Przewodnik po jednojednostkowym zapisie in vivo z optogenetycznie zidentyfikowanych korowych interneuronów hamujących

Ogólnym celem poniższego eksperymentu jest uzyskanie wysokiej jakości zewnątrzkomórkowych nagrań pojedynczych jednostek z neuronów korowych u myszy z ekspresją korzenia kanału w drugim. Osiąga się to poprzez przepuszczenie elektrody rejestrującej o wysokiej impedancji przez tkankę w celu identyfikacji neuronów między neuronami w wyniku gwałtownych reakcji na impulsy światła niebieskiego. Sygnał elektryczny jest monitorowany pod kątem zmian, które wskazują na odpowiednią szybkość wyprzedzenia i prawdopodobieństwo uzyskania stabilnego, dobrze izolowanego zapisu.

Jeśli nie można osiągnąć dobrej izolacji pojedynczej jednostki lub odwrotnie, rzadko spotyka się neurony reagujące na światło, wymień elektrodę rejestrującą. Wyniki pokazują niezawodność światła wywołującego reakcje od optycznie zidentyfikowanych neuronów oraz typowy stosunek sygnału do szumu uzyskany za pomocą tej strategii. Podejście oparte na fotostymulacji jest dostępnym i niedrogim sposobem celowania w genetycznie zidentyfikowane typy komórek przy użyciu standardowego wzmacniacza zewnątrzkomórkowego i niebieskiego światła.

Jest to nasza strategia odpicowania określonych neuronów wewnętrznych w znieczuleniu kory słuchowej, ale bardziej ogólne punkty dotyczą innych obszarów korowych niż rzadkie typy komórek Aby rozpocząć tę procedurę. Po znieczuleniu zwierzęcia koktajlem ketaminy meine poprzez wstrzyknięcie dootrzewnowe, umieść je w stereotaktycznym lub innym aparacie do trzymania głowy, upewnij się, że czaszka jest dobrze zabezpieczona. Jest to niezbędne do utrzymania stabilnych zapisów pojedynczych komórek.

Następnie nałóż maść okulistyczną na oczy, aby zapobiec wysuszeniu i utrzymać temperaturę ciała zwierzęcia na poziomie 37 stopni Celsjusza, aby wykonać drenaż mostka CI w celu dodatkowej stabilności zapisu, usuń tkankę z tylnej części czaszki za pomocą ostrza skalpela, aby odsłonić kręty mostek CI. Następnie wykonaj małe nacięcie w Dorze czubkiem ostrza, aby odsączyć płyn mózgowo-rdzeniowy. Teraz za pomocą skalpela wykonaj małą kraniotomię nad obszarem zainteresowania kory mózgowej.

Następnie usuń oponę twardą, a następnie przykryj odsłoniętą korę warstwą ciepłych aros. Utrzymuj agros wilgotny solą fizjologiczną. Przygotuj elektrodę do stania na językach.

Przyklej elektrodę do szklanej rurki kapilarnej za pomocą super kleju i akceleratora. Następnie dodaj rurkę termokurczliwą do chwytania. Następnie zamontuj elektrodę na zmotoryzowanym lub hydraulicznym manipulatorze mikrom i ustaw ją tak, aby poruszała się prostopadle do powierzchni kory mózgowej.

Wsuń przewód uziemiający pod skórę przy czaszce. Unikaj kontaktu z mięśniami z boku głowy i z tyłu szyi, ponieważ mogą one generować artefakty miograficzne. Sygnał elektryczny jest wzmacniany za pomocą wzmacniacza zewnątrzkomórkowego odpowiedniego do nagrywania pojedynczego urządzenia, najlepiej wyposażonego w tryb sprawdzania impedancji.

Bieżąca aktywność skokowa jest monitorowana za pomocą dwóch oscyloskopów i zestawu zasilanych głośników. Teraz przeprowadź elektrodę przez agros i przetestuj jej impedancję, aby upewnić się, że mieści się w zakresie od siedmiu do 14 megaomów. Gdy końcówka naruszy powierzchnię kory, wyzeruj tę pozycję na manipulatorze mikrom.

Aby jak najlepiej oszacować głębokość zapisu, potwierdź wzrokowo, że końcówka elektrody wychodzi z powierzchni kory mózgowej na głębokości zera. Podczas wycofywania elektrody pod koniec penetracji w korze słuchowej w celu upewnienia się, że ta nastawa zerowa odpowiada poziomowi kory mózgowej, monitoruje potencjały pola wywołanego bodźcem. Przesuwając elektrodę przez pierwsze kilkaset mikrometrów tkanki, upewnij się, że polaryzacja potencjału pola lokalnego odwraca się na głębokości 100 mikrometrów.

Następnie zamontuj światłowód sprzężony ze źródłem niebieskiego światła na ręcznym mikromanipulatorze. Reguluj moc wyjściową źródła światła za pomocą jednostki sterującej zdolnej do dostarczania ciągu impulsów TTL o określonej szerokości i czasie trwania. Następnie monitoruj sygnał na obu oscyloskopach.

Zmierz całkowitą moc światła na końcówce światłowodu za pomocą miernika mocy. Użyj tej wartości, aby obliczyć natężenie promieniowania, dzieląc je przez pole przekroju poprzecznego rdzenia włókna. Zacznij od wartości w zakresie od 10 do 15 miliwatów na milimetr kwadratowy.

Za pomocą mikroskopu umieść końcówkę włókna jak najbliżej powierzchni aros. Wyśrodkuj wiązkę w miejscu, w którym elektroda wejdzie w tkankę. Teraz sprawdź, czy nie ma artefaktów świetlnych za pomocą elektrody w aros.

Dostarcz napięcie pulsu. Wyeliminuj wszelkie przejściowe artefakty świetlne, zmieniając położenie światłowodu względem elektrody, aby zmienić kąt padającego światła. Jeśli artefakty utrzymują się, spróbuj zmniejszyć moc światła.

Następnie powoli przesuwaj elektrodę przez mózg z szybkością około jednego mikrometra na sekundę. Użyj jednego oscyloskopu do monitorowania bieżącej aktywności elektrody. Drugi służy do wyzwalania impulsów laserowych.

Posłuchaj słabego skrótu światła wywołanego skokami na monitorze audio, co wskazuje, że elektroda zbliża się do dodatniego ogniwa opsyny kanałowej. Następnie zwolnij tempo postępu, gdy tylko pojawi się światło. Skoki są na tyle duże, że można je wyzwolić indywidualnie na oscyloskopie.

Zacznij to robić. Dostosuj skalę na osi poziomej, aby obserwować dokładny kształt fali skokowej. W tym momencie zatrzymaj przesuwanie elektrody i poczekaj, aż osiądzie w tkance.

Ma to kluczowe znaczenie dla stabilnego nagrania. Po kilku minutach, jeśli stosunek sygnału do szumu nie uległ poprawie, przesuń się o pięć mikrometrów dalej i poczekaj. Ponownie powtarzaj ten proces, aż szczyt lub dolina potencjału czynnościowego będzie mógł zostać niezawodnie uchwycony za pomocą progu napięcia.

Ustaw znacznie powyżej poziomu szumów podczas nagrywania. Monitoruj bieżącą aktywność na pierwszym oscyloskopie. Jednocześnie zwróć uwagę na wielkość i kształt kolców za pomocą drugiego oscyloskopu i zwróć uwagę na jakość ich dźwięku na głośniku.

Nasłuchuj uważnie nagłych zmian, które wskazują, że ogniwo albo zbliża się zbyt blisko elektrody, albo oddala się. Jeśli kolce staną się duże i zniekształcone, wycofaj elektrodę. Jeśli staną się mniejsze, przesuń elektrodę.

Poruszaj się powoli w dwóch krokach mikrometrowych, aby potwierdzić jakość kolców. Nałóż cały przebieg spajka na szeroki zakres wartości progowych. Powinien być widoczny tylko jeden spójny kształt kolca o jednolitej wysokości.

Większość ogniw fotowoltaicznych dodatnich może wytrzymać zapłon przez pełną jedną sekundę. Jeśli sygnał zostanie zanieczyszczony kolcami z sąsiedniego neuronu, przesuń elektrodę i szukaj nowej komórki w każdej penetracji, opuść elektrodę przez całą głębokość kory. Jeśli po wielu penetracjach nie napotka się neuronów reagujących na światło lub odwrotnie, nagrania są rutynowo zanieczyszczone kolcami z sąsiedniego kanału, ogniwami ujemnymi opsyny, wypróbuj nową elektrodę.

Rysunek przedstawia przykładowe nagrania z trzech typów optycznie zidentyfikowanych neuronów pośrednich. Komórki reagują na ciąg impulsów poszukiwawczych niezawodnym impulsem impulsów. Pokazano tutaj skoki linii 100 tr i średni interpolowany przebieg

Te wykresy składu pokazują konsekwentny czas wywoływania skoków wywołanych światłem. Pierwsze skokowe opóźnienia dla próbki mocy. Przedstawiono tutaj interneurony dodatnie w wolinie.

Podejście do stymulacji fotograficznej jest koncepcyjnie bardzo proste, ale może być zaskakująco trudne i mało wydajne. W praktyce. Elektrody ze szklaną łatą są silnie ukierunkowane w kierunku neuronów parametalicznych, więc neurony wewnętrzne nie pojawiają się zbyt często.

Z drugiej strony, w przypadku tetros otrzymujesz mnóstwo reagujących na światło neuronów międzyneuronowych, ale kolce są małe i występuje wiele nakładających się na siebie form fal, więc bardzo trudno jest niezawodnie posortować je na pojedyncze jednostki. Próbujemy to osiągnąć na wiele różnych sposobów, a w przypadku neuronów wewnętrznych odkryliśmy, że te ostre elektrody o długości od 10 do 14 mega osiągnęły właściwą równowagę pod względem promienia słuchania, który musi być wystarczająco duży, aby wykryć światło dębowych kolców z daleka, ale wystarczająco ograniczony, aby uzyskać dobrą izolację pojedynczej jednostki. Jest w tym jednak trochę voodoo.

Jeśli nie możesz tego osiągnąć, zaoszczędzisz dużo czasu, po prostu porzucając tę elektrodę i przechodząc do następnej, aż znajdziesz taką, która działa.