Name: Przewodnik po jednojednostkowym zapisie in vivo z optogenetycznie zidentyfikowanych korowych interneuronów hamujących (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-11-07T13:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 32 s
Description: Poznaj metodę jednojednostkowego zapisu elektrofizjologicznego z korowych interneuronów hamujących u myszy z ChR2. Technika wykorzystuje optyczną identyfikację komórek wrażliwych na niebieskie światło.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Ta praca została sfinansowana przez Fundację Whitehall i NIH. Dziękujemy Cliffordowi Daxowi (University of Oregon Technical Support Administration) za jego pomoc i doświadczenie w projektowaniu obwodu do dostarczania światła.

UWAGA: Poniższy protokół jest zgodny z wytycznymi National Institutes of Health, zatwierdzonymi przez Komitet ds. Opieki i Użytkowania Zwierząt Uniwersytetu Oregon.
1. Ostra chirurgia
<ol>
	<li>Znieczulić zwierzę koktajlem ketaminowo-medetomidynowym poprzez wstrzyknięcie dootrzewnowe (i.p.) (Tabela 1). 
	UWAGA: Myszy użyte w tych eksperymentach są generowane przez skrzyżowanie zależnej od cre transgenicznej linii10 ChR2-eYFP z liniami sterującymi interneuronów (Pvalb-iCre11, PV+; Sst-iCre12, SOM+; Cr-iCre12, CR+). Dostarczanie wirusa ChR2 lub pokrewnych opsyn powinno działać równie dobrze, zakładając, że uzyskane są podobne poziomy ekspresji.</li>
	<li>Przed rozpoczęciem operacji upewnij się, że zwierzę nie reaguje na delikatne szczypanie palca. W razie potrzeby podawaj ponownie środki znieczulające przez cały czas trwania eksperymentu, aby utrzymać tę głębokość znieczulenia. W przypadku stosowania środków znieczulających do wstrzykiwań, opcjonalnie należy wszczepić cewnik i.p. do wstrzyknięć podtrzymujących.</li>
	<li>Zwierzę należy nawodnić solą fizjologiczną lub roztworem Ringera z mleczanami przez cały czas trwania eksperymentu (około 3 ml/kg/godz.), na przykład stosując odpowiednio rozcieńczony koktajl znieczulający do wstrzyknięć podtrzymujących (Tabela 1).</li>
	<li>Umieść zwierzę w aparacie stereotaktycznym lub innym aparacie do trzymania głowy. Upewnij się, że czaszka jest dobrze zabezpieczona. Jest to niezbędne do utrzymania stabilnych zapisów pojedynczych komórek.</li>
	<li>Nałóż maść okulistyczną na oczy, aby zapobiec wysuszeniu. Utrzymuj temperaturę ciała na poziomie 36,5-37 °C.</li>
	<li>Wykonaj drenaż cysterny, aby uzyskać dodatkową stabilność nagrywania. Za pomocą ostrza skalpela usuń tkankę z tylnej części czaszki, aby odsłonić cisterna magna. Zrób małe nacięcie w oponie twardej, aby odprowadzić płyn mózgowo-rdzeniowy. Używaj tylko samej końcówki ostrza i unikaj kontaktu z móżdżkiem lub pniem mózgu.</li>
	<li>Za pomocą skalpela wykonaj małą kraniotomię (~2 mm2) nad obszarem zainteresowania kory mózgowej (w przypadku kory słuchowej około -2,3 mm za bregmą, 4,5 mm po boku linii środkowej).</li>
	<li>Usunąć oponę twardą i przykryć odsłoniętą korę warstwą ciepłej agarozy o grubości 0,5 - 1 mm (1,5% agarozy w soli fizjologicznej, 0,9% NaCl; stosować w temperaturze ~37 °C). Utrzymuj agarozę wilgotną przez cały czas trwania eksperymentu, okresowo nakładając kilka kropli soli fizjologicznej.</li>
</ol>
2. Konfiguracja nagrywania
<ol>
	<li>Przygotuj elektrodę wolframową (7-14 MΩ, średnica 127 μm, końcówka stożkowa 12°, pokryta żywicą epoksydową). Przyklej elektrodę do szklanej rurki kapilarnej i dodaj rurkę termokurczliwą do chwytania (rysunek 1).</li>
	<li>Zamontuj elektrodę na zmotoryzowanym (lub hydraulicznym) mikromanipulatorze, ustawionym tak, aby poruszała się prostopadle do powierzchni kory mózgowej. Wsuń drut szlifowany pod skórę, przy czaszce. Unikaj kontaktu z mięśniami z boku głowy i z tyłu szyi, ponieważ mogą one generować artefakty elektromiograficzne.</li>
	<li>Wzmocnij sygnał elektryczny za pomocą wzmacniacza zewnątrzkomórkowego odpowiedniego do nagrywania pojedynczej jednostki, najlepiej wyposażonego w tryb sprawdzania impedancji. Monitoruj bieżącą aktywność skokową (pasmo przepustowe 300 - 5,000 Hz) za pomocą dwóch oscyloskopów i zestawu zasilanych głośników. W tym przypadku zarejestrowane dane są digitalizowane w sposób ciągły z częstotliwością próbkowania 10 kHz; Spajki są wyodrębniane w trybie offline.</li>
	<li>Przeprowadź elektrodę przez agarozę, aż końcówka dotrze do powierzchni kory. Obserwuj ten krok przez mikroskop. "Wyzeruj" tę pozycję na mikromanipulatorze.</li>
	<li>Aby jak najlepiej przybliżyć głębokość zapisu, należy wizualnie potwierdzić, że końcówka elektrody wychodzi z powierzchni kory mózgowej na głębokości zera podczas wycofywania elektrody na końcu penetracji. 
	UWAGA: Rozbieżność między odczytem manipulatora a obserwowanym położeniem elektrody wskazuje, że przesunął się on względem tkanki. Może to być spowodowane niestabilnością mózgu lub zwierzęcia lub dryfem manipulatora.
	<ol>
		<li>Jako dodatkowe sprawdzenie, aby upewnić się, że ta zerowa wartość zadana odpowiada powierzchni kory mózgowej, monitoruj potencjały pola wywołane bodźcem podczas przechodzenia przez pierwsze kilkaset mikrometrów tkanki. Podczas monitorowania potencjałów pola należy obniżyć dolną granicę filtra pasmowo-przepustowego wzmacniacza zewnątrzkomórkowego do 10 Hz. Upewnij się, że polaryzacja potencjału pola lokalnego odwraca się na głębokości ~100 μm, w pobliżu granicy warstwy I/II13. Jest to wiarygodny punkt odniesienia dla kory słuchowej, ale może się różnić w przypadku innych obszarów kory mózgowej.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Zamontuj światłowód sprzężony ze źródłem światła niebieskiego (rysunek 2) na ręcznym mikromanipulatorze. Za pomocą mikroskopu umieść końcówkę włókna jak najbliżej powierzchni agarozy. Wyśrodkuj wiązkę w miejscu, w którym elektroda wejdzie w tkankę.</li>
	<li>Reguluj moc wyjściową źródła światła za pomocą jednostki sterującej zdolnej do dostarczania ciągu impulsów TTL (logika tranzystorowo-tranzystorowa) o określonej szerokości i czasie trwania – np. Arduino (ilustracja 3), komputerowa karta I/O (jak pokazano) lub dostępny na rynku generator impulsów.
	<ol>
		<li>Monitoruj sygnał na obu oscyloskopach.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Zmierz całkowitą moc świetlną (mW) na końcówce światłowodu za pomocą miernika mocy. Użyj tej wartości, aby obliczyć natężenie promieniowania (mW/mm2), dzieląc przez pole przekroju poprzecznego rdzenia światłowodu. Zacznij od wartości intensywności w zakresie 10 - 15 mW/mm2 i w razie potrzeby zmniejsz, aż artefakty zostaną wyeliminowane.</li>
	<li>Sprawdź, czy nie ma artefaktów świetlnych za pomocą elektrody w agarozie, gotowej do wniknięcia do tkanki. Uruchom ciąg impulsów wyszukiwania (np. impulsy świetlne 30 ms, interwał międzybodźcowy 500 ms (ISI)).
	<ol>
		<li>Wyeliminuj przejściowe artefakty świetlne (ilustracja 4), zmieniając położenie światłowodu względem elektrody, aby zmienić kąt padania światła. Jeśli artefakty utrzymują się, spróbuj zmniejszyć moc światła. W rzadkich przypadkach, gdy artefaktów nie można całkowicie wyeliminować (a jedynie zminimalizować), wydłuż czas trwania impulsu poszukiwawczego. Może to pomóc w identyfikacji prawdziwych kolców neuronalnych.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
3. Prosty PINP-in'
<ol>
	<li>Przesuwaj elektrodę powoli przez mózg z szybkością około 1 μm/s. Użyj jednego oscyloskopu do monitorowania bieżącej aktywności. Z drugiej strony wyłącz impulsy laserowe.</li>
	<li>Słuchaj słabego "haszu" impulsów wywołanych światłem na monitorze audio, który wskazuje, że elektroda zbliża się do ogniwa ChR2+ i często można ją dostrzec na długo przed pojawieniem się sygnału elektrycznego na oscyloskopie. Spowolnij tempo postępu. 
	UWAGA: Jeśli ogniwo leży bezpośrednio na ścieżce elektrody, aktywność wywołana światłem będzie rosła (i będzie głośniejsza). Gdy elektroda zbliża się do pojedynczego interneuronu, haszysz rozpadnie się na małe, ale dobrze zdefiniowane kolce o jednolitym rozmiarze i kształcie.</li>
	<li>Gdy tylko impulsy wywołane światłem będą wystarczająco duże, aby wyzwolić się pojedynczo na oscyloskopie, zacznij to robić. Dostosuj skalowanie na osi poziomej, aby obserwować dokładny kształt fali skokowej.</li>
	<li>Zatrzymaj się i poczekaj, aż tkanka się uspokoi. Oprzyj się pokusie przesunięcia elektrody bliżej ogniwa. Ten krok ma kluczowe znaczenie dla stabilnego nagrania. Jeśli po kilku minutach stosunek sygnału do szumu nie uległ poprawie – to znaczy tkanka osiadła, ale nie zbliżyła ogniwa do końcówki elektrody – przesuń się o 5 μm dalej i ponownie poczekaj.
	<ol>
		<li>Powtarzaj ten proces do momentu, gdy szczyt lub dolina potencjału czynnościowego będą mogły być wiarygodnie uchwycone przy progu napięcia ustawionym znacznie powyżej poziomu szumu (np. +/-300 μV lub więcej). 
		UWAGA: Istnieje niewielkie ryzyko wyników fałszywie dodatnich lub niejednoznaczności podczas PINPing interneuronów hamujących. Większość komórek może z łatwością podążać za ciągiem impulsów o czasie trwania 30 ms i interwałem między impulsami 500 ms lub szybszym, z niezawodnym opóźnieniem pierwszego skoku wynoszącym 2-5 ms (ilustracja 5). W szczególności większość ogniw PV+ może wytrzymać zapłon przez pełną 1 sekundę (ilustracja 6). Ponieważ są to neurony hamujące, aktywacja disynaptic (pośrednia) nie jest poważnym problemem.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Podczas nagrywania monitoruj bieżącą aktywność na pierwszym oscyloskopie. Uważnie obserwuj rozmiar i kształt kolców za pomocą drugiego oscyloskopu. Zwróć uwagę na jakość ich dźwięku w głośniku.
	<ol>
		<li>Nasłuchuj uważnie nagłych zmian, które wskazują, że ogniwo albo zbliża się zbyt blisko elektrody (gdzie grozi przebiciem lub uszkodzeniem), albo oddala się. Jeśli kolce staną się duże i zniekształcone, wycofaj się; Jeśli staną się mniejsze, przesuń elektrodę. Poruszaj się powoli w krokach co 2 μm.</li>
		<li>Potwierdź jakość nagrania post-hoc, nakładając na siebie wszystkie przebiegi szczytowe, wyrównane do wartości szczytowej lub minimalnej. Zmień próg napięcia. W szerokim zakresie wartości progowych powinien istnieć tylko jeden spójny kształt spajka o jednolitej wysokości (Rysunek 5a).</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Jeśli w którymkolwiek momencie sygnał zostanie zanieczyszczony kolcami z sąsiedniego neuronu, przejdź dalej. się powoli, nie licząc szansy, że elektroda wyjdzie poza zasięg sąsiedniej komórki, ale pozostanie w zasięgu docelowego neuronu. (Zwykle się to nie udaje).</li>
	<li>Przesuwaj elektrodę przez całą głębokość kory (900+ μm) przy każdej penetracji. Jeśli po wielu penetracjach nie napotka się neuronów reagujących na światło lub odwrotnie, nagrania są rutynowo zanieczyszczone kolcami z sąsiednich komórek ChR2, wypróbuj nową elektrodę. 
	UWAGA: Nawet w obrębie jednej partii impedancja i geometria końcówek poszczególnych elektrod mogą się znacznie różnić. Oba czynniki przyczyniają się do efektywnego "promienia nasłuchu" elektrody, który musi być wystarczająco duży, aby wykryć impulsy wywołane światłem podczas wyszukiwania, a jednocześnie wystarczająco ograniczony, aby umożliwić rejestrację pojedynczego interneuronu w izolacji.</li>
	<li>Sprawdź impedancję elektrod zgodnie z potrzebami. Aby uniknąć uszkodzenia tkanki, zrób to z końcówką elektrody w górnej części warstwy agarozy, daleko poza mózgiem. W zakresie 7-14 MΩ dokładna impedancja nie jest pewnym predyktorem wydajności lub wydajności dla tego zastosowania. To powiedziawszy, jest to rozsądny wskaźnik proxy dla promienia słuchania: elektrody o niższej impedancji odbierają więcej jednostek; wyższa impedancja, mniej.</li>
	<li>Pod koniec eksperymentu należy poddać zwierzę eutanazji za pomocą środków zatwierdzonych przez instytucję, takich jak przedawkowanie środka znieczulającego lub zwichnięcie szyjki macicy w głębokim znieczuleniu.</li>
</ol>

<ol><li>Lima, S. Q., Hromadka, T., Znamenskiy, P., Zador, A. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((PINP%3A+a+new+method+of+tagging+neuronal+populations+for+identification+during+in+vivo+electrophysiological+recording%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">PINP: a new method of tagging neuronal populations for identification during in vivo electrophysiological recording.</a> PLoS One. 4, (2009).</li>
<li>Moore, A. K., Wehr, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Parvalbumin-expressing+inhibitory+interneurons+in+auditory+cortex+are+well-tuned+for+frequency%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Parvalbumin-expressing inhibitory interneurons in auditory cortex are well-tuned for frequency.</a> J Neurosci. 33, 13713-13723 (2013).</li>
<li>Merchant, H., de Lafuente, V., Pena-Ortega, F., Larriva-Sahd, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Functional+impact+of+interneuronal+inhibition+in+the+cerebral+cortex+of+behaving+animals%5BTitle%5D)+AND+%22Prog+Neurobiol%22%5BJournal%5D)">Functional impact of interneuronal inhibition in the cerebral cortex of behaving animals.</a> Prog Neurobiol. 99, 163-178 (2012).</li>
<li>Markram, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Interneurons+of+the+neocortical+inhibitory+system%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Interneurons of the neocortical inhibitory system.</a> Nat Rev Neurosci. 5, 793-807 (2004).</li>
<li>Atallah, B. V., Bruns, W., Carandini, M., Scanziani, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Parvalbumin-expressing+interneurons+linearly+transform+cortical+responses+to+visual+stimuli%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Parvalbumin-expressing interneurons linearly transform cortical responses to visual stimuli.</a> Neuron. 73, 159-170 (2012).</li>
<li>Wilson, N. R., Runyan, C. A., Wang, F. L., Sur, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Division+and+subtraction+by+distinct+cortical+inhibitory+networks+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Division and subtraction by distinct cortical inhibitory networks in vivo.</a> Nature. 488, 343-348 (2012).</li>
<li>Letzkus, J. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+disinhibitory+microcircuit+for+associative+fear+learning+in+the+auditory+cortex%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">A disinhibitory microcircuit for associative fear learning in the auditory cortex.</a> Nature. 480, 331-335 (2011).</li>
<li>Pi, H. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cortical+interneurons+that+specialize+in+disinhibitory+control%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Cortical interneurons that specialize in disinhibitory control.</a> Nature. 503, 521-524 (2013).</li>
<li>Adesnik, H., Bruns, W., Taniguchi, H., Huang, Z. J., Scanziani, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+neural+circuit+for+spatial+summation+in+visual+cortex%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">A neural circuit for spatial summation in visual cortex.</a> Nature. 490, 226-231 (2012).</li>
<li>Madisen, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+toolbox+of+Cre-dependent+optogenetic+transgenic+mice+for+light-induced+activation+and+silencing%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Neurosci%22%5BJournal%5D)">A toolbox of Cre-dependent optogenetic transgenic mice for light-induced activation and silencing.</a> Nat Neurosci. 15, 793-802 (2012).</li>
<li>Hippenmeyer, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+developmental+switch+in+the+response+of+DRG+neurons+to+ETS+transcription+factor+signaling%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Biol%22%5BJournal%5D)">A developmental switch in the response of DRG neurons to ETS transcription factor signaling.</a> PLoS Biol. 3, 159(2005).</li>
<li>Taniguchi, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+resource+of+Cre+driver+lines+for+genetic+targeting+of+GABAergic+neurons+in+cerebral+cortex%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">A resource of Cre driver lines for genetic targeting of GABAergic neurons in cerebral cortex.</a> Neuron. 71, 995-1013 (2011).</li>
<li>Christianson, G. B., Sahani, M., Linden, J. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Depth-dependent+temporal+response+properties+in+core+auditory+cortex%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Depth-dependent temporal response properties in core auditory cortex.</a> J Neurosci. 31, 12837-12848 (2011).</li>
<li>Povysheva, N. V., Zaitsev, A. V., Gonzalez-Burgos, G., Lewis, D. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Electrophysiological+heterogeneity+of+fast-spiking+interneurons%3A+chandelier+versus+basket+cells%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Electrophysiological heterogeneity of fast-spiking interneurons: chandelier versus basket cells.</a> PLoS One. 8, 70553(2013).</li>
</ol>

Autorzy nie mają konkurencyjnych interesów finansowych.

Chociaż PINP jest koncepcyjnie prosty, w praktyce może być wyzwaniem. Głównym wyznacznikiem sukcesu jest wybór elektrody. Parametrem krytycznym jest elektryczny promień odsłuchu. Musi być wystarczająco duży, aby wykryć impulsy wywołane światłem, gdy końcówka znajduje się jeszcze w pewnej odległości od ogniwa ChR2+, aby można było odpowiednio dostosować szybkość posuwania się. Jednocześnie musi być wystarczająco ograniczony, aby umożliwić dobrą izolację pojedynczej jednostki. Oznacza to, że elektroda nie może również zbie...

Scharakteryzowanie niezliczonych typów komórek, które składają się na mózg ssaków, było głównym, ale długo nieuchwytnym celem neurofizjologii. Na przykład właściwości i funkcje różnych typów komórek hamujących w korze mózgowej są tematami budzącymi duże zainteresowanie, ale nadal są stosunkowo nieznane. Dzieje się tak częściowo dlatego, że konwencjonalne techniki ślepego zapisu in vivo mają ograniczoną zdolność do rozróżniania różnych typów komórek. Zewnątrzkomórkowa szerokość kolca może być wykorzystana do oddzielenia przypuszczalnych neuronów hamujących parwalbuminowo-dodatnich od pobudzających komórek piramidowych, ale ta metoda jest obarczona błędami zarówno typu I, jak i typu II2,3. Alternatywnie, zarejestrowane neurony mogą zostać wypełnione, odzyskane i wybarwione, aby później potwierdzić ich morfologiczną i molekularną tożsamość, ale jest to żmudny i czasochłonny proces. Ostatnio genetycznie zidentyfikowane populacje interneuronów hamujących stały się dostępne za pomocą obrazowania wapnia lub wizualnie sterowanych nagrań plastrów. W tych podejściach wirusowa lub transgeniczna ekspresja reportera wapnia (takiego jak GCaMP) lub białka fluorescencyjnego (takiego jak GFP) umożliwia identyfikację i charakterystykę typów komórek zdefiniowanych przez ekspresję promotora. Podejścia te wykorzystują mikroskopię 2-fotonową, która wymaga drogiego sprzętu, a także jest ograniczona do powierzchownych warstw korowych ze względu na właściwości rozpraszania światła przez tkankę mózgową. 
Niedawno, i współpracownicy1 opracowali nowatorskie zastosowanie optogenetyki do kierowania zapisów elektrofizjologicznych do genetycznie zidentyfikowanych typów neuronów in vivo, co określa się mianem "PINP" - czyli Identyfikacja Populacji Neuronów wspomagana przez fotostymulację. Zapisy wykonuje się u myszy z ekspresją rodopsyny kanałowej-2 (ChR2) w określonych subpopulacjach neuronów. Członkowie populacji są identyfikowani na podstawie ich reakcji na krótki błysk niebieskiego światła. W przeciwieństwie do wielu innych zastosowań optogenetycznych, celem nie jest manipulowanie funkcją obwodów, ale po prostu identyfikacja neuronów należących do genetycznie zdefiniowanej klasy, które można następnie scharakteryzować podczas normalnego funkcjonowania mózgu. Technika ta może być realizowana za pomocą standardowego zewnątrzkomórkowego sprzętu rejestrującego i dlatego może służyć jako dostępna i niedroga alternatywa dla obrazowania wapniowego lub wizualnie sterowanego łatania. Tutaj opisujemy podejście do PINPing określonych typów komórek w znieczulonej korze słuchowej, z oczekiwaniem, że bardziej ogólne punkty mogą być z pożytkiem zastosowane w innych preparatach i obszarach mózgu.
W korze mózgowej PINP jest szczególnie obiecujący do badania właściwości odpowiedzi in vivo interneuronów hamujących. Interneurony GABA-ergiczne obejmują mały, niejednorodny podzbiór neuronów korowych4. Ostatnio wykazano, że różne podtypy, charakteryzujące się ekspresją poszczególnych markerów molekularnych, pełnią różne role obliczeniowe w obwodach korowych5-9. Wraz z ulepszaniem narzędzi genetycznych może w końcu być możliwe rozróżnienie morfologicznie i fizjologicznie oddzielnych typów, które mieszczą się w tych szerokich klasach. Dzielimy się tutaj naszą strategią uzyskiwania stabilnych, dobrze izolowanych jednojednostkowych zapisów ze zidentyfikowanych interneuronów hamujących w znieczulonej korze myszy. Strategia ta została opracowana specjalnie do celowania w komórki parwalbuminowo-dodatnie (PV+), ale odkryliśmy, że działa również w przypadku innych typów interneuronów, takich jak interneurony z ekspresją somatostatyny (SOM+) i kalretyniny (CR+). Chociaż PINPing jest koncepcyjnie prosty, w praktyce może być zaskakująco nieustępliwy. Metodą prób i błędów nauczyliśmy się wielu wskazówek i sztuczek, które mogą być przydatne dla innych próbujących tej metody.

<table><tbody><tr><td>ChR2-EYFP Linia</td><td>Jackson Kolonie</td><td>12569</td><td></td></tr><tr><td>Linia Pvalb-iCre (PV) Kolonie</td><td>Jacksona</td><td>8069</td><td></td></tr><tr><td>Linia Sst-iCre (SOM)</td><td>Kolonie Jacksona</td><td>13044</td><td></td></tr><tr><td>Linia Cr-iCre (CR) Kolonie</td><td>Jacksona</td><td>10774</td><td></td></tr><tr><td>Agaroza</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A9793</td><td>Typ III-A, wysoki mikropunkt EEO</td></tr><tr><td>(opona twarda hak)</td><td>FST</td><td>10066-15</td><td></td></tr><tr><td>Nożyczki chirurgiczne</td><td>FST</td><td>14084-09</td><td></td></tr><tr><td>Skalpel</td><td>FST</td><td>10003-12 (rękojeść), 10011-00 (ostrza)</td><td></td></tr><tr><td>Maść okulistyczna Puralube</td><td>Foster & Smith</td><td>9N-76855</td><td></td></tr><tr><td>Koc homeotermiczny</td><td>Aparatura Harvard</td><td><a name="ZASIĘG! C11">507220F</a></td><td></td></tr><tr><td>Mikroelektrody wolframowe</td><td>Systemy AM</td><td>577200</td><td>12 M&Omega; Odporność na prąd przemienny, 127 &mu; m średnica, 12&deg; stożkowa końcówka, rurka</td></tr><tr><td>ze szkła kapilarnego</td> pokrytego żywicą epoksydową <td>Warner Instruments</td><td>G150TF-3</td><td></td></tr><tr><td>Rurka termokurczliwa</td><td>DigiKey</td><td>A332B-4-ND</td><td></td></tr><tr><td>Akcelerator Zapit</td><td>DVA</td> SKU <td>ZA/ZAA</td><td>Stosować ze standardowym klejem Super Glue.&nbsp;</td></tr><tr><td>Mikroelektroda Wzmacniacz prądu przemiennego 1800</td><td>AM Systems</td><td>700000</td><td></td></tr><tr><td>MP-285 Mikromanipulator z napędem</td><td>silnikowym Sutter</td><td>MP-285</td><td></td></tr><tr><td>4-kanałowe oscyloskopy cyfrowe</td><td>Tektronix</td><td>TDS2000C</td><td></td></tr><tr><td>Głośniki zasilane</td><td>Harman</td><td>Model JBL&nbsp; Manipulator</td> ręczny Duet <td></td></tr><tr><td></td><td>Scientifica</td><td>LBM-7</td><td></td></tr><tr><td>800 &micro; m Patch Cable</td><td>światłowodowy ThorLabs</td><td>FC/PC BFL37-800</td><td></td></tr><tr><td>Miernik mocy</td><td>ThorLabs</td><td>PM100D (miernik mocy), S121C (standardowy czujnik mocy)</td><td></td></tr><tr><td>475 nm Cree XLamp XP-E</td><td>DigiKey</td><td>XPEBLU-L1-R250-00Y01DKR-ND</td><td>LED moc i wydajność stale rosną, dlatego zalecamy sprawdzenie najnowszych produktów (www.cree.com).</td></tr><tr><td>Arduino UNO</td><td>DigiKey</td><td>1050-1024-ND</td><td></td></tr></tbody></table>

przewodnik po jednojednostkowym zapisie in vivo z optogenetycznie zidentyfikowanych korowych interneuronów hamujących

A Guide to In vivo Single-unit Recording from Optogenetically Identified Cortical Inhibitory Interneurons

Głównym wyzwaniem w neurofizjologii było scharakteryzowanie właściwości odpowiedzi i funkcji licznych typów komórek hamujących w korze mózgowej. Dzielimy się tutaj naszą strategią uzyskiwania stabilnych, dobrze izolowanych zapisów pojedynczych jednostek ze zidentyfikowanych interneuronów hamujących w znieczulonej korze myszy przy użyciu metody opracowanej przez Limę i współpracowników1. Zapisy wykonuje się u myszy z ekspresją rodopsyny kanałowej-2 (ChR2) w określonych subpopulacjach neuronów. Członkowie populacji są identyfikowani na podstawie ich reakcji na krótki błysk niebieskiego światła. Technika ta – określana jako "PINP", czyli Photostimulation-assisted Identification of Neuronal Population – może być realizowana za pomocą standardowego sprzętu do rejestracji zewnątrzkomórkowej. Może służyć jako niedroga i dostępna alternatywa dla obrazowania wapnia lub wizualnie sterowanego łatania, w celu ukierunkowania nagrań zewnątrzkomórkowych na komórki zidentyfikowane genetycznie. Poniżej przedstawiamy zestaw wskazówek dotyczących optymalizacji metody w codziennej praktyce. Udoskonaliliśmy naszą strategię specjalnie do celowania w komórki parwalbuminowo-dodatnie (PV+), ale odkryliśmy, że działa ona również w przypadku innych typów interneuronów, takich jak interneurony z ekspresją somatostatyny (SOM+) i kalretyniny (CR+).

Przedstawiamy naszą strategię uzyskiwania rejestracji pojedynczych jednostek z genetycznie sklasyfikowanych interneuronów hamujących w korze mózgu znieczurzonej myszy, z wykorzystaniem metody optogenetycznej opracowanej przez Lima et al.1. Tabela 1 szczegółowo opisuje sugerowany koktajl anestetyczny: ketamina-medetomidyna-acepromazyna („KMA”). Rysunek 1 przedstawia mikroelektrodę wolframową przygotowaną do rejestracji. Rysunek 2 zawiera schemat obwodu...

Tutaj opisujemy naszą strategię uzyskiwania stabilnych, dobrze izolowanych pojedynczych nagrań jednostkowych ze zidentyfikowanych interneuronów hamujących w znieczulonej korze myszy. Neurony wyrażające ChR2 są identyfikowane na podstawie ich reakcji na niebieskie światło. Metoda wykorzystuje standardowy zewnątrzkomórkowy sprzęt rejestrujący i służy jako niedroga alternatywa dla obrazowania wapnia lub wizualnie sterowanego łatania.

Przewodnik po jednojednostkowym zapisie in vivo z optogenetycznie zidentyfikowanych korowych interneuronów hamujących

A major challenge in neurophysiology has been to characterize the response properties and function of the numerous inhibitory cell types in the cerebral ...

Ogólnym celem poniższego eksperymentu jest uzyskanie wysokiej jakości zewnątrzkomórkowych nagrań pojedynczych jednostek z neuronów korowych u myszy z ekspresją korzenia kanału w drugim. Osiąga się to poprzez przepuszczenie elektrody rejestrującej o wysokiej impedancji przez tkankę w celu identyfikacji neuronów między neuronami w wyniku gwałtownych reakcji na impulsy światła niebieskiego. Sygnał elektryczny jest monitorowany pod kątem zmian, które wskazują na odpowiednią szybkość wyprzedzenia i prawdopodobieństwo uzyskania stabilnego, dobrze izolowanego zapisu.Jeśli nie można osiągnąć dobrej izolacji pojedynczej jednostki lub odwrotnie, rzadko spotyka się neurony reagujące na światło, wymień elektrodę rejestrującą. Wyniki pokazują niezawodność światła wywołującego reakcje od optycznie zidentyfikowanych neuronów oraz typowy stosunek sygnału do szumu uzyskany za pomocą tej strategii. Podejście oparte na fotostymulacji jest dostępnym i niedrogim sposobem celowania w genetycznie zidentyfikowane typy komórek przy użyciu standardowego wzmacniacza zewnątrzkomórkowego i niebieskiego światła.Jest to nasza strategia odpicowania określonych neuronów wewnętrznych w znieczuleniu kory słuchowej, ale bardziej ogólne punkty dotyczą innych obszarów korowych niż rzadkie typy komórek Aby rozpocząć tę procedurę. Po znieczuleniu zwierzęcia koktajlem ketaminy meine poprzez wstrzyknięcie dootrzewnowe, umieść je w stereotaktycznym lub innym aparacie do trzymania głowy, upewnij się, że czaszka jest dobrze zabezpieczona. Jest to niezbędne do utrzymania stabilnych zapisów pojedynczych komórek.Następnie nałóż maść okulistyczną na oczy, aby zapobiec wysuszeniu i utrzymać temperaturę ciała zwierzęcia na poziomie 37 stopni Celsjusza, aby wykonać drenaż mostka CI w celu dodatkowej stabilności zapisu, usuń tkankę z tylnej części czaszki za pomocą ostrza skalpela, aby odsłonić kręty mostek CI. Następnie wykonaj małe nacięcie w Dorze czubkiem ostrza, aby odsączyć płyn mózgowo-rdzeniowy. Teraz za pomocą skalpela wykonaj małą kraniotomię nad obszarem zainteresowania kory mózgowej.Następnie usuń oponę twardą, a następnie przykryj odsłoniętą korę warstwą ciepłych aros. Utrzymuj agros wilgotny solą fizjologiczną. Przygotuj elektrodę do stania na językach.Przyklej elektrodę do szklanej rurki kapilarnej za pomocą super kleju i akceleratora. Następnie dodaj rurkę termokurczliwą do chwytania. Następnie zamontuj elektrodę na zmotoryzowanym lub hydraulicznym manipulatorze mikrom i ustaw ją tak, aby poruszała się prostopadle do powierzchni kory mózgowej.Wsuń przewód uziemiający pod skórę przy czaszce. Unikaj kontaktu z mięśniami z boku głowy i z tyłu szyi, ponieważ mogą one generować artefakty miograficzne. Sygnał elektryczny jest wzmacniany za pomocą wzmacniacza zewnątrzkomórkowego odpowiedniego do nagrywania pojedynczego urządzenia, najlepiej wyposażonego w tryb sprawdzania impedancji.Bieżąca aktywność skokowa jest monitorowana za pomocą dwóch oscyloskopów i zestawu zasilanych głośników. Teraz przeprowadź elektrodę przez agros i przetestuj jej impedancję, aby upewnić się, że mieści się w zakresie od siedmiu do 14 megaomów. Gdy końcówka naruszy powierzchnię kory, wyzeruj tę pozycję na manipulatorze mikrom.Aby jak najlepiej oszacować głębokość zapisu, potwierdź wzrokowo, że końcówka elektrody wychodzi z powierzchni kory mózgowej na głębokości zera. Podczas wycofywania elektrody pod koniec penetracji w korze słuchowej w celu upewnienia się, że ta nastawa zerowa odpowiada poziomowi kory mózgowej, monitoruje potencjały pola wywołanego bodźcem. Przesuwając elektrodę przez pierwsze kilkaset mikrometrów tkanki, upewnij się, że polaryzacja potencjału pola lokalnego odwraca się na głębokości 100 mikrometrów.Następnie zamontuj światłowód sprzężony ze źródłem niebieskiego światła na ręcznym mikromanipulatorze. Reguluj moc wyjściową źródła światła za pomocą jednostki sterującej zdolnej do dostarczania ciągu impulsów TTL o określonej szerokości i czasie trwania. Następnie monitoruj sygnał na obu oscyloskopach.Zmierz całkowitą moc światła na końcówce światłowodu za pomocą miernika mocy. Użyj tej wartości, aby obliczyć natężenie promieniowania, dzieląc je przez pole przekroju poprzecznego rdzenia włókna. Zacznij od wartości w zakresie od 10 do 15 miliwatów na milimetr kwadratowy.Za pomocą mikroskopu umieść końcówkę włókna jak najbliżej powierzchni aros. Wyśrodkuj wiązkę w miejscu, w którym elektroda wejdzie w tkankę. Teraz sprawdź, czy nie ma artefaktów świetlnych za pomocą elektrody w aros.Dostarcz napięcie pulsu. Wyeliminuj wszelkie przejściowe artefakty świetlne, zmieniając położenie światłowodu względem elektrody, aby zmienić kąt padającego światła. Jeśli artefakty utrzymują się, spróbuj zmniejszyć moc światła.Następnie powoli przesuwaj elektrodę przez mózg z szybkością około jednego mikrometra na sekundę. Użyj jednego oscyloskopu do monitorowania bieżącej aktywności elektrody. Drugi służy do wyzwalania impulsów laserowych.Posłuchaj słabego skrótu światła wywołanego skokami na monitorze audio, co wskazuje, że elektroda zbliża się do dodatniego ogniwa opsyny kanałowej. Następnie zwolnij tempo postępu, gdy tylko pojawi się światło. Skoki są na tyle duże, że można je wyzwolić indywidualnie na oscyloskopie.Zacznij to robić. Dostosuj skalę na osi poziomej, aby obserwować dokładny kształt fali skokowej. W tym momencie zatrzymaj przesuwanie elektrody i poczekaj, aż osiądzie w tkance.Ma to kluczowe znaczenie dla stabilnego nagrania. Po kilku minutach, jeśli stosunek sygnału do szumu nie uległ poprawie, przesuń się o pięć mikrometrów dalej i poczekaj. Ponownie powtarzaj ten proces, aż szczyt lub dolina potencjału czynnościowego będzie mógł zostać niezawodnie uchwycony za pomocą progu napięcia.Ustaw znacznie powyżej poziomu szumów podczas nagrywania. Monitoruj bieżącą aktywność na pierwszym oscyloskopie. Jednocześnie zwróć uwagę na wielkość i kształt kolców za pomocą drugiego oscyloskopu i zwróć uwagę na jakość ich dźwięku na głośniku.Nasłuchuj uważnie nagłych zmian, które wskazują, że ogniwo albo zbliża się zbyt blisko elektrody, albo oddala się. Jeśli kolce staną się duże i zniekształcone, wycofaj elektrodę. Jeśli staną się mniejsze, przesuń elektrodę.Poruszaj się powoli w dwóch krokach mikrometrowych, aby potwierdzić jakość kolców. Nałóż cały przebieg spajka na szeroki zakres wartości progowych. Powinien być widoczny tylko jeden spójny kształt kolca o jednolitej wysokości.Większość ogniw fotowoltaicznych dodatnich może wytrzymać zapłon przez pełną jedną sekundę. Jeśli sygnał zostanie zanieczyszczony kolcami z sąsiedniego neuronu, przesuń elektrodę i szukaj nowej komórki w każdej penetracji, opuść elektrodę przez całą głębokość kory. Jeśli po wielu penetracjach nie napotka się neuronów reagujących na światło lub odwrotnie, nagrania są rutynowo zanieczyszczone kolcami z sąsiedniego kanału, ogniwami ujemnymi opsyny, wypróbuj nową elektrodę.Rysunek przedstawia przykładowe nagrania z trzech typów optycznie zidentyfikowanych neuronów pośrednich. Komórki reagują na ciąg impulsów poszukiwawczych niezawodnym impulsem impulsów. Pokazano tutaj skoki linii 100 tr i średni interpolowany przebieg.Te wykresy składu pokazują konsekwentny czas wywoływania skoków wywołanych światłem. Pierwsze skokowe opóźnienia dla próbki mocy. Przedstawiono tutaj interneurony dodatnie w wolinie.Podejście do stymulacji fotograficznej jest koncepcyjnie bardzo proste, ale może być zaskakująco trudne i mało wydajne. W praktyce. Elektrody ze szklaną łatą są silnie ukierunkowane w kierunku neuronów parametalicznych, więc neurony wewnętrzne nie pojawiają się zbyt często.Z drugiej strony, w przypadku tetros otrzymujesz mnóstwo reagujących na światło neuronów międzyneuronowych, ale kolce są małe i występuje wiele nakładających się na siebie form fal, więc bardzo trudno jest niezawodnie posortować je na pojedyncze jednostki. Próbujemy to osiągnąć na wiele różnych sposobów, a w przypadku neuronów wewnętrznych odkryliśmy, że te ostre elektrody o długości od 10 do 14 mega osiągnęły właściwą równowagę pod względem promienia słuchania, który musi być wystarczająco duży, aby wykryć światło dębowych kolców z daleka, ale wystarczająco ograniczony, aby uzyskać dobrą izolację pojedynczej jednostki. Jest w tym jednak trochę voodoo.Jeśli nie możesz tego osiągnąć, zaoszczędzisz dużo czasu, po prostu porzucając tę elektrodę i przechodząc do następnej, aż znajdziesz taką, która działa.

a-guide-to-vivo-single-unit-recording-from-optogenetically-identified

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Neuronauka

Ten film demonstruje rejestrację sygnałów elektrycznych z pojedynczych neuronów mózgowych za pomocą mikropipety szklanej z cienką końcówką i specjalistycznej konfiguracji. Mikropipeta jest ostrożnie wprowadzana do mózgu szczura i jest brzęcząca, aby przeniknąć do neuronu w celu zarejestrowania wewnętrznych neuronalnych sygnałów elektrycznych.

Rejestracja in vivo sygnałów wewnątrzkomórkowych z pojedynczego neuronu

Ten film demonstruje procedurę analizy połączeń synaptycznych między przyśrodkową korą przedczołową (mPFC) a neuronami ciała migdałowatego za pomocą ostrych wycinków mózgu ciała migdałowatego od myszy. Neurony mPFC u tych myszy wyrażają rodopsynę kanałową połączoną z białkiem fluorescencyjnym. Rodopsyny kanałowe ułatwiają napływ jonów i generowanie potencjału czynnościowego w neuronach mPFC po aktywacji światłem. W konsekwencji neurony mPFC uwalniają neuroprzekaźniki, które wiążą się z...

Wizualizacja i mapowanie ścieżek neuronalnych w wycinku mózgu ciała migdałowatego

Ten film demonstruje procedurę badania efektywności synaptycznej w bocznej korze śródwęchowej (LEC) poprzez optogenetyczną stymulację aksonów przyśrodkowej kory przedczołowej (mPFC) i rejestrowanie odpowiedzi neuronów piramidowych w LEC. Metoda ta łączy zapisy patch-clamp z aktywacją synaptyczną przez stymulację światłem w celu zbadania plastyczności synaptycznej.

Stymulacja optogenetyczna i elektrofizjologiczny zapis zdarzeń synaptycznych w wycinkach mózgu szczura

Źródło: Lai, J., et al. Jednoczesny zapis elektrofizjologiczny i mikroiniekcje środków hamujących do mózgu gryzonia. J. Vis. Exp. (2015)Ten film demonstruje technikę opartą na mikroiniekcjach do jednoczesnego rejestrowania i hamowania neuronów w wzgórku górnym szczura. Procedura obejmuje celowanie stereotaktyczne, wiercenie czaszki i wprowadzenie iniekrody, która dostarcza neuroprzekaźnik hamujący, jednocześnie rejestrując aktywność neuronów. Stymulacja światłem wywołuje potencjały...

Hamowanie aktywności neuronalnej i jej wykrywanie za pomocą elektrofizjologii u szczura

Niedawny rozwój narzędzi neuronauki, które łączą genetykę i optykę, określany jako "optogenetyka", umożliwia kontrolę nad aktywnością obwodów neuronowych z niespotykanym dotąd poziomem rozdzielczości przestrzennej i czasowej. W tym miejscu przedstawiamy protokół integracji zapisu in vivo z manipulacją optogenetyczną genetycznie zdefiniowanych podzbiorów neuronów przedczołowych korowych i podkostnych neuronów piramidowych.

Metoda wysokiej wierności optogenetycznej kontroli pojedynczych neuronów piramidowych in vivo

Sieci korowe są kontrolowane przez mały, ale zróżnicowany zestaw hamujących interneuronów. Funkcjonalne badanie interneuronów wymaga zatem ukierunkowanego rejestrowania i rygorystycznej identyfikacji. Opisano tutaj podejście łączone obejmujące zapisy całych komórek z pojedynczych lub synaptycznie sprzężonych par neuronów z etykietowaniem wewnątrzkomórkowym, analizą morfologiczną post-hoc i immunocytochemiczną.

Nagrania całokomórkowych klamry krosowej z morfologicznie i neurochemicznie zidentyfikowanych interneuronów hipokampa

Podejścia optogenetyczne są powszechnie używane do manipulowania aktywnością neuronalną i oceny konsekwencji dla funkcjonowania mózgu. W tym miejscu przedstawiono technikę, która po ekspresji in vivo aktywatora optycznego rodopsyny kanałowej pozwala na analizę ex vivo właściwości synaptycznych określonych połączeń neuronalnych dalekiego zasięgu i lokalnych połączeń nerwowych w obwodach związanych ze strachem.

Ex vivo Optogenetyczna analiza obwodów strachu w wycinkach mózgu

W tym artykule omawiamy trzy preparaty mózgowe używane do rejestracji klamer z całych komórek w celu zbadania obwodu siatkówkowego kijanek Xenopus laevis. Każdy preparat, z własnymi specyficznymi zaletami, przyczynia się do eksperymentalnej wykonalności kijanki Xenopus jako modelu do badania funkcji obwodów neuronalnych.

Preparaty i protokoły do rejestracji całych komórek w postaci klamry krosowej neuronów tektalnych Xenopus laevis

Wycinki mózgu ex vivo mogą być używane do badania wpływu lotnych środków znieczulających na wywołane reakcje na bodźce aferentne. Optogenetyka jest wykorzystywana do niezależnej aktywacji aferentów wzgórzowo-korowych i korowo-korowych do niepierwotnej kory nowej, a odpowiedzi synaptyczne i sieciowe są modulowane izofluranem.

Optogenetyczna aktywacja szlaków aferentnych w wycinkach mózgu i modulacja odpowiedzi za pomocą lotnych środków znieczulających

Tutaj prezentujemy protokół opisujący transdukcję wirusa w dyskretnych obszarach mózgu za pomocą konstruktów optogenetycznych, które umożliwiają specyficzną dla synaps charakterystykę elektrofizjologiczną w ostrych wycinkach mózgu gryzoni.

Ex vivo Badanie optogenetyczne transmisji synaptycznej dalekiego zasięgu i plastyczności od przyśrodkowej kory przedczołowej do bocznej kory śródwęchowej

Tutaj prezentujemy dwa protokoły do rejestracji mikro-elektrokortykografii o wysokiej gęstości (μEcoG) u szczurów i myszy, w tym metody chirurgiczne, implantacyjne i rejestracyjne. Zapisy μECoG są wykonywane w połączeniu z zapisem laminarnej politrody w korze słuchowej szczura lub z optogenetycznym manipulowaniem aktywnością neuronalną w korze somatosensorycznej myszy.

Wieloskalowe badania przetwarzania kory mózgowej poprzez integrację politrod laminarnych i optogenetyki z mikroelektrokortykografią u gryzoni

Poznaj metodę jednojednostkowego zapisu elektrofizjologicznego z korowych interneuronów hamujących u myszy z ChR2. Technika wykorzystuje optyczną identyfikację komórek wrażliwych na niebieskie światło.

Przewodnik po jednojednostkowym zapisie in vivo z optogenetycznie zidentyfikowanych korowych interneuronów hamujących

Przeglądaj więcej filmów