzenia w czasie rzeczywistym informacji na temat dalszych szlaków sygnałowych zaangażowanych w neuroprotekcję. W obecnym protokole opisujemy zastosowanie analizatora komórkowego opartego na impedancji w czasie rzeczywistym do określenia neuroprotekcyjnego działania agonistów receptora serotoniny 2A (5-HT2A) w linii komórek neuronalnych w warunkach bezznacznikowych i w czasie rzeczywistym przy użyciu pomiarów impedancji. Ponadto wykazaliśmy, że inhibitory szlaków drugiego przekaźnika mogą być wykorzystywane do wyznaczania cząsteczek biorących udział w działaniu neuroprotrotekcy. Opisujemy również przydatność tej techniki do określenia, czy wpływ na proliferację komórek przyczynia się do obserwowanego efektu neuroprotekcyjnego. System wykorzystuje specjalne płytki mikroelektroniczne zwane E-Plates, które zawierają naprzemienne złote układy mikroelektrod na dolnej powierzchni studni, służąc jako czujniki ogniw. Odczyt impedancji jest modyfikowany przez liczbę przylegających komórek, żywotność komórek, morfologię i adhezję. Bezwymiarowy parametr o nazwie Cell Index pochodzi z pomiarów impedancji elektrycznej i służy do reprezentowania stanu ogniwa. Ogólnie rzecz biorąc, analizator komórek oparty na impedancji w czasie rzeczywistym pozwala na bezznacznikową ocenę neuroprotekcji i neurotoksyczności w czasie rzeczywistym oraz ocenę zaangażowania szlaków drugiego przekaźnika, przyczyniając się do bardziej szczegółowej i wysokoprzepustowej oceny potencjalnych związków neuroprotekcyjnych in vitro w celu wyboru kandydatów terapeutycznych.

Pozbawienie surowicy prowadzi do spadku wartości wskaźnika komórkowego (Cell Index), co można monitorować w sposób ciągły za pomocą analizatora komórkowego w czasie rzeczywistym
Bodźce neurotoksyczne działające na komórki prowadzą do spadku wartości wskaźnika Cell Index, co można monitorować w czasie rzeczywistym za pomocą przedstawionej techniki, a dynamika tego procesu zależy od konkretnego bodźca neurotoksycznego oraz badanego typu komórek. Rysunek 2 przeds...

Ulepszone testy neurotoksyczności in vitro pomogłyby w identyfikacji nowych związków neuroprotekcyjnych. Przedstawiono przydatność analizatora komórkowego opartego na impedancji w czasie rzeczywistym do określania cytotoksyczności i cytoprotekcji w liniach komórek neuronalnych oraz do wyznaczania udziału szlaków drugiego przekaźnika, uzyskując w ten sposób wgląd w mechanizm neuroprotekcji.

Analizator komórek oparty na impedancji w czasie rzeczywistym jako narzędzie do wyznaczania szlaków molekularnych zaangażowanych w neurotoksyczność i neuroprotekcję w linii komórek neuronalnych

Many brain-related disorders have neuronal cell death involved in their pathophysiology. Improved in vitro models to study neuroprotective or neurotoxic ...

Ogólnym celem niniejszej procedury jest wykorzystanie techniki opartej na impedancji do monitorowania w czasie rzeczywistym cytoprotekcji linii komórek neuronalnych w celu określenia roli szlaków drugich przekaźników w procesie ochrony. Jest to realizowane poprzez wstępne hodowanie linii komórek neuronalnych w warunkach proliferacyjnych w analizatorze komórkowym czasu rzeczywistego opartym na impedancji. W drugim kroku, potencjalnie istotne.Przed zastosowaniem działań neuroprotekcyjnych w linii komórkowej przeprowadza się farmakologiczną inhibicję szlaków wtórnych przekaźników. Następnie, przy użyciu analizatora komórek w czasie rzeczywistym, monitoruje się stan neuronalnej linii komórkowej w różnych warunkach eksperymentalnych. Ostatecznie można wykorzystać analizę statystyczną, aby ocenić udział szlaków wtórnych przekaźników w cytoprotekcji komórek neuronalnych w czasie rzeczywistym.Główną zaletą tej techniki w porównaniu z istniejącymi metodami, takimi jak testy neurotoksyczności punktu końcowego, jest to, że pozwala ona na ocenę ochrony i toksyczności w liniach komórek neuronalnych w czasie rzeczywistym i bez użycia znaczników. Metoda ta może pomóc w szybkim uzyskaniu odpowiedzi na pytania w dziedzinie biologii molekularnej neuronów, przyczyniając się do bardziej wysokoprzepustowej oceny potencjalnych związków neuroprotekcyjnych in vitro oraz dostarczając wglądu w molekularne mechanizmy zaangażowane w neuroprotekcję. Należy rozpocząć od przemycia warstwy adherentnej linii komórek neuronalnych. Przykładowo, w tym przypadku komórki ludzkiego neuroblastoma S-K-N-S-H są przemywane roztworem PBS, a następnie poddawane trypsynizacji przez pięć minut w temperaturze 37 °C.Usuń trypsynę poprzez wirowanie, a następnie ponownie zawieś komórki w 10 ml medium proliferacyjnego. Po policzeniu komórek rozcieńcz je do stężenia 3 × 10⁵ komórek/ml, dodając więcej medium proliferacyjnego, a następnie w komorze z laminarnym przepływem powietrza w temperaturze pokojowej wprowadź do każdego dołka płytki EPL 96 100 µL medium proliferacyjnego w celu równowagi. Po 30 minutach umieść płytkę EPL 96 w stacji analizatora komórek w czasie rzeczywistym w inkubatorze z CO2 w temperaturze 37 °C i uruchom oprogramowanie analizatora komórek w czasie rzeczywistym.Następnie na stronie układu (layout) należy wybrać odpowiednie dołki do eksperymentu i wprowadzić typ komórek, liczbę komórek oraz nazwy i stężenia interesujących związków chemicznych w polach edycyjnych na stronie oprogramowania do harmonogramowania, ponieważ krok pierwszy jest ustawiony domyślnie. W celu pomiaru tła należy wybrać opcję dodaj krok i ustawić krok drugi tak, aby mierzył wskaźnik komórkowy (cell index) co 15 minut przez 96 godzin. Następnie należy kliknąć start, aby zainicjować krok pierwszy i zmierzyć impedancję tła medium.Następnie należy usunąć EPL i dodać 100 µL zawiesiny komórek neuroblastoma. Delikatnie zakręć płytkę EPL 96 w każdym studzienku eksperymentalnym, aby równomiernie pokryć ich powierzchnię, a następnie inkubuj płytkę w temperaturze pokojowej w dygestorium do hodowli tkanek, aby umożliwić osiadanie komórek. Po pół godzinie umieść płytkę EPL 96 z powrotem w stacji analizatora komórek w czasie rzeczywistym i rozpocznij drugi krok. Aby monitorować wartości indeksu komórkowego w trakcie całego eksperymentu, analizuj krzywe komórkowe na stronie wykresu oraz surowe dane indeksu komórkowego na stronie indeksu komórkowego przez 24 godziny.Po wysianiu komórek należy wstrzymać eksperyment i wyjąć płytkę ze stacji analizatora komórek w czasie rzeczywistym. Do każdej studzienki należy nanieść 1 µL świeżo rozcieńczonych inhibitorów, a następnie po ponownym włożeniu EPL 96 wznowić pomiary indeksu komórkowego po 30 minutach. Następnie należy ponownie wstrzymać eksperyment i szybko, lecz ostrożnie usunąć pożywkę do proliferacji z każdej studzienki, kierując krawędź końcówki pipety w stronę narożnika studzienki, aby uniknąć naruszenia przylegającej warstwy komórek. Bezzwłocznie należy dodać do każdej studzienki 200 µL pożywki do deprywacji surowicy, 1 µL świeżo rozcieńczonych związków neuroprotekcyjnych oraz 1 µL inhibitorów szlaków wtórnych przekaźników do odpowiednich studzienek.Następnie kontynuuj pomiary indeksu komórkowego co 15 minut przez 96 godzin zgodnie z wcześniejszymi ustawieniami. Aby przeanalizować dane, wybierz na stronie wykresu funkcje znormalizowanego indeksu komórkowego (normalized cell index) oraz znormalizowanego czasu (normalized time), aby znormalizować indeks komórkowy do ostatniego punktu czasowego przed wprowadzeniem modyfikacji w hodowli komórkowej. Pozwoli to zredukować zmienność między eksperymentami. Zaznacz na stronie wykresu studzienki odpowiadające interesującym warunkom eksperymentalnym i kliknij „dodaj”, aby wykreślić krzywe znormalizowanego indeksu komórkowego.Następnie wyeksportuj dane eksperymentalne dla wszystkich punktów czasowych indeksu komórkowego ze strony oprogramowania do indeksu komórkowego do pliku arkusza kalkulacyjnego, aby przeprowadzić analizę statystyczną różnic w wartościach indeksu komórkowego w różnych warunkach traktowania w określonych punktach czasowych. W wyeksportowanym pliku arkusza kalkulacyjnego zaznacz wartości indeksu komórkowego dla odpowiednich punktów czasowych. Na koniec, za pomocą oprogramowania statystycznego, przeanalizuj wartości indeksu komórkowego dla wybranych punktów czasowych, stosując jednoczynnikową lub dwuczynnikową analizę wariancji (ANOVA), a następnie test post hoc. Bodźce neurotoksyczne podane komórkom prowadzą do spadku wartości indeksu komórkowego; na poniższych wykresach przedstawiono wzrost indeksu komórkowego w przypadku hodowli komórek S-K-N-S-H w medium proliferacyjnym oraz spadek indeksu komórkowego, po którym następuje stabilizacja na nowym, niższym poziomie po przeniesieniu komórek do medium z deprywacją surowicy.Można zaobserwować efekt neuroprotekcyjny dwóch agonistów receptora serotoninowego 2A: 5 µM DOI oraz 20 µM IDE, dodanych w momencie karmienia komórek pożywką z deprywacją surowicy. Ważną kwestią w badaniach nad neuroprotekcją jest to, czy wpływ na proliferację komórek przyczynia się do obserwowanego efektu związku na przeżywalność komórek. Na tym wykresie pokazano brak wpływu traktowania 5 µM DOI na proliferację komórek SKNS, co sugeruje, że proliferacja nie przyczynia się do obserwowanego efektu neuroprotekcyjnego.Na tym ostatnim wykresie można zaobserwować wpływ traktowania 10 µM inhibitorem fosfatydyloinozytolo-3-kinazy LY 2 9 4 0 0 2 na przeżywalność komórek oraz efekt neuroprotekcyjny DOI w komórkach SK NSH pozbawionych surowicy. LY 2 9 4 0 0 2 zapobiegał efektowi neuroprotekcyjnemu DOI w fazie deprywacji surowicy, ale wykazał również własny efekt toksyczny. Po obejrzeniu tego filmu powinni Państwo posiadać wiedzę na temat monitorowania ochrony CTO w neuronalnej linii komórkowej przy użyciu analizatora komórek w czasie rzeczywistym oraz określania roli szlaków wtórnych przekaźników w procesie ochrony.

real-time-impedance-based-cell-analyzer-as-tool-to-delineate

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Neuronauka

Analizator komórki oparty na impedancji w czasie rzeczywistym jako narzędzie do określenia ścieżek molekularnych zaangażowanych w neurotoksyczność i neuroprotekcję w linii komórek neuronowych

W tym filmie pokazujemy proces monitorowania zdarzeń komórkowych w czasie rzeczywistym, w tym proliferację przylegających komórek, za pomocą testu impedancji komórkowej. W tym przypadku przylegające ogniwa działają jak izolatory, ograniczając przepływ prądu między elektrodami i zwiększając impedancję.

Analiza oparta na impedancji komórkowej do monitorowania procesów komórkowych w czasie rzeczywistym

Źródło: Mudduluru, G.,  et. al. Oparty na impedancji pomiar migracji i inwazji komórek rakowych w czasie rzeczywistym. J. Vis. Exp. (2020)Ten film przedstawia test oparty na impedancji do pomiaru inwazji i migracji komórek glejaka. Komórki degradują macierz zewnątrzkomórkową, przemieszczają się przez mikroporowate błony i przylegają do elektrod, generując impedancję. Ta analiza w czasie rzeczywistym odzwierciedla ich potencjał inwazyjny w zastosowaniach badawczych nad rakiem.

Pomiary inwazji komórek raka mózgu oparte na impedancji

Ten protokół omawia Wykrywanie Impedancji Elektrycznej Komórki, metodę rejestrowania i analizy widma impedancji przylegających komórek do ilościowego określenia przyczepienia, proliferacji, ruchliwości i reakcji komórkowych na bodźce farmakologiczne i toksyczne. Położono nacisk na wykrywanie przepuszczalności śródbłonka oraz ocenę kontaktów komórka-komórka i komórka-substrat.

Wykrywanie impedancji substratu elektrycznego podłoża komórkowego w celu ilościowego określenia proliferacji śródbłonka, funkcji bariery i ruchliwości

Ten manuskrypt opisuje, jak przygotować płynowe biochipy z komórkami nabłonkowymi skrzeli pstrąga tęczowego do użycia w przenośnym czujniku impedancji podłoża elektrycznego ogniwa.  Opisano również protokół przeprowadzania szybkiego testu toksyczności wody pitnej za pomocą czujnika.

Przygotowanie i testowanie opartych na impedancji biochipów fluidycznych z ogniwami RTgill-W1 do szybkiej oceny próbek wody pitnej pod kątem toksyczności

Tutaj opisujemy mysi model bariery krew-mózg in vitro, który wykorzystuje impedancję spektroskopii komórek, koncentrując się na konsekwencjach dla integralności i przepuszczalności komórek śródbłonka po interakcji z aktywowanymi limfocytami T.

Model in vitro bariery krew-mózg przy użyciu spektroskopii impedancyjnej: skupienie się na interakcji limfocytów T z komórkami śródbłonka

Rak jest chorobą śmiertelną ze względu na jego zdolność do dawania przerzutów do różnych narządów. Określenie zdolności komórek nowotworowych do migracji i inwazji w różnych warunkach leczenia ma kluczowe znaczenie dla oceny strategii terapeutycznych. Protokół ten przedstawia metodę oceny zdolności przerzutowych linii komórkowej raka glejaka w czasie rzeczywistym.

Oparty na impedancji pomiar migracji i inwazji komórek rakowych w czasie rzeczywistym

Opisujemy podejście do wykrywania i przechwytywania inwazyjnych subpopulacji komórek w czasie rzeczywistym. Projekt eksperymentalny wykorzystuje analizę komórkową w czasie rzeczywistym poprzez monitorowanie zmian impedancji elektrycznej komórek. Można wychwycić inwazyjne komórki nowotworowe, immunologiczne, śródbłonkowe lub zrębowe w złożonych tkankach i ocenić wpływ kokultur.

Wykrywanie i wychwytywanie w czasie rzeczywistym inwazyjnych subpopulacji komórek z kokultur

Tutaj pokazujemy użycie komórkowej impedancji elektrycznej (CEI) jako bardzo łatwej i prostej metody badania infekcji wirusem Zika i jego replikacji w ludzkich komórkach w czasie rzeczywistym. Ponadto test CEI jest przydatny do oceny związków przeciwwirusowych.

Komórkowa platforma impedancji elektrycznej do oceny inhibitorów wirusa Zika w czasie rzeczywistym

Tutaj demonstrujemy technikę korzystania z biosensorów opartych na impedancji: ECIS i cellZscope, do pomiaru siły bariery śródbłonka mózgu. Szczegółowo opisujemy przygotowanie i technikę dodawania różnych bodźców do modelu śródbłonka mózgu in vitro. Mierzymy, rejestrujemy i przedstawiamy reprezentatywną analizę wyników.

Pomiar zmian w integralności bariery śródbłonka mózgu za pomocą dwóch bioczujników opartych na impedancji w odpowiedzi na komórki nowotworowe i cytokiny

Opracowaliśmy program komputerowy do analizy morfologii neuronów. W połączeniu z dwoma istniejącymi narzędziami analitycznymi o otwartym kodzie źródłowym, nasz program przeprowadza analizę Sholla oraz określa liczbę neurytów, punktów rozgałęzień i zakończeń neurytów. Analizy są wykonywane w taki sposób, aby można było obserwować lokalne zmiany w morfologii neurytów.

Zautomatyzowana analiza Sholla zdigitalizowanej morfologii neuronów w wielu skalach

Poznaj analizę impedancyjną w czasie rzeczywistym do monitorowania cytoprotekcji w liniach komórek neuronalnych. Ta metoda pozwala identyfikować szlaki drugich przekaźników zaangażowane w neuroprotekcję.

Analizator komórek oparty na impedancji w czasie rzeczywistym jako narzędzie do wyznaczania szlaków molekularnych zaangażowanych w neurotoksyczność i neuroprotekcję w linii komórek neuronalnych (Wideo) | JoVE Journal

Analizator komórek oparty na impedancji w czasie rzeczywistym jako narzędzie do wyznaczania szlaków molekularnych zaangażowanych w neurotoksyczność i neuroprotekcję w linii komórek neuronalnych

Przeglądaj więcej filmów